KLINISCH-GENETISCHE KENMERKEN VAN PEDIATRISCHE MYELODYSPLASIE: RECENTE INZICHTEN EN HUN IMPACT OP DIAGNOSE, CLASSIFICATIE EN BEHANDELING

FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar 2012-2013 KLINISCH-GENETISCHE KENMERKEN VAN PEDIATRISCHE MYELODYSPLASIE: RECENTE INZICHTEN EN HUN IMPACT OP DIAGNOSE, CLASSIFICATIE EN BEHANDELING Ellen SEYS Promotor: Dr. T. Lammens Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar 2012-2013 KLINISCH-GENETISCHE KENMERKEN VAN PEDIATRISCHE MYELODYSPLASIE: RECENTE INZICHTEN EN HUN IMPACT OP DIAGNOSE, CLASSIFICATIE EN BEHANDELING Ellen SEYS Promotor: Dr. T. Lammens Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

Voorwoord Deze scriptie werd geschreven in het kader van de Masterproef in de opleiding geneeskunde aan de Universiteit van Gent, faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen. De scriptie omvat een literatuurstudie over pediatrische myelodysplasie. Bij de aanvang van deze masterproef zou ik graag mijn promotor Dr. T. Lammens bedanken. Zonder zijn ondersteuning en professioneel advies was het onmogelijk geweest om dit werk tot een goed einde te brengen. Ook zijn snelle feedback en de vele tijd die hij hierin geïnvesteerd heeft, zijn een grote hulp geweest.

Inhoudstafel 1. Abstract...1 2. Inleiding...2 2.1. Classificatie, prognose en prognostische parameters...3 2.2. Syndromen geassocieerd met MDS...9 2.3. Therapie-gerelateerde MDS... 11 2.4. Behandeling... 12 2.4.1. Watch-and-wait strategie... 12 2.4.2. Hematopoiëtische stamcel transplantatie... 12 3. Methodologie... 15 4. Resultaten... 16 4.1. Cytogenetica... 16 4.1.1. Monosomie 7... 18 4.1.2. Trisomie 8... 18 4.2. Deleties en mutaties van individuele genen... 19 4.2.1. RUNX1, NRAS, FLT3-ITD en MLL-PTD mutaties... 19 4.2.2. TP53 mutaties en PPARγ mutaties... 21 4.2.3. Mutaties van TET2... 22 4.2.4. Mutaties in ASXL1, EZH2 en ETV6... 24 4.3. Telomeerverkorting... 26 4.4. Epigenetische veranderingen... 27 4.4.1. Methylatie... 27 4.4.2. Micro-RNA... 29 4.5. Proteomische analyse... 34 4.6. Mitochondriale veranderingen... 35 4.7. Multi-drugresistentie in MDS... 37 5. Discussie... 38 6. Referenties... 40

1. Abstract Pediatrische myelodysplasie (MDS) is een zeldzame en heterogene groep van stoornissen met beenmergfalen en dysplasie in 1 of meerdere myeloïde cellijnen. Bovendien zal een beperkt aantal patiënten een transformatie doormaken naar acute myeloïde leukemie (AML). Naast de novo MDS kent men ook therapie-gerelateerde MDS (t-mds), die een levensbedreigende complicatie is na de behandeling van kanker met alkylerende agentia, topoisomerase-ii inhibitoren of radiotherapie. De voorkeursbehandeling van pediatrische MDS is een allogene hematopoiëtische stamceltransplantatie. Er zijn enkele belangrijke onafhankelijke prognostische parameters geïdentificeerd in de loop van jaren onderzoek namelijk: de cytogenetische kenmerken, het blastenpercentage in het beenmerg, de LDH-waarden, het celaantal en de transfusienood op het moment van de diagnose. In dit werk worden de recente bevindingen betreffende de identificatie van grote chromosomale afwijkingen en mutaties in diverse genen (RUNX1, NRAS, FLT3, MLL en TET2, TP53, PPARγ en genen binnen de mitochondriale respiratoire keten) en in het bijzonder hun relatie met overleving en risicograad beschreven. Anderzijds zullen we ons tevens begeven op het epigenetisch domein met de identificatie van verstoorde methylatiepatronen (hypermethylatie) en abnormale expressie van micro-rna s als een basis voor de pathogenese van pediatrische MDS. Tenslotte zal ook het aspect van multidrugresistentie aan bod komen. Alhoewel op moleculair vlak recent heel wat nieuwe inzichten werden verworven in pediatrische MDS, blijft het nog steeds een sterk onder bestudeerde ziekte en vertalen de nieuwe inzichten zich nog niet in nieuwe, aangepaste therapieën, zoals wel het geval is in diverse andere vormen van kanker. Met de recente ontwikkeling in high-throughput sequencing technologieën mogen we verwachten dat in het eerstvolgende jaar heel wat vooruitgang zal worden geboekt binnen de kankergenetica in het algemeen en pediatrische MDS in het bijzonder. 1

2. Inleiding Pediatrische myelodysplasie (MDS) is een heterogene groep van hematopoiëtische stamcelstoornissen gekarakteriseerd door beenmergfalen, dysplastische kenmerken in 1 of meerdere myeloïde lijnen en een variërende neiging tot transformatie naar acute myeloïde leukemie (AML) (1). MDS komt op alle leeftijden voor, bij kinderen jonger dan 14 jaar is de incidentie 1.8/1 000 000 (zoals gecommuniceerd door de European Working Group on MDS in childhood (EWOG-MDS)). Bij ouderen is dit cijfer hoger, namelijk 5 per 100000 en 20-40 per 100 000 in de populatie ouder dan 70 jaar (2). Pediatrische MDS telt mee voor minder dan 5% van alle hematopoiëtische maligniteiten bij kinderen (3). Er is geen verschil tussen het aantal jongens en meisjes waarbij MDS wordt vastgesteld. Enkel wanneer we specifiek kijken naar de subgroep van gevorderde MDS zien we dat er meer jongens vertegenwoordigd zijn (verhouding jongens : meisjes = 2:1) (4). De kinderen presenteren zich vaak met symptomen zoals vermoeidheid, bleekheid, inspanningsgebonden dyspneu, infectie, bloedingen en uitputting. Deze klinische presentatie is het gevolg van beenmergfalen in één of meerdere cellijnen, met als gevolg anemie, neutropenie en/of trombocytopenie (1). De diagnose gebeurt hoofdzakelijk door middel van een beenmergaspiraat waarop morfologisch, immunologisch, moleculair en cytogenetisch onderzoek verricht wordt. Het geheel van deze onderzoeken is cruciaal om te bepalen tot welke risicogroep (zie classificatie) de patiënt behoort en welke prognose kan worden vooropgesteld. De behandeling is grotendeels gebaseerd op deze risicoclassificatie (1). Het is belangrijk om op te merken dat er significante verschillen bestaan tussen pediatrische MDS en MDS bij volwassenen. Zo zal bij volwassen vooral anemie een belangrijk symptoom vormen, terwijl bij kinderen vaker neutropenie en trombocytopenie worden vastgesteld. Anderzijds zijn ook de moleculaire biologie en cytogenetica duidelijk verschillend, waaronder de afwezigheid van del(5q) binnen de pediatrische MDS populatie (3, 5). Alles wat hieronder volgt is dan ook uitsluitend geldig voor pediatrische MDS. 2

