Ploïdieveredeling in Begonia aan de hand van ongereduceerde gameten

Transcriptie

1 Ploïdieveredeling in Begonia aan de hand van ongereduceerde gameten Angelo Dewitte

2 Overzicht Inleiding genoomgrootte, ploidie en chromosoomaantal in Begonia Screenen naar ongereduceerde gameten Genetische diversiteit in ongereduceerde gameten Overerving van ongereduceerde gameten Inductie van ongereduceerde gameten

3 Inleiding Elke plant is opgebouwd uit duizenden cellen. Deze cellen specialiseren zich in groep tot bepaalde plantenstructuren zoals blad, wortel of stengel waarbij elke cel dezelfde hoeveelheid chromosomen of DNA inhoud bevat. Enkel de gameten (pol of eicel) vormen een uitzondering.

4 Inleiding meiose

5

6 Inleiding in plantenveredeling worden chemicaliën als colchicine, oryzaline en trifluraline gebruikt om DNA verdubbelingen uit te voeren op de plant In de natuur ontstaan polyploiden echter voornamelijk door ongereduceerde gameten: gameten waarvan het aantal chromosomen niet gehalveerd is vergeleken met de somatische cellen.

7 n = x = 14 n = 2x = 28 n = 2x = 28 n = x = 14 n = x = 14 n = x = 14 n = x = 14 n = 2x = 28 n = x = 14 n = 2x = 28 n = x = 14 n = x = 14 n = 2x = 28 n = x = 14 2n = 2x = 28 2n = 2x = 28 2n = 2x = 28 2n = 3x = 42 2n = 4x = 56

8 Inleiding Voordelen van meiotische vs. mitotische polyploidisatie geen chemicaliën nodig genetische variatie door homoeologe recombinatie mogelijk geen ploidie chimeren verkrijgen van triploiden in één stap Nadelen gebruik beperkt tot planten die deze gameten aanmaken

9 Inleiding Producenten van 2n gameten Interspecifieke hybriden: problemen met chromosoomparing in meiose Synaptische mutanten: mutatie in gen actief gedurende de meiose Oneven polyploiden: vb. 2n = 3x maakt n = x en n = 2x gameten. Geen echte 2n gameten

10 Inleiding Genetische basis van 2n gameet productie: mutaties 1 gen (recessief-dominant) meerdere genen variabele graad van expressie (bij dominant gen) Andere genen controleren frequentie van 2n gameet productie sex-specifiek: enkel bij eicellen of pollen

11 Begonia als modelplant korte reproductietijd (rijkelijke) bloei gedurende het volledige jaar ruim 1400 beschreven soorten met hoge variatie in morfologie en chromosoomaantallen: 2n = 16 tot 2n > 100 Ruim 200 genotypes aanwezig op het ILVO-PGV

12 Genoomgroote, ploidie en chromosoomaantal

13 Genoomgroote, ploidie en chromosoomaantal Begonia bezit een enorme variatie aan chromosoomaantal. Chromosomen zijn klein: ± 1µm Het basischromosoomaantal is ongekend: 2n = 22 voor begonias met Aziatische oorsprong; 2n = 26 of 28 voor de meeste andere begonias. Verschillende ploidiegraden zijn aanwezig; oa. veel tetraploiden met 2n = 56 Het hoogst gekende aantal is 2n = 156 voor B. acutifolia. Ook veel aneuploidie: 2n = 30, 34, B. Orococo B. Florence Rita B. fisheri 2n = 40 2n = 52 2n = 92

14 Genoomgroote, ploidie en chromosoomaantal B276: 2n = 50 Aneuploidie: Sommige chromosomen ontbreken om een veelvoud van het basischromosoomaantal te bereiken

15 Genoomgroote, ploidie en chromosoomaantal Genoomgroottes worden flow cytometrisch gemeten met Glycine max (2.5 pg) of Pisum sativum (9.09 pg) als interne referentie (internationaal gebruikte referenties) De genoomgrootte varieert van 2C= 0.46 tot 2.93 Begonia Pisum sativum (2C = 9.09 pg)

