Biomarkers voor alcoholmisbruik

STAND VAN ZAKEN Biomarkers voor alcoholmisbruik Albert van de Wiel en Jos P.M. Wielders Het opsporen van chronisch alcoholmisbruik is moeilijk. Hiervoor zijn biochemische indicatoren, onderverdeeld in directe indicatoren (ethanol en metabolieten van ethanol) en indirecte indicatoren, die de effecten van alcohol op organen of de stofwisseling weerspiegelen. Klassieke indicatoren, zoals mean corpuscular volume en γ-glutamyltranspeptidase (γgt) hebben onvoldoende specificiteit en sensitiviteit. Ethylglucuronide (EtG) is een nieuwe directe indicator met een hoge specificiteit, die in urine bepaald kan worden. Tegenwoordig is koolhydraatdeficiënt transferrine (CDT) de meest relevante indirecte indicator. De sensitiviteit is 40-95% en de specificiteit 80-95%, afhankelijk van de onderzochte populatie. De combinatie met een γgtbepaling kan de sensitiviteit nog verhogen. Voor het monitoren van alcoholabstinentie op de korte termijn (tot 5 dagen) is de bepaling van EtG geschikt, voor de middellange termijn (2-3 weken) die van CDT. Beide bepalingen kunnen uitgevoerd worden op apparatuur voor biochemische routinebepalingen. Meander Medisch Centrum, Amersfoort. Afd. Interne Geneeskunde: dr. A. van de Wiel, internist. Afd. Klinische Chemie: dr.ir. J.P.M. Wielders, klinisch chemicus. Contactpersoon: dr. A. van de Wiel (a.vande.wiel@meandermc.nl). Alcoholmisbruik gaat gepaard met veel morbiditeit en sterfte. Het opsporen van met name chronisch alcoholmisbruik is echter niet altijd eenvoudig. De klachten en de symptomen zijn vaak aspecifiek en de diagnostische mogelijkheden zijn beperkt. Behalve naar specifieke anamnestische tests, zoekt men ook naar heel gevoelige en specifieke biochemische bepalingen. In dit overzichtsartikel gaan wij in op nieuwe ontwikkelingen in de bepalingsmethoden. Die kunnen niet alleen nuttig zijn bij het stellen van de diagnose alcoholmisbruik, maar ook bij het monitoren van abstinentie, bij forensisch onderzoek en bij het beoordelen van de rijvaardigheid. Bij dit laatste denken we niet alleen aan de acute situatie bij een verkeerscontrole, maar ook aan het vorderen en het weer teruggeven van het rijbewijs na een ernstige overtreding. Voor het vaststellen van chronisch overmatig gebruik van alcohol werd tot circa 1995 gebruikgemaakt van de bepalingen van het mean corpuscular volume (MCV), het γ-glutamyltranspeptidase (γgt) en de ratio tussen de enzymen aspartaataminotransferase (ASAT) en alanineaminotransferase (ALAT). Deze klassieke bepalingen schieten echter tekort in hun voorspellende waarde en kunnen hooguit een indicatie geven dat alcohol in het spel is. De bepaling van koolhydraatdeficiënt transferrine (CDT) bleek een aanwinst met een zeer hoge specificiteit en een sensitiviteit die tenminste vergelijkbaar is met die van γgt. 1 Voor de bepaling van CDT kwamen recent enkele nieuwe methoden op de markt die voor de klinische praktijk van belang zijn. Daarnaast staan geheel nieuwe NED TIJDSCHR GENEESKD. 2009;153:B160 1

