RIJKSINSTITUUT VOOR VOLKSGEZONDHEID EN MILIEU BILTHOVEN

Transcriptie

1 RIJKSINSTITUUT VOOR VOLKSGEZONDHEID EN MILIEU BILTHOVEN RIVM rapport NRL Salmonella ringonderzoek II: bacteriologische detectie van Salmonella in aanwezigheid van competitieve flora N. Voogt, P.H. in 't Veld, N. Nagelkerke en A.W. van de Giessen januari 1999 Dit ringonderzoek is uitgevoerd in opdracht en ten laste van de Inspectie Gezondheidsbescherming, Waren en Veterinaire Zaken van het ministerie van Volksgezondheid, Welzijn en Sport en valt onder MAP project getiteld: Surveillance van zoönoseverwekkers Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu, Postbus I, 37 BA Bilthoven tel 3791; fax Inspectie Gezondheidsbescherming, Waren en Veterinaire Zaken, Ministerie van Volksgezondheid, Welzijn en Sport, Postbus 168, 5 BC, 'sgravenhage, Nederland; tel 7356; fax

2 bladzijde van 5 Rapport Verzendlijst 15 Inspectie Gezondheidsbescherming, Waren en Veterinaire Zaken van het ministerie van Volksgezondheid, Welzijn en Sport 6 Contactpersoon Inspectie Gezondheidsbescherming, Waren en Veterinaire Zaken dr. J.H.M. Nieuwenhuijs 7 DirecteurGeneraal van de Volksgezondheid 8 Hoofdinspecteur Gezondheidszorg 9 Voorzitter van de Gezondheidsraad Productschappen Vee, Vlees en Eieren dr. T. de Boer 15 Stuurgroep laboratoria Plan van Aanpak PVE 1637 Deelnemers aan het ringonderzoek (verzending via Inspectie W&V) 38 Directeur Volksgezondheid RIVM prof. dr. G. Elzinga 39 Directeur Sector (volksgezondheidsonderzoek) prof. dr. ir. D. Kromhout Hoofd Microbiologisch Laboratorium voor Gezondheidsbescherming (MGB) dr. ir. A.M. Henken 1 Auteurs 5 Depot van Nederlandse publikaties en Nederlandse bibliografie 6 Strategisch Bureau Directie (SBD)A^oorlichting en Public Relations 7 Bibliotheek RIVM 8 Bureau rapportenregistratie 965 Bureau rapportenbeheer en verkoop 6675 Reserve exemplaren

3 Rapport bladzijde 3 van 5 Inhoud pagina Verzendlijst Abstract Samenvatting 5 1 Inleiding 6 Deelnemende laboratoria 7.3 Materiaal en methoden Bereiding van de referentiematerialen met S. Typhimurium 8 3. Bereiding van monsters met stoorflora Ringonderzoek 8 3. Statistische analyse van de resultaten 9 Resultaten.1 Besmettingsniveau van de referentiematerialen. Analyse van de uitvoering van het ringonderzoek.3 Testresultaten.3.1 Capsules getest zonder toevoeging van faeces (n =).3. Capsules getest in combinatie met faeces (n = ) 1 5 Discussie en conclusies 19 Literatuur 1 Bijlage 1. Protocol. Testrapport 7 3. Gegevens over de gebruikte media

4 bladzijde van 5 Rapport Abstract In April 1998, a bacteriological collaborative study was organized by the Dutch National Reference Laboratory (NRL) for Salmonella among 3 laboratories participating in the Dutch national programme for control of Salmonella in the poultry sector. The main objective of this study was to test the capacity of various laboratories in the Netherlands to detect Salmonella in the presence of competitive microorganisms. Reference capsules containing sublethally injured Salmonella Typhimurium had to be tested for the presence of Salmonella with and without the addition of chicken faeces. The laboratories applied the predescribed method of the Product boards for livestock, meat and eggs and optionally their own methods to detect Salmonella in chicken faeces. Fifteen of the 3 participating laboratories isolated Salmonella from all 8 positive capsules tested in combination with faeces. The use of semisolid media, especially MSRV and DIASALM, yielded significantly more positive isolations compared to RappaportVassiliadis as selective enrichment.

5 Rapport bladzijde 5 van 5 Samenvatting In april 1998 werd in opdracht van de Inspectie Gezondheidsbescherming, Waren en Veterinaire Zaken een tweede bacteriologisch ringonderzoek voor de detectie van Salmonella in aanwezigheid van stoorflora georganiseerd door het Nationaal Referentie Laboratorium (NRL) voor Salmonella (RIVM, Bilthoven). Aan het ringonderzoek werd deelgenomen door 3 laboratoria die deelnemen aan het Plan van Aanpak ter bestrijding van Salmonella (en Campylobacter) in de pluimveevieessector van de Productschappen Vee, Vlees en Eieren (PVE). Het belangrijkste doel van dit ringonderzoek was te testen of de deelnemende laboratoria in staat zijn om Salmonella te detecteren in aanwezigheid van stoorflora. Daarvoor werden referentiematerialen met Salmonella gebruikt die dienden te worden onderzocht met en zonder toevoeging van kippenfaeces. De deelnemende laboratoria voerden het ringonderzoek uit volgens het voorschrift van PVE en in bepaalde gevallen met andere gcingbare methodes voor de detectie van Salmonella in pluimveemonsters. Vijftig individueel genummerde capsules werden door de laboratoria onderzocht. Veertig capsules (vier blanco's, 19 met ± kolonie vormende eenheden (kve) Salmonella Typhimurium (STM) en met ± kve STM) werden onderzocht in combinatie met één gram kippenfaeces. Aan 8 van de 19 capsules met kve STM moest een portie faeces dat een antibioticum bevatte worden toegevoegd. Tien capsules (vier met ± 5 kve S. Panama, twee met ± kve STM en vier met ± kve STM) werden zonder faeces onderzocht. Vijftien van de 3 laboratoria isoleerden Salmonella uit de 8 capsules getest in combinatie met kippenfaeces zonder toevoeging van antibioticum. Bij de overige acht deelnemers varieerde het aantal positieve monsters van één tot tien voor de monsters met kve STM en van 6 tot 16 voor de monsters met kve STM. Eén laboratorium isoleerde Salmonella uit twee blanco capsules en uit drie capsules waaraan faeces met een antibioticum was toegevoegd. De gebruikte semisolid media, MSRV en DIASALM, scoorden significant beter in vergelijking met RV.

