UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN METHODEONTWIKKELING VOOR DE BEPALING VAN LSD IN URINE MET BEHULP VAN LC-MS/MS.

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Bio-Analyse Academiejaar METHODEONTWIKKELING VOOR DE BEPALING VAN LSD IN URINE MET BEHULP VAN LC-MS/MS EXPERIMENTEEL ONDERZOEK Ruben DE WAELE Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor Prof. Dr. Apr. W. Lambert Commissarissen Dr. Apr. J. Cordonnier Dr. Apr. C. Stove

2

3 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Bio-Analyse Academiejaar METHODEONTWIKKELING VOOR DE BEPALING VAN LSD IN URINE MET BEHULP VAN LC-MS/MS EXPERIMENTEEL ONDERZOEK Ruben DE WAELE Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor Prof. Dr. Apr. W. Lambert Commissarissen Dr. Apr. J. Cordonnier Dr. Apr. C. Stove

4 AUTEURSRECHT De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor het persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef. 2 juni 2009 De promotor De auteur Prof. Dr. Apr. W. Lambert Ruben De Waele

5 Allereerst wil ik Prof. Dr. Apr. W. Lambert en Dr. Apr. J. Cordonnier bedanken om mij de kans te bieden deze thesis uit te voeren in het laboratorium Chemiphar te Brugge. Dr. Apr. J. Cordonnier, directeur van Chemiphar, wens ik hierbij nog eens te bedanken voor het opvolgen en regelmatig nalezen van het uitgevoerde werk. Een speciaal woord van dank voor Apr. V. Coopman, voor het uitstekend begeleiden van het onderzoek en het helpen verwerken van de resultaten. Verder wil ik ook Ir. S. Van Quekelberghe bedanken voor de technische hulp bij het gebruik van de LC-MS/MS, alsook het verwerken van de resultaten. Tenslotte wens ik Dr. Apr. C. Stove te bedanken, voor het nalezen van de thesis en het aanbrengen van opmerkingen.

6 INHOUDSOPGAVE 1. INLEIDING LSD De ontdekking van LSD Het werkingsmechanisme en de metabolisatie van LSD Het effectenpatroon van LSD Medische toepassingen voor LSD De toxiciteit, afhankelijkheid en tolerantie bij LSD gebruik De gebruiksvormen DE SCREENING VAN LSD IN URINE Historiek Competitieve Enzyme linked immunosorbent assay BEVESTIGINGSTECHNIEKEN Historiek Beknopte beschrijving van de werking van een LC-MS/MS OBJECTIEVEN REAGENTIA EN MATERIALEN STANDAARDEN EN REAGENTIA ANALYTISCHE KOLOMMEN EN APPARATUUR METHODEONTWIKKELING EN VALIDATIE LC-MS/MS TOESTEL Algemene instellingen Kiezen van transities LSD, LSD-D 3 en 2-oxo-3-OH-LSD Werkwijze Resultaten Keuze van de kolom, mobiele fase en gradiënt Eerste chromatografische methode Tweede chromatografische methode VALIDATIE VAN EERSTE CHROMATOGRAFISCHE METHODE Lineariteit Werkwijze Resultaten...22

7 Uittesten verschillende extracties De uitgevoerde extractieprocedures Werkwijze Resultaten Nagaan van de ionsuppressie bij de verschillende extracties Werkwijze Resultaten VALIDATIE VAN TWEEDE CHROMATOGRAFISCHE METHODE Lineariteit Werkwijze Resultaten Controle van de ionsuppressie Werkwijze Resultaten Onderzoeken van de lineariteit van de ijklijn in blanco-urine Werkwijze Resultaten Herhaalbaarheid en intermediaire precisie van het extractierendement Werkwijze Resultaten herhaalbaarheid extractierendement Resultaten intermediaire precisie extractierendement Selectiviteit van de ontwikkelde methode Werkwijze Resultaten Herhaalbaarheid en accuraatheid voor LSD Werkwijze Resultaten Intermediaire precisie en accuraatheid voor LSD + opstellen Shewart kaart Werkwijze Resultaten Opstellen Shewart controlekaart Meetonzekerheid op de bekomen resultaten Berekening CC α, CC β, detectielimiet (LoD) en kwantificatielimiet (LoQ) Werkwijze...45

8 Resultaten TOEPASSING VAN DE METHODE OP RINGTESTEN PROCEDURE RESULTATEN VAN DE ANALYSE BESLUIT LITERATUURLIJST...52

9 LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN LSD: N,N-diethyl-lysergzuuramide 5-HT: 5-hydroxy-tryptamine; serotonine LAE: N-ethyl-lysergzuuramide LEO: N-(2-hydroxyethyl)-N-ethyl-lysergzuuramide 2-oxo-LSD: 2-oxo-N,N-diethyl-lysergzuuramide 2-oxo-3-OH-LSD: 2-oxo-3-hydroxy-N,N-diethyl-lysergzuuramide ASC: Altered states of consciousness RIA: Radioimmunoassay CEDIA: Cloned enzyme donor immunoassay EMIT: Enzyme-multiplied immunoassay ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay TMB: Tetramethylbenzidine GC-MS: Gaschromatografie-massaspectrometrie LC-MS/MS: Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie HPLC: Hogedrukvloeistofchromatografie RP: Reversed phase API: Atmospheric pressure ionisatie ESI: Electrospray ionisatie m/z waarde: massa/lading verhouding CID: Collision-induced dissociation MRM: Multiple reaction monitoring IS: Interne standaard M r : Relatieve molecuulmassa LoD: Detectielimiet LoQ: Kwantificatielimiet

10 1. INLEIDING 1.1. LSD De ontdekking van LSD Alles begon toen Sandoz AG Pharmaceutical Company (Bazel, Zwitserland) in 1917 startte met het onderzoeken van de ergotalkaloïden. Deze stoffen komen voor in ergot of moederkoren. Ergot is het sclerotium van de Claviceps purpurea, een schimmel die behoort tot de Zakjeszwammen (Ascomyceten) en die parasiteert op rogge en andere graangewassen (figuur 1.1). Consumptie van dit geïnfecteerde graan kan leiden tot ergotisme of antoniusvuur, wat gepaard gaat met convulsies en/of gangreen (vaak met dodelijke afloop). Dit is te wijten aan het feit dat er in ergot naast farmaceutisch nuttige componenten ook mycotoxines voorkomen (Röst, 1992). FIGUUR 1.1.: ERGOT OF MOEDERKOREN OP ROGGE ( Het eerste ergotalkaloïde, dat in 1918 geïsoleerd werd uit moederkoren, was ergotamine (figuur 1.2A). Onmiddellijk vond het zijn farmaceutisch nut als middel bij postpartum bloedingen en migraine. Vanaf dan was het wachten tot W. A. Jacobs en L. C. Craig erin slaagden om de gemeenschappelijke kern van alle ergotalkaloïden te karakteriseren. Deze kern kreeg de naam lysergzuur (figuur 1.2B), wat een nogal onstabiele component bleek te zijn. Naar analogie met ergometrine, een minder complex ergotalkaloïde waarbij de amidebinding gevormd is tussen lysergzuur en 2-aminopropanol, slaagde Albert Hofmann ( ) erin lysergzuuramides te synthetiseren met gebruik van eenvoudige amines. Met behulp van 2-aminobutanol verkreeg hij methylergometrine, een oxytocicum, en met diethylamine in 1938 het N,N-diethyl-lysergzuuramide (LSD) (figuur 1.2C). 1/57

