SAMENVATTING
SAMENVATTING Vetten in de voeding zijn belangrijk voor het menselijk lichaam als bronnen van energie en als bouwstenen, vooral in periodes van groei en ontwikkeling. Gewoonlijk is het menselijk lichaam in staat om voedingsvetten zeer efficiënt op te nemen; meer dan 96% van de voedingsvetten wordt opgenomen in het lichaam. Er zijn echter verschillende aandoeningen waarbij de absorptie van voedingsvetten verstoord is. Voor een goede behandeling van patiënten met deze zogenaamde vetmalabsorptiesyndromen is inzicht in het vetabsorptieproces essentieel. Het proces dat verantwoordelijk is voor de opname van vetten uit de voeding speelt zich af in het maagdarmkanaal. Allereerst worden in de maag en in het duodenum de voedingsvetten (voornamelijk triglyceriden) gesplitst in vetzuren en monoacylglyceriden. Dit splitsingsproces, dat bekend is onder de naam lipolyse, wordt gekatalyseerd door lipaseenzymen afkomstig uit de maag en de pancreas. Vervolgens worden deze gesplitste vetdeeltjes opgelost in de waterige omgeving van de dunne darm middels een proces dat bekend staat als solubilisatie. Hiertoe worden micellen gevormd die bestaan uit galcomponenten, zoals galzouten en fosfolipiden, en de vetdeeltjes. Vooral lange-keten vetzuren zijn sterk afhankelijk van een efficiënte solubilisatie, in tegenstelling tot middellange-keten vetzuren, omdat langeketen vetzuren slecht oplosbaar zijn in water. Tenslotte worden de vetdeeltjes getransporteerd over de celwand van de dunne darm, waarna ze terecht komen in de bloedbaan. De vetten die niet worden opgenomen in het lichaam, worden uitgescheiden via de ontlasting. Tot nu toe werd vooral aandacht besteed aan de efficiëntie van het totale proces van vetabsorptie, waardoor het inzicht in de bijdrage van de onderliggende mechanismes aan de vetmalabsorptie beperkt is. Een gedetailleerder inzicht in deze onderliggende mechanismes zou niet alleen kunnen leiden tot verbeteringen in diagnostische methodes, maar ook tot verbeteringen in behandelingsmethoden voor patiënten met vetmalabsorptie. Het doel van het huidige onderzoek was dan ook om meer informatie te verkrijgen over de verschillende pathofysiologische processen die betrokken zijn bij vetmalabsorptie en om de diagnostiek voor vetmalabsorptie te verbeteren. 130
Om deze doelstelling te verwezenlijken zijn studies uitgevoerd met proefdieren, gezonde proefpersonen en patiënten. De studies werden zo opgezet dat, naast de totale vetabsorptie, ook de processen lipolyse en solubilisatie werden onderzocht. De methode die in de kliniek gebruikt wordt om de totale hoeveelheid van geabsorbeerde vetten te bepalen is de vetbalans. Dit houdt in dat patiënten gedurende drie dagen in voedseldagboeken alles noteren wat ze eten, waardoor de totale vetinname kan worden bepaald. In deze periode verzamelen de patiënten ook al hun ontlasting, waarin de niet-geabsorbeerde hoeveelheid vetten kan worden bepaald. Op deze manier kan dan de hoeveelheid geabsorbeerde vetten uitgedrukt worden als percentage van de vetinname. Bijvoorbeeld, als de vetinname gedurende drie dagen 100 g per dag is en de hoeveelheid vet in de ontlasting gedurende deze periode 5 g per dag is, dan betekent dit dat de vetabsorptie 95% is. Met behulp van deze methode kan echter geen informatie over de achterliggende mechanismes (lipolyse en solubilisatie) worden verkregen. Deze informatie kan wel verkregen worden door gebruik te maken van testen waarbij vetten op een onschadelijke manier gelabeld worden met stabiele isotopen. In dit onderzoek zijn de diagnostische capaciteiten van twee verschillende soorten testen beschreven, namelijk een test voor het diagnosticeren van verstoorde lipolyse en een test voor het diagnosticeren van problemen bij solubilisatie. Verstoorde lipolyse kan worden aangetoond met behulp van de 13 C-MTG ademtest. 