2.1. Classificatie, prognose en prognostische parameters Het doel van een classificatiesysteem is om de prognose van een patiënt zo nauwkeurig mogelijk te voorspellen en de meest optimale therapie te bepalen (6). In de loop van de voorbije decennia, deels samenhangend met de evoluties in de kennis van de genetische achtergrond van MDS, werden diverse classificatieschema s opgesteld. In 1982 werd de FAB (French, American, British) classificatie voor MDS opgesteld, dewelke later werd aangepast in de WHO classificatie (2001, aanpassing in 2008). De FAB classificatie is gebaseerd op de morfologische karakteristieken van het beenmerg en het aantal blasten 1. De WHO classificatie houdt bovendien ook rekening met de cytogenetische resultaten. In Tabel 1 wordt een overzicht weergegeven van de MDS subgroepen die door WHO en FAB worden erkend. Door de toenemende beschikbaarheid van moleculaire genetische analyses wordt het aantal moleculaire markers, dat iets leert over staging, prognose en behandeling van MDS, steeds groter (6, 7). De WHO classificatie is gebaseerd op zowel de morfologie als de cytogenetica van het beenmerg (4). Het FAB systeem is in de WHO classificatie grotendeels bewaard gebleven, maar er werden wel enkele aanpassingen doorgevoerd. De meest opvallende verschillen zijn dat het 5q-syndroom in de WHO classificatie erkend wordt als een onafhankelijk subtype. RAEB-t werd verwijderd uit de classificatie, zodat alle patiënten met meer dan 20% blasten in het perifeer bloed en/of beenmerg beschouwt worden als patiënten met AML met multi-cellijn dysplasie. Chronische myelomonocytaire leukemie (CMML) wordt geclassificeerd onder een nieuwe groep, namelijk de myelodysplastische/myeloproliferatieve ziekten (6). 1 Blasten: moedercel (bv. Erytroblast, myeloblast) (Uit: Pinkhof geneeskundig woordenboek 2006) 3

Tabel 1: Vergelijking FAB en WHO classificatie FAB classificatie Refractaire anemie (RA); <5% blasten RA met 15% ringsideroblasten (RARS) RA with excess blasts (RAEB); 5-20% blasten RA with excess blasts in transformation (REAB-t) 21-30% blasten WHO classificatie RA Refractaire cytopenie met multi-cellijn dysplasie (RCMD) Ongeclassificeerde MDS (MDS-U) MDS met del(5q) of 5q- syndroom RARS RCMD met ringsideroblasten (RSCMD) RAEB-1 (5-9% blasten) RAEB-2 (10-19% blasten) CMML Acute lymfoïde leukemie (AML) Uit: Bennett, J. M. (2005). "A comparative review of classification systems in myelodysplastic syndromes (MDS)." Semin Oncol 32(4 Suppl 5): S3-10. De bovenstaande criteria en classificatie zijn weliswaar vooral gebaseerd op gegevens uit studies bij volwassen MDS-patiënten. Tot op heden is er nog geen wereldwijd aanvaard pediatrisch diagnostisch en classificatiesysteem. Een pediatrische aanpassing van de WHO classificatie bestaat en onderscheidt vier diagnostische groepen: refractaire cytopenie (RC;<5% blasten in het beenmerg), RAEB (5-20% blasten), RAEB-t (20-29% blasten) en myelodysplasie gerelateerde AML (MDR-AML, 30% blasten). De subtypes RARS en 5qsyndroom zijn zeer zeldzaam bij kinderen en worden dus niet opgenomen in de pediatrische versie van de WHO classificatie (4, 6). Bij refractaire cytopenie (RC) bestaat het beenmerg uit minder dan 5% blasten waardoor dit moeilijk te diagnosticeren valt, zeker in afwezigheid van een cytogenetische marker. Want cytopenie komt vaak voor in associatie met infecties, metabole stoornissen, nutritionele deficiënties en een variëteit aan andere ziektes (8). Bovendien is RC het meest voorkomende subtype van MDS bij kinderen en telt het mee voor ongeveer 50% van de gevallen. Het karyotype is de belangrijkste factor voor de progressie van RC naar geavanceerde MDS. De progressie is minder dan 2 jaar bij monosomie 7. Terwijl er bij trisomie 8 en andere karyotypes een langer en stabieler verloop van de ziekte voorkomt (3, 9). 4

Figuur 1: a) De overleving van 2347 patiënten met MDS volgens de WHO types. b) Cumulatief risico op AML evolutie. A. RCMD B. RARS C. RC D. 5q- E. RAEB I F. RAEB II Uit: Germing, U., et al., Epidemiology, classification and prognosis of adults and children with myelodysplastic syndromes. Ann Hematol, 2008. 87(9): p. 691-9. Uit figuur 1 kunnen we algemeen afleiden dat hoe verder de ziekte vordert, hoe lager de overleving en hoe hoger het risico op transformatie naar AML wordt. Om het geheel nog complexer te maken bestaan er naast de FAB en WHO classificaties ook nog een aantal scoring systems. De International Prognostic Scoring System (IPPS) classificatie is gebaseerd op drie variabelen, namelijk het percentage blasten in het beenmerg, de specifieke cytogenetische abnormaliteiten en het aantal celtypes met dysplasie en cytopenie (Tabel 2). Een normaal karyotype, -Y, del(5q) en del(20q) worden beschouwd als karyotypes met een goede prognose, een intermediair karyotype wordt toegekend aan karyotypes met andere abnormaliteiten en een karyotype met een slechte prognose wordt gekarakteriseerd door complexe chromosomale veranderingen of abnormaliteiten van chromomsoom 7 (6). 5

Tabel 2 : IPSS classificatie Prognostische variabele Score 0 0,5 1,0 1,5 2,0 BM blasten (%) <5 5-10 - 11-20 21-30 Karyotype Goed Intermediair Slecht Aantal cytopenieën 0/1 2/3 - - - Uit: Bennett, J. M. (2005). "A comparative review of classification systems in myelodysplastic syndromes (MDS)." Semin Oncol 32(4 Suppl 5): S3-10. Op basis van de drie variabelen worden er scores toegekend die dan een idee geven over de prognose van de patiënt en het risico op transformatie naar AML. Zo worden de patiënten in 4 prognostische groepen gedeeld: laag risico, intermediair-1, intermediair-2 en hoog risico. De mediane overleving varieert van bijna 6 jaar bij laag risico tot slechts minder dan 5 maanden bij hoog risico patiënten volgens de IPSS classificatie (Figuur 2, Tabel 3) (6). Tabel 3: De geschatte overleving en evolutie naar AML volgens de IPSS score. Risicogroep Score Mediane overleving (jaren) Risico op AML (%) Laag 0 5,7 9,4 Intermediair-1 0,5-1,0 3,5 3,3 Intermediair-2 1,5-2,0 1,2 1,1 Hoog >2,5 0,4 0,2 Uit: Bennett, J. M., P. A. Kouides, et al. (2002). "The Myelodysplastic Syndromes: Morphology, risk assessment, and clinical management (2002)." International Journal of Hematology 76: 228-238. Deze classificatie is geschikt om een prognose te berekenen, maar minder om een therapie te bepalen, want deze is eerder afhankelijk van de leeftijd, de algemene status van de patiënt en de donorbeschikbaarheid voor transplantatie (1). 6

