Microbiologische media toetsen, of je kan het schudden

Transcriptie

1 Microbiologische media toetsen, of je kan het schudden Praktijkdag microbiologie: ontwikkelingen rond methoden Rijkelt Beumer Wageningen Universiteit Stichting FiMM

2 Microbiologische media toetsen, of je kan het schudden

3 Klinkt ouderwets microbiologische media: maar ze zijn nog steeds nodig: discussie over voorkant van het methodenboek: moest daar niet een modern plaatje op?

4

5 Standaardisatie in levensmiddelenmicrobiologie Er geldt (nog) een algemene regel voor het gebruik van methoden in de levensmiddelenmicrobiologie: The law of confusion: Het aantal methoden (M) om een (groep van) micro-organisme aan te tonen is: M = N + 1

6 Standaardisatie in levensmiddelenmicrobiologie Microbiologen gebruiken eerder elkaars tandenborstel dan elkaars methoden (naar DAA Mossel

7 Toetsen van media volgens ISO kent een lange historie Ik denk dat het begin jaren 90 begon met 3 verschillende werkgroepen nu is het 1 grote groep en over een paar jaar (?) is het echt af? 2017?

8 Definitie: wat is een voedingsbodem samenstelling van stoffen in vloeibare, half vaste of vaste vorm bestaande uit natuurlijke en/of synthetische bestanddelen die bedoeld zijn de groei van micro-organismen te bevorderen (al dan niet met remming van bepaalde micro-organismen) gebruikt worden bij het identificeren van mo of de micro-organismen in leven moeten houden.

9 Indeling van voedingsmedia ingedeeld naar gebruik * transportmedium * bewaarmedium * suspensie/verdunningsmedium * resuscitatiemedium * (voor)ophoping * selectieve ophoping * (selectief) isolatie/tel-medium

10 Indeling van voedingsmedia ingedeeld naar bereiding * kant en klaar medium helemaal kant en klaar medium moet nog opgesmolten worden, evt. toevoegingen * medium bereid uit pot van fabrikant, evt. toevoegingen * medium bereid uit de losse componenten

11 Het begint met water - minder dan 100 kve/ml, als het kan <100 ml - geleidbaarheid <25 Scm -1 - liever nog <5 Scm -1 - Pas op: demi-water: bevat vaak veel mo

12 Dan komt het bereiden van media - afwegen, water toevoegen, oplossen - indien nodig, ph meten - afvullen in buizen, flessen - steriliseren (autoclaaf, filtreren) - maken en toevoegen supplementen - gebruiken na drogen van platen - bewaren en houdbaarheid - opsmelten en afkoelen - ontluchten - toevoegen supplementen - gebruiken na drogen van platen

13 Toetsen van media: waarom? * acceptatie van een batch medium * geschikt om te gebruiken * geeft consistente resultaten * effect bereiden * effect houdbaarheid * effect dalende wateractiviteit (syneresis)

14 Toetsen van media: door wie? Commerciële bedrijven, die kant en klaar media, gedeeltelijk bereide media, of droge media produceren/distribueren Niet-commerciële bedrijven die media doorgeven aan andere partijen Microbiologische laboratoria die media maken voor eigen gebruikderden

15 Toetsen van media: nodig Toetsstammen (zie hiervoor: Samenwerkingsverband van de International Union of Biological Sciences (UBS) en Microbiological Societies (IUMS) Catalogus (vrij te downloaden) met alle referentiestammen voor het toetsen van kweekmedia

16 Bewaren/aanhouden van toetsstammen

17 ontvangst referentiestam verifiëer reinheid en karakteristieken verifiëer en archiveer de bijgeleverde documenten Nee klopt het? Ja reconstituteer de stam volgens instructies. maak een verdunning in een geschikt medium isoleer de stam op een geschikt medium (bv TSA) verdeel in buisjes en bewaar in diepvriezer

18 reference stock verifiëer reinheid en morfologie ontdooi snel Nee klopt dit? Ja kweek op geschikt vast medium, dat wordt de werkcultuur. bereid inoculum voor toets