16 2n = Genoomgrootte (pg) Gemiddelde chromosoomgrootte (x 10-3 pg) Section Augustia B. dregei ± B. sutherlandii ± Section Diploclinium B. grandis var. evansiana ± Section Platycentrum B. diadema ± Section Petermannia B. brevirimosa ± Section Gireoudia B. bowerae 28, ± B. heracleifolia 24, ± B. manicata ± Section Barya B. boliviensis ± Section Begonia B. cucullata var. unknown ± B. fischeri ± B. odorata ± B. schmidtiana 32, ± B. subvillosa var. leptotricha ± B. venosa ± Section Donaldia B. ulmifolia ± Section Eupetalum B. pearcei ± Section Gaerdtia B. albo-picta 54, ± B. corallina ± B. maculata ± B. undulata ± Section Peltaugustia B. socotrana ± Section Pritzelia B. coccinea 42, ± B. dietrichiana ± B. listada ± B. tomentosa ± Section Solananthera B. radicans ± B. solananthera ± Geen correlatie genoomgrootte en chromosoomaantal eg. sectie Gaerdtia en sectie Gireoudia B. boliviensis en B. pearcei: hoge genoomgrootte, laag chromosoomaantal Verschillen in gemiddelde chromosoomgrootte: laag in oa. secties Begonia en Gaerdtia, hoog in oa. Secties Gireoudia en Augustia Verschillen lager binnen een sectie

17 TCV = 2 * (Π * TCL * r 2 ) r Mean chromosome length ± SD (µm) Mean chromosome width ± SD (µm) TCV (µm 3 ) 1C Genome size ± SD (pg) B. Orococo 0,77 ± 0,18 0,61 ± 0,09 4, ± 0.01 B. subvillosa var. leptotricha 0,84 ± 0,13 0,61 ± 0,14 4, ± 0.01 B. cucullata (unknown var.) 0,89 ± 0,17 0,65 ± 0,14 4, ± 0.01 B243 1,21 ± 0,34 0,89 ± 0,19 8, ± 0.01 B. dregei 1,26 ± 0,33 0,86 ± 0,14 9, ± 0.01 B. Tamo 1,49 ± 0,42 0,86 ± 0,10 9, ± 0.02 B. fisheri 0,83 ± 0,26 0,67 ± 0,13 13, ± 0.01 B. Bubbles 1,01 ± 0,22 0,71 ± 0,16 15, ± 0.05 B276 1,11 ± 0,32 0,87 ± 0,18 16, ± 0.03 B. Florence Rita 1,10 ± 0,31 0,86 ± 0,22 16, ± 0.03 B. boliviensis 1,73 ± 0,39 1,09 ± 0,17 22, ± 0.04

18 Flow cytometrie kan niet gebruikt worden om verschillen na te gaan in chromosoomaantallen of ploidie tussen soorten. Enkel chromosoomtellingen geven hierover uitsluitsel. B. albo-picta (2n = 56) en B. diadema (2n = 22) bv. hebben eenzelfde genoomgrootte (0.58 pg). Flow cytometrie toont enkel aan dat de genoomgrootte dezelfde is, maar verschillen in ploidie kunnen niet opgespoord worden. Flow cytometrische ploidie analyse wordt veelal gebruikt in nakomelingenschap. Indien de ouders een verschillende genoomgrootte bezitten wordt verwacht dat de nakomeling een intermediaire genoomgroote heeft. Een nakomeling die een hogere genoomgrootte vertoont is vermoedelijk onstaan uit een ongereduceerde gameet. B. corallina x B. dregei (1.01 pg) B. corallina (0.78 pg) B. dregei (0.66 pg)

19 Interspecifieke hybridisatie Verschil in chromosoomaantal of genoomgrootte is niet noodzakelijk een barriere tot kruisen B. odorata (Begonia) B. heracleifolia (Gireoudia) B. cucculata (Begonia) B. venosa (Begonia) B. schmidtiana (Begonia) B. subvillosa (Begonia) B. ulmifolia (Donaldia) B. echinosepala (Pritzelia) B. listada (Pritzelia) B. coccinea (Pritzelia) B. luxurians (Schweidweileria) B. corallina (Gaerdtia) B. albo-picta (Gaerdtia) B. solananthera (Solananthera) B. boliviensis (Barya) B. pearcei (Eupetalum) B. dregei (Augustia) B. grandis (Diploclinium II) B. emeiensis (Platycentrum) B. diadema (Platycentrum)

20

21 chromosoomaantal genoomgrootte B. coccinea B. corallina B. albo-picta B. solananthera B. dregei B. diadema B. echinosepala B. coccinea B. corallina B. albo-picta B. solananthera B. dregei B. diadema 1 B. echinosepala B. luxuruans B. venosa 5 B. odorata B. subvillosa B. cucculata B. ulmifolia B. emeiensis 2 2 B. heracleifolia B. boliviensis B. grandis 1 B. listada B. pearcei B. luxurians B. venosa B. odorata B. subvillosa B. cucculata B. schmidtiana B. ulmifolia B. boliviensis B. grandis B. pearcei 1: early abortion of the seeds 2: bad seeds 3: good seed present, but no germination 4: germination, but no acclimatisation in greenhouse 5: acclimatisation, but identified as self-cross with AFLP 6: acclimatisation, and identified as hybrid with AFLP