11 (A) (B) (C) FIGUUR 1.2.: (A) STRUCTUUR ERGOTAMINE (B) STRUCTUUR LYSERGZUUR (C) STRUCTUUR LSD Het oorspronkelijke doel van Hofmann was het synthetiseren van een analepticum, maar gedurende de farmacologische testen bleek LSD op de proefdieren weinig interessante effecten uit te oefenen. Verdere testen werden daarom stopgezet en het duurde tot 16 april 1943 alvorens de psychische effecten voor het eerst werden waargenomen. Dit gebeurde toen Hofmann LSD uitkristalliseerde onder vorm van een tartraat en onbewust LSD innam (Hofmann, 1980). Het zijn deze effecten die van LSD hedendaags een drug maken, tot grote spijt van Hofmann (Fusar-Poli & Borgwardt, 2008) Het werkingsmechanisme en de metabolisatie van LSD LSD werd ongeveer tegelijkertijd ontdekt met de neurotransmitter serotonine (5-HT). Aangezien de 2 structuren een indolring gemeenschappelijk hebben (figuur 1.3) vermoedde men dat het psychisch effect van LSD te maken had met 5-HT in de hersenen (Barondes, 1996). Vandaag de dag wordt aangenomen dat LSD zijn belangrijkste psychische effecten uitoefent door op te treden als een agonist van de 5-HT 2A receptoren in de frontale cortex van de hersenen (Ebersole et al., 2003; Aghajanian & Marek, 1999). FIGUUR 1.3.: STRUCTUUR SEROTONINE ( 2/57

12 In het menselijk lichaam wordt LSD zeer sterk gemetaboliseerd. Slechts ongeveer 1 % komt onveranderd in de urine terecht. Gezien de korte plasmahalfwaardetijd (3 uur), gebeurt de metabolisatie en excretie ook heel vlug (Upshall & Wailling, 1972). Dit alles heeft tot gevolg dat na orale inname van een normale dosis LSD ( µg), de urineconcentratie na enkele uren lager is dan 1 ng/ml, wat natuurlijk niet bevorderlijk is voor de detectie en kwantificatie van LSD (Van Bocxlaer et al., 2000). FIGUUR 1.4.: DE METABOLIETEN VAN LSD (Canezin et al., 2001) De metabolieten die kunnen aangetroffen worden in de urine zijn nor-lsd, N-ethyllysergzuuramide (LAE), 2-oxo-N,-N-diethyl-lysergzuuramide (2-oxo-LSD), N-(2- hydroxyethyl)-n-ethyl-lysergzuuramide (LEO), 13-of 14-hydroxy-LSD onder de vorm van glucuroniden en 2-oxo-3-hydroxy-N,N-diethyl-lysergzuuramide (2-oxo-3-OH-LSD) (Canezin et al., 2001) (zie figuur 1.4.). Deze laatste metaboliet, die niet gedetecteerd kan worden in plasma, is de belangrijkste en komt in de urine voor in een 16 tot 43 maal hogere concentratie dan LSD (Klette et al., 2000). Bovendien kan 2-oxo-3-OH-LSD ook langer gedetecteerd worden dan LSD, wat dan weer een voordeel is bij de analyse (Reuschel et al., 1999a). 3/57

13 Het effectenpatroon van LSD LSD behoort samen met ecstacy (methyleendioxymethamfetamine of MDMA) en cannabis tot de meest gebruikte hallucinogenen. Deze klasse van drugs noemt men naast hallucinogenen ook wel psychedelica, psychotomimetica of phantastica (Lewin, 1964). Dergelijke namen geven al een goede indicatie van de te verwachten effecten. Het effect van hallucinogenen zoals LSD is in tegenstelling tot andere centraal werkende drugs sterk afhankelijk van de verwachtingen van de gebruiker ( set ) alsook van de omgeving ( setting ) (Nichols, 2004). Dr. Stanislov Grof formuleerde het als volgt: I consider LSD to be a powerful unspecific amplifier or catalyst of biochemical and physiological processes in the brain (Grof, 1975). Het is deze onvoorspelbaarheid in effect die klinisch onderzoek naar LSD zo moeilijk maakt. Na inname van een typische dosis LSD ( µg) treden er snel effecten op die te wijten zijn aan de verstoring van het evenwicht tussen de ortho- en parasympathische systemen (pupilverwijding, tachycardie, misselijkheid, ). De psychische effecten treden reeds op na 30 tot 60 minuten, en leiden tot hallucinaties die ongeveer 6 tot 12 uur aanhouden (Dierick et al., 2003). Nadien zijn er geen blijvende negatieve effecten beschreven (Strassman, 1984; Halpern & Pope, 1999). Naast deze gewenste effecten, kunnen er ook enkele minder aangename ervaringen plaatsvinden. De eerste mogelijkheid is het optreden van flashbacks, waarbij bepaalde effecten van de drug in een nuchtere toestand worden herbeleefd. Dit werd onderzocht door Halpern & Pope (2003a) en zij kwamen tot de conclusie dat de incidentie hiervoor laag is, maar dat er geen behandeling voor bestaat. Een dergelijke flashback kan tot maanden na inname van LSD optreden en staat totaal niet in relatie met de frequentie van gebruik. Een tweede mogelijkheid is het optreden van een bad trip. Hierbij krijgt de gebruiker angstaanvallen en wordt hij extreem paranoïde. Veelal ligt de oorzaak bij de ongunstige set of setting waarin de persoon LSD nam. Een dergelijke intoxicatie kan men behandelen met benzodiazepines of antipsychotica (Shiloh et al., 1999). Het is echter belangrijk om het slachtoffer gerust te stellen en te ondersteunen, aangezien de angstaanvallen zouden kunnen leiden tot zelfmoordpogingen. 4/57