ethanol EtG (urine) CDT ASAT-ALAT γgt MCV 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 globale duur verhoging (weken) FIGUUR Tijdsduur na alcoholinname waarbinnen een verhoging van een indicator meetbaar is. Alle aangegeven indicatoren worden bepaald in bloed, uitgezonderd ethylglucuronide (EtG). CDT = koolhydraatdeficiënt transferrine; ASAT-ALAT = aspartaataminotransferase-alanine aminotransferaseratio; γgt = γ-glutamyltranspeptidase; MCV = mean corpuscular volume. indicatoren zoals het ethylglucuronide op het punt geïntroduceerd te worden. In dit artikel geven wij een overzicht op basis van publicaties van de laatste 10 jaar. Biochemische bepalingen gericht op het opsporen van het gebruik van alcohol kunnen we verdelen in twee groepen. De eerste groep betreft directe indicatoren, namelijk bepalingen van alcohol en zijn metabolieten. De tweede groep bestaat uit indirecte indicatoren: bepalingen van biochemische veranderingen die secundair zijn aan de effecten van alcohol op organen of de stofwisseling. DIRECTE INDICATOREN Tot deze groep behoren klassieke bepalingen zoals die van alcohol en aceetaldehyde, maar ook een aantal nieuwe tests, waarvan de bepaling van ethylglucuronide de belangrijkste is. KLASSIEKE INDICATOREN Ethanol (ethylalcohol) kan na een recente inname van alcohol worden aangetoond in bloed, uitademingslucht of urine. De bepaling is zeer specifiek en goedkoop en is eenvoudig te gebruiken voor screening en forensisch onderzoek. Ethanol heeft een korte halfwaardetijd; de hoeveelheid in een standaardglas alcoholbevattende drank wordt in ongeveer 1 h afgebroken. Daarom leent deze bepaling zich niet voor het opsporen van chronisch alcoholmisbruik. Toch stelt de National Council of Alcoholism dat problematisch alcoholgebruik waarschijnlijk is als op een willekeurig moment een bloedconcentratie > 3 wordt geconstateerd. 2 Ook bij een promillage > 1,5 zonder tekenen van intoxicatie of > 1 bij een doktersafspraak moet men aan alcoholmisbruik denken. Aceetaldehyde is een direct afbraakproduct dat ontstaat door oxidatie van ethanol. Het bindt zich in het bloed voor een deel aan eiwitten zoals albumine en hemoglobine, wat leidt tot de vorming van geacetyleerde plasmaeiwitten, zogenoemde adducts. Van de bepaling van aceetaldehyde en adducts wordt nauwelijks gebruikgemaakt. Ook het bepalen van IgA-antistoffen gericht tegen aceetaldehyde vindt nauwelijks toepassing, ondanks een sensitiviteit van 65-73% en een specificiteit van 88-94%. 3 ALCOHOLMETABOLIETEN ALS NIEUWE INDICATOR Juist vanwege de hoge specificiteit zijn alcoholmetabolieten in theorie aantrekkelijke indicatoren om alcoholmisbruik op te sporen. Tot deze groep behoren de conjugatieproducten ethylsulfaat, -fosfaat en -glucuronide. Ethylglucuronide (EtG) is een directe metaboliet van ethanol, gevormd door conjugatie van ethanol met geactiveerd glucuronzuur. In bloed is EtG detecteerbaar tot 8 h na inname van alcohol en in urine zelfs tot 75-80 h na inname van een forse hoeveelheid (figuur). 4 Dit tijdsbestek maakt de urinebepaling van EtG interessant voor de klinische praktijk, vooral bij het monitoren van abstinentie. Een voordeel is ook dat er bij het bewaren van urine geen EtG kan ontstaan door vergisting, iets waar men bij alcoholmetingen in de urine wel rekening mee moet houden. Bij een urineweginfectie kan EtG in de urine versneld worden afgebroken, wat een foutnegatieve uitslag oplevert. 2 NED TIJDSCHR GENEESKD. 2009;153:B160

