Samenvatting Dankwoord

Sameenvatttti ing Azospirillum brasilense behoort tot een groep bacteriën die de plantengroei bevorderen. Ze leven in associatie met de wortels van hogere planten.. Die bacteriën noemen we Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) De eerste soort van dit genus, oorspronkelijk Spirillum lipoferum genoemd, werd voor het eerst geïsoleerd uit grond in 1925 in Nederland (Beijerinck 1925). Na een halve eeuw vergetelheid werd Azospirillum herontdekt in de jaren zeventig tijdens het zoeken naar associatieve stikstoffixerende bacteria. Sindsdien is Azospirillum geïsoleerd, groeiend op een groot aantal wilde en gecultiveerde planten over de hele wereld. Tijdens dit thesisonderzoek onderzochten we deze associatie tussen bacterie en plant. We gingen na in welke mate de bacterie d.m.v. de productie van fytohormonen een rol speelt in de bevordering van de wortelgroei van granen, meer bepaald tarwe en mais. Dit deden we aan de hand van zaai- en inoculatie proeven en door het kwantificeren van de auxine en cytokinine productie van Azospirillum in vloeibare culturen. We vonden niet echt statistisch significante gegevens m.b.t. de promotie van wortelgroei, maar stelden vast dat Azospirillum brasilense een auxine effect kan hebben op plantenwortels. Dankwoorrd Nu het hier eindelijk zo wat naar het einde toe gaat bedank ik iedereen. Iedereen die met mij mee gewerkt heeft, tegengewerkt heeft, iedereen waarmee ik goed heb gelachen. Iedereen die mijn studietijd gemaakt heeft tot wat het was. Els, dank u voor het vertrouwen, ik heb mijn best gedaan om het niet te beschamen. Stijn, ik ben hier in het begin wel wat slecht gezind rond gelopen maar uiteindelijk is het toch nog iets geworden. Je hebt me goed geholpen en je was ook een toffe gast om mee samen te werken. Nog veel succes en ook jij dan: bedankt. Tom, die berg zand was wel het minste wat ik kon doen voor al die wiskunde en fysica. Krisje moet ik ongeveer voor alles bedanken, Joris voor de goede cursussen en de goeie Geuze en een aantal proffen misschien nog voor hun geduld. 1

IInhoudssttaffeel l I. Inleiding 1. Woord vooraf 1 2. Azospirillum 2 2.1 taxonomie 2.1.1 classificatie 2.2 Fysiologische kenmerken van Azospirillum 3 2.3 Hormonen 5 2.3.1 auxines 2.3.1.1 auxine en wortelontwikkeling 6 2.3.1.2 bacteriële IAA biosynthese 6 2.3.2 cytokinines 7 Doelstellingen van dit thesisonderzoek 8 II. Materialen en methoden Groeimedia 1 Het aantal bacteriën en de optische densiteit van een vloeibare cultuur 3 1. Zaai en inoculatie experimenten 4 1.1 Triticum aviculare 1.2 Zea mais 6 22... Woor rt tteelllee xxuuddaa tteenn t 88 2.1 Kinetiek van de omzetting van Tryptofaan tot IAA door Azospirillum brasilense 2.1.1 Materialen en methoden 8 2.1.1.1 Bereiding van de tryptofaan stockoplossing 8 2.1.1.2 Overenten van bacteriën in de erlemeyers 8 2.1.1.3 Staalname 8 2.1.1.4 Zuivering van IAA en IAA precursoren 8 2.1.1.5 Detctie en kwantificatie van IAA en IAA precursoren 9 2.1.1.5.1 Massa spectrometrie 9 LC-MS/MS 11 2.2 De invloed van wortelexudaten op de IAA produktie van bacteriën 12 2.2.1. Verkrijgen van wortelexudaten 12 2.2.2 Analyse van de Indoolcomponenten 12 2.2.3 Toedienen van wortelexudaten aan een vloeibare Azospirillum cultuur 2.2.3.1 Overenten van bacteriën in de erlemeyers 13 2.2.3.2 Staalname 13 2.2.3.3 Zuiveren en kwantificeren van IAA en IAA precursoren 2.3 Het tryptofaangehalte van wortels 14 2.3.1 Materialen en methoden 14 33... CCyyt ttookk iinni i iinnee ppr roodduukkt tti iiee ddoooor r AAz zoos sppiiir ri iil lll lluumm 1144 3.1 Zuiveren van cytokinines 14 3.2 Detectie en kwantificatie van cytokinines 15 44... CChheemmoot ttaaxxi iis s eenn aas ssoocci iiaat tti iiee mmeet tt ddee ppl llaannt tteenn wwoo rtr tteel ll 1155 Materialen en methode 15 Chemotaxis 15 De associatie met de wortels 15 III II... RRees suulllt ttaat tteenn eenn BBees sppr reekk iinngg i 11 1 Zaai- en Inoculatieëxperimenten 1 1.1 Triticum aviculare 1 1.1.1 Het eerste experiment 1 1.1.2 Tweede experiment 3

1.1.3 Inoculatie experiment 4 1.2 Zea mais 8 1.2.1 Het effect van bacteriën 10 1.2.2 Het effect van auxine en auxine-precursoren 10 2 Wortelexudaten 10 2.1 Kinetiek van de omzetting van Tryptofaan tot IAA door Azospirillum brasilense 2.1.1 Aantal bacteriën 10 2.1.2 IAA productie 11 2.2 De invloed van wortelexudaten op de IAA productie van bacteriën 12 2.2.1 Aantal bacteriën 12 2.2.2 IAA productie 13 2.3 Mogelijke Tryptofaanbronnen in de natuur 14 2.4 Het tryptofaangehalte van wortels 14 3 Productie van Fytohormonen door Azospirillum brasilense 15 3.1 Indool-3-azijnzuur 15 3.1.1 De verschillende metabolische IAA-synthesewegen in A. brasilense 3.1.2 Meting van de verschillende intermediairen in de IAA biosynthese ( 2.1) 3.1.3 Bespreking van de verschillende biosynthesewegen 21 3.1.4 De synthesewegen bij natuurlijke tryptofaanconcentraties 23 3.2 cytokinines 25 3.2.1 Cytokinine excretie in het medium door Azospirillum 25 3.2.2 Cytokininegehalte van Azospirillum cellen 27 3.2.3.1 De auxine/cytokinine balans 27 44... CChheemmoot ttaaxxi iis s eenn aas ssoocci iiaat tti iiee mmeet tt ddee ppl llaannt tteenn wwoo rtr tteel ll 2288