14 Medische toepassingen voor LSD Na de ontdekking van deze psychische effecten, werden door Sandoz onmiddellijk verschillende studies opgezet bij dieren en mensen. Dit leidde tot de ontwikkeling van het geneesmiddel Delysid, dat gebruikt werd bij neurologisch onderzoek en in de psychiatrie (Passie, 1997). Ondanks het feit dat het gebruik van LSD in deze domeinen van de geneeskunde zeer veilig en succesvol bleek, werd er sinds 1970 geen legaal onderzoek meer uitgevoerd naar de effecten van LSD (Passie, 2008). Dit kent zijn oorzaak in de opkomst van LSD als drug sinds de jaren 60, waardoor LSD in de illegaliteit belandde. Een belangrijke trendsetter voor dit recreationele LSD gebruik was Dr. Timothy Leary van de Harvard universiteit (Hofmann, 1980). Vandaag de dag groeit opnieuw de interesse om LSD te gaan gebruiken als medisch hulpmiddel. Een mogelijke toepassing is de behandeling van clusterhoofdpijn (Sewell et al., 2006). De dosissen die men hiervoor zou gebruiken zijn natuurlijk subpsychedelisch. De effectiviteit van LSD is niet onlogisch aangezien bij de huidige behandeling van migraine ergotamine gebruikt wordt (bijvoorbeeld Cafergot ). Naast clusterhoofdpijn zou LSD kunnen aangewend worden bij de psychotherapeutische behandeling van terminale patiënten (Kurland, 1985; Winkelman & Roberts, 2007), bij alcohol- en drugsverslaving (Halpern, 2003b) en bij dwangstoornis (obsessive-compulsive disorder) (Brandrup & Vanggaard, 1977). Vooraleer men LSD hiervoor zal kunnen aanwenden, moet er natuurlijk nog uitvoerig onderzoek plaatsvinden De toxiciteit, afhankelijkheid en tolerantie bij LSD gebruik Intoxicaties zijn mogelijk vanaf een plasmaconcentratie die hoger is dan 1 µg/l (Moffat et al., 2004), wat dan onder meer kan leiden tot echte psychosen. Maar de veranderingen in het bewustzijn, die ook wel altered states of consciousness (ASC) genoemd worden, gaan niet gepaard met levensbedreigende veranderingen in de cardiovasculaire, renale of hepatische functies. Daardoor is LSD nog nooit de directe doodsoorzaak geweest bij een overlijden (Cohen, 1967; Jaffe, 1985). Dat neemt niet weg dat er geen (fatale) ongelukken kunnen gebeuren na inname van LSD. Bijvoorbeeld te lang in de zon staren met als gevolg irreversibele oogschade of uit een raam springen doordat men denkt te kunnen vliegen (Fuller, 1976; Reynolds & Jindrich, 1985). 5/57

15 Aangezien LSD de dopaminerge neurotransmissie in de hersenen niet beïnvloedt, brengt het geen fysieke afhankelijkheid met zich mee. Het is immers dopamine dat het euforisch effect veroorzaakt dat kenmerkend is voor de zeer verslavende drugs zoals bijvoorbeeld opiaten en cocaïne (O Brien, 2001). Doordat het gebruik van LSD een zeer intensieve ervaring is, is het ook weinig waarschijnlijk dat men psychisch verslaafd zal geraken. Als gevolg hiervan treden er geen sterke abstinentieverschijnselen op. Bij herhaaldelijk gebruik van LSD, ontwikkelt zich een snelle tolerantie voor de psychische effecten. Na ongeveer een week van abstinentie is deze echter opnieuw volledig verdwenen (Dierick et al., 2003). De oorzaak voor deze tolerantie is te vinden bij de desensitisatie en downregulatie van de 5-HT 2A receptoren in de hersenen (Leysen et al., 1989) De gebruiksvormen Illegale LSD komt voor onder een aantal vormen, waarvan het blotter papier het meest gekend is (figuur 1.5.). Hierbij dompel je absorberend papier, onderverdeeld in vierkanten, onder in een oplossing van LSD. Het resultaat is dat elk vierkantje een dosis van de drug zal bevatten (meestal µg). FIGUUR 1.5.: BLOTTER PAPIER Er bestaat een heel eenvoudige manier om na te gaan of er LSD aanwezig is op deze blotters. Hierbij maakt men gebruik van de fluorescerende eigenschappen van LSD. Een methanolextract van de blotter wordt op een filtreerpapier gebracht. Onder UV licht (360nm) treedt een blauwe fluorescentie op bij een positief resultaat. (Cole, 2003) (figuur 1.6.). FIGUUR1.6.: FILTREERPAPIER MET METHANOL (LINKS) EN METHANOLEXTRACT VAN BLOTTERPAPIER (RECHTS) ONDER UV LICHT 6/57

16 1.2. DE SCREENING VAN LSD IN URINE Voor de screening van LSD in urine wordt gebruik gemaakt van immunoassays. Dit zijn immunologische bepalingstechnieken die gebaseerd zijn op de interactie tussen een antigen en een antilichaam. Zij hebben als voordeel dat ze snel en relatief goedkoop zijn, maar bezitten niet de kwantitatieve mogelijkheden en de specificiteit van vloeistofchromatografiemassaspectrometrie (LC-MS) (Wu et al., 1997). Er bestaat bovendien een kans op valspositieve resultaten door het optreden van kruisreactiviteit (crossreactiviteit). Hierbij gaat het antilichaam een aspecifieke interactie aan (bijvoorbeeld met clenbuterol in geval van LSD) (Cody & Valtier, 1997) Historiek Tot voor enkele jaren werd voor deze screening de Radioimmunoassay (RIA) gebruikt. Deze wordt beschouwd als de meest gevoelige en specifieke van alle immunoassays. Het principe van deze bepaling is de competitie tussen het antigen (LSD), dat al dan niet aanwezig is in de urine, en zijn radioactief gemerkt equivalent (LSD-I 125 ) voor binding aan een specifiek antilichaam. Na een incubatieperiode wordt de ongebonden fractie weggewassen en de radioactiviteit gemeten met behulp van een scintillatieteller. Het bekomen signaal is omgekeerd evenredig met de hoeveelheid LSD in de urine. Omwille van de negatieve elementen die verbonden zijn aan radioactiviteit (transport, radioactief afval, gevaar bij zwangere vrouwen, ) wordt deze techniek liever niet meer gebruikt. Deze kan vervangen worden door een Enzyme-multiplied immunoassay (EMIT) of door een Cloned enzyme donor immunoassay (CEDIA). Uit onderzoek is gebleken dat CEDIA betere precisie, accuraatheid en minder kruisreactiviteit vertoont dan EMIT (Wiegand et al., 2002). Naast EMIT en CEDIA bestaat er ook de Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Hiervan bestaan er 2 grote types: de sandwich ELISA en de competitieve ELISA. Het is deze laatste techniek die gebruikt wordt als screeningsmethode in het labo Chemiphar. 7/57

17 Competitieve Enzyme linked immunosorbent assay Deze methode is gebaseerd op de competitie tussen LSD (de belangrijkste metaboliet heeft een lage crossreactiviteit) in het staal en het LSD-horseradish peroxidase conjugaat voor een beperkt aantal antilichamen. Hierbij vertrekken we van microtiterkuipjes die bedekt zijn met het geïmmobiliseerd antilichaam. In deze kuipjes wordt achtereenvolgens staal/controle en drug-enzym conjugaat toegevoegd. Dit mengsel wordt gedurende 1 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur. Na deze incubatieperiode worden de kuipjes gewassen om ongebonden componenten te verwijderen. De aanwezigheid van het conjugaat kan vervolgens aangetoond worden door toevoeging van tetramethylbenzidine (TMB), een substraat voor het enzym. Na 30 minuten incuberen wordt de omzettingsreactie stopgezet door toevoeging van zuur. De resulterende kleur kan visueel worden waargenomen. Deze kleurintensiteit is omgekeerd evenredig met de hoeveelheid LSD (of metaboliet) in het staal (zie figuur 1.7.). (A) (B) (C) (D) (E) (F) FIGUUR 1.7.:COMPETITIEVE ELISA (A)MICROTITERKUIPJES BEDEKT MET ANTILICHAMEN (B)TOEVOEGEN STAAL/CONTROLE EN DRUG-ENZYM CONJUGAAT VERVOLGENS INCUBEREN BIJ KAMERTEMPERATUUR (C)WEGWASSEN ONGEBONDEN COMPONENTEN (D)DRUG/DRUG-ENZYMCONJUGAAT GEBONDEN OP ANTILICHAAM (E)TOEVOEGEN TMB SUBSTRAAT EN INCUBEREN (F)ABSORPTIE METEN BIJ 450NM (VISUEEL IS KLEURLOOS POSITIEF EN BLAUW NEGATIEF) ( Elk urinestaal dat hierbij (zwak) positief test op de aanwezigheid van LSD (cut-off bedraagt 5 ng/ml), moet verder geanalyseerd worden door een techniek met een grotere specificiteit en gevoeligheid. 8/57