EtG werd tot voor kort alleen gemeten voor researchdoeleinden met gecombineerde vloeistofchromatografiemassaspectrometrie (LC-MS). Sinds kort is echter een immunochemische methode op de markt, die op apparatuur voor routinebepalingen kan worden uitgevoerd. Andere metabolieten zijn de vetzuur-ethylesters ( fatty acid ethyl esters ; FAEE), die ontstaan via non-oxidatieve metabolisering van ethanol. FAEE s zijn al snel na alcoholinname in bloed aan te tonen, tot ongeveer 24 h na inname. 5 Het bepalen van FAEE s is erg bewerkelijk en dat is een nadeel voor de dagelijkse praktijk. Dit geldt eveneens voor fosfatidylethanol (PEth), een uniek fosfolipide, dat alleen wordt gevormd in aanwezigheid van ethanol via de werking van fosfolipase-d. 6 De halfwaardetijd in humaan bloed bedraagt ongeveer 4 dagen, maar PEth is bij forse drinkers aantoonbaar tot 3 weken na het staken van het alcoholgebruik. Bij patiënten met alcoholafhankelijkheid hangt de serumconcentratie sterk samen met de alcoholinname. 7 INDIRECTE INDICATOREN De laatste jaren heeft men veel energie gestoken in het ontwikkelen van geheel nieuwe tests voor indirecte biomarkers, maar ook in het verbeteren van de nog tamelijk recente CDT-test. KLASSIEKE INDIRECTE BIOMARKERS Tot de klassieke en klinisch meest gebruikte indirecte biomarkers behoren het γgt, de ASAT-ALAT-ratio en het MCV. Een verhoogd MCV (> 100 fl) in afwezigheid van anemie vormde van oudsher een aanwijzing voor alcoholmisbruik of -afhankelijkheid. Het exacte mechanisme achter deze volumeverandering van rode bloedcellen is onduidelijk, maar zowel alcohol zelf als de metaboliet aceetaldehyde heeft directe toxische effecten op de erytropoëse en kan interfereren met het celmetabolisme. 8 Door de lange levensduur van de erytrocyt duurt het 2-4 maanden voor de waarde normaliseert na het staken van het alcoholgebruik. Een verhoging van MCV komt ook voor bij deficiënties van vitamine B 12 en foliumzuur, bij myelodysplasie, reticulocytose, hypothyreoïdie en bij het gebruik van methadon en heroïne. 9,10 De specificiteit van MCV is dus onvoldoende en deze bepaling is dan ook van beperkte waarde bij de diagnostiek van alcoholmisbruik (tabel). γgt is een membraangebonden enzym, betrokken bij het metabolisme van het antioxidatieve glutathion. Hoewel het in meerdere weefsels wordt aangetroffen, is γgt in serum vooral afkomstig van de lever. 11 De toename van de serumactiviteit van γgt bij alcoholgebruik is zowel het gevolg van een toegenomen synthese door enzyminductie als van het vrijkomen van het enzym door de toxische werking van alcohol op levercellen. Fors drinken in korte tijd ( binge -drinken) lijkt meer effect te hebben op de γgt-waarde dan regelmatig gebruik van alcohol. Toch zijn ook bij een matig gebruik (1-40 g/dag) stijgingen beschreven. 12,13 Zonder leverafwijkingen zoals steatose of cholestase is de halfwaardetijd van γgt ongeveer 4 dagen. 14 Bij alcoholabusus gedurende langere tijd of bij leverlijden kan dit oplopen tot 2 à 3 weken en normaliseren de waarden pas 4 tot 5 weken na het stoppen van alcoholinname. Doordat de γgt-waarde wordt beïnvloed door allerlei factoren, zoals leeftijd, geslacht, gebruik van anticonceptiva, koffieconsumptie en roken, variëren de sensitiviteit en specificiteit voor alcoholgebruik sterk tussen de verschillende onderzoeken. 