Azospirillum-Plant interactie Een Symbiose? II.. IInl leei iding 11.. Woooorrdd Voooorraaf f Microben komen overal in de biosfeer voor; eigenlijk hebben deze opportunistische organismen vrijwel iedere in de natuur beschikbare ecologische niche gekoloniseerd. Vanwege die alomtegenwoordigheid is het niet verwonderlijk dat ze vaak en veel in contact komen met hogere planten. Gezien de vele verschiilende levenswijzen bij micro-organismen, wekt het ook geen verbazing dat planten en microorganismen een intensieve interactie hebben. Een groot deel van het oppervlak,van planten is bedekt met een dun laagje bacteriën en andere micro-organismen. De groeizone aan de worteltop bijvoorbeeld synthetiseert verschillende typen organische moleculen die nodig zijn voor de groei van de wortel; sommige van deze moleculen lekken weg of worden uitgescheiden naar de omliggende bodem, waar ze beweeglijke bacteriën en andere microben aantrekken. Een aantal bacteriën gedraagt zich coöperatief, in die zin dat ze de plantengroei op een of andere manier bevordert. Die bacteriën noemen we Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) (Galston 1995). De meeste elementen, noodzakelijk voor de plantengroei, zijn opneembaar in oplossing na afbraak van gesteente of dringen in gasvormige toestand de plant binnen. Stikstof komt in de atmosfeer voor als gasvormig N 2, maar is in die vorm niet beschikbaar voor hogere planten en dieren. Voordat die organismen er gebruik van kunnen maken moet het stikstofgas worden omgezet tot ammoniak (NH 3 ), tijdens een proces dat stikstoffixatie heet. In de natuur zijn het vooral bacterën die aan stikstoffixatie doen(galston 1995). Genera zoals Azotobacter, Azospirillum en Clostridium kunnen vrij in de bodem leven ; de meeste van deze vrijlevende bacteriën halen hun energie, voor de synthese van voedselmoleculen en voor de stikstoffixatie, uit de oxidatie van reeds gevormd rottend organisch materiaal. Die energie kan ook afkomstig zijn uit fotosynthese, zoals bij de Cyanobacteria Nostoc en Anabaena of bij anders gepigmenteerde fotosynthetisch actieve bacteriën als Chromatium (purper), Chlorobium (groen) en Rhodospirillum (rood). De stikstoffixerende, fotosynthetisch actieve bacterien Nostoc en Anabaena komen algemeen voor in holten in de bladeren van het watervarentje Azolla, dat algemeen voorkomt in natte rijstvelden in het Verre Oosten. Vermoedelijk krijgen de bacteriën vanuit de bladeren organische stoffen die via de fotosynthese zijn geproduceerd en die voor de groei van hun kolonies zorgen, terwijl de varen in ruil daarvoor gebonden stikstof terugkrijgt. Hoewel zowel Nostoc als Anabaena onafhankelijk kunnen leven, schijnen ze het bijzonder goed te doen als ze nauw verbonden zijn met Azolla. Oosterse boeren hebben door ervaring geleerd dat hun rijstplanten het best gedijen als ze op natte rijstvelden eerst Azolla laten groeien en afsterven. Bij het afsterven van de watervarens komen verschillende vormen vastgelegde stikstof vrij in het water op de rijstvelden; deze worden opgenomen door de jonge rijstplanten, die veel stikstof nodig hebben om een goede oogst te kunnen leveren. Een stikstoffixerende bacterie kan zich met een groot aantal soorten hogere planten verbinden. Dat blijkt uit de talrijke symbiosen tussen vlinderbloemigen en cellen van Rhizobium, een bacterie die erwten, bonen, klaver en alfalfaplanten koloniseert, en uit die van Bradyrhizobium, die een voorkeur heeft voor sojabonen. De stikstoffixatie gebeurt hier in wortelknolletjes. Een minder soort- of familiespecifieke stistoffixatie in wortelknolletjes gebeurt door Frankia. Deze bacterie induceert vorming van wortelknolletjes in de wortels van erg verschillende plantengenera als Alnus en Casuarina. Nog minder strikt is de associatie van Azospirillum lipoferum en de wortels van verscheidene tropische grassen waaronder maïs (Galston 1995). 1

22.. Azzoossppi irri illuum I. Inleiding 2.1. Taxonomie De eerste soort van dit genus, oorspronkelijk Spirillum lipoferum genoemd, werd voor het eerst geïsoleerd uit grond in 1925 in Nederland (Beijerinck 1925). Na een halve eeuw vergetelheid werd Azospirillum herontdekt in de jaren zeventig tijdens het zoeken naar associatieve stikstoffixerende bacteria in de rhizosfeer van Digitaria en Zea mais in Brazilië (Döbereiner et al. 1975,1976) Sindsdien is Azospirillum geïsoleerd, groeiend op een groot aantal wilde en gecultiveerde planten over de hele wereld. De naam Azospirillum is afgeleid van het Franse azote, stikstof en spirillum wijst op de spiraalvorm van de bacterie. Volgens Bergey's Manual of Systematic bacteriology (1984) wordt Azospirillum geklasseerd onder Aërobe/microaërofiele, beweeglijke, helixvormige of vibrioïde, gram-negatieve bacteriën. Zij zijn vrijlevende diazotrofen. In tegenstelling tot Spirocheten, die zich voortbewegen volgens een kurkentrekkervormige baan, hebben zij geen axiale filamenten. Zij hebben één of meerdere flagella aan één of aan beide polen. (Tortora et al. 1995) Moens et al. (1998) rapporteren het bezit van laterale flagellen voor beweging over een vast substraat.(3) A. brasilense bezit een megaplasmide waarop veel genen voorkomen die de flagellatie bepalen (Vande Broeck et al. 1995). 2.1.1. classificatie Eubacteria Proteobacteria alpha subdivision Fam. Rhodospirillaceae. genus Azospirillum Tarrand et al. 1979 Soorten Azospirillum amazonense Magalhães et al. 1984, een zuur tolerante Azospirillum soort. Azospirillum brasilense corrig. Tarrand et al. 1979 fig. 1.1 : Azospirillum brasilense (bron : internet) Azospirillum halopraeferens Reinhold et al. 1987, een stikstoffixerende bacterie, voor het eerst geïsoleerd, groeiend op de wortels van kallar grass (Leptochloa fusca (L.) Kunth) Azospirillum irakense Khammas et al. 1991 een stikstoffixerende bacterie, voor het eerst geïsoleerd, groeiend op de wortels van rijst en in de rhizosfere grond. Azospirillum largimobile corrig. (Skerman et al. 1983) Ben Dekhil et al. 1997 voorheen Conglomeromonas largomobilis subsp.largomobilis Skerman et al. 1983. Azospirillum lipoferum (Beijerinck 1925) Tarrand et al. 1979, species. (Type species van het genus ) 2

2.2 Fysiologische kenmerken van Azospirillum I. Inleiding De leden van het stikstoffixerende genus Azospirillum zijn bodembacteriën die in associatie leven met het wortelstelsel van een aantal gastheerplanten, vooral tropische grassen. Zoals de meeste rhizosfeer bacteriën produceert dit genus fytohormonen. De excretie van planthormonen door de bacteriën kan enerzijds de groei van de gastheerplant en mede hierdoor de totale opbrengst van een gewas positief beïnvloeden. Verschillende bacteriële IAA biosynthesewegen zijn reeds beschreven. Het gesynthetiseerde IAA kan ook als aminozuur- of suikerconjugaat opgeslagen worden. Azospirillum gebruikt nutriënten die door de plant worden uitgescheiden en fixeert atmosferische stikstof (Fogher et al.1995) De afbraak van planten polysaccharides afkomstig van planten voorziet de bacteriën van nieuwe koolstofbronnen. Binnen het genus Azospirillum is de afbraak van pectine en polygalacturonaat het best gedocumenteerd voor A. irakense (Keijers et al. 1995). De bacteriën reageren chemotactisch op wortelexudaten en aërotactisch op de gereduceerde zuurstofconcentratie die nodig is voor stikstoffixatie (Vande Broeck et al. 1995). Er is geen absolute gastheerspecificiteit maar Azospirillum vertoont een hogere chemotactische respons voor de componenten die in wortelexudaten van de geprefereerde planten aanwezig zijn (Heinrich en Hess 1985, Reingold et al. 1985). De stikstoffixatie is het meest uitgesproken bij enkele tropische grassen en bij suikerriet. De bacterie kan echter ook worden geïsoleerd uit het wortelstelsel van een groot aantal planten uit gematigde gebieden zoals mais.( Fogher et al.1995). Fig. 1.2 : Confocaal beeld van een dwarse doorsnede van een mais wortel geïnoculeerd met A. brasilense gekleurd met antibodies tegen een glycoproteïne van de celwand van Azospirillum. De bacteriën liggen aan de buitenzijde van de wortel (aangeduid met de pijlen) en zijn op deze foto rood gekleurd. (bron: internet) De aanhechting van Azospirillum aan plan-tenwortels gebeurt in twee duidelijk te onderscheiden fases. De eerste, de adsorp-tiefase, omvat een zwakke binding van de bacteriën aan de wortels. Tijdens de tweede 3

