Sediment toxiciteitstest met Brachionus plicatilis

Transcriptie

1 Ministerie van Verkeer en Waterstaat Directoraat -Generaal Rijkswaterstaat Rijksinstituut voor Kust en Zee/RIKZ Standaardvoorschrift Sediment toxiciteitstest met Brachionus plicatilis (ROTOXkit-M) Trefwoorden : sediment, toxiciteit, Brachionus plicatilis, raderdiertje, poriewater 1. Onderwerp Dit protocol beschrijft de procedure voor het uitvoeren van een poriewater toxiciteitstest met het raderdiertje Brachionus plicatilis. Raderdiertjes worden gebruikt voor toxicologische studies vanwege hun snelle reproductie, korte generatietijd en de commerciële beschikbaarheid van de zo genaamde rusteitjes. 2. Toepassingsgebied Met behulp van de Brachionus plicatilis kan de acute toxiciteit van poriewater worden bepaald. Dit voorschrift is toepasbaar op brak- en zoutporiewater met een saliniteit van 1 tot 36 pagina nr. 1 van 17 pagina's

2 3. Termen en definities Acclimatiseren Contaminatie Controlesediment Cysten Hatchen Juveniel LC 50 Mortaliteit Neonaten NOEC Overleving Poriewater Randvoorwaarden Referentietoxicant Rotifeer : Het aanpassen van het testorganisme aan de omstandigheden die gelden in het laboratorium. : Vervuiling van sediment met zware metalen en/of organische microverontreinigingen : Ook wel negatief controlesediment genoemd. Sediment dat dient als controle op de respons van de testorganismen en testopstelling. : Rust eitjes van Brachionus plicatilis : Het ontwikkelen van de cysten. : Levensstadium van het organisme voordat de geslachtsrijpheid is bereikt. : Lethal Effect Concentration. De concentratie van een toxicant waarbij 50% van de testorganismen dood gaat. : Sterfte van het testorganisme ten gevolge van blootstelling aan gecontamineerd sediment. : Net uitgekomen exemplaren van Brachionus plicatilis : No Observed Effect Concentration : De hoogste concentratie van een toxicant waarbij geen waarneembaar ongunstig effect optreedt. : Overleving van testorganismen na blootstelling aan gecontamineerd sediment. : Water aanwezig tussen sedimentdeeltjes welke wordt verkregen door centrifugeren van sediment : Binnen de experimentele situatie geldende strikt afgebakende grenzen voor saliniteit, temperatuur, ph en zuurstofgehalte, waarbinnen het experiment als betrouwbaar wordt beschouwd. : Toxische stof waarmee de gevoeligheid van het testorganismen regelmatig wordt vastgesteld. Hiervoor wordt de LC50 vastgesteld met een waterfasetest met kaliumbichromaat. : Raderdiertje pagina nr. 2 van 17 pagina's

3 4. Principe van de methode Met een 24 uur durende bioassay wordt de LC 50 waarde van sediment bepaald. In de bioassay worden neonaten van het estuariene raderdiertje Brachionus plicatilis aan het sediment poriewater blootgesteld. 5. Reagentia en hulpstoffen 5.1 Fosforzuur 10% 5.2 Gedemineraliseerd water 5.3 Standaard (artificieel) zeewater ROTOXkit M 5.4 Referentietoxicant (kaliumbichromaat K 2 Cr 2 O 7 ) ROTOXkit M 5.5 Concentratie zoutoplossingen ROTOXkit M 6. Apparatuur en hulpmiddelen 6.1 Vaatjes met cysten van het raderdiertje Brachionus plicatilis ROTOXkit M 6.2 Multiwell testplaten (13,5 x 9,5 cm) ROTOXkit M 6.3 Micropipetten (polyethyleen) ROTOXkit M 6.4 Incubator van 25 C met lamp van lux 6.5 Incubator van 25 C (donker) 6.6 Parafilm 6.7 Handschoenen 6.8 Bovenweger 6.9 Maatkolf 100 ml 6.10 Centrifuge met tijdschakelaar 6.11 Kunststof centrifugebuisjes 6.12 Pipetten 1, 5 en 10 ml 6.13 Bruine glazen flessen (0,5 l) 6.14 Testbuisjes 30 ml 6.15 Binoculaire microscoop met donkerveldinstelling (30x) 6.16 Tissue 6.17 Zeef 500 µm 6.18 Polyethyleen vaten (± 25l) 7. Monstername 7.1 Bemonstering van sediment Zie Standaardvoorschrift SPECIE-08 Bemonstering Zoute Baggerspecie. pagina nr. 3 van 17 pagina's

