Het referentielaboratorium voor stafylokokken - MRSA (Erasmus Ziekenhuis Brussel) verleent de volgende diensten : - Identificatie en antibiogram van atypische stafylokokkenstammen met behulp van de volgende methodes : fenotypische : biochemische tests, minimale remmingsconcentraties, fenotype van de glycopeptidengevoeligheid (populatiestudie); genotypische : identificatie van de verschillende stafylokokkenspecies door PCR inter-trna, opsporing van de genen nuc (voor de identificatie van S. aureus), meca (coderend voor de oxacillineresistentie), mupa (coderend voor de mupirocineresistentie) en van de genen resistent tegen macroliden-lincosamiden-streptograminen (MLS). De opsporing van de genen coderend voor de aminoglycosidenresistentie is uitgevoerd op de dienst Antibiotica en Ziekenhuisinfecties van het Pasteurinstituut in Brussel. De opsporing van de genen coderend voor de exfoliatinen A en B, Panton Valentine Leucocidine (PVL) en de Toxic Shock Syndrom Toxin (TSST-1) gebeurde door multiplex PCR. - Moleculaire typering : genomische macrorestrictie door Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), multi-locus sequence typing (MLST) en typering van de mec chromosoomcassette van de stafylokok (SCCmec). Deze analysen worden op verzoek van de ziekenhuislaboratoria gemaakt van klinische stalen die diagnostische problemen opleveren of van stafylokokkencollecties uit lokale epidemiologische enquêtes. De aanvraagformulieren voor deze analysen kunnen van de internetsite van het referentielaboratorium voor MRSA, http://www.ulb.ac.be/medecine/lrstaph/, worden gedownload. Het laboratorium neemt ook deel aan het surveillanceprogramma van MRSA in het kader van : 1) het Europese programma EARSS (European Antimicrobial Resistance Surveillance System) met betrekking tot de resistentie van S. aureus, die bij opgenomen patiënten bacteriëmiën veroorzaakt, in samenwerking met de afdeling Epidemiologie van het Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid (WIV); 2) het nationale programma voor de microbiologische surveillance van MRSA in België om de evolutie te bepalen van de antibioticaresistentie en de verspreiding van de epidemische genotypes in de acute ziekenhuizen. Karakterisering van atypische stafylokokkenstammen In 2003 heeft het laboratorium 136 atypische stafylokokkenstammen, afkomstig van 26 ziekenhuizen, in het kader van doelgerichte aanvragen gakarakteriseerd door de fenotypische en/of genotypische identificatie (n = 46) en de resistentieanalyse (oxacilline en/of vancomycine) (n = 129). In deze periode is geen enkele stam met verminderde vancomycinegevoeligheid vastgesteld. Het mupirocineresistentieniveau is geanalyseerd met de minimale remmingsconcentratie (E-test) en een PCR voor de opsporing van gen mupa voor 33 stammen, afkomstig van 7 ziekenhuizen, waarvan er 24 (73%) een hoog resistentieniveau tegen mupirocine toonden (> 524 mg/l). Een stam van CA-MRSA (Community Acquired MRSA) met een atypisch profiel (alleen resistent tegen kanamycine, tetracycline en fusidinezuur) wees op de aanwezigheid van het gen coderend voor Panton Valentine Leucocidine (PVL); de stam is gekarakteriseerd door MLST en behoort tot kloon ST80/ SCCmec IV, verantwoordelijk voor epidemieën in Frankrijk en Zwitserland. De retrospectieve analyse van de MRSA-stammen, in 2002 verzameld tijdens een studie over CA-MRSA, heeft 2 andere MRSA-stammen met het gen coderend voor PVL aangetoond. Deze 2 stammen, geïsoleerd uit huidinfecties, werden gekarakteriseerd als behorend tot de klonen