fase, of verankeringsfase, geraken de bacteria onomkeerbaar gebonden aan het wortel-oppervlak. Een tot I. Inleiding nog toe niet gekarak-teriseerd calcofluor-bindend oppervlakte polysaccharide wordt verantwoordelijk geacht voor deze verankering. Bij de adsorptiefase is waarschijnlijk de tussen-komst van het polair flagellum belangrijk (Vande Broeck et al. 1998). Azospirillum werd reeds getest als inoculum voor granen en grassen in uiteenlopende klimatologische- en agronomische omstandigheden. Uit verschillende onderzoeken blijkt een positief effect op zaadopbrengst en proteïne gehalte van de vegetatieve organen (Fogher et al.1995). Commerciële Azospirillum inocula, onder de naam Azogreen-N en Biogold, worden reeds toegepast in de maïsteelt in landen zoals Frankrijk en India. Bij inoculatie van de wortels met Azospirillum is er een toename van het aantal wortelharen en de wortellengte ( Bellone et al. 1995). Dit vergroot het absorptieoppervlak, hetgeen de opname van nutriënten en water bevordert. De plant kan dus in meer ariede gebieden groeien en is sterker en groter. De planten waaraan Azospirillum werd gegeven zijn even produktief als diegene die stevig bemest werden. Onderzoekers hebben vastgesteld dat zij minder meststoffen kunnen toedien en toch goede opbrengsten kunnen krijgen. Dit zou landbouwers in ontwikkelingslanden kunnen helpen hun opbrengst te verhogen zonder hun kosten merkelijk op te drijven. Het gebruik van minder meststoffen verlaagt de hoeveelheid nutriënten die het oppervlakte- en drinkwater vervuilen in meer ontwikkelde landen. Spijtig genoeg is de opbrengst niet echt constant. Bepaalde velden reageren heel goed op het toevoegen van Azospirillum. Andere velden reageren helemaal niet. Deze variatie in respons op Azospirillum inoculatie zijn te wijten aan de grote variatie in bodem- en microflora componenten. Bij kolonisatie van de wortels van aardbeien stelt men een toename in grootte en aantal van de wortelharen vast, samen met gewijzigde morfolgie van de wortelharen (vertakte, gekrulde of spatelvormige-) en infectiedraad vorming bij een aantal. Bij gemengde infectie van A. brasilense en Glomus intraradix (een VAM-fungus) is er een positieve interactie die het interne- en externe kolonisatieproces versnelt (Bellone et al 1995). De verhoogde groei van de gastheerplant in aanwezigheid van Azospirillum wordt toegeschreven aan een verhoogde IAA concentratie en niet aan een verhoogde stikstof toevoer. Dit werd aangetoond door waarnemingen met een mutant met een verlaagde auxineproduktie. (Vande Broek et al. 1995) 4

2.3. Hormonen I. Inleiding Plantenhormonen zijn organische substanties die actief zijn in uiterst kleine hoeveelheden (<1mM en vaak zelfs <lpm), die gevormd worden in een bepaald deel van de plant en meestal getransloceerd worden naar andere sites waar ze specifieke biochemische, fysiologische en/of morfologische reacties teweeg brengen (Davies 1995). Naast hun deelname in reacties veroorzaakt door omgevingsfactoren, zijn ze ook de voornaamste stoffen die de expressie reguleren op het moleculaire niveau van de plant (Moore 1989). De natuurlijke plantenhormonen worden gewoonlijk in 5 groepen ingedeeld, nl. auxines, gibberellinen, cytokininen, abscicinezuur en ethyleen. Naast deze 5 zijn er nog andere stoffen die in aanmerking komen als plantenhormonen, nl. polyaminen, jasmonaten, salicylzuur, brassinosteroiden en lipo-chitooligosacchariden. (Davies 1995, Rohrig et al. 1995). Azospirillum produceert auxines, gibberellines en cytokinines. Deze thesis beperkt zich tot de auxines en de cytokinines. 2.3.1. Auxines Naast IAA (indool-3-azijnzuur) (Figuur 6) zijn ook IBA (indool-3-boterzuur) en 4-Cl-IAA natuurlijk voorkomende auxinen (Davies 1995). Fig. 1.3 : De drie natuurlijke auxines. In de plant komen naast het vrije IAA, dat de primaire actieve vorm is, ook conjugaten voor die een bron zouden kunnen zijn van vrij IAA zonder dat er nood is aan een de novo synthese. De conjugaten kunnen zowel esters als amiden zijn. Deze geconjugeerde vorm wordt door de plant gcbruikt als transportmiddel naar een bepaald weefsel en biedt tevens bescherming tegen peroxidase. De voornaamste precursor van IAA is tryptofaan, waarbij de biosynthese in planten voornamelijk plaatsgrijpt in bladprimordia, jonge bladeren en in ontwikkelende zaden. Ook andere biosynthesewegen, waarbij het tryptofaan niet betrokken is, zijn bekend (Wright et al., 1991; Michalczuk et al., 1992; Normanly et al., 1993) Er kan een onderscheid gemaakt worden tussen invloed op cellulair niveau enerzijds en op het niveau van de plant en haar organen anderzijds. Op cellulair niveau bevorderen auxinen de celstrekking. Hierdoor wordt ondermeer de stengel- en wortelgroei bevorderd. Tevens beïnvloeden zij ook de celdeling. Auxine diffundeert in de lente van de stengeltop naar het cambium en bevordert hier de celdeling, zodat secundair xyleem en floëem ontstaan(davies 1995). Op niveau van de plant en organen spelen auxinen een rol in de groeicorrelatie. Dit is een verschijnsel waarbij de groei van het ene plantenorgaan (vb.zijmeristeem) afgestemd wordt op deze van een ander (apikale meristeem). IAA zorgt voor de communicatie tussen deze twee plantenweefsels. Auxinen bevorderen de wortelhaarvorming, vruchtgroei en vertragen de vruchtrijping, Samengevat zijn de functies van Auxines (Davies 1995): -Celdeling en celstrekking. -Differentiatie van floëem en xyleem -Wortelinitiatie -Apikale dominantie 5