9 Daarnaast kan de γgt-waarde verhoogd zijn bij metabole aandoeningen zoals diabetes mellitus, dyslipidemieën, overgewicht en non-alcoholische steatosis hepatis (NASH) en bij het gebruik van geneesmiddelen, zoals anti-epileptica. De ASAT-ALAT-ratio, ook wel de de-ritis-ratio genoemd, werd vroeger soms gehanteerd als marker voor alcoholgebruik. Een waarde > 2 zou wijzen op aanzienlijke leverschade door alcohol. Hierbij is de synthesecapaciteit van de lever afgenomen. Deze kan men meten met bepalingen van albumine en stollingsfactoren. Deze geven echter geen uitsluitsel over de oorzaak van de leverschade. Tegenwoordig staat vast dat ook een ASAT- ALAT-ratio > 2 vooral een uiting is van gevorderde leveraandoeningen. De correlatie met alcoholgebruik is zo TABEL Sensitiviteit en specificiteit van de bepaling van klassieke en nieuwe indicatoren voor chronsich overmatig alcoholgebruik indicator sensitiviteit specificiteit opmerking klassiek MCV 34-89 26-95 niet bewijzend voor alcoholmisbruik ASAT/ALAT-ratio 15-69 laag niet bewijzend voor alcoholmisbruik γgt 34-85 11-95 ondersteunend bewijs voor alcoholmisbruik nieuw CDT* CDTect 26-85 69-97 tot 1999 in gebruik %CDT Axis-Shield 39-94 82-100 tot eind 2008 in gebruik HPLC Helander 35-55 91-97 referentiemethode N-Latex 43-93 95-97 recent ingevoerd MCV = mean corpuscular volume ; ASAT = aspartaataminotransferase; ALAT = alanineaminotransferase; γgt = γ-glutamyltransferase; CDT = koolhydraatdeficiënt transferrine. *Hiervan worden 4 verschillende bepalingsmethoden weergegeven. NED TIJDSCHR GENEESKD. 2009;153:B160 3

zwak dat men de bepaling voor dit doeleinde als obsoleet moet beschouwen. 15 Gezien de vele plaatsen in ons lichaam waar alcohol invloed uitoefent, wekt het geen verbazing dat een groot aantal biochemische parameters veranderingen kan ondergaan. Echter, tussen het oorspronkelijke aangrijpingspunt van alcohol en de uiteindelijk gemeten effecten liggen vaak vele stappen en verstoringen, zodat veel parameters een lage specificiteit hebben. Dit maakt ze weinig geschikt voor de diagnostiek van alcoholmisbruik. Hooguit kunnen de veranderingen een vermoeden versterken. Dit geldt bijvoorbeeld voor urinezuur, IgA, en hdl-cholesterol. Cholesterolester-transferproteïne (CETP) regelt het transport van veresterd cholesterol van hdl naar vldl en ldl en de overgang van triglyceriden uit vldl en ldl naar hdl. Deze indicator is wellicht sensitiever en specifieker dan de andere genoemde, maar de concentratie wordt sterk beïnvloed door geneesmiddelen en ziekten en de bepaling ervan is te bewerkelijk voor de dagelijkse praktijk. 16 KOOLHYDRAATDEFICIËNT TRANSFERRINE ALS NIEUWE INDICATOR De belangrijkste en klinisch meest relevante nieuwe indirecte biomarker is CDT. Het ijzertransporteiwit transferrine bevat twee koolhydraatketens ( glycanen ), die gewoonlijk elk twee siaalzuurgroepen bevatten (tetrasialotransferrine). Omdat het aantal siaalzuurgroepen per molecuul transferrine kan variëren van 0 (asialotransferrine) tot 8 (octasialotransferrine) zijn er 9 isovormen bekend. Onder invloed van alcohol of het afbraakproduct aceetaldehyde ontstaan isovormen van transferrine waaraan één of beide koolhydraatketens ontbreken, vandaar de naam koolhydraatdeficiënt transferrine. 17 Met een toename van het alcoholgebruik stijgt vooral de isovorm disialotransferrine, die traditioneel samen met asialotransferrine en monosialotranferrine tot het CDT wordt gerekend. 