22 Phalaenopsis GISH: hybriden met duidelijk verschil in chromosoomgroottes van de ouderplanten

23 Interspecifieke hybridisatie Verschil in chromosoomaantal of genoomgrootte leidt wel tot steriliteit in nakomelingen Oorzaak te vinden in verstoorde chromosoomparing tijdens meiose

24 Screenen van ongereduceerde gameten

25 Screening van ongereduceerde gameten 4 potentiële screeningstechnieken: Verschillen in pollengroote: het volume van een cel (pol) wordt bepaald door de DNA inhoud Meiose studie: aanwezigheid van monaden, dyaden en triaden naast normale tetraden Flow cytometrische bepaling van pollen DNA inhoud Ploidie analyse van nakomelingen

26 Screening van ongereduceerde gameten Guzmania

27 Screening van ongereduceerde gameten Hibiscus

28 Screening van ongereduceerde gameten

29 Correlatie genoom-pollengrootte pollen size (µm) ,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 genome size 1C

30 Flow cytometrische bepaling van pollen DNA inhoud Principe Isolatie kernen uit blad of pollen Uit blad: via choppen Uit pol: via sonicator of osmotische shock op gekiemd pollen

31 Blad referentie Osmotische shock op gekiemd pollen Sonicator

32 Flow cytometrische bepaling van pollen DNA inhoud Blad referentie (p = 150) Vegetatieve kern normaal pollen (p = 75) Generatieve kern normaal pollen + Vegetatieve kern ongereduceerd pollen (p = 150) Generatieve kern ongereduceerd pollen (p = 300)

33 G n + V 2n V n G 2n B. pearcei

34 Lolium perenne referentie Osmotische vrijstelling van nuclei pollen Enkel 1 piek van 1C nuclei

35 Lolium perenne

36 Screening van een Begonia collectie 76 genotypes gescreend: 11 genotypes vertonen 2n pollen vorming waarvan 5 genotypes leefbare 2n pollen Genotypes die 2n pollen vormen vertonen abnormaal grote pollen en een verstoorde meiose (voornamelijk diaden) Meiotisch polyploiden werden ontwikkeld in B. Art hodes x B. Orococo, B. echinosepala var. elongatifolia x B. luxurians var. ziesenhenne, B. corallina x B. dregei en B. Bubbles x B276.

37 Genetische diversiteit in ongereduceerde gameten

38

39 Two hoofd mechanismen: FDR and SDR Homogeneous population of heterozygous 2n pollen Heterogeneous population of homozygous 2n pollen

40 AB AaBb AABB ab Ab ab AB AaBb ab aabb AB Ab AABB ab Geen mendeliaanse uitsplitsing 2n = 2x = 28 2n = 2x = 28 Vb: AaaaBbbb Vb: AaBB Vb: AaaBbB 2n = 2x = 28 2n = 3x = 42 2n = 4x = 56

41 Meiose in controle planten Binnenin één antheer ontwikkelen alle pollenmoedercellen (PMCs) zich simultaan doorheen de meiose Anaphase I

42 Meiose in 2n pollen producenten Alle PMCs ontwikkelen simultaan tot metaphase I binnenin dezelfde antheer; maar niet alle PMCs ontwikkelen verder tot anaphase I. Kernen restitueren in telophase I en delen gedurende anaphase II, waaruit een FDR diade van 2n microspores wordt gevormd. Normal division Prophase I restitution Anaphase I restitution Anaphase I restitution Normal division Restitution nucleus divides Incomplete division Telophase I Anaphase II Anaphase I Normal division Only in B. Florence Rita and B276

43 Overerving van 2n pollen

44 50 diploiden 3 triploiden x B. soli mutata 1 diploid zelfbestuiving 19 triploiden B. Orococo (diploid) B. glabra x B. soli-mutata B. soli mutata x B. Art Hodes x 9 diploiden 212 triploiden 1 diploid 64 triploiden B. soli mutata x B. Orococo x 2 tetraploiden 12 tetraploiden

45 snelheid kiembuisvorming na 24 uur % kiembuislengte (µm) n pollen 2n pollen B. Orococo

46 B. Art Hodes x B. Orococo B. soli-mutata x B. Orococo 3X 3X 2X 3X 2X 3X 3X 3X B. soli-mutata x B. Orococo B. soli-mutata x B. Orococo 3X 2X

47 B. Art Hodes x B. Orococo 2n = 3x nakomeling Monaden Diaden Triaden Tetraden Andere* Niet gebloeid

48

49 Nakomeling % ellipsoïdale pollen Grootte ellipsoïdale pollen (µm) % ronde pollen Grootte ronde pollen (µm) Gemiddeld % kieming Niet gebloeid Geen pollen Slechte pollen Geen pollen Geen pollen , Slechte pollen Slechte pollen Slechte pollen