19 In plaats van het bereiden van een suspensie voor de test, mag ook: - de stam geënt worden op een geschikt medium, bv een schuine buis TSA, bebroed en max 4 weken bewaard worden; dit is de stock culture - er mag ook een suspensie gemaakt worden, die ingevroren wordt bij -70ºC; dit is de stock culture beide kunnen (later) afgestreken worden op een geschikt medium; dit is de werkcultuur hiervan moet nog geverifiëerd worden of alles klopt

20 Toetsen van media: welke toetsstammen? Aerococcus viridans L. anisa Aspergillus brasiliensis Listeria monocytogenes 4b Bacillus cereus Listeria innocua B. subtilis ssp spizizenii Proteus mirabilis Campylobacter jejuni Pseudomonas aeruginosa Citrobacter freundii Ps. fluorescens Clostridium perfringens Saccharomyces cereviseae Cl. bifermentans Salm. Typhimurium of Enteritidis Enterobacter aerogenes Staph. aureus Enterococcus faecalis Staph. epidermidis E. faecium; E. hirae Staph. saprofyticus E. coli (2x); E. coli O157 Vibrio cholerae non O1/non O1139 Klebsiella pmeumoniae V. furnissii V. vulnificus Lactobacillus sakei V. parahaemolyticus Lactococcus lactis Wallemia sebi Legionella pneumophila Yersinia enterocolitica

21 Toetsen van media Hoeveelheid micro-organismen (kve) nodig voor: Productiviteit, kwantitatief, plaat verdunningsvlst kve kve Productiviteit, kwalitatief plaat kwalitatief, ophopingen kwalitatief, vaste transportmedia kve 100 kve kve Selectiviteit, vast, vloeibaar kve Specificiteit, vast kve

22 Toetsen van media Toetsen: - kwantitatief of kwalitatief, hoeft niet beide - media voor tellingen: altijd kwantitatief - nieuw medium/nieuwe producent: bvk kwantitatief - hoe vaak, en na welke handeling? dat bepaalt de eindgebruiker Let op: interacties tussen stammen in vloeibare media!

23 Toetsen van vaste media kwantitatief uitplaten kwalitatief uitstrijken andere kwalitatieve methoden

24 Kwantitatief uitplaten: wanted productiviteit wanted mo productiviteits ratio (PR) PR = kve te testen medium kve referentiemedium selectieve media: PR 0,5 niet selectieve media: PR 0,7 PR > 1.4: zoek oorzaak!

25 Een voorbeeld van kwantitatief uitplaten 42 ref.medium (ns) 25 testmedium (ns) 25/42 = 0.6 (<0.7), dus niet goed

26 Kwantitatief uitplaten: unwanted selectiviteit unwanted mo Selectiviteits Factor = Do ref.medium Ds test medium Do: hoogste verdunning met groei op niet sel. ref.medium Ds: hoogste verdunning,met groei in selectief testmedium (gebruik de logwaarden: de 10-4 verdunning is 4) SF 2

27 Kwalitatief uitstrijken Interpretatie groei 2 1 PR van 0-2 wanted : 2 0 unwanted : (partly) inhibited, 0 of 1

28 1,4 1,2 1 1,13 1,27 1,31 0,8 0,6 0,84 0,8 0,96 0,4 0,2 0 PCA Difco PCA Merck PCA Oxoid fresh 2 weeks Minimum PR: 0.7

29 Example: specificity ALOA Criterion: blue/green colonies with (Lm) or without precipitation halo (Li) L. innocua L. monocytogenes

30 ALOA- Selective enumeration L. monocytogenes Growth characteristics, different suppliers AES Oxoid Biomerieux

31 productivity ratio Productivity Results - ALOA 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 1,19 0,995 1,005 0,4 0,2 0 fresh 2 weeks 4 weeks Minimum PR: 0.5