18 Later onderzoek heeft geleerd dat alleen asialo- en disialotransferrine correleren met alcoholgebruik. De CDT-waarde kan op verschillende wijzen worden bepaald. Van oorsprong is de analyse gebaseerd op ladingsverschillen tussen de isovormen. Daardoor kan men met elektroforese of met een ionenwisselaarkolom fracties met een oplopend gehalte aan siaalzuur en dus transferrine-isovormen van elkaar scheiden. Dankzij een hoge specificiteit en een aanvaardbare sensitiviteit blijkt de test een duidelijke aanwinst bij de diagnostiek van alcoholmisbruik. Vóór 1999 werd de CDTect-test gehanteerd. Deze had als belangrijkste nadeel dat de uitslag werd beïnvloed door schommelingen in de transferrineconcentratie, zoals bij LEERPUNTEN De klassieke indicatoren voor chronisch overmatig alcoholgebruik zijn onvoldoende specifiek en sensitief. Er zijn bepalingen voor nieuwe biomarkers ontwikkeld. In de praktijk zijn de bepalingen van ethylglucuronide (EtG) en koolhydraatdeficiënt transferrine (CDT) het geschiktst. Hiermee kan men de diagnose alcoholmisbruik stellen en alcoholabstinentie monitoren. anemie, zwangerschap of maligniteit. Dit werd ondervangen bij de introductie van de %CDT-test volgens Axis-Shield, waarbij de CDT-fractie wordt weergegeven als percentage van het transferrine. 19 Voor gezonde, volwassen niet-drinkers loopt bij de axis-shield-test het referentiegebied tot 2,6%. Bij deze bepalingsmethode wordt echter tot 30% van het trisialotransferrine meegeteld in de CDT-fractie. Deze isovorm houdt echter weinig of geen verband met alcoholgebruik. Zowel verhoogde trisialofracties als incidenteel voorkomende onschuldige erfelijke varianten van transferrine leiden tot foutief hoge uitslagen bij de axis-shield-methode. 19 Men schat dat 2-5% van de %CDT-bepalingen met de axis-shieldmethode door deze storende factoren foutpositief of incidenteel foutnegatief wordt beïnvloed. Gedurende de laatste jaren zijn nieuwe en specifiekere methoden ontwikkeld, zoals de commerciële testkits voor de bepaling van CDT met hogedruk-vloeistofchromatografie (HPLC) of met capillaire elektroforese (CE), maar ook een directe immuno-inhibitiebepaling met nefelometrie (meting via strooilicht). Bij deze laatste methode, in de handel onder de naam N-Latex CDT, wordt direct het ontbreken van één of beide glycanen gemeten. 20 Het ontbreken daarvan leidt vermoedelijk tot een verandering van de structuur van het transferrinemolecuul, waardoor specifieke epitopen beschikbaar komen waaraan speciale antilichamen kunnen hechten. Deze moderne en specifiekere tests gaan de oude axisshield-test vervangen die nu nog in gebruik is, onder andere bij keuringen van het Centraal Bureau Rijvaardigheidsbewijzen (CBR). Bij betwiste CDT-resultaten gebruikt het CBR voor keuringen de nauwkeurig omschreven HPLC-methode van Helander. Om het door elkaar gebruiken van tests en daaruit voortvloeiende onduidelijkheden te voorkomen, is een internationale werkgroep van laboratoriumspecialisten bezig met het opstellen van een standaard en het definiëren van een referentiemethode. Ondanks de beperkingen van de oude methode is de CDT-bepaling al jaren de meest bruikbare biochemische bepaling voor het vaststellen van overmatig alcoholgebruik. De specificiteit is hoog, terwijl de sensitiviteit 4 NED TIJDSCHR GENEESKD. 2009;153:B160

beter of tenminste vergelijkbaar is met die van γgt. De sensitiviteit wordt sterk bepaald door de onderzochte populatie; de sensitiviteit neemt namelijk toe naarmate het alcoholgebruik groter is. 1 De CDT-concentratie neemt toe vanaf een dagelijks gebruik van 60-80 g alcohol; bij een dagelijkse inname < 40 g zijn de testresultaten minder eenduidig. 9 Bij onthouding daalt de CDT-concentratie doorgaans binnen 2 tot 3 weken naar een normale waarde, maar na zeer langdurig alcoholgebruik kan deze normalisatie langer duren. Behalve voor het volgen van patiënten die geen alcohol meer gebruiken, kan men de test ook inzetten bij postmortemonderzoek om chronisch alcoholmisbruik vóór het overlijden vast te stellen. 