Figuur 2: a) De overleving van 676 patiënten met MDS volgens de IPSS classificatie. b) Het cumulatief risico op AML evolutie bij 676 patiënten. Uit: Germing, U., et al., Epidemiology, classification and prognosis of adults and children with myelodysplastic syndromes. Ann Hematol, 2008. 87(9): p. 691-9 Figuur 3: De relatie tussen de FAB en IPSS classificatie van MDS. Uit: Bennett, J. M. (2005). "A comparative review of classification systems in myelodysplastic syndromes (MDS)." Semin Oncol 32(4 Suppl 5): S3-10. WPSS (WHO adapted prognostic scoring system) is een classificatie die gebaseerd is op de WHO classificatie, de cytogenetische kenmerken en de transfusienood op het moment van de diagnose. Net als de IPPS classificatie is de WPSS classificatie geschikt om de risicogroepen te identificeren met een verhoogd risico op transformatie naar AML. 7

Zo heeft een patiënt met een laag risico karyotype zonder transfusienood een mediane overleving van 200 maanden en een cumulatief risico op ontaarding in AML van 8% na 2 jaar. Bij de aanwezigheid van een ongunstig karyotype en het ontstaan van transfusienood wordt de prognose minder gunstig (5). Tenslotte kennen we ook de CCC classificatie waarin de patiënten ingedeeld worden volgens 3 criteria: Categorie (idiopathisch, syndroom-gerelateerd of therapie-gerelateerd), Cytologie en Cytogenetica. Deze classificatie werd specifiek opgesteld voor pediatrische MDS. De CCC classificatie geeft ook een beter beeld over de klinische situatie, waarop men zich kan baseren om een therapie op te starten (10). Hoewel deze benadering niet echt toepasbaar is als classificatiesysteem, levert deze wel de informatie die noodzakelijk is voor het maken van een klinische beslissing (9). Algemeen kunnen we besluiten dat de cytogenetische kenmerken, het blastenaantal in het beenmerg, de LDH-waarden, de celaantallen en de transfusienood op het moment van de diagnose de belangrijkste onafhankelijke prognostische parameters zijn (5). 8

2.2. Syndromen geassocieerd met MDS Uit diverse onderzoeken blijkt dat patiënten met bepaalde erfelijke beenmergaandoeningen een verhoogde kans hebben op het ontwikkelen van MDS (Tabel 4). Dit risico is het grootst bij Fanconi anemie, Shwachmann-Diamond syndroom en ernstige congenitale neutropenie (SCN: severe congenital neutropenia) (4, 9). Tabel 4: Overzicht van genetische afwijkingen die aan de basis liggen van een genetische syndroom en de frequentie waarmee ze gepaard gaan met een myeloïde maligniteit. Syndroom Genetische Achtergrond Percentage myeloïde maligniteit Fanconi anemie Mutatie van één of meerdere van de 13 30-40 % FANC genen Shwachmann-Diamond SBDS 30-40% syndroom Dyskeratosis congenita DKC1, TERC, TERT, NOLA3 5% Ernstige congenitale HAX1, ELA2, GFI1, WAS 30% neutropenie Diamond-Blackfan anemie RPS19, RPS24, RPS17 5% Uit: Niemeyer, C.M. and C.P. Kratz, Paediatric myelodysplastic syndromes and juvenile myelomonocytic leukaemia: molecular classification and treatment options. British Journal of Haematology, 2008. 140(6): p. 610-624. Bij Fanconi anemie zijn er defecten in het antwoord op DNA schade. Karakteristiek aan dit syndroom is de aanwezigheid van mutaties in één of meerdere van de 13 FANC genen. De geassocieerde proteïnen vormen een nucleair complex dat de mono-ubiquitinatie van FANCD2 en FACI toelaat. Dit proces is essentieel voor de vorming van foci op de chromatine die DNA schade aanduiden en herstel initiëren (9). Het Shwachmann-Diamond syndroom (SDS) is een autosomaal recessief syndroom gekarakteriseerd door algemene beenmerginsufficiëntie. Het wordt veroorzaakt door mutaties in het SBDS gen, dat een sleutelrol speelt in de ribosoom biogenese en dus in het RNA metabolisme. Het Shwachmann-Diamond syndroom is dikwijls gekenmerkt door cytogenetische afwijkingen van chromosoom 7 (4, 9). 9

Dyskeratosis congenita gaat meestal gepaard met genmutaties die coderen voor componenten van het telomerasecomplex. Dit beschadigt de activiteit van het telomerase-enzym en veroorzaakt overvloedige telomeerverkorting waardoor cellulaire ouderdom en apoptose geïnduceerd worden (4, 9). Ernstige congenitale neutropenie is een autosomaal recessieve ziekte en wordt veroorzaakt door een mutatie van HAX1. Dit gen codeert voor een mitochondriaal proteïne dat myeloïde cellen beschermt tegen apoptose. De ziekte kan ook autosomaal dominant zijn, dit is dan te wijten aan mutaties van ELA2 of zeldzaam van GFI1. Hierdoor komt het genproduct, neutrofiel elastase, niet op de juiste plaats terecht, wat gepaard gaat met een toegenomen apoptose (9). Bij SCN is het 15-jaar cumulatief risico op myelodysplasie 15% (4). Bij patiënten met erfelijke aplastische anemie ontwikkelt 10-15% van degene die niet behandeld worden met een stamceltransplantatie, MDS (4). 10

2.3. Therapie-gerelateerde MDS Therapie gerelateerde of secundaire MDS (t-mds) is een levensbedreigende complicatie na de behandeling van pediatrische kanker. Deze complicatie is het gevolg van de blootstelling aan alkylerende medicatie (temozolomide), topoisomerase-ii inhibitoren (epipodophyllotoxine) en radiotherapie. Deze therapieën worden voornamelijk toegepast in de behandeling van het osteosarcoom, het Hodgkin lymfoom, non Hodgkin lymfoom, ewing sarcoom, medulloblastoom en acute lymfoblast leukemie (ALL). De mediane latentieperiode bedraagt 4,1 jaar (11). Men schat dat t-mds minstens 1% van de pediatrische kankerpatiënten treft, met een hogere incidentie bij kinderen die behandeld zijn voor de ziekte van Hodgkin (4%) (12). Patiënten met t-mds zijn gemiddeld ouder dan diegene met de novo MDS en hebben een lagere kans op complete remissie en overleving (11). T-MDS na blootstelling aan alkylerende agentia (zoals bv. bij de behandeling van de ziekte van Hodgkin) wordt vaak geassocieerd met een hoge incidentie aan chromosomale afwijkingen, vooral abnormaliteiten van de chromosomen 5 en 7. Bij deze patiënten wordt een dysplasie gezien waarin de drie cellijnen betrokken zijn, ook is er een significante beenmergfibrose en een sneller verloop naar AML. T-MDS na behandeling van de primaire kanker met topoisomerase-ii inhibitoren is vaak geassocieerd met translocaties (bv. t(8;21), t(15;17)) die ook aanwezig zijn bij de novo AML (13). Er zijn een aantal factoren gerapporteerd die de kans op het ontwikkelen van t-mds vergroten. De belangrijkste predisponerende factoren zijn bepaalde polymorfismen van DNA-herstel en - detoxificatie enzymen. Detoxificatie enzymen beschermen ons tegen de potentieel schadelijke invloed van de omgeving en beïnvloeden de metabolisatie van medicatie. Indien deze enzymen door een polymorfisme trager werken, blijven de schadelijke stoffen langer in het lichaam, waardoor er een groter risico bestaat op DNA schade. Zo vertonen personen met een Glutathione S-transferase Mu 1 (GSTM1) en/of glutathione S-transferase theta 1 (GSTT1) of N-acetyltransferase (NAT) polymorfisme meer DNA-schade als gevolg van blootstelling aan carcinogenen. Polymorfismen van DNA-herstel enzymen kunnen leiden tot de persistentie van mutaties waardoor er secundaire maligniteiten, zoals t-mds, kunnen ontstaan (14). 11

