Whole genome sequencing op direct materiaal voor virus detectie en typering Janette Rahamat-Langendoen, arts-microbioloog
Acute luchtweginfecties Belangrijke oorzaak van ziekenhuis opnames bij kinderen < 5 jr; geassocieerd met morbiditeit en mortaliteit > 65% veroorzaakt door virussen Ontwikkelingen in moleculaire diagnostiek: verbetering in detectie van virale oorzaken van luchtweginfectie, maar in aanzienlijk deel van luchtweginfecties nog steeds geen oorzaak te vinden Gebruik van WGS in virale diagnostiek: Verbreden palet aan virussen dat gedetecteerd kan worden Detectie en karakterisering in 1 stap
Gedetecteerde pathogenen in kinderen met CAP waarvoor ziekenhuisopname, VS, 2010 2012 Jain S et al. N Engl J Med 2015;372:835-845.
Gedetecteerde pathogenen in volwassen met CAP waarvoor ziekenhuisopname, VS, 2010 2012 Jain S et al. N Engl J Med 2015;373:415-427.
De studie Doel: bepalen viroom direct op klinisch materiaal met behulp van multiplex whole genome sequencing als proof of principle voor het gebruik van deep sequencing technieken in virale diagnostiek Patiënten: respiratoir materiaal (nasofarynxspoelsel, sputum) van 8 pediatrische patiënten met matige tot ernstige luchtweginfectie twee controle samples van gezonde volwassenen alle samples eerder getest met routine RT-PCR voor respiratoire pathogenen (14 virussen, 2 bacteriën) Zoll et al. J Clin Virol 2015 May;66:6-11
sample no. materiaal leeftijd (dgn) geslacht symptomen ernst routine diagnostiek PCR Ct 1 sputum 10 v apnoe O 2 negatief 2 sputum 42 m apnoe en bradycardie MV HRV 25 3 sputum 122 m resp insufficientie O 2 hmpv 23 4 sputum 4 m respiratoire problemen negatief 5 NPA 329 v milde dyspnoe negatief 6 NPA 827 v matige dyspnoe O 2 RSV sneltest 7 NPA 406 v matige dyspnoe O 2 HRV >40 8 NPA 158 v O 2 negatief 9 NPA volw m negatief 10 NPA volw m negatief
Basis: -Isolatie DNA/RNA -verrijken van virale partikels (depletie van humaan rrna) -Whole genome amplificatie en sequencing (IonTorrent) -Analyse van sequenties (humaan, viraal, bacterieel) -Assembly van virale genoom
Resultaten Sample no Aantal reads Humaan Bacterieel Viraal Onbekend 1 993998 697750 74597 11914 209571 2 825553 594679 55643 12222 162983 3 773971 502667 57778 10783 199107 4 751586 517245 63413 13790 166629 5 487771 289089 123664 4054 64348 6 508867 283180 174614 4476 38098 7 945295 278390 186841 7503 449158 8 506399 81513 368907 258 52243 9 856423 580032 81032 11684 183593 10 599969 413713 47052 110 139057
RSV-A HRV-C HRV-C HRV-A Other enteroviruses Anellovirus HRV-A38 hmpv
Sample no. materiaalsoort routine PCR Ct waarde WGS resultaten 1 sputum negatief negatief 2 sputum HRV 25 HRV-A38 3 sputum hmpv 23 hmpv 4 sputum negatief negatief 5 NPA negatief HRV-C 6 NPA RSV sneltest RSV-A 7 NPA HRV >40 HRV-C 8 NPA negatief negatief 9 NPA negatief negatief 10 NPA negatief negatief Sample no 5: Analyse van virale sequentie wees op verschillende mismatches tussen forward primer van routine PCR en target sequentie in 5 -UTR van HRV-C
Conclusie WGS op direct materiaal bevestigt de resultaten gevonden met routine PCR: vergelijkbare gevoeligheid Eén sample, in routine getest als negatief, was HRV-C positief m.b.v. WGS: Variabiliteit van HRV target regio voor detectie met PCR Voorkeur voor sequentie-onafhankelijke detectiemethodes (zoals WGS) Met WGS verbreding palet aan virussen dat gedetecteerd kan worden, plus detectie en karakterisering van virale verwekkers in 1 stap (versnelt het diagnostisch proces) HRV en RSV karakterisering Detectie van meerdere virussen in 1 sample (HRV-C en verschillende soorten enterovirus) Anelloviruses:
Conclusie Anellovirus: Veel voorkomend in populatie, meeste mensen worden geïnfecteerd in eerste maand na geboorte Drie genera: Torque-teno virus Torque-teno-like mini virus Torque-teno-like midi virus Klinische relevantie? Associatie met luchtweginfectie? Nog niet duidelijk
Norovirus RNA virus in familie van Caliciviridae, zonder envelop Genus norovirus: 5 genogroepen, 3 kunnen mens infecteren GI, GII, GIV Genogroep verdeeld in genotypes GII.4 Mens is de enige gastheer Genogroup I Genogroup IV GII.4 Meest voorkomende oorzaak van gastro-enteritis. 5-31% van patiënten opgenomen met gastro-enteritis. 5-36% van poliklinische patiënten met diarree Genogroup II Genotype II.4 epidemiologisch wat verschillend:. Oorzaak van grote uitbraken. Antigene drift: opkomende nieuwe varianten, minder immuniteit
De studie Proof of principle : met behulp van WGS in 1 stap - Betrouwbare detectie norovirus - Accurate genotypering Epidemiologische surveillance (globaal/regionaal) Outbreak management (ziekenhuis) Bronopsporing (GGD/ ziekenhuis) Bavelaar et al. J Clin Virol. 2015 Nov;72:122-5
Methode 10 feces samples, bekend norovirus + in routine PCR 8 hiervan eerder getypeerd (UMC Groningen) obv ORF 2 (capside); geselecteerd op basis van hoogste prevalentie 2 samples met onbekend genotype van norovirus uitbraak geriatrie RadboudUMC
Methode
Resultaten + coxsackie B1
Resultaten GII.4 Ook op feces leidt WGS tot: -betrouwbare detectie van verwekker -accurate genotypering
Rol WGS in routine diagnostiek? Voordelen: - detectie en karakterisering in 1 proces (surveillance, outbreak management) - tijdswinst - detectie andere virussen/onbekende virussen Uitdagingen: - kosten - getraind personeel - klinische interpretatie: pathogeen of niet
Radboudumc Afdeling Medische Microbiologie Jan Zoll Herjan Bavelaar Willem Melchers Afdeling Kindergeneeskunde Inge Ahout Jop Jans Gerben Ferwerda Marien de Jonge UMC Groningen Afdeling Medische Microbiologie Bert Niesters University of Aberdeen Adilia Warris