21 De sensitiviteit van de CDT-bepaling kan nog iets worden verbeterd door deze te combineren met een γgt-bepaling. 22 Bij twijfel, bij onderzoek ter bevestiging van een bepaling, forensisch onderzoek of in situaties met juridische implicaties zal de HPLC-methode volgens Helander worden ingezet, eventueel in combinatie met aanvullende tests. Gezien de complexiteit van de bepalingen, de hiervoor noodzakelijke analyseapparatuur en benodigde expertise kunnen deze bepalingen slechts in enkele centra plaatsvinden. Naast de verbeteringen in de CDT-bepaling zijn ook geheel nieuwe indirecte indicatoren ontwikkeld. Hiertoe behoren onder andere de siaalzuren, de siaalzuurindex van apolipoproteïne J, β-hexosaminidase, dolichol, uitscheiding van 5-hydroxytryptofol in de urine en de 5-hydroxytryptofol-5-hydroxyindolazijnzuurindex in de urine. Het bepalen van deze indicatoren is echter veelal bewerkelijk, zodat toepassing in de klinische praktijk op korte termijn onwaarschijnlijk is. CONCLUSIE Biochemische bepalingen kunnen een belangrijke bijdrage leveren bij het vaststellen van alcoholmisbruik. Bovendien kan laboratoriumonderzoek van nut zijn bij de controle op abstinentie en bij forensisch onderzoek. In acute situaties blijft de directe bepaling van alcohol het eenvoudigst en het goedkoopst. Voor het opsporen van chronisch overmatig gebruik is voor de praktijk de bepaling van CDT het beste alternatief; een CDT-bepaling paart een hoge specificiteit aan een goede sensitiviteit. De thans gangbare %CDT-methode van Axis-Shield wordt vervangen door de nieuwe en specifiekere HPLC-, CE- of N-Latex-methoden. Voor de klassieke markers zoals MCV, ASAT-ALAT-ratio en γgt is eigenlijk geen plaats meer vanwege de matige specificiteit. Hooguit kan γgt gebruikt worden als aanvulling op of in combinatie met CDT. Voor het monitoren van abstinentie kan men voor de korte termijn (tot 5 dagen) het best een directe alcoholmetaboliet als indicator gebruiken, zoals EtG in urine, en voor de middellange termijn (2-3 weken) een specifieke indirecte marker zoals CDT. Normalisatie van biomarkers zoals CDT en γgt bij abstinentie kan sterk verschillen van individu tot individu, afhankelijk van de ernst en de duur van het alcoholgebruik, de leverfunctie en medicijngebruik. De nieuwe CDT-tests en de EtG-bepaling kan men uitvoeren op standaardanalyseapparatuur en men kan ze daardoor overal in de dagelijkse praktijk inzetten. Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld. Aanvaard op 11 augustus 2008 Citeer als: Ned Tijdschr Geneeskd. 2009;153:B160 > Meer op www.ntvg.nl/klinischepraktijk LITERATUUR 1 Koch H, Meerkerk GJ, Zaat JO, Ham MF, Scholten RJ, Assendelft WJ. Accuracy of carbohydrate-deficient transferrin in the detection of excessive alcohol consumption: a systematic review. Alcohol Alcohol. 2004;39:75-85. 2 Criteria Committee, National Council on Alcoholism. Criteria for the diagnosis of alcoholism. Ann Intern Med. 1972;77:249-58. 3 Hietala J, Koivisto H, Latvala J, Anttila P, Niemelä. IgA s against acetaldehyde-modified red cell protein as a marker of ethanol consumption in male alcoholic subjects, moderate drinkers, and abstainers. Alc Clin Exp Res. 2006;30:1693-9. 4 Wurst FM, Kempter C, Metzger J, Seidl S, Alt A. Ethyl glucuronide: a marker of recent alcohol consumption with clinical and forensic implications. Alcohol. 2000;20:111-6. 5 Pragst F, Auwaerter V, Sporkert F, Spiegel K. Analysis of fatty acid ethyl esters in hair as possible markers of chronically elevated alcohol consumption by headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Forensic Sci Int. 2002;121:76-88. NED TIJDSCHR GENEESKD. 2009;153:B160 5