-Uitstel van bladsenescentie 2.3.1.1 Auxine en wortelontwikkeling I. Inleiding Het plantenhormoon auxine controleert vele aspecten van de ontwikkeling en fungeert deels door inductie van de expressie van verschillende genen (Van den Berg et al. 1998). Auxine reguleert processen zoals wortelvorming, vasculaire ontwikkeling en gravitropie. Wortels gebruiken gespecialiseerde zwaartekracht gevoelige columella cellen in het wortelmutsje om de wortel oriëntatie te sturen. Na gravistimulus zetten de columella cellen, actief groeiende weefsels in de elongatie zone aan tot differentiële groei in de elongatie zone. Dit resulteert dan in een correcte buiging. IAA reguleert de zwaartekracht geïnduceerde buiging door inhibitie van wortelcel elongatie. Studie van een agravitrope Arabidopsis mutant van het AUX1 gen en experimenten met T-DNA leiden tot isolatie van het AUX1 polypeptide. Het heeft een sequentie dat lijkt op planten- en fungale aminozuur permeasen. Dit suggereert een transportfunctie voor een aminozuur-achtige molecule (tryptofaan) (Bennett et al. 1996). Arabidopsis thaliana semidominante SHY2 (short hypocotyl) mutaties veroorzaken bladvorming bij in het donker gegroeide planten. Dit suggereert dat SHY 2 een belangrijke rol speelt bij de regulatie van de ontwikkeling. Het SHY 2 gen codeert voor IAA3, een gekend lid van de auxine / IAA familie van auxine geïnduceerde genen. Tian en Reed (1999) isoleerden SHY2 mutaties met functieverlies. Terugmutaties en verliesmutaties beinvloeden de auxine afhankelijke wortelgroei, vorming van zijwortels en de timing van gravitropie. Dit wijst erop dat SHY2/IAA3 verschillende auxine responsen in wortels reguleert. De verschillende fenotypes van de mutanten zijn een indicatie voor het vermogen van SHY2/IAA3, verschillende auxine responsen te activeren en andere responsen te onderdrukken. Modellen die rekening houden met weefselspecificiteit, feedback inhibitie of de controle van auxinetransport zouden deze resultaten kunnen verklaren. 2.3.1.2 Bacteriële IAA-biosynthese De biosynthesewegen voor IAA bij Azospirillum zijn nog grotendeels onbekend. Drie ervan werden aangetoond door Prinsen et al. (1993) : De indoolacetamide (IAM)-biosyntheseweg Een tweede tryptofaan afhankelijke syntheseweg Een tryptofaan-onafhankelijke syntheseweg Deze laatste is, in afwezigheid van exogeen tryptofaan in het bacterieel medium, de belangrijkste weg voor IAA biosynthese. Aan het F.A. Janssens Laboratorium voor Genetica te Leuven werd het indool-pyruvaat decarboxylase gen gecloneerd uit A. brasilense. In de overeenkomstige mutant (SpM7918) is de IAA biosynthese gereduceerd tot 10% van de wildtype produktie. Deze gegevens vormen de basis voor verder onderzoek betreffende de precursor van het indool-pyruvaat en het effect van indool-pyruvaat (en indoollactaat) accumulatie in de cel op IAA biosynthese. 6

2.3.2. Cytokinines I. Inleiding Cytokinines zijn substanties die in de aanwezigheid van optimale auxineconcentraties celdeling induceren in tabaksmergcellen of gelijkaardige systemen gekweekt op een optimaal gedefinieerd medium (Horgan, 1984). Naast de cytokinine basen komen ook ribotiden, ribosiden en glucosiden voor. Cytokininen kunnen voorkomen in vrije vormen, maar ook als constituenten van sommige trnas. De biosyntheseplaatsen zijn de worteltoppen en ontwikkelende zaden, waarbij adenosine-monofosfaat de belangrijkste precursor is (Figuur 1.4) in de bacteriele biosyntheseweg. De biosyntheseweg in planten is nog niet aangetoond. Fig. 1.4: De novo cytokinine biosynthese bij bacterien (Davies, 1995) Fig.1.5: Biosynthese en metabolisme van cytokininen (Letham k Palni, 1983) 7

I. Inleiding Men kan [9R-5 P]iP beschouwen als precursor van de overige vrije cytokininen. [9R-5 P]iP kan ook gehydroxyleerd worden tot zeatine derivaten. Vanaf dit punt zullen een aantal metabole reacties plaatsgrijpen waarbij men zowel aglyconen (d.i. Z en ip), glucosiden, ribosiden, ribotiden en aminozuurconjugaten als reductie- en oxidatie producten bekomt (Figuur 4). Deze metabolische reacties kunnen in 4 categorieen ingedeeld worden namelijk: conjugatie, hydrolyse, reductie en oxidatie (McGaw and Burch, 1995). Ribosiden en hun 5 fosfaten (ribotiden) zijn waarschijnlijk de meest voorkomende natuurlijke cytokininen (Letham et al.,1983; McGaw et al.,1984; Scott et al.,1984). De conjugatie van de ribosylgroep gebeurt steeds op de 9 positie van de purinering. Het enzyme adenine phosphoribosyl transferase (APRT) is verantwoordelijk voor de conversie van de basen naar hun nucleotide vorm. Glucosylatie is niet enkel beperkt tot de 9 positie van de purinering zoals bij de ribosylconjugaten. 7- en 9- glucosiden en de zijketen 0-glucosiden zijn de natuurlijke glucosiden. 3-glucosiden zijn waargenomen als metabolieten van extern toegevoegde cytokininen (Letham et al., 1982; McGaw et al., 1984). N- glucosylconjugatie, bekomen door de werking van glycosyltransferasen, wordt beschouwd als een belangrijke vorm van regulatie van de cytokinine activiteit. 7-en 9-glucosiden zijn biologisch inactief en enorm stabiel in de weefsels waarin ze gevormd zijn (Letham et al., 1983; Parker et al., 1973). In tegenstelling blijken 0-glucosiden eerder opslagvormen te zijn die een bron kunnen vormen van actieve cytokininen (Letham et al., 1983). Dooeel lsst teel llinnggeenn vvaann ddi itt thheessi t issoonnddeerrzzooeekk We bekijken de associatie van Azospirillun met een gastheerplant. In de eerste plaats gaan we na welk voordeel een plant haalt uit deze associatie. Aan de hand van zaai- en inoculatieexperimenten, reeds gerapporteerd door Leuvense onderzoekers en waarvan wij de resultaten proberen te reproduceren, gaan wij na onder welke omstandigheden een groeibevorderend effect kan vastgesteld worden op de wortels van Triticum vulgare cv. Rubino kiemplanten door Azospirillum brasilense (Sp 245 ). Wij gaan na of een gelijkaardig effekt bekomen wordt door toedienen van het fytohormoon indool-3-azijnzuur, tryptofaan en zijn intermediairen. We bekijken ook, in welke mate wortelexudaatcomponenten de IAA-produktie door de bacterie verhogen. Het aandeel van tryptofaan in een verhoogde IAA-produktie gaan we na door toevoeging van verschillende concentraties tryptofaan aan een vloeibare bacteriecultuur. Dit vergelijken we met het gehalte aan indoolcomponenten van het wortelexudaat van de planten bij zaaiproeven. We gaan de relevantie van dit soort experimenten na. Waarschijnlijk ligt de concentratie van het tryptofaan dat in gelijkaardige proeven werd toegedient veel hoger dan in de natuur het geval is. De maximaal beschikbare hoeveelheid tryptofaan voor de bacterie wordt bepaald door het gehalte aan tryptofaan conjugaten in de wortel te bepalen. Het is bekend dat Azospirillum brasilense ook cytokinines produceert. We meten of de concentraties die worden uitgescheiden significant genoeg zijn om een werkelijke invloed uit te oefenen op de plant. Daarbij is vooral de auxine/cytokinine balans belangrijk. 8