6 bladzijde 6 van 5 Rapport Inleiding Salmonella is in Nederland een belangrijke oorzaak van gastroenteritis bij de mens. Op basis van door het RIVM uitgevoerd populatieonderzoek wordt geschat dat zich jaarlijks in Nederland ca.. gevallen van SalmoneUainfecÜQ voordoen (6). Uit diverse onderzoeken is gebleken dat pluimveevlees en eieren een belangrijke rol spelen in de epidemiologie van Salmonella bij de mens. Onderzoek van de Inspectie Gezondheidsbescherming heeft uitgewezen dat in Nederland in 1997 ca. 3% van de rauwe kipproducten in de detailhandel besmet was met Salmonella (van der Zee, Inspectie W&V Zutphen, pers. mededeling). Het wordt algemeen erkend dat een vermindering van de Salmonellabesmetting van pluimveevlees primair dient te worden gerealiseerd middels een reductie van het aantal Salmonellapositieye pluimveekoppels. In verband met deze problematiek is in 1997 door de Productschappen Vee, Vlees en Eieren (PVE) een plan van aanpak in de pluimveevleessector geïmplementeerd, welke is gericht op het terugdringen van het aantal Salmonella (en Campylobacter) positieve koppels vleeskuikens. Deze aanpak is voor een belangrijk deel gebaseerd op monitoring van Salmonella (en Campylobacter) bij pluimveekoppels in de productieketen middels bacteriologisch onderzoek van o.a. mest en blindedarmmonsters. Het bacteriologisch onderzoek wordt daarbij uitgevoerd door laboratoria die daarvoor een voorlopige erkeiming van het PVE hebben verkregen, mede op advies van de Inspectie W&V. De Inspectie W&V heeft aan het RIVM de opdracht gegeven om in 1998 tweemaal een ringonderzoek te organiseren met de in het Plan van Aanpak participerende laboratoria. Deze ringonderzoeken hebben ten doel om de bekwaamheid van de betrokken laboratoria te testen voor bacteriologische detectie van Salmonella in kippenfaeces. Dit rapport beschrijft het eerste ringonderzoek van 1998 (ringonderzoek II), waaraan door 3 laboratoria werd deelgenomen. Er werd gebruik gemaakt van referentiematerialen met verschillende besmettingsniveau's van Salmonella in combinatie met kippenfaeces als stoorflora.

7 Rapport bladzijde 7 van 5 Deelnemende laboratoria Boxmeer Breda Den Bosch Deventer Diepenbeek (België) Ede Groess en/duiven Harderwijk Haulerwijk Kornhorn Leek Leeuwarden Lelystad Putten Ruurlo Someren Someren Utrecht Veghel Vosselaar (België) Weert Wezep Wijhe Maasweide laboratory services BCO Analytical Services BV Biochem Food BV Gezondheidsdienst voor Dieren Dr. L. Willemsinstituut Conex laboratorium BACHEVO Diergeneeskundig Onderzoekcentrum NWVeluwe Frisia Storteboom bv Pluimveepraktijk NoordOost Pro Analyse Food Control BV IDDLO Lab. Jansen Pluimveeslachterijen Dierenartsenpraktijk 'De Achterhoek' Pluimveepraktijk ZuidNederland Veterinair Centrum Someren Laboratorium Premervo Coöperatief Centraal Laboratorium Lavetan Laboratorium Pro Health B.V. Plukon Poultry afd. R en D KBBL Wijhe B.V.

8 bladzijde 8 van 5 Rapport Materiaal en methoden 3.1 Bereiding van de referentiematerialen met^s. Typhimurium Er zijn drie batches Salmonella Typhimurium (STM) gebruikt met een besmettingsniveau van respectievelijk, en kolonie vormende eenheden (kve) per capsule. De bereiding van de referentiematerialen (RM) was gelijk aan die van het eerste bacteriologisch ringonderzoek dat in mei 1997 door het Nationaal Referentie Laboratorium (NRL) voor Salmonella werd georganiseerd (5). De batches met een besmettingsniveau van ongeveer en kve STM per capsule zijn bereid uit een met STM hoog besmet melkpoeder (hetgeen opgeslagen lag bij C). Voor de capsules met ± kve STM werd gebruik gemaakt van het poeder gemengd voor bacteriologisch ringonderzoek I (5). Vijftig capsules met ± kve STM en 5 met ± kve STM werden geteld om het aantal Salmonella bacteriën per capsule te bepalen. De telling werd uitgevoerd zoals eerder beschreven in rapport (5). Er zijn 36 capsules met ± kve STM, 8 capsules met ± kve STM en 36 capsules met ± kve STM gevuld met,3 g gemengd poeder volgens RIVM SOP m. MGB/M3 () en tot gebruik in het ringonderzoek bewaard bij C. 3. Bereiding van monsters met stoorflora De bereiding van monsters met stoorflora vond plaats zoals eerder beschreven door N. Voogt e.a (). Ook in dit ringonderzoek is gebruik gemaakt van faeces aflcomstig van legkippen. Tevens is gebruik gemaakt van faecesmonsters waaraan een antibioticum is toegevoegd dat Salmonella bacteriën doodt. De ontwikkeling van deze monsters is beschreven door M. Raes e.a.(l). 3.3 Ringonderzoek Drie weken voor de start van het ringonderzoek werden een protocol en een testrapport (zie bijlagen 1) aan de deelnemers verzonden. De RM (in totaal 5 individueel genummerde capsules) en vijf porties bevroren faeces werden in de week voorafgaande aan het ringonderzoek gekoeld naar de 3 deelnemers verstuurd. De inhoud van de 5 capsules en het feit dat één van de porties faeces (portie ) een antibioticum bevatte was niet bekend bij de

9 Rapport bladzijde 9 van 5 deelnemers. Na aankomst op het laboratorium moesten, zoals beschreven in het protocol, de capsules en de faeces tot het begin van het ringonderzoek bewaard worden bij C. Veertig capsules dienden te worden getest in combinatie met kippenfaeces. Na voorincubatie van de capsules moest één gram kippenfaeces worden toegevoegd. Negentien capsules bevatten ongeveer kve STM per capsule, ongeveer kve STM en vier waren blanco capsules. Aan acht van de 19 capsules met kve STM diende faeces met daarin een antibioticum te worden toegevoegd. De overige tien capsules (vier met 5 kve Salmonella Panama, twee met ± kve STM en vier met ± kve STM per capsule) werden zonder toevoeging van faeces getest. Daarnaast dienden twee controles te worden ingezet. Dit betrof één procedure controle, waarbij geen capsule en geen faeces aan de media moest worden toegevoegd en één negatieve controle, waarbij alleen één gram faeces moest worden toegevoegd. De deelnemers volgden de procedure zoals die beschreven stond in het protocol en maakten daarbij gebruik van de methode en media die op het laboratorium normaal toegepast worden voor de detectie van Salmonella in pluimveemonsters uit de praktijk. De benodigde onderzoeksgegevens en de eindresultaten werden in het testrapport aan het NRL gerapporteerd. 3. Statistische analyse van de resultaten Voor alle testen werd een onbetrouwbaarheidsdrempel (a) van 5% gebruikt. De betrouwbaarheidsintervallen voor de fractie positieve monsters werden berekend met behulp van arcsin V transformatie. De variantie stabiliserende arcsin V transformatie zorgt ervoor dat de variantie voor alle uitkomsten (ongeveer) hetzelfde is. Teneinde te onderzoeken of er binnen een laboratorium significante verschillen waren in de resultaten van de verschillende media werd de McNemar's test met behulp van het programma SAS (PROC FREQ) (3) uitgevoerd. Dezelfde test, geaggregeerd over de deelnemende laboratoria, werd gebruikt om de verschillen in resultaten tussen de meest toegepaste selectieve ophopingsmedia te berekenen.

10 bladzijde van 5 Rapport Resultaten.1 Besmettingsniveau van de referentiematerialen Het besmettingsniveau van de batches RM met ± en ± kve STM is één keer bepaald. Het gemiddeld aantal kve in de RM met een besmettingsniveau van ongeveer kve was,7. De waarde voor de homogeniteit van deze batch, uitgednikt als T/(I1), was,9. In dit geval is er sprake van een bijna ideale homogene verdeling (T/(I1) = 1). Het gemiddeld aantal kve in de. batch met ongeveer kve was 9 per capsule. De corresponderende waarde voor de homogeniteit was 1,7. Hier is sprake van overdispersie tussen de capsules (T/(I1) > 1). De batch is wel gebruikt in het ringonderzoek, omdat de kans op het vinden van een capsule zonder Salmonella verwaarloosbaar klein is door het hoge besmettingsniveau van de capsules. Het besmettingsniveau en de homogeniteitswaarde van de batch met ± kve STM is eerder beschreven door N. Voogt e,a. (5).. Analyse van de uitvoering van het ringonderzoek Voorophoping Alle laboratoria gebruikten gebufferd pepton water (BPW) als voorophopings. In Tabel (bijlage 3) zijn de door de laboratoria gebruikte fabrikanten en artikelmmimers weergegeven. Voordat één gram faeces aan de BPW werd toegevoegd, moesten de capsules een halfuur bij 37 C worden geïncubeerd. Eenentwintig laboratoria incubeerden tussen 3 en 35 minuten. Laboratoria 5 en losten de capsules 55 minuten respectievelijk uur op voordat de faeces werd toegevoegd. De start en eindtijden van de incubatie van het voorophopings zijn ook in Tabel vermeld. De incubatieperiode varieerde tussen uur (labcode 1) en 3 uur 9 minuten (labcode ), Eén laboratorium (labcode 7) rapporteerde de eindtijd niet. Selectieve ophoping De door de laboratoria gebruikte selectieve ophopingsmedia met de bijbehorende fabrikanten en incubatietijden zijn vermeld in Tabel (bijlage 3). De frequentie van gebruik van de, in totaal, vijf verschillende media is weergegeven in Tabel 1. De incubatietijden varieerden tussen en 5 uur, met uitzondering van laboratorium (8 uur met RV als selectief ophopings). Zeven van de 3 laboratoria incubeerden het selectieve ophopings voor een tweede periode, waarbij de totale incubatietijd varieerde tussen 5 en 9 uur.

11 Rapport bladzijde van 5 Isolatie De door de deelnemers gebruikte isolatiemedia, de fabrikanten en de incubatietijden staan in Tabel 1 (bijlage 3). De meeste deelnemers incubeerden de isolatiemedia tussen 19 en 5 uur. Eén laboratorium (labcode ) incubeerde de media korter (15 uur 35 min.) en één laboratorium (labcode ) langer (8 uur). Tabel I Frequentie van gebruik van diverse selectieve ophopingsmedia door de deelnemende laboratoria selectief ophopings RV DIASALM MSRV RVS SC frequentie van gebruik 15 n.3 Testresultaten.3.1 Capsules getest zonder toevoeging van faeces (n = ) De negatieve controle en procedure controle waren bij alle deelnemende laboratoria negatief De resultaten van de tien zonder faeces geteste capsules zijn weergegeven in Tabel. Alle laboratoria isoleerden Salmonella uit de zes met ( en kve) STM besmette capsules. Uit de vier capsules met (5 kve) S. Panama werd door twee laboratoria (labcode 16 en 18) respectievelijk één en twee keer geen Salmonella geïsoleerd. Van de laboratoria die meer dan één selectief ophopings gebruikten, vonden vier laboratoria (labcodes, 3, 6 en ) verschillende resultaten met de media. Met uitzondering van laboratorium 3 vonden deze laboratoria een verschil bij het onderzoek van de vier capsules met S. Panama. In twee gevallen werd S. Panama geïsoleerd met RV als selectief, waarbij één keer DIASALM en één keer MSRV negatief was, terwijl in het derde geval MSRV poshief en RV negatief was. Laboratorium 3 isoleerde Salmonella uit één capsule kve STM en uit één capsule kve STM met MSRV als isolatie, terwijl RV negatief was.