ST30/ SCCmec IV en ST8/SCCmec IV. Typering in het kader van lokale epidemiologische enquêtes De moleculaire typering (PFGE) van stammen van S. aureus in het kader van lokale epidemiologische enquêtes is uitgevoerd voor 182 stammen, afkomstig van 18 ziekenhuizen. De analyse van de 178 MRSA-stammen heeft het overwicht aangetoond van het epidemische genotype B2, opgespoord in 38% van de stammen. Dit genotype, gekend sinds 1992, is tijdens de nationale surveillance in 2001 aangetroffen in 80% van de ziekenhuizen. Genotype A20 is opgespoord in 15% van de geanalyseerde stammen en de andere epidemische genotypes, C3, D4 en G10 zijn in slechts 2% à 6% van de MRSA-stammen gevonden. Twaalf verdachte epidemieën zijn geanalyseerd en drie van hen zijn bevestigd. Helaas zijn de epidemiologische gegevens van de meeste enquêtes niet doorgegeven aan het referentielaboratorium, wat de interpretatie van de typeringsresultaten bemoeilijkt. De moleculaire typering is ook uitgevoerd voor 10 coagulasenegatieve stafylokokkenstammen (CNS), wat het mogelijk heeft gemaakt om de besmetting van een farmaceutisch product te ontkrachten en de infectie van een patiënt door dezelfde stam (CNS) te bevestigen. Programma EARSS voor de surveillance van de resistentie van S. aureus geïsoleerd uit een hemocultuur Sinds 2001 is het protocol van de surveillance voor de Belgische deelnemers gewijzigd. De MRSA-stammen zijn ter bevestiging naar het referentielaboratorium verstuurd terwijl de MSSA-stammen (methicillinegevoelige S. aureus) eenvoudigweg het voorwerp hebben uitgemaakt van de schriftelijke registratie van de klinische en bacteriologische gegevens. 1
Referentielaboratorium In 2003 zijn in 42 ziekenhuizen 1133 gevallen met een eerste episode van bacteriëmiën met S. aureus geregistreerd. Onder deze patiënten werden 334 gevallen van bacteriëmiën met MRSA bevestigd, dit is 29,5% van de MRSA. Het aandeel van de MRSA onder de S. aureus geïsoleerd uit hemoculturen van opgenomen patiënten ligt in 2003 significant hoger dan voordien (23% in 1999, 21% in 2000, 24% in 2001, 28% in 2002). De gegevens voor alle landen die deelnemen aan het programma EARSS zijn beschikbaar op de website http://www.earss.rivm.nl/. Op dit ogenblik blijft het aandeel van de MRSA geïsoleerd uit hemoculturen laag (< 1%) in de Scandinavische landen en in Nederland; hun aandeel is echter bijzonder hoog in Groot- Brittannië (44,8%), Griekenland (51,4%), Italië (37,6%) en Frankrijk (28,9%). De gevoeligheidsbepaling van MRSA voor vancomycine is uitgevoerd op een vancomycin screen agar (BBL). In 2003 is geen enkele stam van MRSA met verminderde vancomycinegevoeligheid vastgesteld onder de stammen afkomstig van hemoculturen. Nationaal surveillanceprogramma voor MRSA in België Sinds 1995 organiseert het referentielaboratorium voor stafylokokken regelmatig, in samenwerking met het WIV, enquêtes voor de microbiologische surveillance van MRSA. Het doel van deze surveillance bestaat erin de evolutie op te volgen van de genotypes van MRSA en van hun resistentie tegen antibiotica in de Belgische ziekenhuizen voor acute verzorging. In het kader van het protocol van de vierde enquête, in 2003, werden de laboratoria voor microbiologie van de Belgische ziekenhuizen gevraagd om 5 consecutieve en niet-gedupliceerde klinische stammen van MRSA evenals een klinische stam van MSSA te verzamelen. De stammen zijn naar het referentielaboratorium voor stafylokokken verstuurd met een bijgaand formulier waarop demografische gegevens stonden vermeld : leeftijd, geslacht, eenheid