2.4. Behandeling Het therapeutisch doel bij kinderen is curatief, dat is in tegenstelling met de therapie bij volwassenen aangezien deze eerder palliatief is (4). 2.4.1. Watch-and-wait strategie Bij patiënten met refractaire cytopenie zonder chromosoom 7 abnormaliteiten of een complex karyotype kan een watch-and-wait strategie gevolgd worden indien de patiënt niet transfusieafhankelijk is en niet bedreigd wordt door een laag neutrofielenaantal. Een jaarlijks onderzoek van het beenmerg is aangewezen om zo ziekteprogressie naar een intermediair of hoog-risico stadium vroeg te detecteren. Indien progressie optreedt is een hematopoiëtische stamceltransplantatie (HSCT) de enige behandelingsmogelijkheid (9). 2.4.2. Hematopoiëtische stamcel transplantatie Een hematopoiëtische stamceltransplantatie is tegenwoordig de enige therapeutische mogelijkheid die potentieel curatief is (15, 16). Een allogene 2 hematopoiëtische stamceltransplantatie is dan ook de standaardbehandeling bij pediatrische myelodysplasie. Vooraleer een HSCT uitgevoerd wordt, moet de patiënt eerst geconditioneerd worden (door middel van chemo- en/of radiotherapie). Als gevolg van deze conditionering wordt het immuunsysteem van de patiënt uitgeschakeld waardoor het risico op het afstoten van het donorbeenmerg aanzienlijk verlaagd wordt en tegelijk worden de zieke cellen vernietigd. Een HSCT is niet zonder risico s: er kunnen ernstige complicaties (zoals Graft versus Host Disease 3 ) en infecties optreden, die mogelijks levensbedreigend kunnen zijn. De ideale donor voor een allogene HSCT is een broer of zus met identieke HLA-antigenen 4. Slechts 1/3 van de patiënten hebben binnen het gezin of familie een HLA-identieke donor. Bij het merendeel van de patiënten moet men dus op zoek naar een alternatief donortype, namelijk een ongerelateerde donor, waarbij men zoveel mogelijk overeenkomst beoogt tussen de HLA-antigenen van de patiënt en de donor (15). 2 Allogene: afkomstig van een genetisch niet-identiek individu van dezelfde species. 3 Graft versus Host disease: soms na een transplantatie voorkomende ernstige reactie van de transplantaatcellen gericht tegen de cellen van ontvanger 4 HLA-antigenen: antigeen dat aanwezig is op de celmembranen van vrijwel alle lichaamscellen en dat een belangrijke rol speel bij transplantaties; komt vooral voor op leukocyten; is erfelijk bepaald door genen die liggen op vier nauwgekoppelde loci (HLA-A, HLA-B, HLA-C en HLA-D) op de korte arm van het 6 e chromosoom. (Uit: Pinkhof geneeskundig woordenboek 2006) 12

Figuur 4: A) de 8-jaars probabiliteit van ziektevrije overleving na beenmergtransplantatie (BMT) voor patiënten die een overeenkomstige donor (overeenkomstig voor HLA-A, B, C, DRB1) hebben (matched, 57%) of niet (mismatched, 33%) B) de 8-jaars probabiliteit van ziektevrije overleving na BMT, uitgesplitst over RC, RAEB en RAEB-t. Uit: Woodard, P., et al., Unrelated Donor Bone Marrow Transplantation for Myelodysplastic Syndrome in Children. Biology of Blood and Marrow Transplantation, 2011. 17(5): p. 723-728. Het ziektestadium en het aantal overeenkomende donorantigenen spelen een belangrijke rol voor het succes van de beenmergtransplantatie. De beste resultaten na een ongerelateerde donor HSCT worden behaald bij patiënten met refractaire cytopenie en wanneer de donor en ontvanger overeenkomen in HLA-A, - B, -C en DRB1 (Figuur 4). Wanneer er geen overeenkomstige ongerelateerde donor beschikbaar is, is een transplantatie met navelstrengbloed van een ongerelateerde donor een alternatief (15). HLA-overeenkomstige donoren die minstens één ouder gemeenschappelijk hebben, hebben het minst transplantatie gerelateerde mortaliteit (TRM), acute GVHD, chronische GVHD evenals een betere ziektevrije en algemene overleving dan HLA-niet-overeenkomstig gerelateerde en ongerelateerde donoren (17). Tussen HLA-niet-overeenkomstig gerelateerde en de ongerelateerde donoren is er geen verschil geobserveerd in TRM, acute en chronische GVHD, ziektevrije en algemene overleving (17). In de EWOG-MDS 98 studie ondergingen pediatrische patiënten met geavanceerde myelodysplasie een myeloablatieve therapie met drie alkylerende agentia, namelijk busulfan, cyclophosphamide en melphalan, vooraleer een HSCT werd uitgevoerd. Dit geeft een hogere kans op overleving bij kinderen met geavanceerde MDS. De studie toont aan dat er bij een allogene HSCT een overlevingskans is van 63% (18). 13

Binnen dezelfde studie is de 5-jaars cumulatieve incidentie van transplant-gerelateerde mortaliteit (TRM) 21%. Terwijl vroeger deze incidentie verhoogd was bij ongerelateerde donors in vergelijking bij een HLA-identieke broer/zus, is deze nu ongeveer vergelijkbaar, namelijk 23% tegenover 18%. Een verhoogde TRM wordt gezien bij patiënten ouder dan 12 jaar, bij een structureel complex karyotype, bij een interval tussen diagnose en HSCT van meer dan 4 maanden en het voorkomen van een acute of extensieve chronische graft-versushost disease (18). De 5-jaars cumulatieve incidentie van herval bedraagt gemiddeld 21%. Hervallen van de ziekte was meer voorkomend bij patiënten die reeds geavanceerde MDS hadden op het moment van de transplantatie. Het ondergaan van een intensieve chemotherapie voor de transplantatie en de aanwezigheid van een lager blastenaantal op het moment van HSCT zijn niet geassocieerd met een significant verlaagd risico op herval van de ziekte. Het risico op herval is wel verhoogd bij hooggradige MDS en bij transplantatie van een onvoldoende overeenkomstige ongerelateerde donor (18). Bij t-mds wordt de ziektevrije overleving geschat op 7,8-27,5% en ligt lager in vergelijking met de novo MDS. Naast het risico op het herval van de secundaire MDS, is er ook nog het risico op herval van de primaire kanker. Voorgaande therapie met anthracyclines of bestraling verhogen de neveneffecten van de conditionering, waardoor er een gestegen incidentie is van matig ernstige en ernstige geassocieerde toxiciteit bij patiënten die getransplanteerd worden voor t-mds. Ook is het zo dat patiënten met t-mds die geconditioneerd worden met busulfan en cyclophosphamide een hoger risico op herval hebben in vergelijken met patiënten met de novo MDS die geconditioneerd worden met dezelfde medicatie. Hieruit kan besloten worden de t- MDS meer agressief en meer resistent is tegen therapie dan de novo MDS (19). 14