IIII.. Matteerri ialeen een Meetthodeen II. Materialen en Methoden Grrooeei imeeddi iaa Vloeibaar Medium Azospirillum wordt gegroeid in een minimaal medium. Samenstelling van 1 liter MMAB-medium 850 ml H 2 O 50 ml AB-fosfaten 60 g/l K 2 HPO 4 20 g/l NaH 2 PO 4 50 ml AB-zouten 20 g/l NH 4 Cl 6 g/l MgSO 4. 2 H 2 O 3 g/l KCl 0.2 g/l CaCl 2 0.05 g/l FeSO 4. 2 H 2 O 50 ml 10 % malaat oplossing Agar Telling van aantal CFU s (colony forming units) Zowel minimale als rijke agar zijn bruikbaar. Minimale agar is selectief ttz. weinig bacteriën kunnen malaat als enige koolstofbron gebruiken. ( 8.5 g agar / liter MMAB ) Op rijke agar groeit Azospirillum iets sneller, een voordeel bij telling van aantallen bacteriekolonies. Agar gebruikt voor zaai- en inoculatieëxperiment 8.5 g/l agar 4.3 g/l MS-zouten Wasbuffer voor bacteriën 1.24 g/l K 2 HPO 4 0.39 g/l KH 2 PO 4 8.8 g/l NaCl ph = 6.8 Hoagland planten voedingsmedium 1/1= per 0.5 l 50ml macroelementenoplossing 0.3 ml Fe-DPTA oplossing 0.5 ml sporenelementen oplossing Macroëlementen Per liter KNO 3 10.2 g Ca(NO 3 ) 2. 4 H 2 O 7.08 g NH 4 H 2 PO 4 2.3 g MgSO 4. 7H 2 O 4.9 g Fe-DPTA oplossing Per 100 ml CHELAL Fe(L) 2.545 ml Fe 2.73 E-3 M of 0.153 g Sporenelementen Per liter H 3 BO 3 2.86 g MnCl 2. 4H 2 O 1.81 g CuSO 4. 5H 2 O 0.08g H 2 MoO 4. H 2 O 0.09 g ZnSO 4. 7H 2 O 0.22g 1

MPCL planten voedingsmedium II. Materialen en Methoden Stockoplossing per ½ liter 1. Ca(NO 3 ) 2. 4H 2 O 82 g KNO 3 10.1 g 2. K 2 SO 4 17.4 g MgSO 4. 7H 2 O 24 g 3. PH 6.8 K 2 HPO 4 KH 2 PO4 NH 4 NO 3 KCl 26.11 g 20.4 g 24 g 14.8 g 4. Na Fe (III). EDTA 0.4035 g 5. H 3 BO 3 1.72 g MnSO 4. H 2 O 0.325 g ZnSO 4. 7H 2 O 0.425 g CuSO 4. H 2 O 0.18 Na 2 MoO 4. 2H 2 O 0.09 g ph = 6.8 Deze oplossing bleek echter onbruikbaar. Als controle werd ze een tweede maal aangemaakt. Telkens vormde zich een neerslag bij het samenvoegen van de verschillende stockoplossingen. Bij de planten groei experimenten werd uitsluitend gebruik gemaakt van Hoagland planten voedingsmedium. Deze oplossing gaf wel bevredigende resultaten. 2

II. Materialen en Methoden Heet t aaaannt taal l bbaacct teerri iëënn eenn ddee Oppt tisscchhee Deennssi iteei itt vvaann eeeenn vvl looeei ibbaarree ccuul ltuuuurr Indien er frequent een telling van het aantal CFU s in verschillende vloeibare culturen op een bepaald tijdstip vereist is, kan men dit doen door de optische densiteit of de absorptie van licht bij een bepaalde golflengte in een medium te bepalen. Hoe groter het aantal bacteriën in een medium, hoe hoger de lichtabsorptie. Van een aantal overnacht vloeibare bacterieculturen werd een verdunningsreeks gemaakt. Telkens werd van die verdunde cultuur een deel uitgeplaat op een minimale agar met malaat, waarop na een nacht incubatie bij 30 C het aantal kolonies werd geteld. Bij 250μl van die cultuur werd in een Labsystems Multiskan RC de optische densiteit bij 600 nm gemeten. Via lineaire regressie kan de bepaling van het aantal CFU s in een cultuur voortaan via optische densiteits meting gebeuren. Bepaling van het Aantal Bacteriën adhv de Optische Densiteit bij 600 nm dmv Lineaire Regressie 1.00E+09 1.00E+08 Aantal bacteriën 1.00E+07 RSQ=0.97311982 1.00E+06 Aantal bacteriën geteld na uitplaten op een agar Aantal bacteriën=exp((1.56*ln(od-waarde))+20.4) 1.142 0.75 0.477 0.271 0.125 0.085 0.07 0.047 Optische Densiteit bij 600 nm fig. 2.1 : Het verband tussen de optische densiteit bij 600 nm en het aantal bacteriën in verschillende verdunningen van een overnacht bacterie precultuur. O.D. # bacteriën ln (OD) ln (# Bact.) lny=lnmlnx+lnb y=exp(lnmlnx+lnb) 1.142 870000000 0.13278111 20.58400377 20.63444454 915009069.6 0.75 480000000-0.28768207 19.98929666 19.97695537 474112583 0.477 210000000-0.74023879 19.16261809 19.26928071 233637356.9 0.271 87000000-1.30563646 18.28141868 18.38515374 96509667.12 0.125 48000000-2.07944154 17.68671157 17.17513469 28778372.1 0.085 21000000-2.46510402 16.860033 16.57206429 15745486.13 0.07 8700000-2.65926004 15.97883358 16.2684575 11622547.28 0.047 4800000-3.05760768 15.38412648 15.64555098 6234138.659 helling (lnm): 1.563725892 lnb: 20.42681127 Aantal bacteriën=exp((1.56*ln(od-waarde))+20.4) tabel 2.1 : dmv lineaire regressie kan het aantal bacteriën in een precultuur bepaald worden a.d.v. de optische densiteit. 3

II. Materialen en Methoden fig. 2.2 : Faze-contrast microscopische foto van een vloeibare cultuur van A. brasilense : Azospirillum brasilense zijn vrijlevende bacteriën. 1 CFU komt dus overeen met 1 bacterie. 11.. Zaaaai i-- eenn IInnooccuul laat tieeëëxxppeerri imeennt teenn 1.1 Triticum aviculare Dag 1 In de Laminaire air flow worden de zaden als volgt gesteriliseerd: Achtereenvolgens Drie minuten in 70% methanol. Drie maal spoelen met steriel gedestilleerd water. Een half uur in een 3% oplossing natrium hypochloriet met SDS (een detergent). Natrium hypochloriet breekt DNA af, terwijl het detergent de membranen verstoort. Drie maal spoelen met steriel gedestilleerd water. Een half uur imbiberen in steriel gedestilleerd water. In plastic petrischalen van 8.5 cm diameter wordt een rond filtreerpapiertje gelegd. Daarop wordt 2ml steriel H 2 O gepipetteerd. Per petrischaal worden vijf tarwezaden gelijkmatig verdeeld. De petrischalen worden ingepakt in aluminiumfolie om ze van het licht af te sluiten. Vervolgens plaatsen we ze één dag in een geaclimatiseerde groeikamer bij 21.5 C. Dag 2 Aan reeksen van drie petrischalen worden verschillende concentraties indool-3-azijnzuur en een aantal van zijn metabolische precursoren of verschillende hoeveelheden bacteriën in 1ml wasbuffer voor bacteriën toegevoegd. De hormoon- en hormoon precursor oplossingen waren steriel. De producten werden eerst in een hoge concentratie (10-2 M) opgelost in MeOH met een druppeltje NaOH. Daarna werd dit tot de gewenste concentratie verdund met steriele wasbuffer voor bacteriën. Bij ieder experiment wordt als blanco 1ml wasbuffer toegevoegd. 4

