Sediment toxiciteitstest met Echinocardium cordatum

Transcriptie

1 Ministerie van Verkeer en Waterstaat Directoraat -Generaal Rijkswaterstaat Rijksinstituut voor Kust en Zee/RIKZ Standaardvoorschrift Sediment toxiciteitstest met Echinocardium cordatum Trefwoorden: Echinocardium cordatum, sediment, toxiciteit, mortaliteit, ingraafgedrag. Inhoud 1. Onderwerp Toepassingsgebied Termen en definities Principe van de methode Reagentia en hulpstoffen Apparatuur en hulpmiddelen Monstername Bemonstering van sediment Bemonsteren van testorganisme Werkwijze Voorzorgsmaatregelen Voorbehandeling van een sediment Analyse van een sedimentmonster Inzetten Periodieke controle Afbreken van de test (tijdstip 21 dagen) Instelling apparatuur Kalibratie Controlesediment- en referentietoxicant Randvoorwaarden Identificering en Kwantificering LC 50 waarde van de Referentietoxicant Berekening percentage mortaliteit Berekening percentage niet-normaal-ingraafgedrag Berekening percentage totaal effect Kentallen Rapportage Kwaliteitszorg Veiligheid Literatuur Bijlagen...13 Pagina nr. 1 van20 pagina's

2 1. Onderwerp Het principe van de Echinocardium cordatum test is gebaseerd op directe blootstelling tussen sediment en de zich met sediment voedende zeeklit Echinocardium cordatum. Tijdens de bioassay worden als eindparameters mortaliteit en het niet-normaalingraafgedrag van de zeeklit bestudeerd. Deze eindpunten zijn een maat voor toxiciteit. De toxiciteit wordt uitgedrukt in het percentage mortaliteit en het percentage nietnormaal-ingraafgedrag van de zeeklitten na 14 dagen blootstelling aan het sediment. 2. Toepassingsgebied De Echinocardium cordatum test is van toepassing op mariene en brakke sedimenten. Pagina nr. 2 van20 pagina's

3 3. Termen en definities Acclimatiseren : Het aanpassen van een testorganisme aan omstandigheden die gelden in het laboratorium. Bentisch : Levend op of in de waterbodem Contaminatie : Vervuiling van sediment met zware metalen en/of organische microverontreinigingen Controlesediment : Negatieve controle genoemd. Sediment dat dient als blanco controle op de respons van de testorganismen. EC 50 : Effect concentration. De sediment of toxicant concentratie waarbij 50% van de testorganismen een bepaald effect ondervindt binnen een bepaalde blootstellingsduur. LC 50 : Lethal Concentration. De concentratie van een toxicant waarbij 50% van de testorganismen dood gaat binnen een bepaalde blootstellingsduur. LOEC : Lowest Observed Effect Concentration : De laagste concentratie van een toxicant waarbij een significant effekt optreedt. Mortaliteit : Sterfte van het testorganisme ten gevolge van blootstelling aan gecontamineerd sediment. Niet-normaalingraafgedrag Het percentage zeeklitten dat zich binnen 30 minuten niet-normaal ingraaft in controlesediment NOEC : No Observed Effect Concentration : De hoogste concentratie van een toxicant waarbij geen ongunstig effect optreedt. Overleving : Overleving van testorganismen na blootstelling aan gecontamineerd sediment. Poriewater Water aanwezig tussen sediment deeltjes dat wordt verkregen door centrifugatie van sediment. Randvoorwaarden : Binnen de experimentele situatie geldende afgebakende grenzen voor saliniteit, temperatuur, ph en zuurstofgehalte, waarbinnen geen negatieve effecten optreden van deze parameters. Referentietoxicant : Toxische stof waarmee de gevoeligheid van de gebruikte testorganismen wordt vastgesteld. Pagina nr. 3 van20 pagina's

4 4. Principe van de methode Zeeklitten worden gedurende 14 dagen blootgesteld aan sediment. Onder invloed van toxische stoffen kunnen zeeklitten gedragsverandering laten zien, een verslechtering van conditie laten zien en waardoor uiteindelijk zelfs sterfte op kan treden. De volgende gedragsveranderingen kunnen bij de zeeklit worden waargenomen; verlies van oriëntatievermogen (onderzijde boven), verlies van stekels, vertraagd heringraven op schoon sediment (gedeeltelijk of geheel boven het sediment). De toxiciteit van sedimenten wordt uitgedrukt op drie verschillende wijzen; Percentage mortaliteit. Percentage niet-normaal-ingraafgedrag (d.w.z. nog niet ingegraven binnen 30 minuten) van de overlevende dieren. Percentage totaal effect; som van de mortaliteit plus het niet-normaal-ingraafgedrag uitgedrukt als percentage van de inzet. 5. Reagentia en hulpstoffen 5.1 Zoutzuur 37% 5.2 Gefiltreerd zeewater 5.3 Lucht 5.4 Cadmium chloride (CdCl 2 ) 5.5 Ammonium chloride (NH 4 Cl) 5.6 Ammoniumtest (meetbereik: mg NH + 4 /l, op 1 mg/l nauwkeurig, detectiegrens 0,1 mg/l) 6. Apparatuur en hulpmiddelen 6.1 Acclimatisatie inrichting met doorstroom van natuurlijk zeewater 6.2 Glazen testbakken (minimaal 50 cm 2 per zeeklit) met druppelsgewijze doorstroommogelijkheid 6.3 Beluchtingsinstallatie 6.4 Buffervat zeewater 6.5 Pomp zeewater 6.6 Temperatuur gecontroleerde ruimte (15 ± 2 C) 6.7 Menginstallatie sedimentmonsters (Rollenbank, mixer of mengmolen) Pagina nr. 4 van20 pagina's

5 6.8 Afsluitbare monstervaten, lucht- en vochtdicht (HPE) 6.9 ph meter 6.10 Zuurstof- /Temperatuurmeter 6.11 Saliniteitsmeter 6.12 Stopwatch/klok 6.13 Platte bakken voor uitvoering heringraaftest 6.14 Bovenweger 7. Monstername 7.1 Bemonstering van sediment Zie Standaardvoorschrift SPECIE-08 Bemonstering Zoute Baggerspecie. 7.2 Bemonsteren van testorganisme Zeeklitten kunnen langs de Nederlandse kust worden bemonsterd (of afkomstig zijn uit kweek). De bemonstering in het veld kan gedaan worden met een Van Veen happer, waarbij de bodemhappen op een zeefplaat met zeewater worden uitgezeefd. Zeeklitten komen vrij algemeen voor langs de Nederlandse kust, en vooral jonge dieren komen in concentraties voor. Deze concentraties kunnen (zeer) plaatselijk zijn waardoor het bemonsteren van zeeklitten soms tijdrovend is voordat men een goede plek gevonden heeft. De zeeklitten worden aan boord opgeslagen in platte bakken met gezeefd zand en op doorstroom gehouden totdat ze aan land gebracht worden. Bij aankomst op het laboratorium kunnen zeeklitten in zand en met doorstroom van zeewater geacclimatiseerd worden. Acclimatisatie dient minimaal 14 dagen te zijn. 8. Werkwijze 8.1 Voorzorgsmaatregelen Gebruik handschoenen en laboratoriumjas tijdens de uitvoering van de experimenten. Zie ook hoofdstuk 13 Veiligheid. 8.2 Voorbehandeling van een sediment Het sediment wordt opgeslagen in het donker bij 4 ± 2 C. Uiterlijk een maand na monstername wordt de bioassay gestart. Voor dat de bioassay kan worden gestart, dient het gebruikte sediment gehomo- Pagina nr. 5 van20 pagina's