3. Methodologie Deze scriptie is volledig gebaseerd op literatuuronderzoek. Bij het begin van academiejaar 2011-2012 werd er eerst en vooral op zoek gegaan naar algemene informatie omtrent pediatrische myelodysplasie. Om zo beter inzicht te krijgen in de ziekte. Hiervoor werden algemene artikels opgezocht met behulp van de zoekmachines PubMed en ISI Web of Science met de zoektermen myelodysplastic syndrome, MDS, childhood en pediatric. Na het verzamelen en lezen van de algemene artikels over pediatrische MDS, werd er gezocht naar meer specifieke artikels over de classificatie, genetica, prognose en behandeling. Ook hiervoor werden PubMed en ISI Web of Science geconsulteerd en werden combinaties van bovenstaande en onderstaande zoektermen gebruikt: chromosome, methylation, hypermethylation, RNA, micro-rna, mi-r, ribosomal, ribosome telomere, drug resistance, mitochondrial en therapy. Het selecteren van relevante artikels gebeurde op basis van titel, abstract en inhoud. Daarnaast speelde ook het tijdstip van publicatie een rol, aangezien het onderzoek van pediatrische myelodysplasie nog steeds een sterk evoluerend studiegebied is. Voor artikels met eerder algemene informatie over myelodysplasie werd met een marge van ongeveer 10 jaar rekening gehouden, voor de meer gedetailleerde gegevens werden enkel artikels van maximaal 5 jaar oud aangewend. De geselecteerde artikels werden dan voorgelegd aan de promotor, waarna de meest relevante publicaties werden weerhouden. 15

4. Resultaten De voorbije vijf jaar werd veel vooruitgang geboekt in het onderzoek naar de moleculaire genetica van MDS. Moleculaire merkers (zowel genetisch als epigenetisch) veranderen geleidelijk aan de diagnostische, classificatie en prognostische criteria voor MDS. Ook hebben deze onderzoeken een duidelijke impact op het ontwikkelen van specifieke medicijnen en behandelingsschema`s. 4.1. Cytogenetica Cytogenetische abnormaliteiten worden gevonden in ongeveer 50% van de patiënten met de novo MDS en zijn frequenter bij patiënten met t- MDS (80 tot 90%). Dit betekent dus dat, tenminste voor de novo MDS, 50% van de patiëntenpopulatie geen structurele chromosomale afwijkingen waarneembaar zijn (20). Desalniettemin is het karyotype een belangrijke prognostische parameter en wordt dus ook geïntegreerd in de bepaling van de prognose, voornamelijk binnen de WHO en IPSS classificaties (21). Een structureel complex karyotype (3 of meer afwijkingen met minstens één structurele abnormaliteit) gaat gepaard met een overlevingskans van slechts 14% over 2 jaar. Hieruit blijkt dat de aanwezigheid van een structureel complex karyotype een zeer sterke onafhankelijke parameter is die een ongunstige prognose voorspelt bij kinderen met hoogrisico MDS (Figuur 5) (22). Complexe abnormaliteiten kunnen het resultaat zijn van een multistep proces met sequentiële accumulatie van afwijkingen, dit wordt karyotype evolutie genoemd (21). In tegenstelling tot AML zijn gebalanceerde abnormaliteiten zoals translocaties en inversies zeldzaam bij myelodysplasie en worden vooral deleties en monosomieën vastgesteld, wat ongebalanceerde afwijkingen zijn. Een uitzondering hierop vormt de recurrente trisomie 8 (21). 16

Figuur 5: Probabiliteiten van de 5-jaars overleving volgens de cytogenetische stratificatie. A) Probabiliteit van 5-jaarsoverleving van kinderen met geavanceerde primaire of secundaire MDS volgens de cytogenetische onderverdeling. Een complex karyotype is gedefinieerd als de aanwezigheid van 3 of meer afwijkingen. Een structureel complex karyotype bevat minstens 3 chromosomale abnormaliteiten inclusief minstens één structurele afwijking, exclusief deze met clonale evolutie van monosomie 7. B) de probabiliteit van de 5- jaarsoverleving van kinderen met geavanceerde primaire of secundair MDS met een structureel complex karyotype; monosomaal karyotype met minstens een autosomale monosomie en één of meer structurele aberraties die niet voldoet aan de criteria van een structureel complex karyotype ( monosomal karyotype only ); monosomie 7 met of zonder bijkomende afwijkingen, inclusief clonale evolutie van monosomie 7; normaal karyotype; andere karyotypes. C) De 5-jaars overleving probabiliteit van patiënten volgens de cytogenetische subgroep. Patiënten die in B als monosomal karyotype only worden geclassificeerd, zijn hier in de groep van monosomie 7 gerekend. D) Probabiliteit van de 5- jaars overleving zonder herval van patiënten die een allogene HSCT ondergaan hebben (N=143). Uit: Gohring, G., et al., Complex karyotype newly defined: the strongest prognostic factor in advanced childhood myelodysplastic syndrome. Blood, 2010. 116(19): p. 3766-3769. 17

4.1.1. Monosomie 7 Abnormaliteiten van chromosoom 7 zijn de meest frequente afwijkingen bij pediatrische myelodysplasie. Monosomie 7 of del(7q) komt voor in 30% van de primaire MDS en ongeveer 50% van de patiënten met t-mds (9). Afwijkingen van chromosoom 7 bij t-mds zijn geassocieerd met methylatie van de CDKN2B promotor en mutatie van RUNX1 (9, 23, 24). Monosomie 7 gaat gepaard met een slechte prognose (25). 4.1.2. Trisomie 8 Trisomie van chromosoom 8 is de enige recurrente chromosomale amplificatie in myelodysplasie. In ongeveer 8% van de patiënten is trisomie 8 de enige chromosomale abnormaliteit. Deze afwijking wordt beschouwd als een cytogenetische abnormaliteit met een intermediair risico. Cellen met trisomie 8 vertonen hogere expressie van anti-apoptotische genen waardoor ze een selectief voordeel hebben ten opzichte van de normale hematopoiëtische precursoren (26). Er wordt een opregulatie van proto-oncogen c-myc, CD1 (Cluster of Differentiation 1) en survivin (een inhibitor van apoptose) gezien. Dit zorgt ervoor dat de cellen met trisomie een relatief proliferatief voordeel bekomen en resistent zijn aan apoptose (27). Figuur 6: A) Cumulatieve incidentie van progressie naar geavanceerde MDS bij patiënten met RA en een normaal karyotype, monosomie 7, trisomie 8 of andere abnormaliteiten bij de diagnose. B) De overleving vanaf de diagnosestelling van 66 kinderen met RA volgens het karyotype. A B Uit: Kardos, G., I. Baumann, et al. (2003). "Refractory anemia in childhood: a retrospective analysis of 67 patients with particular reference to monosomy 7." Blood 102(6): 1997-2003. 18