II. Materialen en Methoden Concentratie in de toegevoegde 1 ml wasbuffer Bij het eerste experiment: 10-4 M AA 10-5 M AA 10-4 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-6 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-8 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-4 M Indool-3-acetamide (IAM) 10-5 M Indool-3-acetamide (IAM) 10-4 M Indool-3-pyruvaat (IpyA) 10-5 M Indool-3-pyruvaat (IpyA) 10-4 M tryptamine (tra) 10-5 M tryptamine (tra) 10-4 M tryptofaan (trp) 10-5 M tryptofaan (trp) Bij het tweede experiment: 10-4 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-6 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-8 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-9 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 48.10 3 Azospirillum-cellen Bij het derde experiment: 90 Azospirillum-cellen 900 Azospirillum-cellen 9.10 3 Azospirillum-cellen 90.10 3 Azospirillum-cellen Uiteindelijke concentratie in de petrischaal 1 / 3.10-4 M AA 1 / 3.10-5 M AA 1 / 3.10-4 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / 3.10-6 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / 3.10-8 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / 3.10-4 M Indool-3-acetamide (IAM) 1 / 3.10-5 M Indool-3-acetamide (IAM) 1 / 3.10-4 M Indool-3-pyruvaat (IpyA) 1 / 3.10-5 M Indool-3-pyruvaat (IpyA) 1 / 3.10-4 M tryptamine (tra) 1 / 3.10-5 M tryptamine (tra) 1 / 3.10-4 M tryptofaan (trp) 1 / 3.10-5 M tryptofaan (trp) 1 / 3.10-4 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / 3.10-6 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / 3.10-8 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / 3.10-9 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 48.10 3 Azospirillum-cellen 90 Azospirillum-cellen 900 Azospirillum-cellen 9.10 3 Azospirillum-cellen 90.10 3 Azospirillum-cellen tabel 2.2 Ook deze handelingen gebeuren in de steriele omgeving van de laminaire air flow. De petrischalen worden weer in aluminiumfolie ingepakt en gaan vijf dagen in de groeikamer waar de zaden in het donker kiemen. Dag 7 De wortels van de kiemplantjes worden gekleurd met kristalviolet opgelost in ethanol. De wortels worden mooi uitgespreid in een petrischaal (zonder filtreerpapiertje). De schaal wordt dan rechtstreeks op een scanner gezet en als transparant ingescand. De kleuring van de wortels verhoogt het contrast. Het meten van de wortellengte gebeurt met behulp van een Scion Image, een computerprogramma dat vrij via het internet te krijgen is. Scion Image is een beeldverwerkings en analyse programma voor PC s. Met de functie Freehand Line teken ik een lijn over een wortel. Die wordt gemeten en genummerd. (fig. 2.2) Voor ieder kiemplantje weet ik zo het aantal wortels en de lengte ervan. De resultaten worden als tekst file geëxporteerd en bewaard. Later worden ze in Excell ingelezen. 5

II. Materialen en Methoden fig. 2.2 : Geëtioleerde maiskiemplant in een petrischaal. De wortels zijn gekleurd met kristalviolet om het contrast te verhogen. 1.2 Zea mais Dag 1 In de Laminaire air flow worden de zaden van Zea mais als volgt gesteriliseerd: Achtereenvolgens Tien minuten in 70% methanol. Drie maal spoelen met steriel gedestilleerd water. Een half uur in een 3% oplossing natrium hypochloriet met SDS (natrium dodecyl sulfaat). Drie maal spoelen met steriel gedestilleerd water. Een uur imbiberen in steriel gedestilleerd water. In plastic petrischalen van 8.5 cm diameter wordt een rond filtreerpapiertje gelegd. Daarop wordt 2ml steriel H 2 O gepipeteerd. Per petrischaal worden drie mais zaden gelijkmatig verdeeld. De petrischalen worden ingepakt in aluminiumfolie om ze van het licht af te sluiten. Vervolgens werden ze twee dagen in een geaclimatiseerde groeikamer bij 21.5 C geplaatst om te kiemen. 6

II. Materialen en Methoden Dag 3 Er werd nagegaan of alle zaden gekiemd waren. Het kiemingspercentage lag merkelijk hoger dan bij de proeven met tarwe. De niet gekiemde zaden werden verwijderd en vervangen door gekiemde uit een andere petrischaal zodat elke petrischaal drie gekiemde zaden bevatte. Vervolgens werden IAA en tryptofaan in verschillende concentraties en verschillende hoeveelheden bacteriën in 1 ml wasbuffer voor bacteriën toegediend aan telkens reeksen van vier petrischalen. Bij de blanco s wordt 1ml wasbuffer toegevoegd. Concentratie in de toegevoegde 1 ml wasbuffer 10-6 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-8 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-9 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-4 M tryptofaan (trp) 10-5 M tryptofaan (trp) 10 5 Azospirillum-cellen Uiteindelijke concentratie in de petrischaal 1 / 3.10-6 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / 3.10-8 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / 3.10-9 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / 3.10-4 M tryptofaan (trp) 1 / 3.10-5 M tryptofaan (trp) 10 5 Azospirillum-cellen tabel 2.3 De petrischalen worden weer ingepakt en zeven dagen in de groeikamer gezet. Dag 11 De wortels van de geëtioleerde kiemplanten werden gekleurd zoals hierboven beschreven voor tarwe. Het inscannen gebeurde nu reflectief zoals bij een foto. Het meten van de wortellengte verliep identiek. 7

II. Materialen en Methoden 22.. Woorrt teel leexxuuddaat teenn 2.1 Kinetiek van de omzetting van Tryptofaan tot IAA door Azospirillum brasilense 2.1.1 Materialen en methoden Zes gesteriliseerde 250 ml erlemeyers met gleuven in de zijkant. Hierin worden verschillende concentraties tryptofaan opgelost in MMAB. 2.1.1.1 Bereiding van de tryptofaan stockoplossing Op 10 ml H 2 O oplossing 100mg tryptofaan 1 druppel (1N) NaOH (bevordert het oplossen van trp door de molecule polair te maken) Soniceren + vortex in een falcon buis (oplossen). Filtreren in Flow door een bacteriële filter (Schleicher & Schuell FP 030/3 porie diameter 0.2 µm) (steriliseren) Toevoegen van verschillende hoeveelheden oplossing aan 50 ml MMAB. Tabel 2.4 Tryptofaan eindconcentratie (μg/ml) 0 1 5 20 50 100 Toegevoegd volume stockoplossing / 50 ml MMAB (μl) 0 5 25 100 250 500 2.1.1.2 Overenten van bacteriën in de erlemeyers Aan de erlemeyers met 50 ml MMAB wordt 20 μl van een overnacht bacterie precultuur toegevoegd. 2.1.1.3 Staalname Op verschillende tijdstippen, na 30, 60 en 90 uur, wordt telkens 10 ml en 5 ml staal genomen. In een falcon buis worden de stalen vervolgens gecentrifugeerd bij 2000 g gedurende 10 minuten. De bacterie pellet en het supernatans worden gescheiden en apart ingevroren bij 70 C. Ook wordt telkens van iedere cultuur een 250 μl staal genomen voor het meten van de optische densiteit bij 600 nm m.b.v. een Labsystems Multiskan RC. 2.1.1.4 Zuivering van IAA en IAA precursoren Zuivering van het 5 ml supernatans. Aan het nog bevroren medium wordt 5 ml 0.1 M HCl en een aantal met zware isotopen gemerkte standaarden toegevoegd. Dit wordt gesoniceerd totdat het volledig ontdooid is. De stalen worden op een RP C18 kolom gebracht die vooraf geconditioneerd is met achtereenvolgens aceton, ethanol en gedestilleerd water. Na het water mag de kolom niet meer droog worden. Dan wordt de kolom gespoeld met 0.05 M HCl. Van het tot 0.05 M HCl verdunde staal wordt resp. 2ml en 8 ml apart gezuiverd. 8

