Ministerie van Verkeer en Waterstaat Directoraat -Generaal Rijkswaterstaat Rijksinstituut voor Kust en Zee/RIKZ Standaardvoorschrift Het kweken van de Zeeklit Echinocardium cordatum voor gebruik in sedimentbioassays Trefwoorden: Zeeklit Echinocardium cordatum, kweek. Inhoud 1. Onderwerp...2 2. Toepassingsgebied...2 3. Termen en definities...2 4. Principe van de methode...2 5. Reagentia en hulpstoffen...3 6. Apparatuur en hulpmiddelen...3 7. Monstername...3 8. Werkwijze...4 8.1 Kweekmethodiek...4 8.2 Controle- en referentie monsters...8 8.3 Randvoorwaarden...9 8.4 Instelling apparatuur...10 9. Identificering en kwantificering...10 9.1 Gemiddelde sterfte bij referentiesediment...10 9.2 LC50 waarde van de referentietoxicant...10 10. Kengetallen...10 11. Rapportage...10 12. Kwaliteitszorg...11 14. Literatuur...11 Pagina 1 van 11 pagina's
1. Onderwerp Dit voorschrift beschrijft een methode voor het kweken van de Zeeklit Echinocardium cordatum om de juveniel verkregen Zeeklitten te kunnen gebruiken in sediment bioassays. 2. Toepassingsgebied Met behulp van dit standaard voorschrift kunnen juveniele zeeklitten verkregen worden om de acute toxiciteit van brakke tot mariene sedimenten te bepalen (zie RIKZ/Specie-03). 3. Termen en definities Acclimatiseren : Het aanpassen van een testorganisme aan de omstandigheden die voor een goede voortplanting nodig zijn. Maturatie : Afrijpen van de gonaden (voortplantingsweefsel) Spawning : Het loslaten van gameten in de waterkolom Competente pluteuslarve : Larve van zee-egel die gereed is voor metamorfose tot juveniel Metamorfose : De omschakeling van larvaal stadium (planktonfase) tot juveniele Zeeklit (bodemleven) 4. Principe van de methode Adulte Zeeklitten worden kunstmatig aangezet tot voortplanten waarna de verkregen larven in kweek worden genomen. Na een larvaal stadium van 3 weken treedt broedval op en metamorfoseren de larven naar juveniele Zeeklit. Deze zijn na circa 16 weken uitgegroeid tot testbaar formaat. Pagina 2 van 11 pagina's
5. Reagentia en hulpstoffen 5.1 Gefiltreerd zeewater 5.2 Demiwater 5.3 Lucht 5.4 Algenkweek van Dunaliella tetriolecta 6. Apparatuur en hulpmiddelen 6.1 Klimaatkamer van 15 tot 18 ± 2 C met temperatuurregistratie. 6.2 1 ml injectiespuiten en kleine naalden 6.3 Bekerglazen van 25 tot 100 ml 6.4 Bekerglazen (1-5 liter), borosilicaatglas 6.5 Scintillatieflesjes van 20 ml 6.6 Beluchtingspomp 6.7 Luchtfilter 6.8 Bovenweger 6.9 Zuurstofmeter 6.10 Saliniteitsmeter en temperatuurmeter 6.11 ph-meter 6.12 Pasteurpipetten 6.13 Binoculair 7. Monstername Adulte Zeeklitten kunnen in de kustwateren gevangen worden met b.v. een grote Van Veenhapper. Zij komen meestal groepsgewijs voor in hogere dichtheden. Het zoeken naar een dergelijke Zeeklitbank kan enige tijd kosten. Zeeklitten worden met de bodemhapper bemonsterd en op een zeeftafel uitgezeefd. Hierna worden zij aan boord opgeslagen in bakken met gezeefd zand en een doorstroom van zeewater. Aan land gekomen kunnen zij worden geacclimatiseerd aan de kweekomstandigheden. Pagina 3 van 11 pagina's