4.2. Deleties en mutaties van individuele genen 4.2.1. RUNX1, NRAS, FLT3-ITD en MLL-PTD mutaties Aangezien MDS bij sommige patiënten als het ware een voorbode is van AML, heeft men heel wat onderzoek verricht op de detectie van AML-geassocieerde mutaties. Deze onderzoeken hebben uitgewezen dat, met uitzondering van Runt-related transcriptiefactor I (RUNX1), deze mutaties slechts in heel lage frequenties voorkomen in MDS en dus geen impact hebben op classificatie en prognose (28). Aangezien RUNX1 mutaties frequenter voorkomen in patiënten met hooggradige MDS, is het voorkomen van deze mutatie sterk geassocieerd met progressie naar AML, een slechtere prognose en korte overlevingstijd (Figuur 7). Mutaties in RUNX1 veroorzaken een vermindering in het transactivatie potentieel. RUNX1, ook gekend als Acute Myeloid Leukemia 1 (AML1) of Core-Binding Factor-α (CBFA), codeert voor het DNA-bindend subunit van het heterodimeer CBF complex dat essentieel is in de ontwikkeling van de definitieve hematopoiëse (24). Deze mutatie is beschreven bij AML, t-aml, RAEB, RAEB-t en MDS-AML. MDS- patiënten met RUNX1 mutaties hebben frequent ook somatische mutaties in genen die betrokken zijn in de RAS signaalcascade (9). Ook mutaties in FLT3, JAK2 en C-KIT gaan dikwijls samen met RUNX1 mutaties (23). Patiënten met RUNX1 mutaties bij de diagnose hebben een hoger aantal neutrofielen, een tendens van een lager aantal trombocyten en een hogere frequentie van -7/7q deleties. De mutatie in RUNX1 kan eveneens verworven worden tijdens de verdere progressie van de ziekte (24). Puntmutaties van AML1 zijn significant gerelateerd aan eerdere therapie met alkylerende agentia en t- MDS. Hierbij is er ook een snellere progressie naar AML (29). 19

Figuur 7: Vergelijking van de overleving tussen patiënten met en zonder de RUNX1 mutatie bij diagnose. Uit: Chen, C.Y., et al., RUNX1 gene mutation in primary myelodysplastic syndrome - the mutation can be detected early at diagnosis or acquired during disease progression and is associated with poor outcome. British Journal of Haematology, 2007. 139(3): p. 405-414. Neuroblastoma RAS viral oncogene homolog (NRAS), een guanine nucleotide (GTP) bindend eiwit, is een signaaltransductor die de antwoorden op een aantal cytokines (zoals GM-CSF (granulocyt-macrofaag stimulerende factor) en PDGF (platelet derived growth factor)) medieert. Mutaties in RAS genen (vooral NRAS) komen voor in verscheidene myeloïde ziektes, waaronder AML, MDS en CML. Bij MDS worden NRAS mutaties beschreven in 3-42% van de patiënten met progressie naar AML waarvan de oorzaak toegekend wordt aan de NRAS mutaties zelf (20). FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3) is een receptor tyrosine kinase die betrokken is in de vroege stamceloverleving en myeloïde differentiatie. Activerende mutaties worden beschreven in 25-30% van de patiënten met AML en zijn geassocieerd met een slechte prognose. Bij MDS zijn FLT3 activerende mutaties minder frequent (3-11%), ze komen het meest voor in hoog-risico MDS en zijn geassocieerd met verdere ziekteprogressie. De mutaties zijn meer aanwezig bij de novo MDS in vergelijking met t-mds (20). 20

Het mixed lineage leukemia (MLL) gen is gelokaliseerd op chromosoom 11q23 en codeert voor een proteïne dat de gentranscriptie reguleert door middel van chromatine modulatie. MLL is betrokken bij een groot aantal gebalanceerde translocaties in acute leukemie, maar wordt zelden gerapporteerd bij patiënten met t-mds en al helemaal niet bij patiënten met de novo MDS (20). Tabel 5: Mutaties in RUNX1, NRAS, FLT3 en MLL met hun kenmerken. Mutatie Functie Eigenschap Voorkomen in MDS RUNX1 Regulatie hematopoiëse Slechte prognose, 5-21,6% Transcriptiefactor progressie naar AML NRAS Signaaltransductie in de cel Progressie naar AML 3-42% FLT3 Overleving en myeloide Slechte prognose, 3-11% differentiatie stamcellen ziekteprogressie MLL Regulatie gentranscriptie -translocatie: zeldzaam -amplificatie: 5-14% Gebaseerd op gegevens uit: Cherian, S. and A. Bagg (2006). "The genetics of the myelodysplastic syndromes: Classical cytogenetics and recent molecular insights." Hematology 11(1): 1-13. 4.2.2. TP53 mutaties en PPARγ mutaties Tumor Protein p53 (TP53), dat zich bevindt ter hoogte van 17p31.1, codeert voor een tumorsuppressor gen verantwoordelijk voor groeiarrest en apoptose (30). Het TP53 gen is gemuteerd in een belangrijke proportie van de MDS patiënten en is voornamelijk geassocieerd met t-mds (9). Mutaties van TP53 zijn geassocieerd met 17p deleties en met een complex karyotype. De aanwezigheid van dergelijke mutaties voorspelt een prognostisch ongunstige MDS vorm en een verhoogde kans op progressie naar AML. Sommige studies suggereren zelfs dat mutaties van TP53 de meest ongunstige prognostische factor is bij MDS (Figuur 8)(20). 21

Figuur 8: De invloed van een bijkomende TP53 mutatie bij patiënten met MDS met 5qabnormaliteiten. Uit: Haferlach, T. (2012). "Molecular genetics in myelodysplastic syndromes." Leuk Res. Een andere tumorsuppressor gesitueerd in de TP53 apoptose signaalcascade is peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ). Het gen bevindt zich op chromosoom 3p25.1 en codeert voor een nucleaire receptor die betrokken is in het energiemetabolisme en apoptose. Het heeft ook een rol in de suppressie van de expressie van verscheidene oncogenen. PPARγ receptor activatie inhibeert de hematopoiëtische tumorcel proliferatie door de inductie van apoptose via caspase 3 activatie. Deletie van dit gen is geassocieerd met een slechte prognose (30). 4.2.3. Mutaties van TET2 Ten-eleven translocation 2 (TET2) maakt deel uit van een genfamilie die een belangrijke rol speelt in de epigenetische programmering, het behoud van de embryonale stamcellen en de vroege ontwikkeling ervan (31). Mutaties van TET2 gaan gepaard met een goede prognose, een verlengde overleving, een lagere kans op transformatie naar AML (Figuur 9). De afwezigheid van de mutatie is geassocieerd met een 4,1 keer groter risico op mortaliteit. TET2 mutaties komen in ongeveer 20% van de MDS patiënten voor. Uit een multivariate analyse werd besloten dat mutaties van TET2 een onafhankelijke gunstige prognostische factor is (32). 22

Figuur 9: Kaplan Meiers curves voor algemene, leukemie-vrije en eventvrije overleving. A) Overleving in TET2 gemuteerde (---) en niet-gemuteerde ( ) MDS-patiënten. B) Leukemie-vrije overleving van gemuteerde en niet-gemuteerde MDS-patiënten. C) Overleving zonder dood of AML progressie in gemuteerde en niet-gemuteerde patiënten. Uit: Kosmider, O., V. Gelsi-Boyer, et al. (2009). "TET2 mutation is an independent favorable prognostic factor in myelodysplastic syndromes (MDSs)." Blood 114(15): 3285-3291. 23

4.2.4. Mutaties in ASXL1, EZH2 en ETV6 Additional Sex-comb Like-1 (ASXL1) gen codeert voor een proteïne dat deel uitmaakt van een familie van chromatine bindende eiwitten en is betrokken in de epigenetische regulatie van de genexpressie. Mutaties in ASXL1 worden beschreven in ongeveer 10-15% van de patiënten met MDS en myeloïde proliferatieve neoplasma. Dit kan samengaan met mutaties van RUNX1 en TET2 (26). Recent werden ook mutaties in het Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2) ontdekt bij myelodysplasie. Dit gen is eveneens betrokken in de regulatie van de epigenetische status. EZH2 bevindt zich op de distale deel van chromosoom 7q en codeert een histon methyltransferase. Mutatie wordt gerapporteerd in 6% van de MDS-patiënten en gaat gepaard met een slechte prognose (26). Het ETS Variant 6 (ETV6) gen bevindt zich op chromosoom 12p13 en codeert voor een transcriptiefactor. Bij MDS is dit gen betrokken bij de reciproke translocatie t(3;12)(q26;p13), waardoor het niet meer functioneel is. Deze translocaties komen weinig voor bij MDS, namelijk slechts in 0,2% van de patiënten (33). Bovenstaande mutaties zijn alle drie onafhankelijk geassocieerd aan een gedaalde overleving en zijn dus ongunstige prognostische markers (34). 24

Figuur 10: Doelwitten van puntmutaties en deleties in myelodysplastische syndromen. Mutaties in verscheidene signaalcascades zijn betrokken in de pathogenese van MDS. In het rood de doelwitten van activerende mutaties, in het blauw waar mutatie of deletie resulteert in verlies van functie. Uit: Bejar, R., R. Levine, et al. (2011). "Unraveling the Molecular Pathophysiology of Myelodysplastic Syndromes." Journal of Clinical Oncology 29(5): 504-515. 25

4.3. Telomeerverkorting Verkorting van de telomeren 5 en chromosomale instabiliteit zouden een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling van myeloïde maligniteiten, waaronder MDS (35). Uit de studie van Lange K. et al. blijkt dat patiënten met MDS uit alle subgroepen, uitgezonderd bij monosomie 7, significant kortere telomeren vertonen dan deze van gezonde controles. Patiënten met een geïsoleerde monosomie 7 vertonen significant langere telomeren dan patiënten met een normaal karyotype. Er werden mutaties gevonden in telomerase componenten wat leidt tot de sterke daling van de telomerase-activiteit en dus een verhoogd risico op hematologische maligniteiten. Als telomeren steeds korter worden en een kritieke korte lengte bereikt wordt, kunnen dicentrische chromosomen gevormd worden die een break-fusion-bridge cyclus ondergaan, wat leidt tot verlies of winst van chromosomen of tot het ontwikkelen van ongebalanceerde chromosomale veranderingen (35). Cellen met chromosomale aberraties kunnen een proliferatief voordeel verwerven en evolueren naar klonen. Dit is vooral het geval wanneer de cel deze aberraties stabiliseert door middel van switchen naar ALT (alternative lengthening of telomeres) of reëxpressie/opregulatie van telomerase. Patiënten met een complex karyotype of RAEB2 zijn reeds het punt van korte telomeren en de hoogste chromosomale instabiliteit voorbij. Door de opregulatie van telomerase, kunnen de telomeren verlengd worden, waardoor de afwijkingen op chromosomaal niveau gestabiliseerd worden. Bij patiënten met meer geavanceerde subtypen van MDS worden verhoogde levels van htert (human telomerase reverse transcriptase) en verhoogde telomerase activiteit gezien. Deze hypothese wordt ook ondersteund door de identificatie van neo-telomeren bij MDS met een complex subtype en RAEB2. Laag-risico MDS daarentegen wordt gekarakteriseerd door een toegenomen telomeerverkorting (35). 5 Telomeer: het distale uiteinde van een chromosoomarm (uit: Pinkhof geneeskundig woordenboek 2006) 26

4.4. Epigenetische veranderingen 4.4.1. Methylatie DNA methylatie is een epigenetisch proces dat bestaat uit de additie van een methylgroep op cytosine in een CpG dinucleotide. Dit proces wordt uitgevoerd door bepaalde enzymen, de methyltransferasen, en zorgt ervoor dat de transcriptie binnen de betrokken genetische regio s onderdrukt wordt. Wanneer DNA methylatie ongecontroleerd gebeurt, kan de transcriptie en de expressie van tumorsuppressor genen onderdrukt worden, wat dan weer (meestal in samenwerking met andere factoren) aanleiding kan geven tot kanker. Ook bij pediatrische MDS werd recent nagegaan of aberrante methylatie plaatsgrijpt en welke impact dit heeft op classificatie, prognose en behandeling (36, 37). CALCA, CDKN2B/p15 en CDKN2A/p16 CALCA en CDKN2B zijn het meest frequent gehypermethyleerd bij pediatrische patiënten met MDS (resp. 85,7% en 50%). Er is echter geen significante correlatie tussen de methylatiestatus en de klinische kenmerken of overleving. CALCA is een gen gelokaliseerd op chromosoomregio 11p15, een gebied dat meerdere tumorsuppressor genen bevat. Methylatie van CALCA speelt een rol in de neerregulatie van p57kip2, een cyclin-dependent kinase inhibitor, die meespeelt in de regulatie van de G1/S overgang in de celcyclus. Het wordt geassocieerd met een ongunstige klinische uitkomst (36). Zowel p15(cdkn2b) als p16(cdkn2a) behoren tot de cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor familie, die de progressie van de celcyclus van de G1 fase naar de S fase controleren (38). Wanneer de hoeveelheid transcript van deze genen door hypermethylatie daalt, ontstaat er een proliferatief voordeel, groei en maligne transformatie naar AML (36). Bij t-mds is er een sterke associatie tussen de methylatie van p15 en deletie of verlies van chromosoomarm 7q, wat de meest voorkomende cytogenetische abnormaliteit is bij t-mds. Er is geen associatie met deletie van 5q of 17p, de tweede en derde meest frequent geziene cytogenetische abnormaliteiten. Patiënten met een complex karyotype en drie of meer chromosoomaberraties vertonen een hogere p15 methylatiegraad in vergelijking met diegene met een normaal karyotype of een/twee chromosoomabnormaliteiten. De methylatie van p15 wordt niet beïnvloed door de leeftijd van de patiënt, het geslacht en het type van de voorafgaande therapie met alkylerende agentia, topoisomerase II inhibitoren of radiotherapie 27

In tegenstelling met t-mds wordt bij de novo MDS p15 methylatie niet als een onafhankelijke prognostische factor gezien als ook andere parameters zoals het blastenpercentage in het beenmerg ook in beschouwing genomen worden. Bij t-mds hebben zowel het percentage myeloblasten in het beenmerg als de p15 methylatie een prognostische betekenis (39). Figuur 11: Overleving in functie van p15 methylatie aan de hand van een Kaplan-Meier curve van 50 patiënten met t-mds. Uit: Christiansen, D. H., et al. (2003). "Methylation of p15ink4b is common, is associated with deletion of genes on chromosome arm 7q and predicts a poor prognosis in therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia." Leukemia 17(9): 1813-1819. Methylatie van p15 en p16 is geassocieerd met de meer gevorderde stadia van myelodysplasie (RAEB en RAEB-t) en ziekteprogressie, dit suggereert een rol van methylatie in de progressie van de ziekte en de voorspelling van evolutie naar AML. Hierbij is er een directe correlatie tussen de graad van methylatie van beide genen en het percentage blasten in het beenmerg. Dit betekent dat proliferatie van de MDS kloon en zijn evolutie naar AML de ontsnapping vereist uit de G1 fase van de celcyclus. Hierbij lijkt de methylatie van beide genen een belangrijke rol te spelen. Zo kan men suggereren dat de methylatie van deze genen een mogelijke epigenetische biomarker is van ziekte-evolutie en gepaard gaat met een ongunstige prognose (Figuur 11) (37, 38). 28

