19.10-19.40 uur Resultaten uit de REMIS+ werkgroep Next Gen Sequencing: Kweek onafhankelijke detectie en identificatie van bacteriële species m.b.v. 16S-23S rdna NGS: kansen en uitdagingen Mirjam Kooistra-Smid, Medisch Moleculair Microbioloog, Certe 19.40-20.00 uur 16S-23S rdna NGS op klinische samples van orthopedische patiënten Glen Mithoe, arts-microbioloog, Certe 20.00-20.20 uur 16S-23S rdna NGS: meer dan je dacht Alewijn Ott, arts-microbioloog, Certe
Kweek onafhankelijke detectie en identificatie van bacteriële species m.b.v. 16S-23S rdna NGS: kansen en uitdagingen Mirjam Kooistra-Smid 08-05-2017
MMB Diagnostic Stewardship Focus klinische microbiologie: - snelle identificatie van pathogenen in klinische samples - kweek en op PCR gebaseerde technieken - 16S rdna Sanger sequencing - vaststellen van het resistentieprofiel optimale behandeling van de individuele patiënt Snelle diagnostiek verhoogt: - bruikbaarheid van laboratorium resultaten - toegevoegde waarde van de medische microbiologie in het zorgnetwerk 4
Beperkingen huidige diagnostiek (1/2) - conventionele kweek: Maldi-TOF - identificatie bacteriële species niet altijd mogelijk moeilijke groeiers-kweek en identificatie gecompliceerd time en resource consuming significante reductie van de gevoeligheid van de kweek door antibiotische behandeling
Beperkingen huidige diagnostiek (2/2) - PCR gebaseerde technieken a priori inzicht van het verdachte pathogeen in het klinisch monster is noodzakelijk - 16S rdna Sanger seqencing identificatie van sommige species is niet altijd mogelijk polymicrobiële samples: identificatie van species is erg gecompliceerd
Sequencing 16S rrna gene (appr. 1,5 kb) present in all bacteria conserved function variable regions - highly useful in regards to bacterial classification - poor discriminatory power for some genera Patel. Mol. Diag., 2001 Michael Janda et.al. J Clin Microbiol., 2007
Sequencing 16S rrna gene (appr. 1,5 kb) present in all bacteria conserved function variable regions - highly useful in regards to bacterial classification - poor discriminatory power for some genera Patel. Mol. Diag., 2001 Sequencing 23S rrna gene (appr. 2,9 kb) - highly useful in regards to bacterial classification - high sequence variation Hunt et. al. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2006 Challenge: sequencing whole 16S -23S rrna region
Kweek onafhankelijke diagnostische methode voor detectie en identificatie van bacteriële species Next Generation Sequencing (NGS) Benchtop sequencers Diagnostic tool Metagenomics Targeted NGS 16S-23S rdna NGS 2005-2017 kweek/pcr 2018-2020 2021 - xxxx kweek/pcr 16S-23S rdna NGS kweek/pcr 16S-23S rdna NGS metagenomics
DNA extraction 16S-23S rdna PCR NGS 16S-23S rdna NGS Short reads Result 16S-23S rdna NGS analysis Contig assembly
Conventional diagnostics Modern diagnostics Complex clinical materials Culture of fastidious micro-organisms Day 0 Culture positive Week 1 16S-23S rdna NGS Microbiome identification (multiple bacterial species) Culture positive Culture negative Week 2 Culture positive MALDI-TOF 16S rdna Sanger sequencing 16S rdna Sanger sequencing Week 3 Week 4 Applications: - Primary sterile clinical materials - Samples orthopedic patients - Samples endocarditis patients - Urine samples 6
16S-23S rdna NGS Project Doel: Ontwikkeling, validatie en implementatie van een robuuste kweek onafhankelijke diagnostische methode gebaseerd op targeted next generation sequencing van de 16S-23S rdna regio voor de detectie en identificatie van bacteriële species in complexe klinische monsters. Subdoelen - Ontwikkelen identificatie methode met een hoog discriminerend vermogen - DNA-extractie - 16S-23S rdna PCR Bacteriële isolaten - targeted NGS - data-analyse Klinische materialen - data rapportage - Ontwikkelen software pipeline - Ontwikkelen database met 16S-23S rrna sequenties - Verrichten prospectieve klinische validatie studies - Implementatie 16S-23S rdna NGS in de reguliere diagnostiek