6 Gunnarsson T, Karlsson A, Hansson P, Johnson G, Alling C, Odham G. Determination of phosphatidylethanol in blood from alcoholic males using high-performance liquid chromatography and evaporative light scattering or electrospray mass spectrometric detection. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 1998;705:243-9. 7 Aradottir S, Asanovska G, Gjerss S, Hansson P, Alling C. Phosphatidylethanol (PEth) concentrations in blood are correlated to reported alcohol intake in alcohol-dependent patients. Alcohol Alcohol. 2006;41:431-7. 8 Niemelä O. Biomarkers in alcoholism. Clin Chim Acta. 2007;377:39-49. 9 Hannuksela ML, Liisanantti MK, Nissinen AE, Savolainen MJ. Biochemical markers of alcoholism. Clin Chem Lab Med. 2007;45:953-61. 10 Mihas AA, Tavassoli M. Laboratory markers of ethanol intake and abuse: a critical appraisal. Am J Med Sci. 1992;30:415-28. 11 Whitfield JB. Gamma glutamyl transferase. Crit Rev Clin Lab Sci. 2001;38:263-355. 12 Anton RF, Stout RL, Roberts JS, Allen JP. The effect of drinking intensity and frequency on serum carbohydrate-deficient transferring and gammaglutamyl transferase levels in outpatient alcoholics. Alcohol Clin Exp Res. 1998;22:1456-62. 13 Hietela J, Puukka K, Koivisto H, Anttila P, Niemelä O. Serum gammaglutamyltransferase in alcoholics, moderate drinkers and abstainers: effect on GT reference intervals at population level. Alcohol Alcohol. 2005;40:511-4. 14 Sharpe PC. Biochemical detection and monitoring of alcohol abuse and abstinence. Ann Clin Biochem. 2001;38:652-64. 15 Nyblom H, Berggren U, Balldin J, Olsson R. High AST/ALT ratio may indicate advanced alcoholic liver disease rather than heavy drinking. Alcohol Alcohol. 2004;39:336-9. 16 Hannuksela M, Kesäniemi YA, Savolainen MJ. Evaluation of plasma cholesteryl ester transfer protein (CETP) activity as a marker of alcoholism. Alcohol Alcohol. 1992;27:557-62. 17 Van Pelt J. Koolhydraat-deficiënt transferrine: een nieuwe biochemische marker voor chronisch overmatig alcoholgebruik. Ned Tijdschr Geneeskd. 1997;141:773-7. 18 Fleming MF, Anton RF, Spies CD. A review of genetic, biological, pharmacological, and clinical factors that affect carbohydrate-deficient transferrin levels. Alcohol Clin Exp Res. 2004;28:1347-55. 19 Delanghe JR, Helander A, Wielders JP, Pekelharing JM, Roth HJ, Schellenberg F, et al. Development and multicenter evaluation of the N latex CDT direct immunonephelometric assay for serum carbohydratedeficient transferrin. Clin Chem. 2007;53:1115-21. 20 Bengström JP, Helander A. Clinical characteristics of carbohydratedeficient transferring measured by HPLC: sensitivity, specificity, gender effects, and relationship with other alcohol biomarkers. Alcohol Alcohol. 2008;43:436-41. 21 Malcolm R, Anton RF, Conrad SE, Sutherland S. Carbohydrate-deficient transferrin and alcohol use in medical examiner cases. Alcohol. 1999;17:7-11. 22 Sillanaukee P, Olsson U. Improved diagnostic classification of alcohol abusers by combining carbohydrate-deficient transferrin and gammaglutamyltansferase. Clin Chem. 2001;47:681-5. 6 NED TIJDSCHR GENEESKD. 2009;153:B160