4 8. Werkwijze 8.1 Bereiding Standaard zeewater Vul een maatkolf met 800 ml demiwater (5.2) en los de buisjes op met geconcentreerde zoutoplossingen (5.5) 1 tot en met 6. De maatkolf goed schudden Vul de maatkolf aan tot 1000ml met demiwater (5.2) Voorbehandeling van het sediment Poriewater vers bereiden! Het poriewater is slechts 4 uur in goed afgesloten bruinefles houdbaar Centrifugeer kunststof buisjes (6.11) met elk 50 gram sediment 20 minuten bij 2500 g. Opmerkingen: gram sediment geeft ongeveer 10 ml poriewater. 2. De rotor van de centrifuge (6.10) dient nauwkeurig te worden gecalibreerd door de kunststof buisjes af te wegen met behulp van een bovenweger (6.19). 3. Centrifuge zowel poriewater van het te testen sediment als van het controlesediment Pipetteer het poriewater na het centrifugeren af en breng dit over in een gelabelde bruine glazen fles (6.13) Nummer 5 testbuisjes (6.14): Pipetteer met een 10 ml pipet (6.12) 5 ml Standaard zeewater (5.3) in de buisjes nummer 2, 3, 4 en 5 ( ) Pipetteer 10 ml poriewater van het te testen sediment uit de fles in testbuis 1. Spoel de pipet met Standaard zeewater (5.3) Dek testbuis 1 af met een dop en homogeniseer de inhoud door te zwenken Pipetteer 5 ml uit testbuis 1 in testbuis 2. Spoel de pipet met Standaard zeewater (5.3) Herhaal : 5 ml van testbuis 2 naar testbuis 3 5 ml van testbuis 3 naar testbuis 4 5 ml van testbuis 4 naar testbuis 5 Opmerking: dit kan met dezelfde pipet gebeuren! De volgende verdunningsreeks ontstaat (tabel 1): pagina nr. 4 van 17 pagina's

5 Tabel 1: Verdunningsreeks van het poriewater testbuis poriewaterconcentratie (%) ,5 5 6, Dek de testbuisjes af met parafilm (6.6). N.B. Sla het poriewater op voor maximaal 4 uur in een gelabelde bruine glazen (6.13) bij + 4 C. fles Voorbehandeling van Brachionus plicatilis Meng (30 uur voor het inzetten van de test) 5,7 ml Standaard zeewater (5.3) met 4,3 ml gedemineraliseerd water (5.2), zodat 10 ml geprepareerd zeewater ontstaat met een saliniteit van Breng de inhoud van een vaatje cysten (6.1) over in het incubatiegootje van de multiwell testplaat (6.2) Spoel het vaatje na met 0,5 ml geprepareerd zeewater, waarna de inhoud in het incubatiegootje gepipetteerd wordt Voeg 2 ml geprepareerd zeewater toe aan het incubatiegootje Dek de multiwell testplaat af met het dekseltje Plaats de multiwell testplaat 2 uur onder een lichtbron van 3000 tot 4000 lux (6.4) Incubeer daarna de testplaat nog 28 uur bij 25 ± 1 C onder een lichtbron van 3000 tot 4000 lux (6.4). pagina nr. 5 van 17 pagina's