waar de patiënt werd opgenomen, klinische isolatiesite van de stam en het verwervingstype van de stam (nosocomiaal of geïmporteerd). Een nosocomiale MRSA is gedefinieerd als een isolatie van MRSA bij een patiënt na de 48 eerste uren van opname. Deelneming In 2003 namen 112 ziekenhuizen aan het nationale microbiologische surveillanceprogramma. Tabel 1 toont het toenemende aantal deelnemers aan de drie enquêtes die sinds 1995 worden georganiseerd. Tabel 1 : S. aureus : Deelneming van de ziekenhuizen (per gewest) aan de microbiologische surveillance-enquêtes van MRSA, 1995-2003 Gewest Aantal deelnemende ziekenhuizen (%) 1995 1997 2001 2003 Brussel 12 (50) 14 (58) 12 (50) 16 (70) Vlaanderen 46 (49) 41 (339) 49 (49) 57 (59) Wallonië 27 (40) 35 (51) 37 (55) 39 (64) België 85 (43) 90 (45) 98 (51) 112 (62) Demografische gegevens De geslachtsverhouding M/V van de patiënten voor wie een stam van MRSA is verstuurd, bedraagt 0,78 en de mediane leeftijd 77 jaar (interval : 0-97 jaar) (tabel 2). De patiënten werden voornamelijk opgenomen op de eenheden geneeskunde (33%), geriatrie (25%), chirurgie (17%) of intensieve verzorging (10%). Tabel 2 : S. aureus : Indeling van de patiënten met MRSA volgens geslacht en leeftijd, 2003 Leeftijd (jaar) Aantal geïsoleerde MRSA-stammen uit patiënten Vrouw Man <1 1 2 1-19 2 0 20-49 17 21 50-59 16 19 60-69 24 38 70-79 94 70 80 138 79 Totaal 292 229 Bacteriële stammen Van de 553 ontvangen MRSA-stammen zijn er 521 MRSA bevestigd (94%) door genotypische analyse (PCR 16sRNA, nuc, meca). Vijfentwintig stammen zijn geïdentificeerd als coagulasenegatieve stafylokokken (n = 9) of oxacillinegevoelige S. aureus (n = 16). Zeven stammen zijn na het herprikken niet opnieuw gegroeid. Van de 99 verzamelde MSSA, is de identificatie van 95 stammen (96%) door multiplex PCR bevestigd. Drie stammen zijn geïdentificeerd als S. aureus resistent tegen oxacilline (n = 1) of als coagulasenegatieve stafylokokken (n = 2). Een stam is na het herprikken niet opnieuw gegroeid. Tabel 3 2
toont de voornaamste klinische isolatiesites van MRSA, hoofdzakelijk van cutane of respiratoire oorsprong, ook bij nasale dragers. Tabel 3 : S. aureus : Verdeling van MRSA volgens de oorsprong van het monster, 2003 Oorsprong van het monster Aantal (%) Bloed 41 (8) Wonde, etter, weke weefsels 160 (31) Ademhalingswegen 128 (25) Neusuitstrijkje 120 (23) Urine 43 (8) Andere 30 (6) Totaal 522 (100) Meer dan 64% van de stammen is verworven in een ziekenhuis. De nosocomiale verwervingsgraad is in vergelijking met 2001 stabiel gebleven. Tabel 4 : S. aureus : Evolutie van het verwervingstype van MRSA, 1995-2003 Verwervingstype N patiënten (% per categorie) 1995 1997 2001 2004 Nosocomiaal 243 (82) 257 (77) 285 (66) 332 (64) Geïmporteerd 52 (18) 77 (23) 147 (34) 184 (36) Totaal 295 (100) 334 (100) 432 (100) 518 (100) Antibioticagevoeligheid In 2003 is de minimale remmingsconcentratie (MIC) van 18 antibiotica bepaald zoals in de vorige enquêtes op basis van de dilutiemethode in gelose, volgens de aanbevelingen van het NCCLS. Tabel 5 toont de antibioticagevoeligheidsresultaten voor 499 stammen verzameld in 2003 en vergeleken met de voorgaande gegevens. Tabel 5 : S. aureus : Evolutie van de antibioticaresistentie van MRSA in de surveillance-enquêtes, 1995-2003 Antibioticum (Kritische concentraties in mg/l) 1995 (n=354) 1997 (n=347) 2001 (n=455) 2003 (n=499) % R % I % R % R % R % I % R % I Oxacilline (2-4) 98.9 0.0 99.4 0.3 99.9 0.0 99.9 0.0 Vancomycine (4-32) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Teicoplanine (8-32) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Erythromycine (0.5-8) 80.6 4.8 64.3 4.6 64.0 0.0 62.7 0.4 Clindamycine (0.5-4) 71.9 0.6 49.3 0.3 37.6 0.2 39.9 0.0 Quinu.