13 C-MTG is de afkorting van het gelabelde vet waarvan de volledige chemische naam luidt: 1,3-distearoyl, 2[carboxyl- 13 C]octanoyl glycerol. Na inname van dit substraat splitsen lipaseenzymen, afkomstig van de pancreas, de twee vetzuurketens van het molekuul af (=lipolyse), waarna het 13 C-gelabelde restmolekuul opgenomen kan worden in het lichaam. Omdat restmolekuul een middellange-keten vetzuur is, is de opname van het molekuul niet afhankelijk van solubilisatie. Na opname wordt dit 13 C-gelabelde restmolekuul grotendeels verbrand in het lichaam en vervolgens uitgeademd als 13 CO 2. Dus, het principe van de 13 C-MTG ademtest is gebaseerd op het feit dat, na inname van het substraat, de hoeveelheid 13 CO 2 die uitgeademd wordt, afhankelijk is van de activiteit van het pancreas lipase-enzym. Verstoorde solubilisatie kan worden aangetoond met behulp van lange-keten vetzuren (bijv. 13 C-palmitinezuur of 13 C- linolzuur). Dit zijn molekulen die niet meer gesplitst hoeven te worden door lipase-enzymen en de opname van deze molekulen in het lichaam is dus alleen afhankelijk van een goede solubilisatie. Na inname van bijvoorbeeld het substraat 13 C-palmitinezuur kan de door het lichaam opgenomen hoeveelheid in het plasma gemeten worden als 13 C-gelabeld palmitinezuur en na verbranding in de adem als 13 CO 2. De hoeveelheid die niet wordt geabsorbeerd, wordt uitgescheiden in de ontlasting en kan eveneens gemeten worden. Als het solubilisatieproces goed werkt, zal er veel 13 C-gelabeld palmitinezuur aanwezig zijn in plasma en veel 13 CO 2 in de adem, maar weinig 13 C-palmitinezuur in de ontlasting. In het eerste deel van dit proefschrift werd het proces lipolyse onderzocht. Om dit proces in detail te kunnen bestuderen werd allereerst een proefdiermodel ontwikkeld en gekarakteriseerd voor vetmalabsorptie ten gevolge van verstoorde lipolyse (hoofdstuk 2). Verstoorde lipolyse werd bewerkstelligd door ratten via hun gewone voer een stofje toe te dienen, orlistat, dat de activiteit van lipase-enzymen vermindert. De mate van vetmalabsorptie bleek afhankelijk te zijn van de toegediende hoeveelheid orlistat. Bij deze ratten werd onderzocht of vetmalabsorptie kon worden aangetoond met behulp van de 13 C-MTG 131
ademtest. Er bleek een sterk verband te bestaan tussen het percentage vetabsorptie en de totale hoeveelheid 13 CO 2 in de adem. Echter, als er sprake was van slechts een lichte vetmalabsorptie was, dan bleek er toch een grote variatie in de hoeveelheid 13 CO 2 in de adem te zijn. Dit zou kunnen komen doordat bij een milde vorm van verstoorde lipolyse de 13 CO 2 vorming niet alleen afhankelijk is van de lipolysesnelheid maar ook van factoren als maagontlediging en verbrandingssnelheid. Dit betekent dat de 13 C-MTG ademtest waarschijnlijk minder geschikt is als diagnostisch middel indien vetmalabsorptie slechts in geringe mate verstoord is. Om de toepassingsmogelijkheden van de 13 C-MTG ademtest verder te onderzoeken werd deze test vervolgens uitgevoerd bij gezonde volwassenen (hoofdstuk 3). De volgende factoren werden bestudeerd: het effect van twee verschillende testmaaltijden op de 13 CO 2 respons in de adem, het effect van een extra maaltijd tijdens de test, en het effect van lichamelijke oefening tijdens de test. Uit de experimenten met twee verschillende testmaaltijden bleek dat geen significante verschillen werden gevonden met betrekking tot de 13 CO 2 respons in de adem na een vloeibare testmaaltijd (75 ml slagroom) of een vaste testmaaltijd (2 sneeën tarwebrood en 25 g roomboter). Dit is vooral een voordeel voor zuigelingen, die