II. Materialen en Methoden Volgende standaarden werden toegevoegd. Bij het 2 ml deel : d (5) -Trp, 203 g/mol : 100ng of 4.95 μl 10-4 M (CDN isotopes) 13 C 6 - IAM 174 g/ mol : 10 ng of 11.5 μl 5E-6 M (gesynthetiseerd volgens Van Onkelen et al. 1984) 13 C 6 -IAN 156 g/mol : 100 ng of 7.12 μl 9E-5 M ( gift van N. Ilic, Maryland, USA) 15 N-AA : 100 ng of 6.6 μl microliter van een 15 ng/μl oplossing (CDN isotopes) Bij het 8ml deel: 100ng of 10 microliter van een 10 ng/μl 13 C 6 -IAA oplossing (CDN isotopes) Op een Vacmaster (een bak die vacuum getrokken wordt, waarop men de kolommen plaatst en waarin vloeistof wordt opgevangen) worden de kolommen geladen. Daarna spoelt men de kolommen tweemaal met 0.05 M HCl (kolom laten leeglopen). De kolom wordt geëlueerd met 2 x 1.5 ml Acetonitril (Methyl cyanide). Het eluens wordt opgevangen in een glazen buisje en wordt ingedroogd in de HETOVAC VR1 Lab Equipment. Na het indrogen worden de stalen terug opgelost in 100 μl 100% methanol met enkele druppels rokend HCl en gemethyleerd met diazomethaan (Schlenk & Gellerman 1960) en terug gedroogd. De stalen worden gemethyleerd om ze stabiel te kunnen bewaren. Om de stalen over te brengen in LC-MS flesjes, worden ze opgelost in 50 μl 100% methanol Zuivering van de pellet. Aan de pellet in de Falcon-tube wordt 1 ml zure MeOH toegevoegd. Dit is methanol met een kleine hoeveelheid rokend HCl. Ook worden alle standaarden toegevoegd. d (5) -Trp, 203 g/mol : 100ng of 4.95 μl 10-4 M (CDN isotopes) 13 C 6 - IAM 174 g/ mol : 10 ng of 11.5 μl 5E-6 M (gesynthetiseerd volgens Van Onkelen et al. 1984) 13 C 6 -IAN 156 g/mol : 100 ng of 7.12 μl 9E-5 M ( gift van N. Ilic, Maryland, USA) 15 N-AA : 100 ng of 6.6 μl microliter van een 15 ng/μl oplossing (CDN isotopes) 13 C 6 -IAA :100ng of 10 microliter van een 10 ng/μl oplossing (CDN isotopes) De Falcon buis wordt in ijs geplaatst. Om de bacteriecellen te vernietigen wordt de pellet gesoniceerd met een Vibra cell 400 Watt gedurende 3 minuten telkens met een puls van 5 seconden aan en 5 seconde af. De sonde wordt daarna afgespoeld met 0.05 M HCl en dit wordt in de Falcon-tube opgevangen. Het geheel wordt aangelengd tot 10 ml en wordt gecentrifugeerd bij 3000 g gedurende 10 minuten. Alleen het supernatans wordt op de kolom geladen om te voorkomen dat zij verstopt en verder onbruikbaar wordt. Het verdere verloop van de handelingen is identiek aan de zuivering van het medium. 2.1.1.5 Detctie en kwantificatie van IAA en IAA precursoren (Prinsen et al. 1997,1998) 2.1.1.5.1 Massa spectrometrie Het gebruik van massa- spectrometrie kan zowel kwantitatieve als kwalitatieve informatie geven. Door de koppeling met HPLC bekomen we een hoge specificiteit en nauwkeurigheid. Een massaspectrometer maakt gebruik van magnetische en elektrische velden om krachten uit te oefenen op geladen deeltjes in vacuüm. Hiervoor moeten de moleculen geïoniseerd zijn alvorens zij door de massaspectrometer kunnen geanalyseerd worden. Maar nog belangrijker is dat deze moleculen in de gasfase in het vacuümsysteem worden geïntroduceerd. Voor gassen en vluchtige componenten is dit geen probleem, maar sommige stoffen zijn daarenboven nog thermolabiel. Deze stalen dienen te worden gedesolvateerd voor zij geanalyseerd kunnen worden. Alhoewel ionisatie en desolvatatie aparte processen zijn, wordt de term ionisatie methode frequent gebruikt om naar deze beide processen te verwijzen. De keuze van het type ionisatie is afhankelijk van de te analyseren componenten en van de informatie die men wil bekomen via de analyse. 9

II. Materialen en Methoden Nadat de ionen in de bron zijn geïoniseerd komen zij in de quadrupool terecht. Een quadrupool bestaat uit 4 evenwijdige staven die een bepaalde lading dragen. Door de lading van de staven onderling te regelen, kan men een bepaalde massa selecteren die de detector bereikt. Om een bepaald staal te meten kan men gebruik maken van Select Ion Monitoring (SIM) of een scan. Wanneer men gebruik maakt van SIM, fixeert men de quadrupool op een bepaald ion met een bepaalde massa. Men stelt dus vooraf in welke massa het ion moet hebben wil het gedetecteerd worden. Bij een scan detecteerd men alle mogelijke massa s die op de detector terecht komen. Fig. 21.1. Voorstelling quadrupool massa- analysator. Nadat alle stalen gemeten werden op LC-MS/MS worden de pieken in het massaspectrum geïntegreerd m.b.v. het computerprogramma MassLynx en kan de IAA concentratie berekend worden met behulp van volgende vergelijkingen: (Oppervl.x/Oppervl.y) = (x/y) (1) (Oppervl.x/Oppervl.y)*y= x (2) Hierin is: Oppervlak x = geïntegreerde piekoppervlak van het niet gemerkt IAA Oppervlak y = geïntegreerde piekoppervlak van het 13 C-IAA x = hoeveelheid (in mol) IAA dat initieel in het staal aanwezig was y = hoeveelheid (in mol) 13 C-IAA toegevoegd als tracer 10

II. Materialen en Methoden 2.1.1.5.2 LC-MS/MS In deze analyse maken we gebruik van een zachte ionisatietechniek zoals Electrospray Ionisatie. Deze techniek zorgt voor een kleine tot geen fragmentatie. Deze methode maakt het mogelijk om erg grote en labiele moleculen te analyseren. Het staal, in oplossing, komt uit een hoog spanning capillair in een sterk elektrisch veld en dit onder atmosferische omstandigheden. Hierdoor ontstaat een aërosol van sterk geladen druppels. De verdamping van het solvent resulteert in ionen, die meestal verschillende ladingen dragen. Deze ionen worden via lenzen op de eerste quadrupool massa analysator gericht die door een prefilter beschermd wordt tegen contaminatie. Fig. 24.1. Schematische voorstelling van een electrospray massaspectrometer. De analyse van alle stalen gebeurt door middel van micro LC-MS / MS (Prinsen et al. 1998). Specificaties zijn: LC instruments HPLC autosampler Kontron 465, HPLC Pump Kontron 422, HPLC detector Kontron 325 Analytische Kolom: Hypersil 5 µm C 8 BDS 150 x 1 mm I.D. (Alltech, Deerfield, IL., USA) Prekolom: Hypersil 5 µm C 8 BDS 150 x 3 mm I.D. (Alltech, Deerfield, IL., USA) Solvent: van 10 tot 80 % in 2.5 minuten Debiet: 100µl / minuut Massaspectrometrie: Fisons VG Quattro 2 Ionisatiemode: electrospray + Brontemperatuur: 80 C Capillaire spanning: 3.57 kv Cone spanning: 20 V Bij een collisie energie van 20 ev worden tandem massa spectra van het geprotoneerd moleculair ion ([MH]+) bekomen. De kwantificatie gebeurde door multiple reactant monitoring (MRM). 11

2.2 De invloed van wortelexudaten op de IAA produktie van bacteriën II. Materialen en Methoden Met wortelexudaten bedoelen we het totaal gehalte aan stoffen die al dan niet aktief uitgescheiden worden door de wortels in het omringende medium. F 1 -Hybride mais zaad 7 Glazen Weck-bokalen Plastic roostertjes op pootjes Hoagland planten voedingsmedium 2.2.1. Verkrijgen van wortelexudaten De zaden werden gesteriliseerd zoals reeds beschreven en kiemden in het donker gedurende twee dagen. De glazen bokalen met daarin de roostertjes werden geautoclaveerd en werden in de laminaire air flow tot net onder de roostertjes gevuld met ± 150 ml geautoclaveerde Hoagland oplossing. Op het roostertje in de potten legde ik drie gekiemde zaden, ervoor zorgend dat minstens één worteltje door de rooster tot in de vloeistof kwam. De potten werden met een glazen deksel gesloten. De planten (fig. 2.2) groeiden vervolgens allemaal vrij gelijkmatig gedurende negen dagen in de groeikamer bij 21.5 C. Bij het oogsten bleken slechts twee potten niet door fungi geïnfecteerd te zijn. Daarom stel ik een aanpassing voor van het protocol om zaden te steriliseren, zoals dit aan de tuinbouw hogeschool in Melle wordt gedaan. Hierbij wordt een hogere concentratie natrium hypochloriet gebruikt. Pot 2 bevatte twee uitgegroeide planten (één van de zaden had blijkbaar niet voldoende contact kunnen maken met het groeimedium) en 150 ml medium, pot 1 drie planten en 170 ml medium. Het Hoagland medium (met de wortelexudaten) van de twee potten werd verdeeld over falcon buizen van 50 ml. Telkens twee per pot ter analyse van het tryptofaan gehalte en één om aan een Azospirillum cultuur toe te dienen. 2.2.2 Analyse van de Indoolcomponenten Het medium was lichtjes troebel en werd 10 minuten bij 3000 g gecentrifugeerd. Er was na centrifugatie echter geen pellet zichtbaar. Het gehalte aan Trp en IAA werd bepaald zoals hierboven reeds beschreven in 2.1.1.4 en 2.1.1.5. In het medium is echter nog een tweede bron van Trp aanwezig in de vorm van eiwitten. Om een idee te krijgen van deze potentiële tryptofaan bron, werd er een alkalische hydrolyse uitgevoerd van het wortelexudaat. Aan 5ml wortelexudaat werd 5ml 14N NaOH toegevoegd en in dit alkalische milieu werd het staal gehydrolyseerd gedurende 3 uur, op 100 C en onder een waterverzadigde stikstof atmosfeer. Opnieuw op kamertemperatuur werd het staal verdund met ongeveer 20ml H 2 O en met 2N HCl getitreerd tot ph 2. De verdere zuivering verliep gelijkaardig met 2.1.1.4. De wortels van de planten die voor het verkrijgen van wortelexudaten gebruikt werden, werden per pot in vloeibare stikstof ingevroren en met een vijzel fijngemalen. De wortel werd dan overgebracht in een eppendorf met 1 ml 80% MeOH. Het Trp werd overnacht en op 20 C door MeOH geëxtraheerd. De volgende ochtend werden de interne standaarden toegevoegd voor de uiteindelijke rendementsbepaling. 1/2 hiervan werd hiervan af genomen voor de bepaling van de vrije Trp conc (zie 2.1.1.4) en de andere helft werd onderworpen aan een alkalische hydrolyse. De alakalyse hydrolyse en verdere zuivering gebeurden zoals beschreven in 2.2.2. 2.2.3 Toedienen van wortelexudaten aan een vloeibare Azospirillum cultuur Van elk van beide potten werd 42.5 ml medium filter gesteriliseerd (Schleicher&Schuell FP 030/3 porie grootte 0.2 µm). Daarna werden 3 geconcentreerde stockoplossingen toegevoegd nl.: 2.5 ml AB-zouten, 2.5 ml AB-fosfaten en 2.5 ml malaat, waarvan de samenstelling beschreven is onder de paragraaf Groeimedia. Het resultaat is dan een oplossing met eenzelfde concentratie als MMAB-medium (plus de wortelexudaten en de zouten uit het Hoagland medium). Als blanco nam ik 50 ml MMAB-medium. Het vervolg van het experiment verliep identiek aan de vorige proef vanaf 2.1.1.2. 12

II. Materialen en Methoden 2.2.3.1 Overenten van bacteriën in de erlemeyers Aan het medium, in gesteriliseerde erlemeyers met gleuven in de zijkant, werd 20 μl van een overnacht bacterie precultuur toegevoegd. fig. 2.2: Een pot met maisplantjes. Op deze manier werden wortelexudaten verkregen. Zowel van de exudaten als van de wortels zelf werd het tryptofaangehalte bepaald. In het Hoagland medium waarin de planten groeiden (met de exudaten) werd daarna een bacteriecultuur gegroeid. 2.2.3.2 Staalname Na 30, 60 en 90 uur werd telkens 5 ml en 10 ml staal genomen en werd de Optische densiteit gemeten bij 600 nm in een Labsystems Multiskan RC. Na centrifugatie werden pellet en supernatans apart ingevroren bij 70 C. 2.2.3.3 Zuiveren en kwantificeren van IAA en IAA precursoren Het gehalte aan IAA en zijn metabolische precursoren gemeten zoals hierboven reeds beschreven in 2.1.1.4 en 2.1.1.5. 13

II. Materialen en Methoden 2.3 Het tryptofaangehalte van wortels 2.3.1 Materialen en methoden De wortels van de planten die voor het verkrijgen van wortelexudaten gebruikt werden werden per pot in vloeibare stikstof ingevroren en met een vijzel fijngemalen. 33.. Cyyt tookki inni inneepprroodduukkt tiee ddoooorr Azzoossppi irri illuum 3.1 Zuiveren van cytokinines De 10ml stalen van het experiment, beschreven in 2.1, werden geanalyseerd op hun gehalte aan cytokinines. Zowel het supernatans (de door de bacterie in het medium uitgescheiden cytokinines) als de pellet (het endogene gehalte aan cytokinines) werden geanalyseerd. Zuivering van het supernatans De standaarden worden toegevoegd aan het supernatans. 20 pmol 2 H 5 -zeatine, trans isomeer 98 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 3 -DL-dihydrozeatine, trans isomeer 98 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 5 -zeatine-riboside, trans isomeer 97 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 3 -DL-dihydrozeatine-riboside, trans isomeer 97 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 5 -zeatine-9-β-d-glucoside, trans isomeer 98 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 3 -DL-dihydrozeatine-9-β-D-glucoside, trans isomeer 98 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 5 -zeatine-riboside-5 -monophosfate, trans isomeer 95 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 3 -DL-dihydrozeatine-riboside-5 -monophosfate, trans isomeer 95 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 6 -N 6 -(2-isopentenyl)adenine, 98 %, (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 6 -N 6 -(2-isopentenyl)adenosine, 97 %, (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 6 -N 6 -(2-isopentenyl)adenosine-5 -monophosfate, 95 %, (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 6 -N 6 -(2-isopentenyl)adenine-glucoside, 98 %, (APEX organics, Devon, UK) 14