18 1.3. BEVESTIGINGSTECHNIEKEN Historiek Het grootste probleem bij de analyse van LSD in urine, is de lage concentratie en de beperkte tijdspanne waarin het opspoorbaar is. Om dit te kunnen oplossen zijn er 2 mogelijkheden: enerzijds een metaboliet identificeren die gedurende een langere tijd in een hogere concentratie wordt geëxcreteerd in de urine, anderzijds een analytische methode ontwikkelen die LSD kan detecteren en kwantificeren bij veel lagere concentraties. 2-oxo-3- OH-LSD komt meestal in aanmerking als geschikte metaboliet (Reuschel et al., 1999b; Poch, 1999). De laatste decennia is er op beide vlakken grote vooruitgang geboekt (Reuschel et al., 1999a). De analytische methoden waren tot voor een aantal jaar voornamelijk gebaseerd op gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) (Paul et al., 1990; Nelson & Foltz, 1992). Deze techniek brengt echter een aantal problemen met zich mee aangezien LSD thermolabiel is (bij de GC temperaturen), weinig vluchtig is (zonder derivatisatie) en bovendien irreversibel adsorbeert aan de GC kolom (Van Bocxlaer et al., 2000). Om die redenen maakt men meer en meer gebruik van vloeistofchromatografie-(tandem) massaspectrometrie (LC- MS(/MS)) (Sklerov et al., 2000; Canezin et al., 2001; Johansen & Jensen, 2005; Favretto et al., 2007) Beknopte beschrijving van de werking van een LC-MS/MS Bij deze analysetechniek is een staalvoorbereiding (vloeistof-vloeistof of solid-phase extractie van de urine nodig). Het verkregen extract wordt vervolgens geïnjecteerd op de HPLC-kolom. De chromatografische scheiding is gesteund op de interactie van de componenten met twee verschillende fasen (in dit geval een stationaire en een mobiele). Voor LSD wordt een reversed phase (RP) kolom gebruikt, waardoor de scheiding gebeurt door verschillen in interactie met de apolaire groepen op de kolom. Het gevolg is dat de meest polaire component altijd als eerste zal elueren. Bijgevolg zal 2-oxo-3-OH-LSD een kortere retentietijd hebben dan LSD. 9/57

19 Na elutie van de kolom, worden de componenten naar de massaspectrometer geleid. Hierbij moeten er eerst 2 zaken gebeuren: er moet overgegaan worden van de vloeibare fase naar hoogvacuüm én de componenten moeten geïoniseerd worden. Deze beide doelstellingen worden gerealiseerd door de zogenaamde atmospheric pressure ionisatie (API) technieken. Tot deze technieken behoort onder andere de hier gebruikte electrospray ionisatie (ESI) (figuur1.8.). Bij ESI wordt de vloeibare fase doorheen een metalen capillair gestuurd, waarbij aan de tip een spanning van 3-5 kv wordt aangelegd. Hierdoor wordt de vloeistof aan de tip omgezet tot een aërosol van sterk geladen druppeltjes. Rond het capillair wordt er een vernevelingsgas (meestal N 2 ) aangebracht dat dit proces versterkt, maar dat voornamelijk tot doel heeft de spray te richten naar de massaspectrometer. Vervolgens worden deze druppeltjes verdampt dankzij droge en warme N 2, waardoor de lading op de component terechtkomt. De aldus gevormde ionen treden de massaspectrometer binnen via de cone. Aangezien ESI een zachte ionisatietechniek is, treedt er weinig fragmentatie op en worden er voornamelijk moederionen gevormd. Door het aanleggen van een spanning op de cone, kan men reeds bij de interface een fragmentatie uitvoeren, wat nuttig is om structurele info te verkrijgen. FIGUUR 1.8.: PRINCIPE VAN ELECTROSPRAY IONISATIE ( k/facil/mstut/mstutorial.htm) De gevormde ionen moeten vervolgens gescheiden worden op basis van hun massa/lading verhouding (m/z waarde). Hiervoor bestaan er heel wat massafilters, maar degene die meestal wordt gebruikt in de tandem MS is de triple-quadrupool (figuur 1.9.). FIGUUR 1.9.: BASISOPBOUW VAN EEN TRIPLE-QUADRUPOOL (user s guide Micromass) 10/57

20 Hierbij zijn MS1 en MS2 quadrupolen die bestaan uit een set van 4 parallelle en tegenover elkaar staande metalen staven. Op een dergelijke quadrupool worden 2 elektrische velden aangelegd (1 constant en 1 variërend) waardoor elke m/z waarde zijn bepaalde combinatie heeft om deze massafilter te passeren. Een quadrupool kan in een Single Ion Monitoring (SIM) mode gebruikt worden, waarbij de m/z waarde constant blijft in functie van de tijd; of in een scan mode, waarbij de m/z waarde varieert. Tussen de 2 quadrupolen bevindt zich de collision cel. Hier kan men de ionen laten botsen met atomen van een edelgas (meestal argon). Dit proces noemt men collision-induced dissociation (CID). Het resultaat van dergelijke CID is dat er een tweede fragmentatie van de ionen plaatsgrijpt. Deze triple-quadrupool kan in een aantal vormen gebruikt worden: een dochterion scan (SIM-scan), een moederion scan (scan-sim), een neutral loss scan (scan-scan met een vast verschil) en een multiple reaction monitoring (MRM). Het is in de MRM modus dat er hier zal gewerkt worden. Bij MRM worden de beide quadrupolen gelijktijdig gewijzigd in hun m/z waarde, waardoor er moeder/dochter transities worden bekomen. De uiteindelijke detectie van de ionen gebeurt via een elektronen multiplier (figuur 1.10.). Wanneer de positieve (bij electrospray +) ionen de triple-quadrupool passeren, slaan ze in op een metalen oppervlak waarbij elektronen worden vrijgemaakt. Deze elektronen slaan op hun beurt terug in, waardoor het signaal telkens opnieuw wordt versterkt. Door het signaal te linken aan de spanning die er over de quadrupool staat, kan men het ion identificeren (Van Bocxlaer et al., 2000; Watson et al., 2008; Pitt, 2009). FIGUUR 1.10.: PRINCIPE ELEKTRONEN MULTIPLIER ( 11/57