12 bladzijde 1 van 5 Rapport Capsules getest in combinatie met faeces (n ) In totaal werden door de laboratoria capsules getest in combinatie met faeces. In Tabel 3 is het aantal monsters waaruit door de deelnemende laboratoria Salmonella is geïsoleerd weergegeven. Er is daarbij onderscheid gemaakt tussen de capsules toegevoegd aan faeces zonder een antibioticum (totaal 3 capsules) en faeces met een antibioticum (8 capsules). Uit de acht capsules waaraan faeces met een antibioticimi was toegevoegd en die in principe een negatief resultaat behoorden op te leveren, werd door twee laboratoria (labcode 6 en 1) respectievelijk drie en één maal Salmonella geïsoleerd. Tevens isoleerden laboratoriimi 6 en 9 Salmonella uit twee respectievelijk één van de vier blanco capsules. De overige laboratoria isoleerden geen Salmonella uit de blanco capsules en/of de capsules waaraan faeces met een antibioticum was toegevoegd. Bij de capsules die werden toegevoegd aan de faeces zonder een antibioticum is onderscheid gemaakt tussen capsules met kve STM (totaal ) en met kve STM (totaal ). Van de 3 laboratoria isoleerden er 15 Salmonella uit alle monsters met kve STM, terwijl de resterende acht deelnemers tussen de één en monster(s) negatief vond(en) voor Salmonella. In Tabel staat voor deze laatste categorie laboratoria het percentage positieve monsters aangegeven met het bijbehorende 95% betrouwbaarheidsinterval. Negentien laboratoria isoleerden Salmonella uit alle monsters met kve STM. Het percentage positieve monsters met het bijbehorende 95% betrouwbaarheidsinterval voor de resterende zes laboratoria is weergegeven in Tabel 5. In Tabel 6 en 7 zijn de resultaten per selectief ophopings te zien voor capsules met kve STM respectievelijk kve STM. Laboratorium gebruikte alleen MSRV als selectief ophopings. Laboratorium 13 gebruikte drie selectieve ophopingsmedia (RV, DIASALM en SC) en vond bij de capsules met kve STM geen significante verschillen tussen de media, terwijl bij de capsules met kve STM SC significant slechter (p <,5) scoorde in vergelijking met RV en DIASALM. Laboratorium testte in totaal vijf ophopingsmedia (RV, DIASALM, SC, MSRV en RVS). SC scoorde vergeleken met de overige media bij beide besmettingsniveaus significant slechter (p <,5), terwijl bij de capsules met kve STM significant slechtere (p <,5) resultaten werden behaald met het gebruik van RV en MSRV (vergeleken met DIASALM en RVS). De overige laboratoria gebruikten twee ophopingsmedia. Negen laboratoria vonden geen significante verschillen tussen de resultaten verkregen met één van beide media. Bij laboratoria 6, 1 en 1 scoorde MSRV, zowel met STM als met STM, beter in vergelijking met RV. Laboratorium isoleerde bij beide niveaus met DIASALM significant meer Salmonella vergeleken met RV. Drie laboratoria vonden alleen significant betere resultaten bij capsules met kve

13 Rapport bladzijde 13 van 5 STM (x met gebruik van DIASALM en Ix met gebruik van RV als selectief ophopings), terwijl laboratoria significant meer Salmonella isoleerden uit capsules met kve STM (3x met RV en lx met DIASALM). Zeventien van de laboratoria gebruikten naast RV een semisolid ; in acht gevallen MSRV en üen keer DIASALM. Zowel MSRV als DIASALM scoorden significant beter (p <,5) vergeleken met RV. Op drie laboratoria na (labcode 5, 7 en 3) gebruikten alle laboratoria als selectief isolatie. Laboratorium 5 en 3 streken uit op een BPLS plaat, terwijl laboratorium 7 XLD als isolatie gebruikte.

14 bladzijde 1 van 5 Rapport Tabel Het aantal capsules waaruit door de deelnemende laboratoria Salmonella werd geïsoleerd labcode 1 capsules met 5 kve S. Panama (n = ) capsules met kve S. Typhimurium (n) capsules met kve 5". Typhimurium (n = ) ' 3

15 Rapport bladzijde 15 van 5 Tabel 3 Het aantal monsters waaruit door de deelnemende laboratoria Salmonelia werd geïsoleerd faeces zonder een antibioticum faeces met een antibioticum labcode 1 aantal positieve blanco's (n = ) aantal positieve monsters met kve STM (n=ll) aantal positieve monsters met kve STM (n=) 16' aantal positieve monsters met kve STM (n = 8) = één van de capsules ontbrak

16 bladzijde 16 van 5 Rapport Tabel Aantal en percentage van de monsters met kve STM dat positief werd bevonden labcode gevonden aantal positieve monsters (n=ll) % positief 95% betrouwbaarhe i dsinterval 9,9 67, 99, ,8 5,3 98, 5 9,9 67, 99,9 7 9,9 67, 99,9 36,,566, ,7 3,5 9, 8 7,7 3,59, 3 1 9,1 3,6 Tabel 5 Aantal en percentage van de monsters met kve STM dat positief werd bevonden labcode gevonden aantal positieve monsters (n=) % positief 95% betrouwbaarheidsinterval 16 9,1 78, 99, , 68,8 98, ,5 53,6 93, 58,8 3,8 8, , 6,8 96, ,3 1,7 59,3

17 Rapport bladzijde van 5 Tabel 6 Aantal Salmonella positieve isolaties per selectief ophopings uit monsters met kve STM (n = ) lab RV DIAS MSRV RVS SC XLD BPLS XLD BPLS XLD XLD

18 bladzijde 18 van 5 Rapport Tabel 7 Aantal Salmonella positieve isolaties per selectief ophopings uit monsters met kvestm(n = ) lab RV DIAS MSRV RVS SC XLD BPLS XLD BPLS XLD XLD

19 Rapport bladzijde 19 van 5 Discussie en conclusies In dit ringonderzoek diende Salmonella te worden geïsoleerd uit referentiematerialen met verschillende besmettingsniveaus in aan en afwezigheid van competitieve microorganismen in de vorm van kippenfaeces. Aan één van de vijf porties kippenfaeces was een antibioticum toegevoegd dat Salmonella doodt. De resultaten van alle laboratoria werden gebruikt in de statistische analyse. Door alle deelnemende laboratoria werd Salmonella geïsoleerd uit de capsules met STM, waaraan geen faeces was toegevoegd uit zowel die met als kve. Eenentwintig van de 3 laboratoria isoleerden Salmonella uit alle capsules met S. Panama en laboratoria isoleerden Salmonella uit respectievelijk en 3 van de capsules. Het berekende percentage negatieve capsules van de gebruikte batch S. Panama was, % met een 95 % betrouwbaarheidsinterval tussen,1,5 %. De negatieve bevindingen van deze laboratoria kurmen een aanwijzing zijn dat zij moeite hebben met het detecteren van lage aantallen Salmonella. Door twee laboratoria werd Salmonella geïsoleerd uit monsters met blanco capsules. Dit duidt op krui she smetting tussen monsters of verwisseling van monsters. Daarnaast isoleerde één van deze laboratoria drie keer Salmonella uit capsules waaraan faeces met een antibioticum was toegevoegd. Dit gebeurde bij een ander laboratorium één keer. Zes van de 3 deelnemende laboratoria isoleerden geen Salmonella uit een aantal monsters met en kve STM waaraan faeces zonder een antibioticum was toegevoegd. Twee laboratoria vonden alleen negatieve monsters bij de capsules met kve STM. Het aantal positieve bevindingen varieerde voor de met kve STM besmette monsters (n = ) tussen één (95% betrouwbaarheid voor % positieve monsters tussen O en 3,6) en (95% betrouwbaarheid tussen 67, en 99,9%). Bij de capsules met kve STM (n =) varieerde het aantal positieve bevindingen tussen zes (95% betrouwbaarheid tussen 1,7 en 59,3%) en 16 (95% betrouwbaarheid tussen 78, en 99,9%). Dit laatste betekent dat met 95% betrouwbaarheid geschat kan worden dat in dit laboratorium bij onderzoek op vergelijkbaar monstermateriaal met een vergelijkbaar besmettingsniveau met gebruik van dezelfde methode er van de werkelijk positieve monsters tussen de 78 en 99 % positief gevonden zullen worden. In het kader van het Plem van Aanpak van het PVE is een uniforme methode voor de detectie van Salmonella in pluimveefaeces afgesproken. Er wordt daarbij gebruik gemaakt van RV en een tweede selectief ophopings naar keuze; namelijk MSRV of DIASALM. De resultaten met deze semisolid media waren significant beter vergeleken met de resultaten bij

20 bladzijde van 5 Rapport gebruik van RV. Dit in tegenstelling tot de resultaten uit ringonderzoek I (5), waarin RV significant beter scoorde. De aanvankelijke onbekendheid van de laboratoria met het gebruik van het DIASALM bij het eerste ringonderzoek kan hier een oorzaak van zijn. Uit eerdere bacteriologische ringonderzoeken (1,,5) is al gebleken dat selectieve ophopingsmedia verschillen in geschiktheid voor de isolatie van Salmonella in aanwezigheid van stoorflora. Zowel bij het RIVM als bij de GD te Deventer vindt momenteel onderzoek plaats naar methoden voor detectie van Salmonella in pluimveefaeces, hetgeen uiteindelijk dient te leiden tot selectie van de meest geschikte methode. Een bacteriologisch ringonderzoek zoals in dit rapport gepresenteerd is, zal door het RIVM in opdracht van de Inspectie W & V x per jaar worden georganiseerd. De criteria waaraan de resultaten moeten voldoen en de aan het resultaat gekoppelde consequenties worden door het PVE vastgesteld. Indien een laboratoriimi voldoet aan de door de PVE gehanteerde criteria zal dit laboratoria bij volgende ringonderzoeken 15 capsules dienen te onderzoeken hetgeen trendanalyse mogelijk maakt. Is dit niet het geval dan dienen 5 capsules te worden onderzocht hetgeen statistische analyse mogelijk maakt.

21 Rapport bladzijde 1 van 5 Literatuur 1. Raes M, Voogt N, Veld PH in 't, Nagelkerke N, Henken AM. Bacteriological detection of Salmonella in the presence of competitive microorganisms: bacteriological collaborative study III amongst the National Reference Laboratories for Salmonella. Bilthoven: National Institute of Public Health and the Environment; 1998 September. Report RIVM SOP lu". MGB/M3. Handmatig vullen van capsules m.b.v. een capsuleer apparaat. Revisie nr.. 3. The SAS system for Windows (statistic program) release ; Gary, NC 7513 USA. Voogt N, Veld PH in 't. Nagelkerke N, Henken AM, Bacteriological detection of Salmonella in the presence of competitieve microorganisms: a collaborative study amongst the National Reference Laboratories for Salmonella. Bilthoven: National Institute of Public Health and the Environment; 1997 September. Report Voogt N, Veld PH in 't. Nagelkerke N, Giessen AW van de. NRL Salmonella ringonderzoek I: bacteriologische detectie van Salmonella in aanwezigheid van competitieve flora. Bilthoven: Rijksinstituut voor Volksgezondheid en milieu; 1998 januari. Rapport Wit MAS de, HoogenboomVerdegaal AMM, Goosen ESM, Sprenger MJW, Borgdorff MW. Een bevolkingsonderzoek in vier regio's in Nederland naar de incidentie en ziektelast van gastroenteritis en van Campylobacter en Salmonellainfectie. Bilthoven: Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu, Rapport 191.

22 bladzijde van 5 Rapport Bijlage 1 (Protocol) RINGONDERZOEK II BACTERIOLOGISCHE DETECTIE VAN SALMONELLA IN KIPPENFAECES GEORGANISEERD DOOR HET NATIONAAL REFERENTIE LABORATORIUM (NRL) VOOR SALMONELLA Opzet van het ringonderzoek Bacteriologisch ringonderzoek II wordt uitgevoerd door het Nationaal Referentie Laboratorium (NRL) voor Salmonella in opdracht van de Veterinaire Hoofdinspectie (VHI) van de Volksgezondheid en houdt verband met de procedure voor erkerming van laboratoria in het kader van het Plan van Aanpak Salmonella in de pluimveevleessector van de Productschappen Vee, Vlees en Eieren (PVE). In het ringonderzoek wordt gewerkt met referentiecapsules welke al dan niet in combinatie met kippenfaeces onderzocht dienen te worden op Salmonella. Daarbij dient gebruik gemaakt te worden van de methode welke het laboratoriimi zelf gebruikt voor onderzoek van pluimveemestmonsters uit de praktijk in het kader van het Plan van Aanpak. In totaal dienen 5 monsters, exclusief controles, te worden onderzocht. Daartoe ontvangt iedere deelnemer een pakket met daarin: 5 genummerde potjes die elk één capsule bevatten; 5 porties a gram ingevroren kippenfaeces. Een gedetailleerde procedure voor de uitvoering van het onderzoek is beschreven in Bijlage 1 van dit protocol. Testrapport De resultaten van het onderzoek dienen te worden vermeld in het testrapport. Na afloop van het onderzoek wordt dit testrapport volledig ingevuld naar het NRL Salmonella opgestuurd. Bij het NRL zullen de resultaten (statistisch) worden verwerkt. Tevens dienen in het testrapport alle gegevens te worden opgenomen over de media die gebruikt zijn tijdens de uitvoering van het ringonderzoek. Daarnaast moet alle informatie worden vermeld die invloed kan hebben op het eindresultaat. Afwijkingen van het protocol en andere gebeurtenissen moeten vermeld worden. In het testrapport dienen de namen vermeld te worden van de personen die het ringonderzoek hebben uitgevoerd en van degene die er verantwoordelijk voor is.