32 productivity ratio 1,8 Productivity Results - TSC 1,6 1,4 1, Merck 0,8 0,6 Oxoid 0, , fresh 2 weeks 4 weeks Minimum PR: 0.5

33 - geen verschil tussen aeroob of anaeroob bewaren - geen verschil tussen giet- of strijkplaat - tot 2 weken bewaren geen invloed E.coli: groei op alle Merck gietplaten

34 Productivity Ratio Productivity ratios MYP Productivity > 0.5 No E. coli growth Good specificity * * Merck Oxoid Difco 0.0 Fresh 2 Weeks 4 Weeks Supplier ph declared Fresh 2 weeks 4 weeks ph Aw ph Aw ph AW Merck 7.2 +/ Oxoid 7.2 +/ , , Difco 7.2 +/

35 Productivity ratio Productivity ratios CFC Productivity > 0.5 Good selectivity Merck Oxoid Biokar Coloration differed depending on supplier Fresh 8 Days 2 Weeks 4 Weeks Supplier ph Fresh 8 days 2 weeks 4 weeks declared ph Aw ph Aw ph Aw ph AW Merck 7.1 +/ Oxoid 7.1 +/ Biokar 7.1 +/

36

37 Toetsen van vloeibare media kwantitatieve buismethode: productiviteit ent 100 kve/10 ml en bebroed, onderzoek 10µl: >10 kve van max 10kve/ml naar 1000 kve/ml? selectiviteit: laatste verd. werkcultuur (>10 kve/ml), delen door laatste verd. gg (<10 kve) in 10 µl. SF 2 kwalitatieve buismethode (1 buis target, de ander nt, of mix) target ( 100 kve) en non-target (>1000 kve); bebroed zie boven voor productiviteit; gg (<10 kve) voor selectiviteit kwalitatieve éénbuismethode (troebeling) geen (0), lichte (1) of duidelijke (2) troebeling

38 Kwalitatieve methode (twee buizen)

39 EE-broth Productivity test Sufficient growth on VRBG plates(cfu>10) Selectivity test Criteria: total inhibition on TSA ph declared Fresh Week 2 Week 4 E. faecalis ph E. faecalis ph E. faecalis ph Oxoid 7.2± Merck 7.2± BD 7.2±0.2 Batch > Batch 2 >

40 Fraser Productivity test Sufficient growth on ALOA plates(cfu>10) Selectivity test Criteria: <100 colonies of E. coli and E. faecalis ph declared on TSA Batch Fresh Week 1 Week 2 Oxoid 7.2± > E.coli E. faecalis ph E.coli E. faecalis ph E.coli E. faecalis ph 2 0 > > > Merck 7.2± BD 7.2± Some of the plates exceed the criteria Conclusion: Performance of Oxoid is not satisfactory

41 Regular versus expired media! Rappaport Vassiliadis RVS selective enrichment for Salmonella Control strains: S. Typhimurium ATCC E. coli ATCC Ps. aeruginosa ATCC Criteria ISO > 10 colonies on XLD Result RVS regular 1.3log5 Result RVS expired 4.5log4

42 Regular versus expired media! Rappaport Vassiliadis Control strains: E. coli ATCC Criteria ISO < 100 colonies on TSA Result RVS regular No growth Result RVS expired 4.5 cells Control strains: E. faecalis ATCC Criteria ISO < 10 colonies on TSA Result RVS regular No growth Result RVS expired 0.2 cells No growth

43 Toetsen van microbiologische media Joint Working Group ISO/TC 34/SC 9/WG 5 and ISO/TC 147/SC 4/WG 12 Microbiology of food, animal feed and water Preparation, production, storage and performance testing of culture media Bevestigingsmedia en reagentia volgende telefonische vergadering: 30 april volgende bijeenkomst: waarschijnlijk dit najaar

44 Begonnen in de jaren 90; in 2005 dachten we: still a long way to go? En nu?. Dank aan MSc-studenten, Wilma Hazeleger en Heidy den Besten van de lsg FHM. WUR