21 2. OBJECTIEVEN Wanneer men wil achterhalen of een bepaald individu LSD heeft genomen, wordt door het laboratorium Chemiphar een screening uitgevoerd op urine via ELISA. Hierbij bestaat echter de kans op een vals positief of een vals negatief resultaat. Een vals positief resultaat kan men bekomen doordat de ELISA techniek een crossreactiviteit bezit tegenover een aantal componenten die mogelijks in de urine voorkomen, maar die weinig met LSD te maken hebben. Een voorbeeld hiervan is de screening van geputrefieerde lijken, waarbij de ELISA testen een positief resultaat kunnen geven. Een vals negatief resultaat is echter ook mogelijk. De gebruikte ELISA test heeft namelijk wel een crossreactiviteit voor enkele metabolieten van LSD (bijvoorbeeld 36 % voor nor-lsd), maar voor de belangrijkste metaboliet (2-oxo-3- OH-LSD) is deze zeer laag (slechts 2.1 %). Het gevolg hiervan is dat LSD gebruik slechts een beperkte tijd na inname detecteerbaar zal zijn via deze screening. Bovendien is de ELISA screeningstest gevoelig voor een aantal vervalsingen zoals het verdunnen van de urine door gebruik van diuretica, of het toevoegen van adulteranten zoals zouten (natriumchloride, natriumhypochloriet) aan de urine. Als gevolg van deze vervalsingen testen de urinestalen negatief. Beide vervalsingen kan men echter makkelijk opsporen door bijvoorbeeld respectievelijk de creatinine waarde en de osmolariteit van de urine te controleren. Omwille van de onzekerheid die gepaard gaat met een ELISA screening, is het wenselijk dat er een techniek wordt ontwikkeld op basis van LC-MS/MS die een grotere selectiviteit én gevoeligheid bezit. De doelstellingen die worden vooropgesteld zijn de volgende: De nieuwe methode moet in staat zijn om het LSD gebruik te kunnen bevestigen en te kwantificeren na een positieve screening via ELISA op urine. De methode moet een oplossing bieden voor de geputrefieerde lijken, waarbij ELISA testen vaak geen zin hebben. LSD-gebruik moet ook kunnen aangetoond worden wanneer ELISA een vals negatief resultaat geeft. Dit kan door het opsporen van 2-oxo-3-OH-LSD die in een hogere concentratie voorkomt en een langere excretieduur heeft in de urine. 12/57

22 Om tot een dergelijke methode te komen, richten we ons op de 2 belangrijkste componenten: LSD en 2-oxo-3-OH-LSD. Als interne standaard (IS) kiezen we voor LSD-D 3, een gedeutereerde vorm van LSD. Dit heeft als voordeel dat de 2 componenten zich identiek zullen gedragen (extractierendement, chromatografisch gedrag, ) en enkel te onderscheiden zijn op basis van hun massaspectrum. Hierdoor zal de techniek toelaten LSD niet alleen te identificeren, maar ook te kwantificeren. Aangezien 2-oxo-3-OH-LSD verschilt in polariteit t.o.v. LSD, zal het een ander extractierendement en retentietijd bezitten. Daardoor zal LSD-D 3 vermoedelijk geen geschikte IS zijn voor kwantificatie van 2-oxo-3-OH-LSD. We stellen ons echter tot doel om een zo hoog mogelijk extractierendement te verkrijgen voor LSD. Doordat 2-oxo-3-OH-LSD in veel hogere concentratie aanwezig is in de urine, zal het vermoedelijk toch mogelijk zijn om deze component simultaan te identificeren, ondanks een minder gunstig extractierendement. Bij dergelijke methodeontwikkeling zullen de volgende stappen doorlopen worden: Infuseren van LSD, LSD-D 3 en 2-oxo-3-OH-LSD in de massaspectrometer om de transities te selecteren en de instellingen (cone-voltage en collision-energie) te optimaliseren. Ontwikkeling van een hogedrukvloeistofchromatografie (keuze van de kolom, mobiele fase, gradiënt ) voor de scheiding van LSD en 2-oxo-3-OH-LSD. Keuze van de optimale ionsuppressie. Bepaling van het extractierendement bij gebruik van verschillende extractievloeistoffen. Validatie van de ontwikkelde methode: lineariteit, selectiviteit, herhaalbaarheid, accuraatheid, detectielimiet, kwantificatielimiet, meetonzekerheid. Testen van de bruikbaarheid voor de bepaling van LSD en 2-oxo-3-OH-LSD in urine aan de hand van monsters die vooraf via ELISA gescreend werden. 13/57

23 3. REAGENTIA EN MATERIALEN 3.1. STANDAARDEN EN REAGENTIA LSD-stockoplossing 25 µg/ml (Cerilliant, Round Rock, TX, VS) lotnummer D LSD-D 3 25 µg/ml (Cerilliant, Round Rock, TX, VS) lotnummer FC oxo-3-OH-LSD-stockoplossing 100 µg/ml (Cerilliant, Round Rock, TX, VS) lotnummer FN Ammoniumhydroxideoplossing 25 % p.a. (VWR International, Leuven, België) lotnummer 05E n-hexaan p.a. (Scharlau Chemie S.A., Sentmenat, Barcelona, Spanje) lotnummer Ethylacetaat p.a. (Merck, Darmstadt, Duitsland) lotnummer I Chloroform p.a. (Scharlau Chemie S.A., Sentmenat, Barcelona, Spanje) lotnummer Isopropanol p.a. (Scharlau Chemie S.A., Sentmenat, Barcelona, Spanje) lotnummer Ultrapure H 2 O geproduceerd door Arium 611 UV (Sartorius, Leuven, België) Methanol p.a. (Scharlau Chemie S.A., Sentmenat, Barcelona, Spanje) lotnummer Ammoniumformiaat (Sigma-Aldrich, St-Louis, VS) lotnummer Acetonitrile p.a. (Scharlau Chemie S.A., Sentmenat, Barcelona, Spanje) lotnummer Mierenzuur % (Merck, Darmstadt, Duitsland) lotnummer F1 Werkstandaarden (1 µg/ml) van LSD, LSD-d3 en 2-oxo-3-OH-LSD werden bereid door verdunnen van de respectievelijke stockoplossingen met acetonitrile. De stockoplossingen worden bewaard bij -20 C en afgeschermd van licht ANALYTISCHE KOLOMMEN EN APPARATUUR XTerra RP18 (100 x 2,1 mm, 3,5 µm) (Waters, Milford, Massachusetts, VS) XTerra MS C18 (100 x 2,1 mm, 3,5 µm) (Waters, Milford, Massachusetts, VS) XTerra MS C18 (10 x 2,1 mm, 3,5 µm) (Waters, Milford, Ierland) (prekolom) Centrifuge (Jouan type B4i, St-Herblain, Frankrijk) Turbo Vap LV Evaporator (Zymark, Hopkinton, Massachusetts, VS) Vortexmixer: Top-mix (Fisher Bioblock Scientific, Doornik, België) HPLC Waters 2695 Separations Module (Waters, Milford, Massachusetts, VS) Massaspectrometer Micromass Quattro (Waters, Milford, Massachusetts, VS) Stikstofgenerator NM30L (Peak scientific, Billerica, Massachusetts, VS) Softwarepakket bij LC-MSMS: MassLynx v /57

24 4. METHODEONTWIKKELING EN VALIDATIE 4.1. LC-MS/MS TOESTEL Algemene instellingen De temperatuur in de autosampler bedraagt 20 C (± 2 C). De stalen worden hier op hun juiste positie ingebracht, waarna er 40 µl wordt geïnjecteerd op de HPLC-kolom. De kolomoven wordt ingesteld op 35 C (± 5 C) en de flow van de mobiele fase bedraagt 0,2 ml/min. Na scheiding op de kolom wordt het eluaat naar de MS geleid, waar de spanning aan de tip van het capillair +3,5 kv bedraagt (electrospray positief). De temperatuur in de bron en bij verdamping wordt ingesteld op respectievelijk 120 en 350 C. De flow van N 2 gas naar de cone en voor de verdamping bedraagt respectievelijk 50 en 500 liter per uur Kiezen van transities LSD, LSD-D 3 en 2-oxo-3-OH-LSD Werkwijze Van de werkstandaarden (1 µg/ml) wordt een 1 op 10 verdunning gemaakt door 100 µl te mengen met 450 µl acetonitrile en 450 µl ultrapuur water. Deze verdunningen worden vervolgens afzonderlijk rechtstreeks geïnfuseerd in de MS. Dankzij de ESI ontstaan er positief geladen moederionen. In eerste instantie werken we enkel op basis van de eerste quadrupool zonder collision gas. Dit stelt ons in staat om de exacte m/z waarde van het moederion te bepalen en de cone-voltage te optimaliseren. Wanneer er een te hoog voltage wordt aangelegd, wordt het moederion sterk gefragmenteerd. Bij een te laag voltage zal het moederion onvoldoende worden binnengetrokken in de massaspectrometer. Eens de m/z waarden en de cone-voltages voor de moederionen bepaald zijn, leggen we het collision gas aan. Hierdoor ontstaat er een CID, wat ons in staat stelt om een scan van de dochterionen te analyseren. Wanneer we de componenten willen identificeren en kwantificeren hebben we nood aan 2 transities. Hierbij moeten we niet enkel oog hebben voor de abundantie van de dochterionen, maar ook opletten dat we geen dochterionen kiezen die voorkomen bij de verschillende componenten. Voor 2-oxo-3-OH-LSD zou dit geen probleem geven, maar wel voor LSD en LSD-D 3 aangezien ze op hetzelfde tijdstip elueren. Eenmaal de exacte m/z waarden van de dochterionen gekend zijn, is het de bedoeling om voor elk ion de collision energie te optimaliseren. Dit heeft tot doel de abundantie van het dochterion tot haar maximum te brengen, wat resulteert in een optimale gevoeligheid. 15/57

25 Resultaten Onderstaande figuur geeft de scans weer van de dochterionen van respectievelijk LSD- D 3, LSD en 2-oxo-3-OH-LSD. Hieruit blijkt dat het ion met m/z waarde 281 geen goede keuze zou zijn (ondanks de hoge abundantie), aangezien het zowel voorkomt bij LSD als LSD- D 3 (figuur 4.1.). FIGUUR 4.1.: SCANS VAN DOCHTERIONEN VAN LSD-D 3, LSD EN 2-OXO-3-OH- LSD. DE MOEDERIONEN ZIJN BLAUW OMCIRKELD EN DE GEBRUIKTE DOCHTERIONEN ROOD. De transities die werden gekozen, worden samen met de cone-voltages en collision energie weergegeven in onderstaande tabel (tabel 4.1.). Deze transities zullen niet meer gewijzigd worden. Wat wel nog moet ingesteld worden, is het tijdsinterval waarbij de MS de transities moet opvolgen. Dit kunnen we slechts bepalen wanneer we de retentietijden kennen van de componenten. Deze hangen af van de HPLC-kolom, de mobiele fase en de gradiënt. 16/57

26 TABEL 4.1.: OVERZICHT TRANSITIES EN BIJHORENDE INSTELLINGEN Component LSD (M r : 323g/mol) m/z waarde en conevoltage van het moederion m/z waarde en collision energie van het dochterion [fragment] (27V) (20eV) a [MH-C 4 H 11 NCO] (17eV) b [MH-C 4 H 11 N] + LSD- D 3 (M r : 326g/mol) 2-oxo-3-OH-LSD (M r : 355g/mol) a ion gebruikt voor kwantificatie b ion nodig voor identificatie (27V) (22eV) a [MH-C 4 H 11 NCO] (17eV) b [MH-C 4 H 11 N] (25V) (20eV) a [MH-H 2 O-C 4 H 11 NCO] (18eV) b methode1 [MH-RNCH 2 ] (10eV) b methode2 [MH-H 2 O] Keuze van de kolom, mobiele fase en gradiënt Eerste chromatografische methode Als HPLC-kolom wordt gebruik gemaakt van de XTerra RP18 (100 x 2,1 mm, 3,5 µm). Bij deze kolom is de silica chemisch gemodificeerd door binding met C 18 ketens, waardoor de stationaire fase apolair wordt (omgekeerde fase of reversed phase ). Bij de keuze hebben we ons laten leiden door de literatuur, maar ook door de voordelen die verbonden zijn aan RP chromatografie. Eén van deze voordelen is dat alle actieve plaatsen gelijk zijn in adsorptiesterkte, wat resulteert in een betere pieksymmetrie en resolutie. Bovendien heeft LSD een log P waarde van 2.9, wat betekent dat het veeleer een apolaire molecule is. Hierdoor zal LSD meer affiniteit vertonen voor een RP-kolom dan voor een normal phase -kolom. Dit heeft tot gevolg dat een RP-kolom beter in staat is om LSD te scheiden van andere apolaire componenten. Aangezien de stationaire fase apolair is, moet de mobiele fase polair zijn. Voor deze mobiele fase hebben we ons gebaseerd op de literatuur (Favretto et al., 2007). Oplossing A bestaat uit een mengsel van 1,0 ml mierenzuur en 0,1261 g ammoniumformiaat, opgelost in 999 ml ultrapuur water (ph 3). Als oplossing B gebruiken we een mengsel van 1,0 ml mierenzuur en 0,1261 g ammoniumformiaat, opgelost in 999 ml methanol. Het verschil met de literatuur is dat we methanol gebruiken in plaats van acetonitrile. Dit doen we omwille van de hoge kostprijs van acetonitrile. Oplossing B heeft hierbij de grootste eluotrope sterkte. Wanneer we deze niet zouden gebruiken, bestaat het gevaar voor irreversibele adsorptie van 17/57

27 sterk apolaire substanties. Mierenzuur en ammoniumformiaat worden toegevoegd om de ph van de mobiele fase op de gewenste waarde (ph 3) in te stellen, zodanig dat de 3 componenten (LSD, LSD-D 3 en 2-oxo-3-OH-LSD) reeds in de geprotoneerde vorm voorkomen. Bovendien begunstigt mierenzuur eveneens de werking van de ESI (electrospray positief). Na het kiezen van de kolom en de mobiele fase, worden een hele reeks van gradiënten uitgetest. De doelstelling is het vinden van de gradiënt die de beste scheiding geeft tussen LSD en 2-oxo-3-OH-LSD. Hiervoor wordt in een vial 250 µl van de LSD, LSD-D 3 en 2-oxo- 3-OH-LSD werkstandaarden (1 µg/ml) onder N 2 drooggedampt en na toevoegen van 1,0 ml mobiele fase (beginsamenstelling van de gradiënt) grondig gemengd met een vortexmixer. De chromatogrammen die de beste scheiding vertonen, worden weergegeven in onderstaande figuur (figuur 4.2.). De bijhorende gradiënt is weergegeven in tabel 4.2. FIGUUR 4.2.: CHROMATOGRAMMEN BEKOMEN VIA METHODE 1 VOOR DE VERSCHILLENDE TRANSITIES VAN LSD, LSD-D 3 EN 2-OXO-3-OH-LSD ( IDENTIFICATIE 2-OXO-3-OH-LSD VIA 356,10 > 313,10 ) 18/57