6 geniseerd te worden op de rollenbank, mengmolen of met een mixer (6.6). Het materiaal dient zodanig gehomogeniseerd te worden, dat de sedimentdeeltjes en het aanwezige water vermengd worden tot een egale, min of meer vloeibare massa, uniform van kleur en textuur. 8.3 Analyse van een sedimentmonster Voorbereiding inzetten van de analyse Verricht onderstaande werkzaamheden bij voorkeur in een ruimte van 15 ± 2 C Breng per sediment in vier aquaria ca. 3-5 liter (min. 5 cm) gehomogeniseerd materiaal aan Breng per controlesediment in vier aquaria ca. 3-5 l (min. 5 cm) sediment aan Voeg voorzichtig gefiltreerd zeewater (5.3) aan de aquaria toe (min. 5 cm waterkolom), zonder de toplaag van het sediment te verstoren Belucht de aquaria continu met een pasteurse pipet Laat de testsystemen gedurende minimaal 12 uur in een klimaatruimte van 15 ± 2 C (6.1) staan Neem hierna uit elke replica 10 ml watermonster en maak een mengmonster. Meet vervolgens de randvoorwaarden: zuurstofgehalte (%) (6.12), de ph (6.14), temperatuur (6.13) en zoutgehalte (6.13). Meet van bovenstaande water ook het ammoniumgehalte (5.8). Noteer de waarden in een tabel, een voorbeeld staat in bijlage Inzetten Weeg (6.25) vier keer 10 organismen (5.2) af tussen 10 en 40 gram. Noteer het gemiddelde gewicht van deze organismen bijvoorbeeld op het testdataformulier (bijlage 2) Zet in 4 replica sedimentbakken met (A, B, C en D) per bak 10 organismen op regelmatige afstand van elkaar (start met controlesediment) Noteer het ingraafgedrag van het traagste organisme per testbak, bijvoorbeeld op het gedragsobservatieformulier (bijlage 4) N.B. Een organisme wordt als ingegraven beschouwd als de bovenzijde van het organisme gelijk is met het sedimentoppervlak Laat de bekerglazen 21 dagen bij een temperatuur van 15 ± 2 C staan. Ververs het bovenstaande zeewater druppelsgewijs, zo dat de hoeveelheid zeewater in het testsysteem dagelijks wordt ververst (per replica komt dit meestal neer op 3-5 liter per dag of meer, Pagina nr. 6 van20 pagina's

7 afhankelijk van de grootte van het testsysteem) Controleer elke werkdag de beluchting. bij dagelijkse controle op continue beluchting blijft het zuurstofgehalte hoger dan 80%, bij verstopping moet het zuurstofgehalte >50% verzadiging zijn. Indien de beluchting bij een bekerglas is uitgevallen, het zuurstofgehalte meten Controleer elke werkdag het gedrag van de organismen en noteer het gedrag bijvoorbeeld op het gedragsobservatieformulier (bijlage 4) NB. Wanneer organismen dood worden aangetroffen, dienen deze verwijderd te worden. 8.5 Periodieke controle Geadviseerd wordt om voor elk sediment ook tussentijds 1 of 2 maal de randvoorwaarden te meten. Noteer de gemeten waarden bijvoorbeeld op het randvoorwaardenformulier (bijlage 3). 8.6 Afbreken van de test (tijdstip 21 dagen) Neem na 21 dagen bloostelling uit elke replica 10 ml watermonster en maak een mengmonster. Meet met een elektrode het zuurstofgehalte (6.12), de ph (6.14), temperatuur (6.13) en het zoutgehalte (6.13). Meet van bovenstaande water ook het ammoniumgehalte(5.8). Noteer de waarden in een tabel, zie bijlage Verwijder voorzichtig de testorganismen uit elke testbak en noteer de mortaliteit (eventueel afwijkingen zoals oriëntatie, stekelverlies) bijvoorbeeld op formulier (bijlage 4) Plaats de levende testorganismen in een heringraafbak (6.20) met schoon zand (5.3) (start met controlesediment)en bepaal het ingraafgedrag van de testorganismen. Noteer het ingraafgedrag van de testorganismen per testbak bijvoorbeeld op formulier 4. < normaal ingraafgedrag d.w.z. binnen 30 minuten ingegraven. = nog niet ingegraven binnen 30 minuten is echter wel bezig met ingraven. # sterfte van testorganisme Ø verlies stekels 8.7 Instelling apparatuur n.v.t. 8.8 Kalibratie n.v.t. Pagina nr. 7 van20 pagina's