-dalf. 0.6 0.6 0.0 0.0 0.2 0.0 En cours Ciprofloxacine (1-4) 96.0 0.3 94.8 0.6 94.5 0.4 98.2 0.0 Gentamicine (4-16) 77.1 0.6 51.3 0.3 11.2 0.2 5.2 0.0 Tobramycine (4-16) 84.3 0.8 61.6 4.0 45.3 1.3 43.5 0.1 Amikacine (16-64) 10.7 25.8 5.2 0.3 1.8 4.4 0.1 0.1 Kanamycine (16-64) NT NT NT NT NT NT 37.1 2.8 Minocycline (4-16) 0.6 1.1 4.3 2.8 4.6 2.0 4.6 1.8 Tetracycline (4-16) NT NT NT NT NT NT 9.6 0.8 Rifampicine (1-4) 28.0 22.3 15.9 11.5 3.5 2.0 1.4 1.6 Cotrimoxazole (2-4) 1.4 0.0 0.0 0.3 0.7 0.0 0.0 0.0 Linezolide ( 4) NT NT NT 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Fusidinezuur (2-32) 0.6 1.6 0.9 1.4 0.7 5.8 0.8 0.6 Mupirocine (2-1024) 0.8 4.3 2.6 4.9 3.5 6.8 3.4 3.0 NT, niet getest Sinds 1995 is het aandeel van stammen gevoelig voor aminoglycosiden, clindamycine en rifampicine significant gestegen. In 2003 is het percentage stammen resistent tegen erythromycine stabiel gebleven in vergelijking met de laatste enquêtes. In 3
Referentielaboratorium deze enquêtes was meer dan 95% van de stammen resistent tegen ciprofloxacine en meer dan 90% was gevoelig voor fusidinezuur, minocycline en cotrimoxazole. Alle stammen getest in een agaroplossing waren gevoelig voor glycopeptiden en linezolide. Het percentage stammen resistent tegen mupirocine is in vergelijking met 2001 stabiel gebleven. Geografische verspreiding van de voornaamste epidemische genotypes. De moleculaire typering door SmaI macrorestrictie en scheiding door Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) is geanalyseerd met de software BioNumerics (Applied Maths, Kortrijk, België) gebruik makend van het coëfficiënt van Dice en de groeperingstechniek van de UPGMA-profielen (Unweighted Pair Group Method using Arithmetic average). Sinds 1999 worden de profielen volgens 3 hiërarchische niveaus ingedeeld : - Groep, aangeduid door een hoofdletter, met de profielen die 6 verschillende DNA-fragmenten bevatten - Type, aangeduid door een numerieke suffix, met de profielen die 3 verschillende DNA-fragmenten bevatten - Subtype met de verschillende profielen die tot een type behoren Een kloon wordt bepaald door zijn PFGE-type, in combinatie met het mec cassettetype (SCCmec). In 2003 blijkt uit de typering van 511 MRSA-stammen, afkomstig van 106 ziekenhuizen, dat 90% van de MRSA tot 9 grote epidemische genotypes behoort : de genotypes B2-SCCmec IV (n = 251); A20-SCCmec IV (n = 97), G10-SCCmec II (27), A21-SCCmec IV (n = 26), C1-SCCmec II (n=13), C3-SCCmec IV (n = 12), A1-SCCmec I (n = 12), D8-SCCmec I (n = 11) en L1-SCCmec IV (n =10). Deze klonen zijn aangetroffen in respectievelijk 95, 55, 17, 22, 10, 11, 10, 9 en 8 van de deelnemende ziekenhuizen. Figuur 1 toont de evolutie van de proportie grote epidemische klonen die sinds 1992 in de Belgische ziekenhuizen worden verspreid. De stammen behorend tot kloon B2 SCCmec IV zijn in 1992 opgetreden in enkele ziekenhuizen ten westen van België. Sinds 2001 hebben zij zich wijd verspreid over het hele land en in 2001 was dit de grootste epidemische kloon. Stammen behorend tot kloon B2 SCCmec IV zijn in ziekenhuizen geïsoleerd. De stammen behorend tot kloon A20 SC- Cmec IV werden voor het eerst geïsoleerd in 1999 en hoofdzakelijk in het zuiden van België. Sinds de laatste enquête hebben zij zich wijd verspreid in de drie gewesten van het land. De multiresistente kloon A1-SCCmec I, die in de jaren 1990 duidelijk aanwezig was in de Belgische ziekenhuizen, is in 2003 in slechts 9% van de ziekenhuizen aangetroffen. Figuur 1 : S. aureus : Evolutie van de voornaamste epidemische klonen in de Belgische ziekenhuizen sinds 1992 100 90 80 % d'hôpitaux 70 60 50 40 A1 (Iberian) B2 (B-Swiss) C3 A20 G10 L1 (UK-15) 30 20 10 0 1992 (n=62) 1995 (n=85) 1997 (n=90) 1999 (n=33) 2001 (n=100) 2003 (n=106) Années (Nbre d'hôpitaux) 4