23 Rapport bladzijde 3 van 5 Rapportage Rapportage van de resultaten van het ringonderzoek geschiedt aan de opdrachtgever. Daarnaast zal ieder laboratorium een uitslag ontvangen van zijn eigen resultaten. Tijdsplanning ringonderzoek De uitvoering van het ringonderzoek vindt plaats in week 1. De start van het onderzoek van de capsules is op maandag april maart 3 april '98 Verzending van protocol en testrapport naar de deelnemers. 1 april 1998 Verzending van de materialen naar de deelnemers. Het pakket wordt via EMS of DHL verstuurd en wordt normaliter op 15 april voor, uur afgeleverd. Koelelementen zorgen ervoor dat de temperatuur tijdens het transport laag blijft. Na aankomst in het laboratorium moeten alle materialen direct bij C geplaatst worden. Controleer of de koelelementen nog bevroren zijn en noteer dat in het testrapport (pagina ). Als het pakket op woensdag 15 april 1998 voor 1. uur niet op het laboratorium is aangekomen, neem dan onmiddellijk contact op met het NRL Salmonella (contactpersoon Nelly Voogt; telefoonnummer: b.g.g. 378 of 7661) april 1998 Uitvoering van het ringonderzoek volgens de procedure zoals beschreven in Bijlage mei 1998 Faxen van het volledig ingevulde testrapport naar het NRL Salmonella. Het orginele testrapport en een kopie van het gebruikte protocol voor de detectie van Salmonella worden per post teruggestuurd naar het NRL. 18 mei 1998 Controle door de deelnemers van de door het NRL Salmonella ingevoerde gegevens.

24 bladzijde van 5 Rapport Als er vragen of opmerkingen zijn over het ringonderzoek, dan kunt u contact opnemen met: Nelly Voogt (onderzoeksassistent) RIVM (postbak 63) Postbus 1 37 BA Bilthoven tel.m. : of 78 fax : 373

25 Rapport bladzijde 5 van 5 vervolg Bijlage 1 Procedure voor bacteriologisch ringonderzoek II Voor het ringonderzoek dient gebruik gemaakt te worden van de methode die op het laboratorium wordt toegepast voor de detectie van Salmonella in pluimveemestmonsters in het kader van het Plan van Aanpak. Vermeld in het testrapport alle gevraagde gegevens over de media die gebruikt worden tijdens het onderzoek. Haal de ingevroren faeces maandagoclttend april uit de vriezer en plaats deze bij 5 C. Zet de faeces een uur voor gebruik bij kamertemperatuur. 1. Voorophoping Haal de genummerde potjes met de capsules één uur voordat ze worden toegevoegd aan het voorophopings uit de vriezer, zodat ze op kamertemperatuur kunnen komen. Als het voorophopings ook bij een lagere temperatuur bewaard wordt moet dit eveneens bij kamertemperatuur geplaatst worden. Vermeld in het testrapport de gevraagde gegevens over het voorophopings. Nummer 5 potten met voorophoping smedia van 1 tot 5 voor de capsules en voor controles. De eerste controle is een procedure controle (Cl), waaraan geen capsule en geen faeces wordt toegevoegd en de tweede is een negatieve controle (C) waaraan alleen 1 gr. faeces wordt toegevoegd. Deze controles worden verder hetzelfde behandeld als de 5 monsters. Nadat de media en capsules op kamertemperatuur zijn gebracht wordt een capsule toegevoegd aan het voorophopings met hetzelfde nummer. De capsule mag niet geopend worden en ook mag het voorophopings niet geschud worden om de capsule sneller op te laten lossen. Vervolgens worden de media gedurende 3 minuten bebroed bij de incubatietemperatuur die volgens uw methode gebruikt wordt. Vermeld de temperatuur van de stoof en de begin en eindtijd van de incubatieperiode in het testrapport. Voeg na 3 minuten 1 ±.1 gr. ontdooide faeces aan de media toe volgens onderstaand schema: 1 gr. uit portie 1 toevoegen aan monsters 18; 1 gr. uit portie toevoegen aan monsters 916 en aan C; 1 gr. uit portie 3 toevoegen aan monsters ; 1 gr. uit portie toevoegen aan monsters 53; 1 gr. uit portie 5 toevoegen aan monsters 33; geen faeces toevoegen aan monsters 15.

26 bladzijde 6 van 5 Rapport Incubeer volgens de methode van uw laboratorium. Vermeld in het testrapport de incubatietemperatuur en de begin en eindtijd van de incubatieperiode.. Selectieve ophoping Vermeld in het testrapport de gevraagde gegevens van de selectieve ophopingsmedia. Nummer 5 buizen/flessen van elk selectief ophopings van 1 tot 5 voor de monsters en C1/C voor de controles. Beent en incubeer de media vanuit het corresponderende voorophopings volgens de methode van uw laboratorium. Vermeld de temperatuur, de start en eindtijd van de incubatieperiode in het testrapport. 3. Isolatie Vermeld in het testrapport de gevraagde gegevens over de gebruikte isolatiemedia. Nummer 5 petrischalen van elk routinematig gebruikt isolatie van 1 tot 5 voor de monsters en C1/C voor de controles. Beent en incubeer de media volgens de methode van het laboratorium. Vermeld in het testrapport de temperatuur, begin en eindtijd van de incubatieperiode.. Bevestiging Vermeld in het testrapport de wijze van bevestiging en de gevraagde gegevens over de bevestigingsmedia. Vermeld het aantal geteste kolonies en ook het aantal als Salmonella bevestigde kolonies voor elke plaat in tabel 8 (indien een tweede isolatie is gebruikt vermeld de resultaten dan in tabel 9) van het testrapport.