8. Werkwijze 8.1 Kweekmethodiek Algemeen De zeeklitten zijn in Nederlandse kustwateren geslachtsrijp in de periode mei en juni. Het opkweken van de Zeeklitten kan zo gereguleerd worden dat gedurende één jaar over juveniele organismen van de vereiste grootte beschikt kan worden om een sedimenttoxiciteit uit te voeren. Per kweek kunnen gemiddeld ca. tienduizenden Zeeklitten gekweekt worden. Voorbereiding Volwassen Zeeklitten worden in de periode februari-april verzameld. De Zeeklitten huisvesten in platte bakken gevuld met zand dat rijk is aan organische stof. Kweekbakken laten doorstromen met belucht zeewater. Zeeklitten langzaam acclimatiseren aan de kweekomstandigheden, temperatuur van het zeewater langzaam naar 15 graden brengen, met een maximale stijging van 2 graden per week. De Zeeklitten aanvullend voeren met kweken van diatomeeën of algen (Phaeodatylum tricornutum, Skeletonema costatum, Thalasiosira pseudonana, Tetraselmis tricornutum ). De algen zullen bezinken op het zandoppervlak en fungeren als voedsel voor de zeeklitten. Het bijvoeren van fijngemalen TetraMin wordt aanbevolen, maar is bij maandelijkse verversing van zand niet noodzakelijk. Fertilisatie en ontwikkeling van larven Spawning Als de zeeklitten een week op 15 graden verblijven zijn zij naar verwachting geslachtsrijp. Maturatie kan middels een microscopisch preparaat van de gonaden of door vaststellen van de gonaden index bepaald worden. Twee methoden worden toegepast om tot spawnen aan te zetten: 1 thermische wisselbaden (10-18 C) van een half uur of 2 injectie met een halve ml 0,5 M KCl. De gameten laten aan de bovenzijde van de Zeeklit los uit kleine openingen tussen de opgerichte stekels. De mannelijke gameten zijn bij spawning wit van kleur en veroorzaken een troebeling in het zeewater, echter de vrouwelijke gameten zijn licht oranje en te zien als kleine korreltjes in het zeewater. Tijdens de spawning zijn de Zeeklitten individueel in bakjes geplaatst. De eicellen worden in het zeewater los gelaten. De spermacellen dienen droog te worden verzameld door de dieren boven water te houden en de gameten met een pasteurpipet over te zetten in een Pagina 4 van 11 pagina's
scintillatieflesje. Dit flesje wordt koel (4 C) opgeslagen tot gebruik. De eicellen worden over 90 µm gezeefd om bezinksel of vervuiling te verwijderen. De eicelsuspensie na bezinken vervolgens voorzichtig 3 maal decanteren zodat de zwevende (onrijpe) eicellen kunnen worden verwijderd. Na decanteren de dichtheid van de eicellen vaststellen door monstername met wijde pipetpunt van 0,1-0,5 ml en onder de microscoop te tellen (afhankelijk van de dichtheid). Fertilisatie De dichtheid aan eicellen dient op concentratie worden gebracht van ca. 30.000 tot 50.000 per liter. Vlak voor bevruchting de mannelijke gameten activeren door 50 µl droge gameten op te nemen in 50 ml zeewater. Onder de microscoop % actieve spermacellen vaststellen. Van 2 à 3 mannelijke zeeklitten 1 à 2 ml van de spermasuspensie aan 1 liter eiceloplossing onder voortdurend met een plunjer homogeniseren toevoegen. Bevruchting van de eicellen is duidelijk zichtbaar aan het ontstaan van een bevruchtingsmembraan. Richtlijn bevruchtingssucces dient ca. 95% te zijn. Als de eerste delingen zichtbaar zijn geworden (meestal binnen een uur) kunnen de bevruchte eicellen (=embryo) in kweekbekers van 3-5 liter overbrengen op een celdichtheid van 1 embryo per ml. De eerste vrijzwemmende blastula stadia zijn na ca. 6 uur bereikt bij 15-18 C, na 24 uur zijn de larven in een driehoekige armloze stadium aangekomen. Op dit moment kan een eerste voergift met de alg Dunaliella gedaan worden van 500 cellen/ml kweekwater. Ontwikkeling van larven Na 2 dagen is het 2 paar armige echinopluteus larvae stadium bereikt en kunnen de larven worden gevoerd met 1.500 cellen/ml Dunaliella. Bij het bereiken van het 3 paar armige stadium wordt de voergift verhoogd naar 2.500 cellen/ml en vanaf het bereiken van het 4 paar armige stadium moet zo n 4.000 cellen/ml worden gegeven. De echinopluteus kweken moeten 2 á 3 maal per week worden ververst en gevoerd. Deze verversing procedure gaat als volgt: zeewater gefiltreerd afhevelen door een trechtertje te omspannen met 100 µm gaas en aan de tuit een slangetje te bevestigen. Het trechtertje wordt omgekeerd met het gaas naar beneden in het kweekglas gehangen waarna het zeewater wordt afgeheveld. Hierdoor blijven de pluteuslarven in het kweekglas. Deze worden met het resterende zeewater voorzichtig overgegoten in een kweekglas met vers zeewater en algen. Voorkom dat bezonken materiaal overgegoten wordt. Hierbij kan enig verlies van larven optreden.. Pagina 5 van 11 pagina's
Echinopluteus competent Drie weken (13-20 dagen) na bevruchting kunnen de eerste competente larven worden verwacht. Deze zijn te herkennen als licht roze bolletjes op de glasbodem. Deze larven hebben een juveniel rudiment gevormd waaruit de Zeeklit zich ontwikkelt. Een enkele dag voor metamorfose bevinden de competente larven zich op de bodem (deze moeten echter niet verward worden met larven in een verminderde conditie die bij het verversen worden afgevoerd!). De competente larven kunnen op zicht met een smal slangetje worden afgeheveld in een bekerglas. Deze larven worden vervolgens in een plat aquarium overgezet waarin een laagje (over 500 µm gezeefd) fijn zand is aangebracht. Dit zand bevat bij voorkeur veel van nature voorkomende diatomeëen, dat als biofilm en voedsel dient. Een laag van 1 cm is voldoende voor metamorfose en de periode van enkele weken daarna. De dichtheid aan competente larven mag oplopen tot zo n 25.000 per vierkante meter zand. De competente larven bezinken op de bodem en 21-35 dagen na bevruchting treedt de metamorfose op, waarbij de juveniele Zeeklit uit het rudiment breekt. Het uiterst kleine Zeeklitje, compleet met buisvoetjes en stekels, verblijft vervolgens nog een enkele dag op het zand en graaft zicht geleidelijk in. Net als bij de larvenkweek wordt het bovenstaande zeewater 2 à 3 maal per week ververst, na verversen wordt tevens gevoerd met gekweekte algen De soort alg lijkt in dit stadium niet kritisch, wel wordt altijd doorgevoerd met Dunaliella met een hoeveelheid die 2 à 3 keer zo hoog is als bij de larvenkweek. Daarnaast kunnen ook gekweekte diatomeeën bijgevoerd worden ( zoals Chaetoceros calcitrans / Skeletonema costatum / Thalasiosira pseudonana). De temperatuur voor een goede groei ligt tussen de 15 en 20 C, hogere en lagere temperaturen zijn ook mogelijk maar verlagen in het algemeen de groeisnelheid. Na 1 maand zijn de juveniele Zeeklitten uitgegroeid tot een grootte van een ca. 2-5 mm en kunnen worden overgezet op vers