nog geen vast voedsel kunnen innemen. Een extra maaltijd drie uur na aanvang van de test (2 sneeën tarwebrood en 25 g aardbeienjam), bleek de resultaten niet te veranderen. Dit is een voordeel voor kinderen omdat die vaak moeite hebben met vasten gedurende een langere periode. Ten derde bleek dat lichamelijk activiteit tijdens de test wel degelijk de resultaten beïnvloedde en dat het dus belangrijk is om tijdens de test in rust te blijven. De tweede stap in het proces van vetabsorptie die onderzocht werd in dit proefschrift is de solubilisatie van vetten. Om dit proces in detail te kunnen bestuderen werd ook hiervoor een proefdiermodel ontwikkeld en gekarakteriseerd (hoofdstuk 4). Verstoorde solubilisatie werd gerealiseerd door langdurige galonderbreking. Dit houdt in dat ratten werden voorzien van een catheter in de galgang, waardoor de gal niet meer de dunne darm instroomt, maar buiten het lichaam van de rat wordt opgevangen. De gal is dan niet meer beschikbaar voor solubilisatie van vetten in de dunne darm met als gevolg dat de vetten niet goed meer geabsorbeerd kunnen worden. In dit proefdiermodel werd onderzocht of verstoorde solubilisatie kon worden aangetoond met behulp van de 13 C-palmitinezuur test. De concentraties 13 C-palmitinezuur in plasma van gal-onderbroken ratten bleken duidelijk lager te zijn dan de concentraties 13 C-palmitinezuur in plasma van controle ratten. De test bleek zeer geschikt te zijn voor het aantonen van een sterk solubilisatieprobleem bij ratten. Om de gevoeligheid van de test verder te bepalen werden testen gedaan bij gezonde volwassenen waarbij een zeer licht vetmalabsorptie was bewerkstelligd ten gevolge van verstoorde solubilisatie (hoofdstuk 5). Dit werd gerealiseerd door de proefpersonen dagelijks 2 g calcium toe te dienen in de vorm van calcium carbonaat. Calcium bindt aan galzouten, waardoor deze niet meer beschikbaar zijn voor solubilisatie. Vervolgens werd onderzocht of deze milde vetmalabsorptie kon worden aangetoond met behulp van de [1-13 C]palmitinezuur test. Bij de proefpersonen werden zowel adem- als plasmamonsters verzameld gedurende een periode van 8 uur. Er bleek echter een discrepantie te zijn tussen de resultaten in het plasma en in de adem en de 13 C-palmitinezuur test is dus blijkbaar niet gevoelig genoeg om een zeer lichte vorm van vetmalabsorptie te detecteren. 132
Vervolgens werden experimenten verricht om meer inzicht te verkrijgen in de vetmalabsorptie die geassocieerd is met de genetische afwijking cystische fibrose. Cystische fibrose patiënten lijden vaak aan een pancreas insufficiëntie wat betekent dat onvoldoende pancreas lipase-enzymen in de dunne darm aanwezig zijn. Deze patiënten worden dan ook behandeld door bij elke maaltijd lipase-enzymen in te nemen. Het is echter meerdere malen aangetoond dat cystische fibrose patiënten, ondanks behandeling met pancreasenzymen, nog steeds een bepaalde mate van vetmalabsorptie overhouden. Een hogere dosis pancreasenzymen is echter niet gewenst omdat dit kan leiden tot aantasting van de dikke darm. Het mechanisme van vetmalabsorptie in cystische fibrose patiënten behandeld met lipaseenzymen kan veroorzaakt worden door een inefficiënte enzymtherapie en/of een verstoorde solubilisatie. Om meer inzicht te krijgen in deze processen werd een studie uitgevoerd bij cystische fibrose patiënten die behandeld werden met pancreasenzymen (hoofdstuk 6). De substraten 13 C-MTG en 13 C-linolzuur werden gebruikt om te bepalen wat de snelheidsbepalende stap achter deze vetmalabsorptie was: respectievelijk een lipolysedefect of verstoorde solubilisatie. Na inname van het 13 C-MTG substraat werd geen verband gevonden tussen de mate van vetabsorptie en de