6 8.3 Analyse van het monster Voorbereiding van de test Pipetteer 0,7 ml onverdund poriewater ( ) van het schone sediment in het verzamelgootje van rij X van de multiwell testplaat Pipetteer 0,3 ml poriewater van het schone sediment in de 6 wells van rij X Homogeniseer de inhoud met testbuisjes 1 tot 5 ( ) zorgvuldig door krachtig te zwenken. fig. 1: Multiwell testplaat Pipetteer 0,7 ml poriewateroplossing uit buis 5 in het verzamelgootje van rij Pipetteer 0,3 ml poriewateroplossing uit buis 5 in de 6 wells van rij Herhaal deze procedure met de testbuisjes 4,3,2 en 1, waaruit de verzamelgootjes en de wells van respectievelijk rij 2, 3, 4 en 5 worden gevuld. Opmerking: Dit kan met dezelfde pipet gebeuren! Inzetten van de test Stel een binoculair microscoop (6.15) met een donkerveldinstelling in op een vergroting van 30x. Neem de multiplaat uit de incubator ( ) Controleer de multiwell testplaat onder de microscoop op de hoeveelheid witte raderdiertjes Pipetteer met een micropipet (6.3) ongeveer 50 witte raderdiertjes in het verzamelgootje van rij X. De pipet wordt nagespoeld met Standaard zeewater(5.3) Herhaal procedure bij rij 1 tot en met Incubeer de multiwell testplaat om de raderdiertjes te laten acclimatiseren aan het verhoogde zoutgehalte. Ze zijn geacclimatiseerd als actief zwemgedrag wordt waargenomen Pipetteer 5 raderdiertjes vanuit het verzamelgootje van rij X in elk van de 6 wells van rij X. De pipet wordt nagespoeld met Standaard zeewater Herhaal procedure bij rij 1 tot en met 5. Om morsen te voorkomen wordt het incubatiegootje leeggemaakt, nagespoeld met Standaard zeewater en drooggemaakt met tissue (6.16) Dek de multiwell testplaat af met parafilm en incubeer 24 uur in het donker bij 25 ± 1 C (6.5) Plaats de multiwell testplaat na incubatie onder de microscoop. Raderdiertjes die na 5 pagina nr. 6 van 17 pagina's

7 seconden nog geen beweging hebben vertoond, zijn dood. 8.4 Blanco/controle Controlesediment Bij elk experiment dient het poriewater van een controlesediment te worden getest. Dit poriewater moet dezelfde constitutie hebben als het te analyseren sediment. Dit wordt in rij X van de multiwell testplaat gepipetteerd volgens Referentietoxicant kaliumbichromaat Bij elk uitgevoerd experiment dient één referentietest te worden uitgevoerd, om de kwaliteit van de raderdiertjes te onderzoeken Los daartoe de inhoud van een buisje kaliumbichromaat 10 g/l K 2 Cr 2 O 7 (5.4) op in een maatkolf van 100ml (6.9) met Standaard zeewater (5.3) Homogeniseer na het afsluiten van de maatkolf de inhoud door zorgvuldig te zwenken Nummer 6 testbuisjes (6.14): S, Pipetteer 5 ml uit de verkregen oplossing kaliumbichromaat oplossing van in testbuisje S Pipetteer 9 ml Standaard zeewater in buisje nummer 1 met behulp van een 10 ml pipet Pipetteer 1 ml K 2 Cr 2 O 7 oplossing uit testbuisje S in testbuis 1. Spoel de pipet na met Standaard zeewater Dek testbuis 1 af met parafilm (6.6) en homogeniseer de inhoud door te zwenken Pipetteer (met dezelfde pipet) uit testbuis 1 de hoeveelheid oplossing volgens tabel 2 in de overige testbuisjes: pagina nr. 7 van 17 pagina's

8 Tabel 2: Verdunningsreeks van de K 2 Cr 2 O 7 -oplossing testbuis Standaard zeewater (5.3) (ml) Volume uit buis 1 (ml) 2 4,4 5,6 3 6,8 3,2 4 8,2 1,8 5 9,0 1, Dek de testbuisjes af met parafilm Sla de overige K 2 Cr 2 O 7 -oplossing op in een gelabelde bruine glazen fles (6.13) bij +4 C Volg voor het vervolg van deze testprocedure Bereken op basis van de overleving de 24h-LC 50 waarde volgens Randvoorwaarden De parameters die gemeten worden in het poriewater van de sedimenten en in die van de referentietoxicant, moeten gedurende de blootstellingsperiode binnen de volgende grenzen blijven: temperatuur 25 ± 2 C saliniteit 32 ± 4 zuurstof >15% verzadiging licht(breedspectrum) 24 uur (lichtkwaliteit lux) ph 5-9 sulfide 1 NOEC=? mg/l 1 ) Geen gegevens bekend; spectrofotometrisch meten 8.6 Kalibratie n.v.t. pagina nr. 8 van 17 pagina's