zand met van nature liefst veel organische stof. Het overzetten moet voortaan maandelijks gebeuren om een goede groei te waarborgen. De dichtheid aan Zeeklit moet verlaagd worden en kan afgestemd worden op de gewenste groeisnelheid. Voor een langzame groei kan een dichtheid gebruikt worden van 1800 dieren/m 2, voor een min of meer veld gerelateerde groei is een dichtheid van 1000-1250 dieren/m 2 gewenst en bij een snelle groei kan gewerkt worden met zo n 300 dieren/m 2. In onderstaande figuur staat de groei van de juveniele Zeeklit bij deze drie dichtheden weergegeven, zoals die is gevonden bij het ontwikkelen van de kweekmethodiek. Zo kan een verwachting opgesteld worden van de gewenste grootte in de tijd. Pagina 6 van 11 pagina's
Gemiddeld gewicht gekweekte Zeeklit 2005 geiwcht in gram 10 8 6 4 2 conform 2004 verhoogd voedselaanbod hoog voedselaanbod 0 0 5 10 15 20 week na spawning Gekweekte Zeeklitten zijn vanaf 5 gram uitstekend te gebruiken in sediment bioassays. Ter controle kan voor aanvang van experimenten de kwaliteit van de gekweekte Zeeklitten getoetst worden aan een negatieve en positieve controle, zoals overleving op referentiesediment en gevoeligheid voor ammoniumchloride. Pagina 7 van 11 pagina's
8.2 Controle- en referentie monsters Voor het toetsen van de kwaliteit van de gekweekte proefdieren worden testen met controlesediment en referentietoxicant ammoniumchloride uitgevoerd. Als controle voor de conditie van de proefdieren wordt een referentiesediment gebruikt, als kwaliteitsborging voor de gevoeligheid van de dieren wordt de referentietoxicant ammoniumchloride toegepast. Controlesediment Als controlesediment wordt schoon gezeefd sediment gebruikt (500 µm) waarop Zeeklitten na 14 dagen blootstelling minder dan 10 % sterfte geven (bijvoorbeeld een slibrijk zand uit het getijdengebied). Referentietoxicant Doormiddel van een referentietoxicant wordt de gevoeligheid van de testorganismen gecontroleerd. Dit gebeurt voor elke batch gekweekte dieren en minimaal eens per half jaar. Deze controle omvat een blootstelling gedurende een 4-daagse waterfase test met ammoniumchloride Kwaliteitscontrole met Ammoniumchloride oplossing Los 28,9 gram NH4Cl (5.7) op in 1 liter demiwater in een maatkolf (ph=8,0±0,5) (6.26). De verkregen oplossing heeft een concentratie van 10 g/l NH4+. Opmerking Waarin m n = g M = 10, 0 18 52 = 0 54, g mol, mol g mnh Cl = n M = 0, 54mol 53, 49 mol = 28, 88 gram n = aantal mol (mol) 4 m = van NH 4 + in 1 liter demiwater (g) M = molecuulmassa van NH 4 + (g/mol) M (NH 4 Cl) = 53,49 g/mol M (NH 4 + ) = 18,52 g/mol Vul 12 bekerglazen (6.5) met 500 ± 10 ml gefiltreerd zeewater (5.3). Bereidt hierin een concentratiereeks NH4+-oplossing (in duplo). Voeg NH4+-oplossing (10 g/l) toe aan de bekerglazen, volgens tabel 2. Pagina 8 van 11 pagina's
