Samenvatting In-lijn koppeling van monstervoorbewerking met chromatografie of massaspectrometrie voor hoge-doorvoer analyse van biologische monsters

Transcriptie

1 Samenvatting In-lijn koppeling van monstervoorbewerking met chromatografie of massaspectrometrie voor hoge-doorvoer analyse van biologische monsters Bioanalyse van geneesmiddelen, drugs en andere, gerelateerde verbindingen is een specialisatie die zich richt op complexe monsters. De meest geanalyseerde monsters zijn urine en bloed, plasma of serum. Via de urine worden veel (afval)stoffen uitgescheiden, al dan niet in gemetaboliseerde vorm. Bloed transporteert naast geneesmiddelen veel essentiële bouwstoffen en bioregulatoren door het gehele lichaam, en bevat daardoor veel exogene en endogene verbindingen. Het belang van bioanalyse komt tot uiting in vele toepassingsgebieden van het farmaceutisch onderzoek. Nieuwe geneesmiddelen worden in diverse ontwikkelingsfasen onderworpen aan diverse testen. In de preklinische fase worden monsters van dierlijke oorsprong geanalyseerd, terwijl in de klinische fase met name monsters van humane vrijwilligers en patiënten worden gemeten. In deze fase worden het potentiële geneesmiddel en diens metabolieten bepaald, en worden in combinatie met farmacokinetiek en -dynamiek de therapeutische en toxische concentraties bepaald. De gewenste formulering van het potentiële geneesmiddel, welke voor een belangrijk deel ook steunt op de bioanalyse, dient eveneens bestudeerd te worden. Als het geneesmiddel op de markt komt is therapeutic drug monitoring van belang. Door de toegenomen kennis van de werking van geneesmiddelen worden potentere stoffen ontwikkeld, waardoor de dosering steeds lager kan worden. Hierdoor wordt ook de concentratie van het geneesmiddel en/of diens metabolieten steeds lager. Bovendien moet de ontwikkeling van een geneesmiddel zo weinig mogelijk tijd kosten. Andere applicaties van bioanalyse waarbij veel monsters moeten worden geanalyseerd zijn o.a. de controle van voeding op residuen van geneesmiddelen en gevaarlijke stoffen, testen op drugsmisbruik en de klinische en forensische toxicologie. Kortom, het aantal complexe biologische monsters neemt toe, terwijl de te bepalen concentraties van de componenten afnemen. Hierdoor is een grote vraag ontstaan naar gevoelige en selectieve systemen met een hoge monsterdoorvoer. Gebruikelijke systemen in de bioanalyse bestaan uit een monstervoorbewerking, een scheidingsstap en uiteindelijk de detectie, waarbij kwantificering en zonodig identificatie plaatsvindt. 205

2 Diverse monstervoorbewerkingstechnieken zijn ontwikkeld voor de bioanalyse. De meest klassieke vorm is vloeistof-vloeistof extractie (LLE). Tegenwoordig wordt vaker vaste-fase extractie (SPE) gebruikt. Deze techniek kan worden gebruikt voor algemene screening op geneesmiddelen, maar ook voor de selectieve extractie van een component of een groep verbindingen. Ondanks de ontwikkeling van nieuwe technieken bleef monstervoorbewerking vaak een zwakke schakel in een bioanalytisch systeem. Daarom is veel werk verricht om de mogelijkheden en beperkingen van deze methoden, ook ten aanzien van automatisering en/of miniaturisering, in kaart te brengen. Parallel aan de ontwikkeling van betere monstervoorbereidingstechnieken liep de ontwikkeling van selectieve detectiesystemen. Met name massaspectrometrie (MS) levert veel selectiviteit en gevoeligheid met mogelijkheden tot identificatie en kwantificering van de analiet. De ontwikkeling van interfaces die bij atmosferische druk werken, hebben gezorgd voor grote interesse in vloeistofchromatografie (LC)-MS, en dit is momenteel de belangrijkste, routinematig toegepaste techniek in de bioanalyse. Door de toename in selectiviteit in de detectie werd het mogelijk om in voorkomende gevallen de selectiviteit in de scheidingsstap te verminderen. Dit had tot gevolg dat snelle scheidings- en detectiesystemen ontstonden, waardoor de monstervoorbewerking wederom snelheidsbepalend werd. Daarom moet deze stap verder versneld, geminiaturiseerd en/of geautomatiseerd worden. Er zijn diverse mogelijkheden om tot miniaturisering te komen. SPE kan worden verkleind door minder stationaire fase te gebruiken. Hierdoor worden alle te gebruiken volumina kleiner en kan SPE sneller worden uitgevoerd. De integratie van SPE met LC is al langer succesvol gerealiseerd, aangezien het eluaat relatief eenvoudig rechtsreeks in het LC systeem kan worden geïnjecteerd (zelfs zonder miniaturisering van SPE). Het kleinere elutie-volume (tot 100 µl) maakt het ook mogelijk SPE te integreren met gaschromatografie (GC), met dien verstande dat de SPE fase goed gedroogd moet worden voor de elutie en een geschikte injector moet worden gebruikt, die groot-volume injectie (LVI) in GC mogelijk maakt. In dit onderzoek is gebruikt gemaakt van de geprogrammeerde-temperatuur verdamper (PTV). Deze injector maakt het mogelijk om naast vloeistofdesorptie ook thermische desorptie toe te passen. Voor dit laatste moet wel een geschikte stationaire fase worden gevonden met goede extractie eigenschappen en thermostabiliteit. Een andere interessante vorm van geminiaturiseerde extractie is vaste-fase microextractie (SPME). De extractie is gebaseerd op een diffusieproces van de analiet uit het monster naar een gecoate fiber. Oorspronkelijk is SPME ontwikkeld om te worden gecombineerd met thermische desorptie en GC, maar de mogelijkheden voor combinatie met vloeistof-desorptie en LC hebben inmiddels ook veel aandacht gekregen. De grootste beperkingen van SPME zijn de lage opbrengst en lange extractietijd. 206