16S-23S rdna NGS Bacterial isolates Materials: 52 clinical strains 15 reference strains from the ATCC collection Encompassing 24 genera and 58 species Achromobacter marplatensis Enhydrobacter aerosaccus Staphylococcus epidemidis Acinetobacter boumanii Enterobacter aerogenes Staphylococcus epidermidis Acinetobacter ilwofii Enterococcus faecalis Staphylococcus haemolyticus Acinetobacter johnsonii Enterococcus faecium Staphylococcus hominis Acinetobacter lwoffii Enterococcus feacalis Staphylococcus lentus Acinetobacter parvus Escherichia coli Staphylococcus lugdunensis Actinobaculum schaalii Granulicatella adiacens Staphylococcus spp. Actinomyces graevenitzii Klebsialla pneumoniae Streptococcus dysgalactiae Actinomyces neuii subsp. anitratus Lactobacillus fermentum Streptococcus feacalis Actinomyces turicensis Lactobacillus paracasei subsp. Streptococcus gordonii paracasei Bacillus cereus Lactobacillus rhamnosus Streptococcus mitis Citrobacter freundii Moraxella catarrhalis Streptococcus mutans Citrobacter youngae Moraxella catharalis Streptococcus parasanguinis Corynebacterium afermentans Moraxella lacunata Streptococcus pasteurianus Corynebacterium amycolatum Moraxella osloensis Streptococcus pneumoniae Corynebacterium coyleae Pantoea dispersa Streptococcus pyogenes Corynebacterium diphtheriae Propionibacterium acnes Streptococcus sanguinis Corynebacterium jeikeium Pseudomonas aeruginosa Streptococcus species Corynebacterium Salmonella enteritidis Streptococcus vestibularis tuberculostearicum Corynebacterium xerosis Shigella soneii Yersinia enterocolitica Delftia acidovorans Staphylococcus aureus Dermabacter hominis Staphylococcus capitis
16S-23S rdna NGS Bacterial isolates Identification methods: I. Maldi-TOF: Microflex MS (Bruker) II. Maldi-TOF: VITEK MS (biomérieux) III. Sanger sequencing of the whole 16S rrna gene LPW57 5 -AGTTTGATCCTGGCTCAG-3 (Woo et. al., 2001) LPW58 5 -AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3 (Woo et. al., 2001) IV. NGS of the 16S-23S rrna region 27F (5 -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ) (Sergeant et. al., 2012) 2490R (5 -GACATCGAGGTGCCAAAC-3 ) (Hunt et. al., 2006) MiSeq sequencer (Illumina) Additional identification by sequence analysis of species specific genes
Discriminatory potential of identification methods Method Species level Genus level 16S-23S rdna NGS 92.5% 100% 16S rdna Sanger sequencing 56.7% 94.0% Microflex MS 73.1% 88.1% Vitek MS 64.2% 83.6% The discriminatory power of species level identification using 16S-23S NGS is significantly higher than 16S rdna Sanger Sequencing, Vitek MS and Microflex MS (p<0.0001, p=0.0060 and p<0.0001, respectively). (McNemar's test) The discriminatory power of genus level identification using 16S-23S NGS is significantly higher than Vitek MS and Microflex MS (p=0.0026 and p=0.0233, respectively). (McNemar's test) Sabat et.al.; accepted for publication
16S-23S rdna NGS: clinical materials Proof of principle Materials: urine samples from patients suspected for urine tract infection (n=60) positive blood culture samples (n=23) Biopsies and punctates from orthopedic patients (n=21) Methods: - Conventional culture - urine samples: blood agar, MacConkey agar; Vitek MS) - positive blood culture samples: Blood agar + 5% sheepblood, Chocolate medium, en Brucella blood agar + 5% sheepblood; Vitek MS - biopsies/punctates: Blood agar base, Chocolate medium, Brucella blood agar + 5% sheepblood, Tryptone soya broth; Vitek MS