Tabel 2. Hoeveelheid toe te voegen NH 4 + -stockoplossing van 10,0 g/l in 3 liter gefiltreerd zeewater (ph=8,0±0,5) Concentratie NH 4 + (mg/l) hoeveelheid stock oplossing (ml) 0 0 5 1,5 10 3,0 20 6,0 36 10,8 60 18,0 Bepaal op dag 0 in de zeewater blanco en in de hoogste concentratie (60 mg/l) de ph (6.14), temperatuur (6.13), zuurstofgehalte (6.12) en zoutgehalte (6.13). Meet het ammoniumgehalte in de concentratie 60 mg/l. Voeg aan elk bekerglas 5 Zeeklitten toe. Regel de beluchting met pasteurpipetten zodat de pipetpunt in het water blaast. Bepaal op dag 4 de ph (6.14), temperatuur (6.13), zuurstofgehalte (6.12), zoutgehalte (6.13) in de zeewater blanco en in de hoogste concentratie (360 mg/l). Tel na 4 dagen de overlevende Zeeklitten, door ze op schoon zand te laten ingraven. Dieren zonder ingraafactiviteit worden als dood beschouwd. Bereken op basis van de overleving de 96h-LC50 waarde volgens hoofdstuk 9.2. De 96h-LC50 voor ammonium is indicatief gesteld in de (voorlopige) range: 96h- LC50; 22-53 mg NH4+/l. 8.3 Randvoorwaarden De parameters die gemeten worden in het bovenstaande water van de sedimenttest en in het testwater van de referentietoxicanten moeten gedurende de blootstellingperiode binnen de volgende grenzen blijven: temperatuur 15 ± 2 C saliniteit 28-36 zuurstof > 50% licht (breedspectrum) 16 uur (lichtkwaliteit 500-1000 lux) ph 7-9 Pagina 9 van 11 pagina's
8.4 Instelling apparatuur N.v.t. 9. Identificering en kwantificering 9.1 Gemiddelde sterfte bij referentiesediment De gemiddelde sterfte in de test met referentiesediment wordt berekend door het aantal gestorven testorganismen te delen door het totaal aantal ingezette testorganismen. Hierbij worden de gegevens van alle replica s opgeteld. sterfte In formule: û=s/(mxn)=s/n waarin: û : geschatte sterftekans, gemiddelde S M N n : totaal aantal gestorven testorganismen : aantal replica s : aantal dieren per replica : totaal aantal ingezette testorganismen De procentuele sterfte wordt berekend door û met 100 te vermenigvuldigen. 9.2 LC50 waarde van de referentietoxicant Voor de berekening van de LC50 wordt de trimmed Spearman-Karber methode gebruikt. Voor deze methode zijn verschillende softwarepakketten voorhanden. Het aanbevolen softwarepakket is TOXCALC. 10. Kengetallen N.v.t. 11. Rapportage De volgende informatie dient op verzoek beschikbaar te zijn: Gemeten randvoorwaarden parameters (bijlage 3). De berekende LC50 waarde voor de referentietoxicant en de sterfte in het controlesediment (volgens bijlage 2). Shewhartcontrolekaart van referentietoxicant. Pagina 10 van 11 pagina's
12. Kwaliteitszorg Om de kwaliteit van de slijkgarnalentest te kunnen waarborgen dient deze te voldoen aan de volgende kwaliteitscriteria: Controlesediment Grootte organisme Referentietoxicant Controle Zeewater Randvoorwaarden Batch niet gebruiken of verder acclimatiseren < 10 % sterfte minimaal 5 gram Indicatief: 96h-LC50(NH4+) = 22-53 mg/l < 10 % sterfte bij waterfase test Noteren van ph, temperatuur, saliniteit, zuurstofverzadiging,ammonium concentraties Voorbeeld bijlage 3 Bij overschrijding van de 3s-grens op de Shewhartcontrolekaart met het referentietoxicant; 10% sterfte in controle zeewater; 10% sterfte controlesediment. 14. Literatuur 1. Aquasense (2005). Het kweken van de Zeeklit Echinocardium cordatum en toepassing in mariene sediment bioassays. Eindrapport periode 2003-2005. In opdracht van: Rijksinstituut voor Kust en Zee. Rapport 1975. 2. Schipper et. Al. (in prep.). Development of a bioassay with cultivated heart urchin Echinocardium cordatum for exposure in whole sediment toxicity test. Marine Environmental Research. Pagina 11 van 11 pagina's