Besluit In België tonen de resultaten van het programma EARSS een significante toename van de proportie MRSA onder de bacteriemiën met S. aureus bij patiënten opgenomen tussen 1999 en 2003. In vergelijking met de andere Europese landen die aan het surveillanceprogramme EARSS deelnemen, situeert de toename zich op intermediair niveau. In het kader van het nationale surveillanceprogramma voor MRSA is een goede identificatie van de stammen van MRSA waargenomen in de 112 deelnemende ziekenhuizen. Sinds 1995 wijzen de microbiologische enquêtes in de Belgische ziekenhuizen op de progressieve veroudering van de patiënten die drager zijn van MRSA bij hun opname in het ziekenhuis. Dit fenomeen vloeit waarschijnlijk voort uit de vorming van een groeiend reservoir van oudere patiënten die chronische dragers van MRSA zijn. De genotypering wijst op de voortdurende frequentieverhoging van het genotype B2-SCCmec IV dat wijd verspreid is in de meeste Belgische ziekenhuizen en verantwoordelijk voor de meeste lokale epidemies bestudeerd in het referentielaboratorium in 2003. We stellen ook een toename vast van de stammen die behoren tot de genotypes A20-SCCmec IV, G10-SCCmec II en L1-SCCmec IV (UK-EMRSA 15) in vergelijking met de enquête die in 2001 is uitgevoerd. Kloon J1-SCCmec IV (UK- EMRSA 16), in 2001 in enkele ziekenhuizen aangetroffen, is in 2003 niet meer waargenomen. Momenteel duiken de eerste communautaire stammen van hypervirulente MRSA op die de genen luks-lukf coderend voor Panton-Valentine Leucocidine dragen. Deze stammen behoren tot dezelfde MRSA-kloon ST80-SCCmec IV, onlangs beschreven in Duitsland, Frankrijk, Griekenland en Zwitserland en tot de klonen ST30-SCCmec IV et ST8-SCCmec IV, beschreven in de VS. Referenties Deplano A, Witte W, van Leeuwen WJ, Brun Y, Struelens MJ. Clonal dissemination of epidemic methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Belgium and neighboring countries. Clin Microbiol Infect 2000; 6(5):239-245. Denis O, Magdalena J, Deplano A, Nonhoff C, Hendrickx E, Struelens MJ. Molecular epidemiology of resistance to macrolides incosamides-streptogramins in methicillin-resistant causing bloodstream infections in patients admitted to Belgian hospitals. J Antimicrob Chemother 2002; 50(5):755-757. Denis O, Deplano A, De Ryck R, Nonhoff C, Struelens MJ. Emergence and spread of gentamicin-susceptible strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Belgian hospitals. Microb Drug Resist 2003; 9(1):61-71. Denis O., Malaviolle X., Titeca G., Struelens M.J., Garrino M.G., Glupczynski Y., Etienne J. Emergence of community- Acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus containing the Panton-Valentine Leukocidin gene in Belgium. Eurosurveillance Weekly. 2004, 8(24) available at http://www.eurosurveillance.org/ Denis O., Deplano A.,Nonhoff C., De Ryck R., de Mendonça R., Rottiers S., Vanhoof R., Struelens M.J.. National surveillance of methicillin resistant in Belgian hospitals indicates rapid diversification of epidemic clones. Antimicrob. Agents Chemother. 2004;48(9):3625-3629. 5