28 TABEL 4.2.: DE GEBRUIKTE GRADIËNT BIJ METHODE 1 interval % oplossing % oplossing (min) A B curve constant constant constant Onder deze voorwaarden bedragen de retentietijden van 2-oxo-3-OH-LSD, LSD en LSD-D 3 respectievelijk 1,87; 2,84 en 2,84 minuten. De analyseduur van 1 run bedraagt 15 minuten. Met behulp van deze retentietijden en transities, kunnen we de MS optimaliseren. Het werken met twee windows, waarbij de MS van 0,5 tot 2,22 minuten enkel de transities registreert van 2-oxo-3-OH-LSD en van 2,22 tot 5 minuten de transities van LSD en LSD-D 3, werd uitgetest. Deze techniek heeft tot voordeel dat de dwell voor elke transitie nu groter is, wat de gevoeligheid ten goede komt. We stelden echter vast dat dergelijke methode niet bruikbaar was op geëxtraheerde urinestalen, doordat de retentietijden dichter bij elkaar kwamen te liggen. Daarom stellen we de MS in om van 0,5 tot 5 minuten alle transities op te volgen met een dwell van 0,3 seconden per transitie Tweede chromatografische methode Bij de tweede methode wordt opnieuw gebruik gemaakt van een RP-kolom, meer bepaald een XTerra MS C18 (100 x 2,1 mm, 3,5 µm). Vóór deze kolom wordt een XTerra MS C18 (10 x 2,1 mm, 3,5µm) prekolom geplaatst. Deze prekolom heeft exact dezelfde samenstelling als de HPLC-kolom, maar heeft tot doel storende bestanddelen te weerhouden die de analytische kolom zouden kunnen verontreinigen. Op deze manier kan men de levensduur van de HPLC-kolom vergroten. Als mobiele fase maken we gebruik van een mengsel van oplossing A (0,15 % mierenzuur in ultrapuur water) en oplossing B (0,15 % mierenzuur in acetonitrile). In vergelijking met de eerste methode is methanol vervangen door acetonitrile. Dit heeft twee grote voordelen: de HPLC-kolom heeft een kortere conditioneringstijd nodig voor acetonitrile in vergelijking met methanol én acetonitrile is bovendien minder vervuilend voor de MS. 19/57

29 Nadat de kolom en mobiele fase gekozen zijn, gaan we opnieuw op zoek naar de gradiënt die de beste scheiding garandeert. Dit doen we op dezelfde manier als beschreven bij methode 1 (zie boven). De beste scheiding wordt bekomen door middel van onderstaande gradiënt (tabel 4.3.). Het chromatogram dat via deze gradiënt wordt verkregen, wordt weergegeven in onderstaande figuur (figuur 4.3.). TABEL 4.3.: DE GEBRUIKTE GRADIËNT BIJ METHODE 2 interval (min) % oplossing A % oplossing B curve constant lineair constant lineair constant lineair constant FIGUUR 4.3.: CHROMATOGRAMMEN BEKOMEN VIA METHODE 2 VOOR DE VERSCHILLENDE TRANSITIES VAN LSD, LSD-D 3 EN 2-OXO-3-OH-LSD ( IDENTIFICATIE 2-OXO-3-OH-LSD VIA 356,10 > 338,10 ) 20/57

30 De retentietijden bij deze methode bedragen voor 2-oxo-3-OH-LSD, LSD en LSD-D 3 respectievelijk 9,40; 10,91 en 10,91 minuten. Doordat 1 run 30 minuten duurt, maken we gebruik van een divert valve. Hiermee zullen we enkel de componenten die elueren tussen 8 en 13 minuten naar de MS leiden. Het overige deel wordt rechtstreeks afgevoerd naar de waste. Dit heeft tot voordeel dat de MS niet onnodig wordt vervuild. Zoals te zien is op de chromatogrammen, maken we hier gebruik van 2 windows. Tussen de 8 en 10,2 minuten laten we de MS enkel de 2 transities van 2-oxo-3-OH-LSD opvolgen. De 4 transities van LSD en LSD-D 3 worden enkel onderzocht tussen 10,2 en 13 minuten. Op die manier kunnen we de dwell vergroten tot 0,5 seconden per transitie. 21/57

31 4.2. VALIDATIE VAN EERSTE CHROMATOGRAFISCHE METHODE Lineariteit Werkwijze Voor de controle van de lineariteit van LSD en 2-oxo-3-OH-LSD werden de standaardcurven telkens in duplo opgesteld met als eindconcentraties 0, 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150 en 200 ng/ml. Hiervoor maken we gebruik van de werkstandaarden en een 1 op 10 verdunning in acetonitrile. De gewenste hoeveelheden worden toegevoegd aan een vial met behulp van een Hamilton spuit. De IS (LSD-D 3 ) wordt aan elke vial in een concentratie van 50 ng/ml toegevoegd. Na droogdampen onder N 2 wordt 200 µl mobiele fase toegevoegd (60 % oplossing A en 40 % oplossing B ) en wordt gedurende 1 minuut gevortext. Eens het LC- MS/MS toestel geconditioneerd is, worden deze stalen geanalyseerd Resultaten Figuur 4.4 geeft de grafiek weer waarbij de gemiddelde relatieve respons van LSD en 2-oxo-3-OH-LSD is uitgezet ten opzichte van de concentratie. Als relatieve respons nemen we de verhouding van de area van LSD of 2-oxo-3-OH-LSD ten opzichte van de area van LSD-D 3, waarna we vervolgens vermenigvuldigen met factor vijftig. Op deze manier wordt gecorrigeerd voor de mogelijke variatie op het injectievolume. 300, ,000 LSD 2-oxo-3-OH-LSD y = 1,272x - 2,3382 R 2 = 0,9995 relatieve respons 200, , ,000 50,000 y = 0,3285x + 0,4237 R 2 = 0,9995 0, concentratie (ng/ml in vial) FIGUUR 4.4.: RELATIEVE STANDAARDCURVEN LSD EN 2-OXO-3-OH-LSD IN MOBIELE FASE 22/57

32 De best passende rechte wordt gevonden via gewogen lineaire regressie. Deze is gebaseerd op de methode van de kleinste kwadraten, rekening houdend met de concentratie. Naarmate de concentratie groter wordt, neemt de standaarddeviatie op het meetresultaat toe. Wanneer we hiervoor niet zouden corrigeren, dan zou de afwijking op een hoge concentratie zwaarder doorwegen dan die op een lage concentratie (Klaessens, 2008). De regressielijnen die aldus bekomen worden, hebben een determinatiecoëfficiënt van telkens 0,9995 ( 0,995). Aangezien de residuele waarden een normale verdeling hebben rond nul, kan men besluiten dat er een lineair verband bestaat Uittesten verschillende extracties De uitgevoerde extractieprocedures Breng in een polyethyleentereftalaat (pet) tube 2,0 ml blanco-urine. Voeg hieraan IS en eventueel LSD / 2-oxo-3-OH-LSD toe, gevolgd door 1,0 ml 1M ammoniumhydroxide. Op deze manier alkaliniseren we de urine, waardoor de ons interesserende componenten als ongeladen moleculen voorkomen. Vervolgens worden er 3 verschillende vloeistof/vloeistof extractiemethoden uitgetest. We voegen daarvoor 6 ml chloroform/isopropanol in een verhouding 80/20 (Favretto et al., 2007) óf 6 ml hexaan/ethylacetaat in een verhouding 70/30 toe. Hierna wordt er gedurende 1 minuut gemengd met een vortexmixer en centrifugeren we de tubes 5 minuten bij 700 g. De organische fase wordt vervolgens met een pasteurpipet overgebracht in een glazen proefbuis, die we via de evaporator droogdampen. Aan deze drooggedampte proefbuizen wordt 200µl mobiele fase toegevoegd (60 % oplossing A en 40 % oplossing B ), waarna er gemengd wordt met een vortexmixer. De vloeistof wordt vervolgens overgebracht in een vial met insert. Als derde extractiemethode wordt een combinatie uitgetest van hierboven vermelde extractievloeistoffen. De urine wordt eerst geëxtraheerd door middel van 6 ml hexaan/ ethylacetaat en vervolgens met 6 ml chloroform/isopropanol. Na extractie worden de twee organische solventen drooggedampt in dezelfde proefbuis. Het verdere verloop is identiek als hierboven beschreven. We passen deze combinatie toe, aangezien (rekening houdend met het verschil in polariteit tussen LSD en 2-oxo-3-OH-LSD) verwacht wordt dat hexaan/ ethylacetaat een hoger rendement zal halen voor LSD en chloroform/isopropanol voor 2-oxo- 3-OH-LSD (Favretto et al., 2007). Op deze manier zouden we het rendement van beide componenten vergroten, maar een nadeel is dat ook de matrixeffecten kunnen toenemen 23/57

33 Werkwijze Het is de bedoeling na te gaan welke extractieprocedure het beste resultaat (extractierendement en matrixeffecten) oplevert. Daarom voeren we het hierna beschreven experiment in duplo uit. Aan 2,0 ml blanco-urine wordt 10 µl van de LSD-D 3, LSD en 2-oxo- 3-OH-LSD werkstandaarden (1 µg/ml) toegevoegd, waarna de urine geëxtraheerd wordt. Voor elk van de 3 extractiemethoden doen we dit 6 keer. Hiernaast maken we ook 6 stalen aan, waarbij we rechtstreeks de 10 µl van elke werkstandaard aan een vial toevoegen, droogdampen en oplossen in 200µl mobiele fase. Deze laatste stalen gelden als referentie voor wat overeenkomt met 100% extractierendement, zonder matrixeffecten. Na analyse van deze stalen, berekenen we voor elke methode het gemiddelde en de variatiecoëfficiënt op de absolute respons van de drie componenten. De bekomen waarden worden vervolgens vergeleken met deze van de referentiestalen. We moeten hier gebruik maken van de absolute respons, zodanig dat we de componenten rechtstreeks met elkaar kunnen vergelijken Resultaten Onderstaande tabel 4.4 geeft de bekomen resultaten weer van de twee experimenten. Wanneer we kijken naar de variatiecoëfficiënt op de absolute respons, wordt het nog maar eens onderstreept hoe belangrijk het is om gebruik te maken van een IS. Deze gedraagt zich immers gelijkaardig als LSD, waardoor de relatieve respons een veel kleinere variatiecoëfficiënt bezit. TABEL 4.4: ABSOLUTE RESPONS BIJ REFERENTIE EN VERSCHILLENDE EXTRACTIES LSD-D 3 (1) n referentie hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol combinatie , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,9 gemiddelde , , , ,0 RSD 7,3% 13,2% 21,3% 29,3% 24/57

34 LSD-D 3 (2) n referentie hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol combinatie , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,2 gemiddelde , , , ,2 RSD 5,4% 14,2% 22,3% 34,5% LSD (1) n referentie hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol combinatie , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,1 gemiddelde , , , ,9 RSD 18,6% 11,2% 20,0% 29,1% LSD (2) n referentie hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol combinatie , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,7 gemiddelde , , , ,1 RSD 4,5% 13,3% 19,3% 34,1% 2-oxo-3-OH-LSD (1) n referentie hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol combinatie ,6 181,2 4883,7 5969, ,1 147,7 9005,4 3412, ,4 45,7 6076,6 3198, ,6 87,5 7673,0 5405, ,0 104,7 5798,3 7222, ,4 172,5 6876,4 5677,5 gemiddelde ,7 123,2 6718,9 5147,6 RSD 5,4% 43,0% 21,9% 30,3% 2-oxo-3-OH-LSD (2) n Referentie hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol combinatie ,6 32,6 1388,9 1068, ,4 41,2 1608,5 574, ,6 45,4 2325,2 790, ,4 32,6 1228,0 1113, ,8 44,9 1675,6 2721, ,2 75,4 1760,9 687,6 gemiddelde 31267,7 45,4 1664,5 1159,1 RSD 4,2% 34,8% 22,7% 68,5% 25/57

35 Wanneer we bij elke extractiemethode voor de drie componenten de verhouding berekenen van de gemiddelde absolute respons ten opzichte van die bij de referentie, levert ons dat de resultaten op die worden weergegeven in tabel 4.5. TABEL 4.5.: PROCENTUELE VERHOUDING VAN DE GEMIDDELDE ABSOLUTE RESPONS EXTRACTIE TEN OPZICHTE VAN REFERENTIE hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol combinatie LSD-D 3 37,9% 32,4% 7,6% 10,9% 13,9% 13,9% LSD 38,7% 33,5% 7,9% 11,3% 14,3% 14,7% 2-oxo-3-OH-LSD 0,1% 0,1% 5,8% 5,3% 4,4% 3,7% Met dergelijke lage percentages kunnen we niet verder werken, aangezien de gevoeligheid van de methode niet groot zal zijn. De oorzaak van dit probleem ligt ofwel bij een laag extractierendement ofwel bij een grote ionsuppressie. Uit de bovenstaande resultaten, kunnen we enkel afleiden dat hexaan/ethylacetaat inderdaad het beste resultaat oplevert voor LSD en chloroform/isopropanol voor 2-oxo-3-OH- LSD. De combinatie van beide extracties geeft echter niet het verwachte resultaat, waarschijnlijk doordat de invloed van de ionsuppressie groter is dan de som van de extractierendementen Nagaan van de ionsuppressie bij de verschillende extracties Werkwijze Het is nu de bedoeling na te gaan of de oorzaak van de ongunstige resultaten moet gezocht worden bij de ionsuppressie. Breng, voor het opmaken van 4 standaardreeksen, respectievelijk 0, 2, 4, 10, 20, 40 µl van de 1 op 10 verdunning van de LSD en 2-oxo-3-OH- LSD werkstandaarden (= 0; 0,2; 0,4; 1,0; 2,0 en 4,0 ng) over in een vial. Voeg aan elke vial 4 µl toe van een 1 op 10 verdunning van de LSD-D 3 werkstandaard (= 0,4 ng). Verdamp het oplosmiddel met de evaporator. Op deze manier bekomen we 4 standaardreeksen van telkens 6 vials. Tegelijkertijd extraheren we voor elk van de drie extractiemethoden acht keer 2,0 ml blanco-urine. Aan elke drooggedampte proefbuis wordt zoals gewoonlijk 200 µl mobiele fase 26/57