4.4.2. Micro-RNA Micro-RNA s zijn kleine endogene niet coderende RNA s die de expressie van doel-mrna s negatief reguleren op basis van het complementariteitsprincipe. Verscheidene cruciale cellulaire processen staan onder controle van micro-rna s waardoor ontregeling ervan leidt tot ziekteontwikkeling en/of -progressie. Ze spelen een essentiële rol in de normale ontwikkeling en in het bijzonder ook in de regulatie van zelfhernieuwing en differentiatie van hematopoiëtische (progenitor)cellen. Recente micro-rna expressie profileringen toonden aan dat men op basis van micro-rna expressie een onderscheid kan maken tussen normale en myelodysplastische hematopoiëse. Het mirna expressieprofiel van laaggradige MDSpatiënten en RAEB-1 patiënten vertoont gelijkenissen met de controlegroep. Anderzijds leunt het RAEB-2 mirna expressieprofiel eerder aan bij het profiel van secundaire AML (40). Vooral op basis van de expressie van twee microrna s, mir-422a en mir-617, blijkt het mogelijk een onderscheid te maken tussen laaggradige MDS, de meer hooggradige stadia en AML (41). MiR-181 speelt een belangrijke rol in de negatieve regulatie van de hematopoiëse, waaronder de proliferatie en differentiatie van de stam-/progenitorcellen en de ontwikkeling van de megakaryocytaire cellijn (42). MiR-221 en mir-222 zijn belangrijk bij de expansie van erythroblasten, bij overexpressie van deze microrna s kan de erythroïde groei onderdrukt worden, waardoor dit een invloed heeft op de ziekte geassocieerde ineffectieve erythropoiëse (42). De expressie mir-221 is significant verlaagd bij post-mds-aml, dit is niet het geval voor mir-222 (43). 29

Figuur 12: Expressie levels van mir-181a en mir-222 in de controlegroep, bij patiënten met MDS en bij patiënten met post-mds AML. Uit: Pons, A., et al. (2009). "Hematopoiesis-related microrna expression in myelodysplastic syndromes." Leuk Lymphoma 50(11): 1854-1859. Uit figuur 12 kan men afleiden dat de expressie van zowel mirna-181a als mirna-222 toeneemt bij progressie van de ziekte. In het geval van mirna-181 wordt de proliferatie en differentiatie en de ontwikkeling van de megakaryocyten onderdrukt. Door de toenemende expressie van mirna-222 bij progressie van MDS wordt de erythroïde groei geïnhibeerd. Uit een andere studie bleek dat MiR-155, een translationele repressor van verscheidene myeloïde transcripiefactors (zoals PU.1, C/EPBβ en CSF1R), significant verhoogt was hoog risico MDS. De studie van O Connell et al (2008) toonde aan dat muizen die getransplanteerd worden met mir-155 bevattende stamcellen een myeloproliferatieve aandoening ontwikkelen met abnormale granulocytenmorfologie zoals gezien wordt in MDS (42). Binnen de mir-29 familie zijn er twee micro-rna s die neergereguleerd zijn in hoog risico MDS in vergelijking met gezonde controles, namelijk mir-29b en mir-29a. Beide zijn gelokaliseerd op chromosoom 7q32, een regio die frequent verloren gegaan is bij MDS. Beide werken in op myeloid cell leukemia sequence 1 (MCL1), een onderdeel van de BCL2 antiapoptotische genfamilie, dat tot overexpressie komt in hoog risico MDS. 30

Verlies van mir-29a/b resulteert niet alleen in een overexpressie van MCL1, maar ook van DNA methyltransferases (DNMT s). Dit suggereert dat de downregulatie van mir-29 mogelijks een sleutelrol speelt in de pathogenese van myelodysplasie en de progressie naar AML (42). MiR-34a komt significant tot overexpressie in de vroege stadia van myelodysplasie. Het is een direct pro-apoptotische transcriptioneel target van p53 en kan via BCL2 een rol spelen in de toegenomen apoptose van beenmergprogenitorcellen zoals gezien in laag risico MDS. Daarnaast veroorzaakt de opregulatie van mir-34a een daling van de PU.I expressie (speelt een belangrijke rol in de hematopoiëtische signalisatie) met een verminderde myeloïde signalisatie tot gevolg, die bijdraagt tot de ineffectieve hematopoiëse (40). De dalende expressie van mirna-10a lijkt geassocieerd te zijn met de progressiestatus van de ziekte. Dit micro-rna controleert de translatie van HOX genen, die een belangrijke rol hebben in de regulatie van de vroege stadia van de hematopoiëse, inclusief de zelfhernieuwing van de hematopoiëtische stamcellen. Door de reductie van de hoeveelheid mir-10a in geavanceerde MDS kunnen de hematopoiëtische stamcellen in het beenmerg transformeren naar leukemische cellen door de opregulatie van de HOX genen. We kunnen dus stellen dat de daling van MiR-10a een marker is van MDS progressie (40). Een toegenomen expressie van mir-125b wordt gezien bij t(2;11)(p21;q23) en mir-125a bij del(5q) MDS, wat interfereert met de monocyten en granulocyten differentiatie van primaire CD34+ cellen. Overexpressie van mir-125b bij muizen resulteert in een overlevingsvoordeel van de immature hematopoiëtische stamcellen, een myeloproliferatieve aandoening en eventueel progressie naar fatale myeloïde leukemie (41). 31

Figuur 13: Overzicht van de mirna-bijdrage in de pathogenese van MDS. Een overzicht van de belangrijkste cellulaire, klinische en morfologische kenmerken van MDS: hematopoietische stamcellen (HSC), erytrocyten (Eryth), megakaryocyten (Mk), en de witte bloedcellen (WHC). De mirna s die overexpressie vertonen worden weergegeven in het bovenste rode vak, diegene die neergereguleerd zijn onderaan in het groene vak. De stippellijnen verbinden het micro-rna met zijn potentiële rol in de pathogenese van MDS. Uit: Rhyasen, G. W. and D. T. Starczynowski (2012). "Deregulation of micrornas in myelodysplastic syndrome." Fosfatidylinositol (PI) 3 kinase reguleert de celoverleving en apoptose voornamelijk via Akt. PI 3 kinase activeert Akt door de productie van 3 fosfoinositides, waarop deze in myeloïde cellen gedefosforyleerd worden door 2 fosfatases, namelijk Phosphatase and Tensin homolog (PTEN) en SH2-containing inositol-5-phosphatase (SHIP-1). De tumor suppressor PTEN is een 3 fosfoinositide fosfatase die frequent geïnactiveerd is bij MDS door epigenetische silencing. SHIP-1 is een 5 fosfoinositide fosfatase die enkel geëxpresseerd wordt in hematopoiëtische cellen. Bij hoog risico MDS patiënten ziet men frequent een verhoging van de Akt kinase fosforylatie in het beenmerg en de mononucleaire cellen in het perifeer bloed. Uit onderzoek bleek dat de hoeveelheid PTEN variabel is in de late stadia van MDS, SHIP-1 daarentegen is significant gedaald in de myeloïde cellen. Herstel van de SHIP-1 activiteit in humane leukemische cellen en in primaire blasten verhoogt de apoptose en vermindert de groei. Dit bevestigt dat SHIP-1 zich kan gedragen als een tumorsuppressor in myeloïde ziektes (44). 32