Methods: - 16S-23S rdna NGS method DNA-extraction *urine samples: UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (Mobio) *positive blood culture samples: BiOstic Bacteraemia DNA Isolation Kit (Mobio) *biopsies/punctates: Purelink Genomic DNA purification kit (Invitrogen) PCR amplification of 16S-23S rrna region - 27F (5 -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ) - 2490R (5 -GACATCGAGGTGCCAAAC-3 ) Library preparation Nextera XT DNA Sample Preparation Kit (Illumina) Next Generation Sequencing - MiSeq reagent cartridge; MiSeq reagent kit v3 and 600 cycles (Illumina) - MiSeq (Illumina)
Methods: - 16S-23S rdna NGS method de novo reads assembly: SeqMan NGen software (DNASTAR) Assigning contigs to bacterial species Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) search of contig 16S-23S rrna sequences in the GenBank database Similarity score o > 99%: species identification (and difference with next closest species > 0.2%) o 90%-99%: genus identification o < 90%: unidentified organism
Sabat et.al.; accepted for publication
Sabat et.al.; accepted for publication
Sabat et.al.; accepted for publication
WORKFLOW 16S-23S rdna NGS(n= 21 samples, 3 controls) Clinical material/ cultured bacteria Day 1 DNA extraction & 16-23S rdna PCR amplification (Purelink genomic DNA minikit, Phire hot start II DNA polymerase) Day 2 PCR fragment detection and purification NGS library preparation (Nextera XT DNA library Preparation kit Friday to Monday Day 3-5 Illumina sequencing (MiSeq Reagent kit v3 600 cycle) Clinical sample: 1-2 million reads/sample Day 6-7 Data analysis CLCbio (Qiagen), NCBI BLAST Minimum length contig: 1500 bp
Experimentele uitslag 16-23S rdna NGS analysis Contig (bp) Identities ID score Fraction % Corynebacterium propinquum 4538 4505/4523 0.996 18% Propionibacterium acnes 4131 2552/2552 1.000 13% Microvirga sp. 4160 3909/4193 0.932 2% Brevundimonas vesicularis 1364 1358/1365 0.995 4% Micrococcus luteus 4400 4392/4424 0.993 2% Brevundimonas sp. 1350 726/751 0.967 2% Paracoccus sp. 2333 2027/2095 0.968 1% 16S-23S rdna NGS analyse Contig Identities IDScore Fraction % Name species assigned to contig Length of contig (bp) Matching of contig (query) with subject Query/subject Percentage identified reads NGS ID score interpretation Species identification ID Score >0,986 Genus identification ID Score >0,90 - <0,986 Unidentified m.o. ID Score <0,90
Conclusies 16S-23S rdna NGS: superieure identificatie bacteriele species kweekonafhankelijke detectie van polymicrobiële samples correcte identificatie klinisch relevante pathogenen hoge potentie voor detectie van pathogenen die niet gekweekt kunnen worden gevoeligheid t.o.v. 16S Sanger sequencing fors verhoogd uitslag mogelijk < 6-7dagen Uitdagingen: complexe analyse ontwikkeling software-pipeline ontwikkeling database 16S-23S rdna sequenties test versnellen klinische prospectieve validatie onderscheid contaminant/kolonisant/oorzaak van infectie
16S-23S rrna NGS Project Retrospectieve klinische validatie Start project Proof of principle geleverd Validatie diagnostische methode Evaluatie 6 maanden Q1 2015 2016 2017 2018 Q4 Q1 Q4 Q1 Q4 Q1 Q4 Evaluatie 12 maanden Methode ontwikkeling Implementatie diagnostische methode in reguliere diagnostiek Instellen aandachtsgebied NGS Prospectieve klinische validatie Ontwikkeling diagnostische methode
Projectgroep 16S-23S rdna NGS Artur Sabat Evert van Zanten Guido Wisselink Viktoria Akkerboom Natacha Couto Brigitte Dijkhuizen Linda Veloo Richard de Boer Willem Vogels Alewijn Ott Glen Mithoe Alexander Friedrich John Rossen Mirjam Kooistra-Smid UMCG Certe Certe UMCG UMCG UMCG UMCG Certe Certe Certe Certe UMCG UMCG Certe/UMCG Met dank aan Julia Berends Emmy de Paus Circe van der Heide