hoeveelheid 13 CO 2 in de adem. Dit betekent dat de verminderde vetabsorptie in deze patiënten waarschijnlijk niet veroorzaakt wordt door een verstoorde lipolyse. Er bleek echter wel een sterk verband te bestaan tussen de mate van vetabsorptie en de concentratie 13 C-linolzuur in plasma na inname van 13 C-linolzuur. Dus, patiënten met een relatief lage vetabsorptie hadden ook een lage hoeveelheid 13 C-linolzuur in hun plasma. Deze resultaten suggereren dat de vetmalabsorptie in cystische fibrose patiënten die behandeld worden met pancreasenzymen waarschijnlijk veroorzaakt wordt door een solubilisatiedefect. Om vetabsorptie in cystische fibrose patiënten te bevorderen is het dus zinvol om de therapie aan te passen met betrekking tot het solubilisatiedefect. Een verstoring in het solubilisatieproces kan echter verschillende oorzaken hebben, zoals verlaagde galzoutconcentratie, andere galzoutsamenstelling, inactivatie van de galzouten door een lage ph in de dunne darm. De volgende stap in dit onderzoek was dan ook om meer inzicht te verkrijgen in dit proces bij cystische fibrose. Hiertoe werden studies uitgevoerd met muizen die genetisch gemanipuleerd waren aan het gen voor cystische fibrose (hoofdstuk 7). Bij deze muizen werd onderzocht of vetmalabsorptie werd veroorzaakt door een verminderde galzoutpool, een verlaagde galzoutconcentratie, en/of een andere galzoutsamenstelling. Dit bleek niet het geval te zijn. De muizen met cystische fibrose bleken wel verhoogde concentraties galzouten in de ontlasting te vertonen, een verschijnsel dat ook bij patiënten met cystische fibrose veel voorkomt. De oorzaak hiervan moet nog verder onderzocht worden. Samenvattend kan worden gezegd dat diagnostische testen met stabiele isotopen, in tegenstelling tot de klassieke vetbalans, gedetailleerde informatie geven over de processen lipolyse en solubilisatie. Derhalve kan met behulp van deze testen gerichte farmacotherapie en dieettherapie opgesteld worden voor patiënten met vetmalabsorptie. De 13 C-MTG test kan bij sterke verstoring van de lipolyse goed gebruikt worden; bij marginale verstoring spelen ook andere experimentele condities een rol, die beter gekarakteriseerd dienen te worden. Met de lange-keten vetzuurtest kunnen verstoringen in solubilisatie opgespoord worden. Deze bevinding kan met name van belang zijn voor de verdere behandeling van patiënten met cystische fibrose. 133
NAWOORD Na ruim 4 jaar noeste arbeid sluit ik met het schrijven van deze allerlaatste pagina de periode Groningen af. Alhoewel ik steeds heb geroepen dat ik Groningen een gezellige, knusse stad vind (al is het dan een beetje ver verwijderd van de rest van Nederland) en ik een erg leuke tijd in Groningen heb gehad, ben ik toch blij dat het nu dan eindelijk achter de rug is. In de afgelopen periode heb ik veel mensen weten te waarderen voor hun steun en gezelligheid. Een aantal mensen wil ik hier daarom persoonlijk noemen. Allereerst wil ik graag Henkjan Verkade bedanken voor alle kennis die hij me heeft bijgebracht en voor zijn enthousiaste begeleiding. Mijn promotor Roel Vonk wil ik bedanken voor zijn zinnige suggesties met betrekking tot de lijn van mijn onderzoek. Frans Stellaard heeft me vooral in het eerste jaar van mijn onderzoek geholpen met alles wat er over stabiele isotopen te leren valt. Daarnaast zijn er natuurlijk ontzettend veel mensen die me wegwijs hebben gemaakt op het laboratorium, achter de computer, in de proefdierruimte, en in de Groningse kroegen en eetcafés. Heel hartelijk bedankt voor jullie professionele en emotionele bijdrage aan mijn promotieonderzoek. We moeten nog maar eens een avondje wat gaan drinken, lachen en kletsen zodat ik jullie persoonlijk kan bedanken. 135