50 Overerving naar F 1 triploiden is enorm hoog: alle onderzochte nakomelingen vormen diaden, behalve enkele genotypes die enkel monades vormen. In alle nakomelingen werden dan ook 2n gameten aangemaakt, tenzij de plant enkel slechte of geen pollen aanmaakt. De diploide F 1 alsook de tetraploide F 2 vertoont eerder een uitsplitsing Nakomelingen die een hoog percentage monaden of micronuclei vormen, zijn steriel. Fertiliteit in triploide F 1 blijkt laag: weinig morfologisch goede pollen en lage kieming, op enkele uitzonderingen na. De fertiliteit blijkt terug te herstellen in de tetraploiden. B. soli-mutata x B. Orococo.15 2n = 3x

51 B276 (tetraploid; vormt enkel 2n gameten) B. Bubbles (tetraploid) x 38 hexaploiden zelfbestuiving X B hexaploid 2 heptaploid

52 B. Bubbles B276 blad B. Bubbles x B276 blad B. Bubbles x B276 B. 'Bubbles' x B276 Pollen (NK1) Blad (NK1) B. Bubbles x B276 B. Bubbles x B276 Pollen (NK2) Blad (NK2) 23, ,5 22, ,5 21, ,5 20, ,5 19, ,5 18, ,5 17, ,5 16, ,5 15, ,5 14, ,5 13, ,5 12, ,5 11, ,5 10, ,5 9, ,5 8, ,5 7, ,5 pollengrootte %

53 Inductie en aanrijking van 2n gameten

54 Inductie en aanrijking van 2n gameten Inductie interspecifieke hybriden mitose inhibitoren Aanrijking flow cytometrische sortering temperatuur

55 Chemische inductie MG 132 Lactacystin Colchicine Propyzamide Oryzaline APM Roscovitine Olomoucine Bohemine Roscovitine Olomoucine Bohemine Mimosine Aphidicolin Hydroxyurea

56 Chemische inductie Enkel N 2 O is succesvol gebleken tot het induceren van 2n gameten onder een druk van 6 bar in lelie en tulp Op deze manier werden in lelie ook steriele pollen terug fertiel.

57 Recombinatie tussen chromosomen is hierbij mogelijk

58 Aanrijking Flow cytometrische scheiding: enkel wanneer het verschil in grootte tussen grote en kleine pollen groot genoeg is

59

60 Temperatuurswijzigingen kunnen de frequentie verhogen van ongereduceerde gameten binnen een bepaald genotypes Lotus tenuis (Negri & Lemmi, 1998) Ook andere factoren zoals nutriëntengebrek, kunnen invloed hebben

61 Conclusies: rol in verdeling?

62 Conclusies: rol in verdeling? Ongereduceerde gameten hebben een belangrijke rol gespeeld in de evolutie van het plantenrijk. Dit is echter een evolutie over lange termijn. Deze evolutie leidde niet enkel tot verschillen in ploidie, maar in verschillende chromosomale herstructureringen. Hoewel kruisingen mogelijk zijn tussen ver gerelateerde species, resulteert dit in de nakomeling veelal in problemen tijdens chromosoomparing tijdens de gameetvorming. Dit resulteert dan weer in steriliteit, hoewel ook ongereduceerde gameten kunnen ontstaan. In de veredeling is deze lange termijn niet beschikbaar. Daar waar ze tot voor kort als zeldzaam werden beschouwd, blijken ze toch veelvuldig gerapporteerd. Veel polyploiden ontstaan namelijk zonder dat de veredelaar er besef van heeft. Veel knolbegonias zijn tegenwoordig tetraploid, maar het is niet geweten waar en wanneer de polyploidisatie gebeurd is. Binnen een populatie is het aantal genotypes dat ongereduceerde gameten vormt duidelijk in de minderheid. Veelal vormt de gewenste soort of cultivar deze gameten niet.

63 Conclusies: rol in verdeling? Het gebruik van 2n gameten is enkel haalbaar indien de gewenste soort deze gameten in acceptabele frequenties vormt. Eventueel kan er eerst een selectie gebeuren naar genotypes die in hogere frequenties deze gameten aanmaken. Hierbij verhoogt de kans om meiotische polyploiden te creëren. Om een echt belangrijke rol in de veredeling te spelen, is het induceren van 2n gameten van groot belang. Hierbij spelen interspecifieke hybriden een belangrijke rol. Ook recent onderzoek naar oa. N 2 O begassing zorgt voor een belangrijke doorbraak. De uiteindelijke effecten zijn niet enkel een gevolg van polyploidisatie, maar ook van genetische recombinatie of genoomstabilisatie waarbij chromosomen verloren gaan. Ze blijven echter moeilijk te voorspellen.

64 VRAGEN?