27 Rapport bladzijde 7 van 5 Bijlage (Test rapport) RINGONDERZOEK II BACTERIOLOGISCHE DETECTIE VAN SALMONELLA IN KIPPENFAECES GEORGANISEERD DOOR HET NATIONAAL REFERENTIE LABORATORIUM (NRL) VOOR SALMONELLA TESTRAPPORT Detectie van Salmonella in aanwezigheid van kippenfaeces Laboratoriumcode : Laboratorium : Begindatum detectie : 1998

28 bladzijde 8 van 5 Rapport Verzending Aankomst pakket op laboratorium: datum :... tijd u min Pakket beschadigd D JA DNEE Koelelementen bij aankomst: D geheel ontdooid D half ontdooid G bevroren

29 Rapport bladzijde 9 van 5 Voorophoping Medium Fabrikant van het : firmanaam artikelnummer batch nummer expiratie datum ph van (na bereiding): Temperatuur voor beënten: C Incubatietijd en temperatuur voor het oplossen van de capsules: begintijd : tijd : u min. : temperatuur stoof: C eindtijd : tijd : u min. : temperatuur stoof: C Incubatietijd en temperatuur tijdens voorophoping: begintijd : tijd : u min, : temperatuur stoof: C eindtijd : tijd : u min. : temperatuur stoof: C

30 bladzijde 3 van 5 Rapport Selectieve ophoping Medium 1 Fabrikant van het : firmanaam artikelnummer batch nummer expiratie datum ph van (na bereiding) : Temperatuur voor beënten Hoeveelheid per buis/fles Gebruikte volume van voorophoping ml ml Incubatietijd en temperatuur tijdens selectieve ophoping: begintijd : tijd: u min. : temperatuur stoof: C einde eerste periode : tijd: u min. : temperatuur stoof: C einde tweede periode : tijd: u min. : temperatuur stoof: C

31 Rapport bladzijde 31 van 5 Als er meer selectieve ophopingsmedia gebruikt worden, vermeld deze dan in een bijlage. Medium Fabrikant van het : firmanaam artikelnummer batch nummer expiratie datum ph van (na bereiding): Temperatuur voor beënten Hoeveelheid per buis/fles Gebruikte volume van voorophoping ml ml Incubatietijd en temperatuur tijdens selectieve ophoping: begintijd : tijd: u min : temperatuur stoof: C einde eerste periode : tijd: u min : temperatuur stoof C einde tweede periode : tijd: u min : temperatuur stoof C

32 bladzijde 3 van 5 Rapport Isolatie Medium 1 Fabrikant van het : firmanaam artikelnummer batch nummer expiratie datum ph van (na bereiding): Temperatuur voor beënten C Incubatietijd en temperatuur voor de eerste isolatie: begintijd : tijd : u min. : temperatuur stoof: C eindtijd : tijd : u min, : temperatuur stoof: C Incubatietijd and temperatuur voor de tweede isolatie: begintijd : tijd : u min. : temperatuur stoof: C eindtijd : tijd : u min. : temperatuur stoof: C

33 Rapport bladzijde 33 van 5 Als er meer isolatiemedia gebruikt worden, vermeld deze dan in een bijlage. Medium : Fabrikant van het : firmanaam artikelnummer batch nummer expiratie datum ph van (na bereiding): Incubatietijd en temperatuur voor de eerste isolatie: begintijd : tijd : u min. : temperatuur stoof: C eindtijd : tijd : u min. : temperatuur stoof C Incubatietijd en temperatuur voor de tweede isolatie: begintijd : tijd : u min. : temperatuur stoof: C eindtijd : tijd : u min. : temperatuur stoof: C

34 bladzijde 3 van 5 Rapport Bevestiging G Serologische bevestiging Welke sera zijn gebruikt? D commerciële sera G firmanaam:, D sera gemaakt in eigen laboratorium O Biochemische bevestiging Als er meer bevestigingsmedia gebruikt worden, vermeld deze dan in een bijlage. Medium 1 Fabrikant van het : firmanaam artikelnummer batch nummer expiratie datum Medium Fabrikant van het : firmanaam artikelnummer batch nummer expiratie datum Medium 3 Fabrikant van het mediimi: firmanaam artikelnummer batch nummer expiratie datum

35 Rapport bladzijde 35 van 5 Tabel 8 Resultaten van de bevestigingen van de eerste isolatie (capsulenummers 1) no selectief ophopings 1 eer ste mee ium tweede kol*^ Sal^ kol Sal selectief ophopings eerste tweede kol Sal kol Sal ^ eerste ^ tweede '^kol d Sal eerste isolatie dat routinematig gebruikt wordt tweede isolatie dat routinematig gebruikt wordt aantal kolonies gebruikt voor bevestiging aantal kolonies bevestigd als Salmonella

36 bladzijde 36 van 5 Rapport Tabel 8 (vervolg) capsulenummers 1 no selectief ophopings 1 eerste^ tweede kol' Sal" kol Sal selectief ophopings eerste tweede kol Sal kol Sal ^ eerste ^ tweede '^kol d Sal eerste isolatie dat routinematig gebruikt wordt tweede isolatie dat routinematig gebruikt wordt aantal kolonies gebruikt voor bevestiging aantal kolonies bevestigd als Salmonella

37 Rapport bladzijde 37 van 5 Tabel 8 (vervolg) capsulenummers 15 + controles no Cl' C*" selectief ophopings 1 eerste^ tweede kol' Sal' kol Sal selectief ophopings eerste tweede kol Sal kol Sal ^ eerste ^ tweede '^kol '^Sal ^Cl ^" eerste isolatie dat routinematig gebruikt wordt tweede isolatie dat routinematig gebruikt wordt aantal kolonies gebruikt voor bevestiging aantal kolonies bevestigd als Salmonella procedure controle negatieve controle

38 bladzijde 38 van 5 Rapport Tabel 9 Resultaten van de bevestigingen van de tweede isolatie (capsulenummers 1) no selectief ophopings 1 eerste^ tweede kol' Sal' kol Sal selectief ophopings eerste tweede kol Sal kol Sal eerste tweede 'kol "Sal eerste isolatie dat routinematig gebruikt wordt tweede isolatie dat routinematig gebruikt wordt aantal kolonies gebruikt voor bevestiging aantal kolonies bevestigd als Salmonella

39 Rapport bladzijde 39 van 5 Tabel 9 (vervolg) capsulenummers 1 no selectief ophopings 1 eerste^ tweede kol' Sal" kol Sal selectief ophopings eerste tweede kol Sal kol Sal eerste tweede kol Sal eerste isolatie dat routinematig gebruikt wordt tweede isolatie dat routinematig gebruikt wordt aantal kolonies gebruikt voor bevestiging aantal kolonies bevestigd als Salmonella

40 bladzijde van 5 Rapport Tabel 9 (vervolg) capsulenummers 15 + controles no Cl' C*^ selectief ophopings 1 eerste^ tweede kol' Sal' kol Sal selectief ophopings eerste tweede kol Sal kol Sal eerste tweede 'kol '^Sal 'Cl ^ C eerste isolatie dat routinematig gebruikt wordt tweede isolatie dat routinematig gebruikt wordt aantal kolonies gebruikt voor bevestiging aantal kolonies bevestigd als Salmonella procedure controle negatieve controle

41 Rapport bladzijde 1 van 5 Opmerkingen en bijzonderheden tijdens de uitvoering van het onderzoek die het resultaat kunnen beïnvloeden: datum: 1998 Naam van de analist die het ringonderzoek heeft uitgevoerd: Naam hoofd van de afdeling: handtekening handtekening:.