3 De diffusie beperkt de monsterdoorvoer, doordat het lang duurt voordat evenwicht is bereikt tussen analiet in het monster en de fiber. Bovendien is de statische desorptie bij SPME-LC, evenals de sorptie, een evenwichtsproces, waardoor de kans op carry-over bestaat. Voor de ontwikkeling van snelle, selectieve en gevoelige systemen die gebaseerd zijn op on-line monstervoorbewerking en analyse zijn de mogelijkheden en beperkingen van SPE-GC en de directe koppeling van SPE en SPME met MS onderzocht. In Hoofdstuk 1 staan de uitgangspunten en doelen van het verrichte onderzoek beschreven. Hoofdstuk 2 geeft een overzicht van nieuwe trends in integratie van monstervoorbewerking en een scheidings- en/of detectiesysteem. De mogelijkheden en beperkingen van de diverse systemen worden besproken en vergeleken. Hoofdstuk 3 bevat het eerste deel van het onderzoek, namelijk de integratie van (geminiaturiseerde) SPE met GC. Sectie 3.1 toont de resultaten van de evaluatie van de PTV voor LVI/GC van extracten van biologische monsters. De zuiverheid van het oplosmiddel en de linerpakking (maximum injectie-volume en inertheid) zijn bestudeerd. Daarnaast blijkt de selectiviteit van de detectie (MS) kritisch. Na indampen en reconstitutie kan het volledige extract (100 µl) worden geïnjecteerd. Een detectielimiet van 0.25 ng/ml is behaald voor lidocaine, fenobarbital, secobarbital en diazepam in plasma. In Sectie 3.2 zijn SPE-pipetpunten (SPEPTs) toegepast, waardoor een kleiner desorptievolume kan worden gebruikt. Een uitwendig koppelstukje maakt on-line desorptie mogelijk. Een verdergaande integratie van SPEPTs en GC (Sectie 3.3) is mogelijk door inkorten van de SPEPT en de liner. Hierdoor is een in-lijn koppeling gecreëerd. Off-line extractie van 200 µl plasma kan zo gecombineerd worden met in-lijn desorptie door injectie van desorptievloeistof op de SPE disk in de injector. De detectielimieten zijn 0.75 en 2.5 ng/ml voor respectievelijk lidocaine en diazepam in plasma. Het gebruik van SPE met thermische desorptie (SPETD) staat beschreven in Sectie 3.4. Alhoewel de ideale stationaire fase nog niet is gevonden, blijkt Tenax voldoende thermostabiel te zijn en kunnen eveneens goede extractieopbrengsten worden verkregen (recoveries voor lidocaine en diazepam respectievelijk 73 en 74%). Slechts 5 mg Tenax is in een liner gedaan waarin ook de (off-line) extractie is uitgevoerd. Na drogen is de liner in de injector gezet en is thermische desorptie toegepast. Door de kleine hoeveelheid stationaire fase is de totale extractietijd slechts 8 min., inclusief 5 min. drogen. Hoewel slechts 50 µl urine is gebruikt, is een bepalingslimiet (relatieve standaard deviatie (RSD) <15%) behaald van 1.0 ng/ml voor beide componenten. De in dit hoofdstuk beschreven systemen zijn een belangrijke 207