9 9. Identificering en kwantificering 9.1 LC 50 - en NOEC berekening van de Referentietoxicant. Voor de berekening van de 24h-LC 50 en NOEC (in vol-%) wordt de trimmed Spearman- Karber methode gebruikt, zoals beschreven door Hamilton et al. (1977). Voor deze methode zijn verschillende softwarepakketten voorhanden. Een aanbevolen pakket is het LC 50 programma ontwikkeld door het RIZA. N.B. In het handboekje van de ROTOXkit M staat een grafische interpolatie figuur voor de schatting van de LC 50 ; Deze grafische schatting niet gebruiken voor de LC 50 berekening. 9.2 Toetsing verschil tussen referentiesediment en te beoordelen sediment Of het verschil tussen het referentiesediment en het te beoordelen sediment significant is, moet worden vastgesteld met een toets. Deze toets kan worden uitgevoerd door het softwarepakket StatXact. 9.3 Gemiddelde mortaliteit in poriewatertest De gemiddelde sterfte kan in één verdunnings concentratie berekend worden, door het aantal dode testorganismen te delen op het totaal aantal ingezette testorganisme. Hierbij worden de gegevens van alle replica s opgeteld. In formule: û =S/(MxN)=S/n waarin: û : geschatte sterftekans, gemiddelde sterfte S : totaal aantal dode testorganismen M : aantal replica s N : aantal testorganismen per replica n : totaal aantal ingezette testorganismen Procentuele sterfte = û * Kentallen Bij rapportage van de data Brachionus plicatilus, worden ook de prestatie kenmerken van de analyse weergegeven in de analysekarakteristiek (zie voorbeeld bijlage 1). pagina nr. 9 van 17 pagina's

10 11. Rapportage De volgende informatie moet worden gerapporteerd: * Analysekarakteristiek (zie bijlage 1) * Poriewater- en Mortaliteit LC 50 gegevens sediment (zie bijlage 2) * Mortaliteit en LC 50 gegevens van de referentietoxicant (zie bijlage 3) * Shewhart controlekaart van referentietoxicant pagina nr. 10 van 17 pagina's

11 12. Kwaliteitszorg De toets kan als geldig worden beschouwd als aan de volgende kwaliteitscriteria (QA) wordt voldaan: 1. Controlesediment < 20 % sterfte 2. Referentietoxicant 24h-LC 50 (K 2 Cr 2 O 7 -oplossing): norm: mg/l Zie Shewhartkaart 3. Blanco (Standaard zeewater) < 10 % sterfte 4. Opslagtijd poriewater Opslagtijd sediment maximaal 4 uur maximaal 4 weken 5. Testdataformulier zie bijlage 2 6. Analysekarakteristiek zie bijlage 1 7. Overschrijding van QA: overleg met betrokken projectleider wanneer overschrijding plaatsvindt van: - opslagtijd poriewater en/of sediment 8. Test verwerpen: bij overschrijding van de 3s-grens van het: 24h-LC 50 positieve controle : <210 mg/l K 2 Cr 2 O 7 -oplossing >460 mg/l K 2 Cr 2 O 7 -oplossing 10% sterfte Standaard zeewater 20% sterfte controlesediment 13. Veiligheid 13.1 Dragen van laboratoriumjas en handschoenen is tijdens de uitvoering van de poriewatertoxiciteitstest en de referentietest verplicht Verontreinigd sediment wordt als chemisch vastafval beschouwd en wordt als zodanig afgevoerd Met de referentietoxicant kaliumbichromaat dient zorgvuldig te worden gewerkt. Zie voor toxiciteitgegevens de internetsites: of Literatuur pagina nr. 11 van 17 pagina's

12 1. Snell, T.W., Persoone, G. (1989); Acute toxicity bioassays using rotifers. A test for brackish and marine environments with Brachionus plicatilis; Aquatic Toxicology 14: Calleja, M.C., Persoone, G. (1993); The influence of solvents on the acute toxicity of some ipophilic chemicals to aquatic invertebrates; Chemosphere 26 (11): Dikkenberg van den L.C. en Schipper C.A.(1998) Validatie rapport Brachionus, RIKZ/IT X. 15. Bijlagen Bijlage 1: Voorbeeld van analysekarakteristiek Bijlage 2: Poriewater-, mortaliteit en LC 50 gegevens van het sediment Bijlage 3: Mortaliteit en LC 50 gegevens referentietoxicant Bijlage 4: Wijzigingsformulier pagina nr. 12 van 17 pagina's