42 bladzijde van 5 Rapport Bijlage 3 Gegevens over de gebruikte media Tabel Gegevens over het voorophopings bpw, gebruikt door de laboratoria labcode 1 fabrikant art. nummer biotrading b.v. Lab 6 Oxoid CM 59 starttijd incubatie u5m 15um eindtijd incubatie 9 u 3 m 9ulm 3 Biokar Diagnostics BK 18 u35m u55m Biotrading K168F5 1um 8u3m 5 Tritium B um u3m 6 Oxoid CM 59 u3m 13u5m 7 Biokar BK18 13u5m 8 Oxoid CM 59 13ul5m 9 u 5 m 9 Sanofi Pasteur 5 15um 9 u m Biokar Diagnostics BK 18 u1 m u3m Becton/Dickinson u3m 1u3m 1 Tritium B u5m 8 u 5 m 13 Oxoid CM 59 ulom u3m 1 Oxoid CM 59 16u3m u m 15 Biotrading B61 t/m B6 13ul5m 9 u 5 m 16 Merck 1.78 ulm 1u5m Biotrading K168 15u3m 1um 18 Biokar BK 18 16u3m 1u3m 19 Biotrading K 168 a 5 ul5m u3m Lab M Lab 6 16u35m llu35m 1 Tritium B um 8u3m Oxoid CM 59 um 7u38m 3 Merck um u3m

43 Rapport bladzijde 3 van 5 Tabel Gegevens over het selectieve ophopings (labcode 11) labcode MSRV RV RV DIASAL RV MSRV RV RVS Seleniet MSRV DIASAL M RV DIASAL RV MSRV RVS DIASAL RV DIASAL DIASAL M DIASAL M RV MSRV RV DIASAL RV Seleniet DIASAL M RV MSRV fabrikant art. nummer Oxoid CM 9 biotrading n,g. Oxoid CM 866 Boom bv Lab 537 Oxoid CM 869 Oxoid CM 9 Oxoid CM 669 Oxoid CM 866 Biotradin Difco LabM Tritium Tritium Merck Oxoid Biokar LabM Merck LabM Tritium Sanofi P LabM Biokar B/D' Oxoid gk5b Lab 537 R155 D CM9B BK 136 Lab Lab 537 D lab 537 BK 13 R155 CM 9 Tritium R155 eigen fabrikaat Oxoid CM 669 eigen fabrikaat Lab M Lab 537 Oxoid Difco CM 669 n.g. starttijd incubatie louoom louoom 9 u 5 m 9 u 5 m 13ul5m 13ul5m 16um 16um 16um 16um 16um u3m llu3m 18um 18um u58m u58m u5m u5m ul5m ul5m u38m llu38m 1u3m 1u3m ul5m ul5m 13ul5m 13ul5m 13ul5m 1um 1um eindtijd eerste incubatie 9 u m 8u3m 1u5m 8u3m 9u35m 9 u m 13um 13um 13um 13um 13um louoom louoom 13u5m 13u5m 8ul5m ul5m ul5m ul5m ul5m 1u55m 1u55m 1u3m 1u3m 9u35m 9u35m u 5 m 13ul5m u3m 13um 13um eindtijd tweede incubatie 13um 13um 13um 13 uoom 13um 8ul5m _ ^ u 5 m u 5 m u3m um ' n.g. B/D niet gerapporteerd Becton/Dickinson

44 bladzijde van 5 Rapport vervolg Tabel Gegevens over het selectieve ophopings (labcode 153) labcode DIASAL RVox RV DIASAL RV DIASAL RV MSRV RV DIASAL MSRV macro RV RV MSRV MSRV fabrikant art. nummer Biotrading Lab 537 Biotrading K3B Merck 177 LabM lab 537 Biotrading 13 Biotrading 35 Tritium R 1559 Tritium M 5 Biotrading K3B Lab M Lab 537 LabM Lab 15 Labo media Tritium R155 Tritium M 5 Merck starttijd incubatie u3m u3m 1u5m 1u5m 15um 15um 13u3m 13u3m u55m u55m llu55m u55m 9u3m 9u3m 9u3m eindtijd eerste incubatie u m u m 9 u 3 m 9u3m 15ulOm 15ulOm 13u3m 13u3m 8u 15m 8u 15m 9 u 3 m 9 u 3 m 9 u m 9 u m 7 u 3 m eindtijd tweede incubatie 1ul5m 1um 1um _ 8ul5m _ 3 RV DIASAL Merck 77 5 Boom bv u5m 13u5m loull m u5m

45 Rapport bladzijde 5 van 5 Tabel 1 Gegevens over de isolatiemedia, gebruikt door de deelnemende laboratoria lab BPLS + novo XLD XLD M XLD BPLS fabrikant (art. nummer) biotrading Oxoid CM 39 Oxoid CM 39 Biotrading K33 P9 Tritium B 51. Oxoid CM 39 Oxoid CM 69 Oxoid CM 39 Merck 7 Sanofi P 166 Sanofi P 51 Biokar BK 91 B/D ' 935 Tritium B 99 Oxoid CM 39 Oxoid CM 69 Oxoid CM 39 Biotrading K8 P9 BioMerieux Dl1 Biotrading 33 Oxoid B 99 Biotrading K77 P9 n.g. 899 Tritium 95 Oxoid CM 39 Merck 75 starttijd incubatie 1 9 u m 16u3m ul5m 1um u m 16u3m louosm um u m 1um uoom u5m 16ulm u m 1um 1um 13um 13u5m ul5m 16um^ 15um^ 1ul5m um u m louoom u5m u 3m^ u5m^ eindtijd incubatie 1 8u3m 8 u 5 m 9 u 5 m 13um 9 u 3 m 1um 8ul5m 8ul5m lluoom 1um u m 15 u 6 m u m u3m 8u3m 8u3m 1ul5m u5m 9ul5m 15um 15um 1ul5m 8ul5mj louoom 9 u m 7 u 3 m louoom louoom starttijd incubatie Ilum 1um u3m 8ul5m 8ul5m 1ul5m 1u3m 1u3m 13um 1u3m 9u3m eindtijd incubatie 9u 15m 13um 8u3m 8ul5m 8u 15m _ 1u3m 1um 8u3m 8 u 3 m 1u3m 8 u m n.g. = niet gerapporteerd ' B/D = Becton/Dickinson ^ na DIASALM ^ narv