4 stap in de richting van nieuwe integratie- en automatiseringsmogelijkheden voor SPE GC. Hoofdstuk 4 beschrijft het tweede experimentele gedeelte van het project, te weten SPE-MS. Clenbuterol is bepaald in urine (Sectie 4.1) door extractie over een polymeerfase en detectie met een ion-trap MS in de MS 3 modus. Schone chromatogrammen zijn verkregen, maar er is wel sprake van ionsuppressie. De bepalingslimiet is ongeveer 1.0 ng/ml bij gebruik van 1 ml urine. Er is een goed lineair verband gevonden over een groot concentratiebereik ( ng/ml). De ionsuppressie-effecten zoals die werden waargenomen bij de bepaling van clenbuterol zijn verder onderzocht (Sectie 4.2). Met behulp van continu post-cartridge infusie van de analiet is ook een concentratie-afhankelijkheid van de suppressie-effecten aangetoond. Verder zijn de twee stationaire fasen (polydivinylbenzeen [PDVB] en molekulair geïmprinte polymeren [MIP]) vergeleken. Bij de PDVB fase is de ionsuppressie door de urinematrix veroorzaakt, terwijl bij de MIPs de bleeding van het imprintmolekuul (broombuterol) tot sterke suppressie van het clenbuterol-signaal leidt. In Sectie 4.3 staat een SPE-MS 2 -methode beschreven voor de bepaling van prednisolon in serum. Ongunstige fragmentatiepatronen en matrixinterferentie zorgen voor een detectielimiet van ca. 10 ng/ml bij gebruik van een triple-quadrupole MS. SPE-MS 2 met een ion-trap zorgt voor een goede selectiviteit, met als gevolg dat een detectielimiet van ongeveer 5 ng/ml. De bepalingslimiet is ca. 10 ng/ml, en een goede lineariteit over het bereik ng/ml is verkregen. Tevens is een goede reproduceerbaarheid aangetoond (RSD <10% bij 20 ng/ml). Voor deze applicatie met dit systeem is geen ionsuppressie waargenomen. Het laatste deel van het proefschrift met betrekking tot experimenten beschrijft de directe koppeling van SPME met MS (Hoofdstuk 5). Lidocaine is uit urine geëxtraheerd met een 100-µm polydimethylsiloxaan (PDMS) gecoate fiber (Sectie 5.1). De experimenten zijn bij kamertemperatuur uitgevoerd. De evenwichtstijd is ongeveer 45 min. Aangezien door de directe koppeling met de MS de detectietijd slechts 1 min is, is overgegaan op niet-evenwicht SPME toegepast. De sorptie is na 5 min. gestopt, waarna er 4 min. is gedesorbeerd. De desorptievloeistof is vervolgens naar de MS getransporteerd. De totale analysetijd wordt nu 10 min., met een detectielimiet van 0.4 ng/ml en een bepalingsgrens van ongeveer 2 ng/ml, waarbij een acceptabele reproduceerbaarheid (RSD <15%) wordt verkregen. Na een enkele desorptie is echter nog ongeveer 10% van de gesorbeerde analiet in de coating aanwezig. Een van de beperkende factoren tijdens de sorptie is de diffusie door een statisch waterlaagje rond de fiber. Een hogere sorptietemperatuur kan de diffusie door het laagje versnellen. In Sectie 5.2 is derhalve een hoge sorptietemperatuur (65 C) toegepast. Het bleek nu mogelijk om met een 30-µm 208

5 fiber goede selectiviteit en gevoeligheid te verkrijgen met slechts 1 min. sorptie, 1 min. desorptie en 1 min. detectie. De bepalingsgrens (RSD <15%) is ongeveer 1 ng/ml. Het blijkt essentieel te zijn de desorptie ook bij hoge temperatuur (55 C) uit te voeren om de analiet sneller en vollediger uit de coating te krijgen, en hiermee ook carry-over te elimineren. Verbeterde temperatuurcontrole m.b.v. een speciaal ontwikkelde desorptie-unit zorgt tevens voor een goede reproduceerbaarheid (RSD <10%) over een relatief groot lineair bereik (5-220 ng/ml). Dit laatste systeem toont heel duidelijk de mogelijkheden voor hoge monsterdoorvoer-analyse op basis van niet-evenwicht SPME bij hogere sorptie- en desorptietemperatuur en directe koppeling met MS. Het laatste deel van dit proefschrift (Hoofdstuk 6) bevat enkele algemene conclusies en een vergelijking van de onderzochte systemen. Daarnaast worden de mogelijkheden en beperkingen van deze systemen besproken en worden enkele ideeën voor toekomstig onderzoek gegeven. 209

6