13 Bijlage 1: Voorbeeld analysekarakteristiek van Brachionus plicatilis 01 Parameter Matrix mortaliteit poriewater 02 Analysevoorschrift Nummer : SPECIE- Versie : Datum : 03 Testcode n.v.t. 04 Beginsel van de methode 05 Configuratie apparatuur Bepaling LC 50 waarde en NOEC aan poriewater van sediment Microscoop 30 x vergroting Monster voorbewerking Centrifugeren van sediment 07 Monsteropslag Max. opslag poriewater 24 uur. Opslag sediment max. 4 weken opslag 08 Meetbereik...% mortaliteit 09 Detectiegrens 10 Afrondingsgrens... % mortaliteit Sediment test:...% Waterfase test...mg/l 11 Herhaalbaarheid sedimenttoxiciteitstoets:...% 12 Reproduceerbaarheid... waterfasetest met K 2 Cr 2 O 7 :...% 13 Referentietoxicant K 2 Cr 2 O 7 14 Controlekaarten Shewhartkaart van de waterfasetest met K 2 Cr 2 O e lijn controle Controlekaart... 2 e lijn controle Gecertificeerd sediment:... Opgesteld door: C.A. Schipper en L.C. van den Dikkenberg Inhoudelijk goedgekeurd door:b.j. Kater bijlage 2 pagina nr. 13 van 17 pagina's Versie: 14 Systeemcode: C: validatie?brachionus: Datum1 juni 1999: Vervangt versie concept 4:

14 3 e lijn controle Ringonderzoek: Storende componenten Zwevende slibdeeltjes in de poriewaterkolom:... Opgesteld door: C.A. Schipper en L.C. van den Dikkenberg Inhoudelijk goedgekeurd door:b.j. Kater bijlage 2 pagina nr. 14 van 17 pagina's Versie: 14 Systeemcode: C: validatie?brachionus: Datum1 juni 1999: Vervangt versie concept 4:

15 Bijlage 2 Poriewater en Mortaliteits tabel Sediment ROTOXkit M Naam uitvoerder: Sediment afkomstig van: Saliniteit van het poriewater: Inzetdatum/tijd test: Beëindigingsdatum/tijd test: kolom A B C D E F Totaal mortaliteit rij (%) X (Controle) /30 1 ( 6,25%) /30 2 ( 12,5% ) /30 3 ( 25% ) /30 4 ( 50% ) /30 5 (100% ) /30 Opmerkingen: 24h-LC 50 : % NOEC: % Paraaf: Datum: Opgesteld door: C.A. Schipper en L.C. van den Dikkenberg Inhoudelijk goedgekeurd door:b.j. Kater bijlage 2 pagina nr. 15 van 17 pagina's Versie: 14 Systeemcode: C: validatie?brachionus: Datum1 juni 1999: Vervangt versie concept 4:

16 Bijlage 3 Mortaliteitstabel voor referentietest ROTOXkit M Naam uitvoerder: Saliniteit van het zeewater: Inzetdatum/tijd test: Beëindigingsdatum/tijd test: kolom rij zeewater A B C D E F Totaal mortaliteit (%) X (Controle) /30 1 ( mg/l) /30 2 ( mg/l) /30 3 ( mg/l) /30 4 ( mg/l) /30 5 ( mg/l) /30 Opmerkingen: 24h-LC 50 : mg/l Paraaf: Datum: Opgesteld door: C.A. Schipper en L.C. van den Dikkenberg Inhoudelijk goedgekeurd door:b.j. Kater bijlage 2 pagina nr. 16 van 17 pagina's Versie: 14 Systeemcode: C: validatie?brachionus: Datum1 juni 1999: Vervangt versie concept 4:

17 Bijlage 4 WIJZIGINGSBLAD Betreft RIKZ/ SV: Nr.: Versie: Datum uitgave: Naam Organisatie Naam Adres Telefoon Omschrijving Wijzigings VOORSTEL Naam analist Paraaf Labhoofd Datum Verwerkt door RIKZ: Datum: bijlage 2 pagina nr. 17 van 17 pagina's Opgesteld door: C.A. Schipper en L.C. van den Dikkenberg Inhoudelijk goedgekeurd door:b.j. Kater Versie: 14 Systeemcode: C: validatie?brachionus: Datum1 juni 1999: Vervangt versie concept 4: