BEPALING VAN CARBADOX IN DIERENVOEDERS (HPLC)

Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-007 I-MET-FLVVT-007 BEPALING VAN CARBADOX IN DIERENVOEDERS (HPLC) Versie 03 Datum van toepassing 2011-09-21 Opgesteld door : Martine Bral, laborant Nazicht door : Mieke Vanbrabant, sectieverantwoordelijke; 2011-09-20 Goedkeuring vrijgave door : Mandy Lekens, laboratoriummanager ; 2011-09-20 Beheer & locatie geldende versie : FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem Bestemmelingen : Medewerkers FLVVT Trefwoorden : Coccidiostatica LAB 25 I-MET-FLVVT-007 - Bepaling van Carbadox in dierenvoeders - v.03-1/10

Overzicht wijzigingen Herziening Reden van de herziening Tekstdeel/draagwijdte door/datum * van de herziening M. Lekens 2008-01-08 Aanleiding : NC-B interne audit (2007/01B op 2007-11-06) QAM, dec 2008 Nummering FoodLIMS Blz 1 + 2 M. Vanbrabant, Invoering Verordening 152/2009 Volledige tekst september 2010 M. Vanbrabant, september 2011 NC-B interne audit (FLVVT-11-002) en actualisatie Omwille van de omvang van de wijzigingen, wordt de tekst door gebruik van markering van wijzigingen niet meer bruikbaar. Vandaar is besloten om de markering van wijzigingen weg te laten in versie 03. 12 Volledige tekst * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 25 I-MET-FLVVT-007 - Bepaling van Carbadox in dierenvoeders - v.03-2/10

INHOUDSTABEL 1 DOEL... 4 2 TOEPASSINGSGEBIED... 4 3 WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN... 4 4 DEFINITIES EN AFKORTINGEN... 4 5 PRINCIPE... 4 6 PRESTATIEKENMERKEN... 4 7 VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN... 5 8 REAGENTIA EN MATERIALEN... 6 8.1 REAGENTIA... 6 8.2 STANDAARDEN... 7 8.2.1 Carbadox standaard stockoplossing, 500 µg/ml (W0501)... 7 8.2.2 Carbadox standaard werkoplossing, 10 µg/ml... 7 9 TOESTELLEN... 7 9.1 ALGEMEEN... 7 9.2 SPECIFICATIES VOOR DEZE METHODE... 7 10 WERKWIJZE... 8 10.1 EXTRACTIE... 8 10.1.1 Diervoeder (tot 1000 mg/kgppm)... 8 10.1.2 Voormengsels (van 0,1 tot 0,2 %)... 8 10.1.3 Voormengsel / Premix (10 > 2 %)... 8 10.2 HPLC-BEPALING... 9 11 KWALITEITSCONTROLE... 9 12 BEREKENING EN RAPPORTERING... 9 13 VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURE, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN... 9 LAB 25 I-MET-FLVVT-007 - Bepaling van Carbadox in dierenvoeders - v.03-3/10

1 Doel Kwantitatieve bepaling van carbadox in dierenvoeders. 2 Toepassingsgebied De methode is geschikt voor de kwantitatieve bepaling van carbadox in diervoeders en premixen. De rapporteringsgrens bedraagt 2 mg/kg. 3 Wettelijke en normatieve documenten Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT. Afgeleide methode gebaseerd op: Bijlage VIII van Verordening 152/2009/EG tot vaststelling van bemonsterings- en analysemethodes voor de officiële controle van diervoeders. Afwijkingen ten opzichte van de referentiemethode: Geen equilibratie met water Geen extractie met methanol/acetonitril mengsel 4 Definities en afkortingen HPLC High performance liquid chromatography 5 Principe Carbadox wordt uit het monster geëxtraheerd met een water/dimethylformamide mengsel. Het extract van diervoeders wordt opgezuiverd over een kolom gevuld met aluminiumoxide. In het geval van voormengsels wordt het extract tot een geschikte concentratie verdund met het extractiemengsel en water. Het gehalte aan carbadox wordt geanalyseerd met behulp van reversed-phase HPLC met UV-detectie bij 365 nm. Een beknopt overzicht van de methode is terug te vinden in bijlage. 6 Prestatiekenmerken De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25-L MEETONZEKERHEDEN FLVVT. 22 OVERZICHT LAB 25 I-MET-FLVVT-007 - Bepaling van Carbadox in dierenvoeders - v.03-4/10

De waarden voor de reproduceerbaarheid (RSD R %) zijn terug te vinden in M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx. 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel giftige en kankerverwekkende stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de voorziene maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. LAB 25 I-MET-FLVVT-007 - Bepaling van Carbadox in dierenvoeders - v.03-5/10

8 Reagentia en materialen 8.1 Reagentia Alle reagentia dienen van pro analyse -kwaliteit te zijn of van hogere kwaliteit indien vermeld. Reagentia Labonr. 8.1.1 Acetonitril, HPLC-kwaliteit (CH 3 CN) R0026 8.1.2 Methanol, HPLC-kwaliteit (CH 3 OH) R0183 8.1.3 Water, HPLC-kwaliteit R1003 8.1.4 Kaliumdiwaterstoffosfaat R0719 8.1.5 Di-kaliumwaterstoffosfaat R0120 8.1.6 Di-isopropylamine R0113 8.1.7 Triethylamine R0659 8.1.8 Aluminiumoxide 90 gestandaardiseerd, gedroogd bij 105 C R0027 8.1.9 Dimethylformamide (DMF) R0702 8.1.10 Fosforzuur 50% W0705 Stockoplossing fosfaatbuffer (ph 7): Weeg 6,8 g kaliumdiwaterstoffosfaat (R0719) en 8,7 g dikaliumwaterstoffosfaat (R0120) af in een 1 l kolf. Voeg 25 g diisopropylamine (R0113), opgelost in 50 ml methanol (R0183) toe. 8.1.11 W0569 Voeg vervolgens 25 g triethylamine (R0659), opgelost in 50 ml acetonitril (R0026) toe. Leng aan tot de maatstreep met water. Fosfaatbuffer (ph 7): 8.1.12 Neem 40 ml stockoplossing (W0569). Leng aan tot 1 liter met water. W0568 Breng de ph op 7 met fosforzuur 50% (W0705). Mobiele fase: Maak een oplossing van buffer (ph 7) (W0568)/acetonitril (R0026) 8.1.13 (860/140, v/v). Naargelang de gebruikte kolom kan deze verhouding W0597 aangepast worden. De beide solventen kunnen in dezelfde verhouding afzonderlijk door de pomp aangezogen worden. 8.1.14 Extractievloeistof: DMF/H 2 O (95/5) W0677 LAB 25 I-MET-FLVVT-007 - Bepaling van Carbadox in dierenvoeders - v.03-6/10

8.2 Standaarden Carbadox standaardstof van gegarandeerde zuiverheid (S0252) 8.2.1 Carbadox standaard stockoplossing, 500 µg/ml (W0501) Weeg, rekening houdend met de zuiverheid, 25 mg op 0,1 mg nauwkeurig af in een maatkolf van 50 ml. Los op in dimethylformamide-water (W0677) en leng aan tot de maatstreep met hetzelfde oplosmiddel. Deze oplossing is 1 maand houdbaar, bewaard in het donker in de koelkast bij een temperatuur lager dan 8 C. 8.2.2 Carbadox standaard werkoplossing, 10 µg/ml Pipetteer 1,0 ml van de standaard stockoplossing (W0501) in een maatkolf van 50 ml. Leng aan tot de maatstreep met extractievloeistof (W0677) en meng. Voeg aan 1 ml van deze werkoplossing 2 ml water (R1003) toe. Deze oplossing is klaar voor HPLC-injectie en wordt bereid op de dag van de analyse. Voor monsters op carry-over-niveau wordt als defaultwaarde 1 µg/ml genomen. 9 Toestellen 9.1 Algemeen Een overzicht van gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT. 9.2 Specificaties voor deze methode Glazen kolom: lengte ca. 40 cm; I.D. 10 mm met ingesmolten frit en kraan aan één einde of vernauwing met een prop glaswol. De volgende condities worden als leidraad gegeven; andere parameters mogen worden gebruikt op voorwaarde dat vergelijkbare resultaten worden verkregen. HPLC-kolom: o Analytische kolom: Chromspher C8, 5 µm, 100 mm x 3 mm of gelijkwaardig eventueel met overeenkomstige voorkolom. Detector : UV op 365 nm Loopsnelheid : 0,5 ml/min Injectievolume : 20 µl LAB 25 I-MET-FLVVT-007 - Bepaling van Carbadox in dierenvoeders - v.03-7/10

10 Werkwijze Carbadox is lichtgevoelig. Alle bewerkingen moeten bij gedempt licht of in bruin glaswerk plaatsvinden. 10.1 Extractie 10.1.1 Diervoeder (tot 1000 mg/kg) Weeg 10 g tot 50 g (± 0,1 g) van het monster af in een fles van 250 ml. Voeg 100 ml extractievloeistof (W0677) toe en schud gedurende 2 uur. Centrifugeer. Maak een opzuiveringskolom door 4 g aluminiumoxide (R0027) droog te pakken in een glazen kolom. Breng nu 10 à 25 ml extract op de kolom. Verwijder de eerste 2 ml van het eluaat. Vang ongeveer 4 ml op. Verdun indien nodig met extractievloeistof (W0677) overeenkomstig de gebruikte standaard werkoplossing (10 µg/ml). Neem 1 ml van deze oplossing en voeg 2 ml water (R1003) toe. Filtreer deze oplossing door een 0,45 µm membraanfilter. Deze oplossing is klaar voor injectie in het HPLC-toestel. 10.1.2 Voormengsel (van 0,1 tot 2 %) Weeg 0,5 g tot 1,0 g (± 0,01 g) van het monster af in een fles van 200 ml. Voeg 100 ml extractievloeistof (W0677) toe. Schud gedurende 2 uur. Centrifugeer indien nodig. Verdun met de extractievloeistof (W0677) overeenkomstig de gebruikte standaard werkoplossing (10 µg/ml). Neem 1 ml van deze vloeistof en voeg 2 ml water (R1003) toe. Filtreer deze oplossing door een 0,45 µm filter. Deze oplossing is klaar voor injectie in het HPLC-toestel. 10.1.3 Voormengsel / Premix ( > 2 %) Weeg 250 mg (± 0,001 g) van het monster af in maatkolf van 50 ml. Voeg extractievloeistof (W0677) toe tot de maatstreep. Zet gedurende 10 minuten in het ultrasoonbad. Pipetteer 1 ml van deze oplossing, in een 50 ml maatkolf en vul aan tot de maatstreep met extractievloeistof (W0677). Neem 1 ml van deze vloeistof en voeg 2 ml water toe. Deze oplossing is klaar voor injectie in het HPLC-toestel. LAB 25 I-MET-FLVVT-007 - Bepaling van Carbadox in dierenvoeders - v.03-8/10

10.2 HPLC-bepaling Algemene richtlijnen m.b.t. het gebruik van het HPLC-systeem (opstart, injectieschema, ) worden weergegeven in LAB 25-P 02 RESULTAATVALIDATIE HPLC-METHODEN COCCIDIOSTATICA & GROEIBEVORDERENDE STOFFEN. 11 Kwaliteitscontrole Zie LAB 25-P 02 RESULTAATVALIDATIE HPLC-METHODEN COCCIDIOSTATICA & GROEIBEVORDERENDE STOFFEN. 12 Berekening en rapportering De berekening van de hoeveelheid carbadox wordt uitgevoerd door de software aan de hand van een standaardcurve (zie ook LAB 25-P 02). Het gehalte aan carbadox in mg/kg in het monster kan ook bepaald worden met behulp van formule: waarbij : A = piekoppervlakte of -hoogte van de monsteroplossing B = piekoppervlakte of -hoogte van de standaardoplossing V = volume van het monsterextract in ml (rekening houdend met eventueel uitgevoerde verdunningen) m = massa van het monster in g C = concentratie van de standaardoplossing in µg/ml De rapportering en de resultaatvalidatie zijn beschreven in LAB 25-P 02. Enkel resultaten 2 mg/kg worden gerapporteerd. 13 Verwijzing naar bijhorende procedure, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 25-P 02 RESULTAATVALIDATIE HPLC-METHODEN COCCIDIOSTATICA EN LAB 25-L 18 LAB 25-L 21 LAB 25-L 22 LAB 25-F 62 GROEIBEVORDERENDE STOFFEN OVERZICHT WETGEVING FLVVT APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART LAB 25 I-MET-FLVVT-007 - Bepaling van Carbadox in dierenvoeders - v.03-9/10

BIJLAGE B001: OVERZICHT CARBADOX CAR I-MET-FLVVT-007 Rapporteringsgrens 2 mg/kg Extractie 1. 20 g / 100 ml extr.vl. = DMF [R0702] + 5% H 2 O [W0677] 2. 2 u schudden centrifugeren 3. ± 25 ml extr. op 5 mg Al 2 O 3 Brockman [R0027] 4. ± 2 ml weg rest opvangen 5. 0,5 ml + 1 ml H 2 O mengen 6. 20 µl injecteren [ 50 mg/kg = 10 µg/ml] Bl +: 50 mg/kg 20 g + 2,0 ml STD geconc.(500 µg/ml) /100 ml STD CAR [S0252] 1 maand 1. 25 mg / 50 ml extr. vl. [ = 500 µg/ml] [W0501] 2. 1 ml / 50 ml extr. vl. [ = 10 µg/ml = 50 mg/kg] 3. 0,5 ml + 1 ml H 2 O HPLC Kolom Chromspher 5 C8, 5 µm, 100 mm x 3 mm (Chrompack) Flow 0,5 ml/min λ 365 nm Eluens ACN / Buffer ph 7 [W0568] (14/86) Inj. Vol. 20 µl Opmerkingen Buffer + RT + Buffer stockoplossing [W0569] = 6,8 g KH 2 PO 4 [R0719] (= 0,05M = 50mM) 8,7 g K 2 HPO 4 [R0120] 25 g diisopropylamine in 50 ml CH 3 OH 25 g triethylamine in 50 ml ACN Oplossen in H 2 O en aanlengen tot 1 l ph 7 = 40 ml stockopl. / 1 l H 2 O [W0568] op ph 7 met H 3 PO 4 50% [W0705] LAB 25 I-MET-FLVVT-007 B001 Overzicht Carbadox v.03 2011-09-21 10/10