8 8.9 Controlesediment- en referentietoxicant Achtereenvolgens wordt ingegaan op het uitvoeren van testen met het controlesediment (8.7.1) en met een referentietoxicant (8.7.2). De referentietoxicant ammoniumchloride wordt toegepast als kwaliteitsborging Controlesediment Als controlesediment wordt schoon sediment gebruikt waarop Echinocardium cordatum na 14 dagen blootstelling minder dan 10 % sterfte geeft. Het controlesediment wordt parallel getest aan het te testen sediment. Wanneer meerdere veldsedimenten tegelijk worden beoordeeld kan het aantal controles beperkt worden tot de wortel uit het aantal te beoordelen sedimenten. Hierbij wordt iedere controle in viervoud uitgevoerd Referentietoxicant ammoniumchloride Van elke levering van Echinocardium cordatum dient als ingangscontrole in duplo de kwaliteit van het testorganismen te worden bepaald. Deze waterfasetest wordt uitgevoerd met de referentietoxicant ammoniumchloride gedurende 96 uur bij 15 ±2 C Maak een stockoplossing van 10,0 g/l ammonium door gram NH 4 Cl (5.4) op te lossen in 1000 ml demiwater Maak een verdunningsreeks van 0 tot 60 mg/l ammonium door de hoeveelheden stockoplossing volgens onderstaande tabel toe te voegen aan 3,0 l gefiltreerd zeewater in bekerglazen van 3l (6.22) (in duplo zijn dit dus 12 bekerglazen) Concentratie NH + 4 (mg/l) ml te pipetteren stockoplossing 0 0,0 5 1,5 10 3,0 20 6, , , Neem een monster (6.14) van de blanco (0 mg/l) en een monster (6.14) van de hoogste concentratie (60 mg/l) en meet de saliniteit (6.18), ph (6.16), temperatuur, en het Pagina nr. 8 van20 pagina's

9 zuurstof gehalte (6.17). Meet van het bovenstaande water ook spectrofotometrisch het ammoniumgehalte (5.5). Noteer de gemeten waarden op bijvoorbeeld het randvoorwaardenformulier (bijlage 3) Plaats op tijdstip 0 in elk bekerglas van de concentratiereeks (8.8.2) 5 zeeklitten Na 96 uur (4 dagen) worden de organismen uit de bekerglazen gehaald en het ingraafgedrag (6.20) vastgesteld. Van elk bekerglas wordt niet-normaal-ingraafgedragtijd en de mortaliteit vastgesteld en genoteerd op bijvoorbeeld het gedragsobservatieformulier (bijlage 5). N.B.Organismen die gedurende de 30 minuten niet-normaal-ingraafgedrag test niet bewegen, worden als dood geteld Neem een monster (6.14) van de blanco (0 mg/l) en een monster van de hoogste concentratie (60 mg/l) en meet de saliniteit (6.18), ph (6.16), temperatuur en zuurstofgehalte (6.17). Noteer de gemeten waarden op het randvoorwaardenformulier (bijlage 5) De resultaten van deze test worden uitgedrukt in 96h-LC 50 waarden en op de daarvoor bestemde Shewhart controle kaart. Norm: referentietoxicant 96h-LC 50 (NH + 4 )= mg NH + 4 /l 8.10 Randvoorwaarden De parameters die in bovenstaand water van de sedimenttesten en in die van de referentietoxicant testen worden gemeten, dienen gedurende de blootstellingsperiode binnen de volgende grenzen te blijven: Temperatuur 15 ± 2 C saliniteit 32 ± 4 zuurstof >60% verzadiging (ook bij de heringraaftest) ammonium gehalte 1) + ph8,5: < 5 mg/l NH 4 + ph8,0: <15 mg/l NH 4 + ph7,5: <25 mg/l NH 4 licht (breedspectrum) lichtkwantiteit lux licht (dag/nacht) 16uur/8uur ph 8 ± 0.5 1) Randvoorwaarden bij sedimenttest Pagina nr. 9 van20 pagina's

10 9. Identificering en Kwantificering 9.1 LC 50 waarde van de Referentietoxicant. Voor de berekening van de LC 50 wordt de trimmed Spearman-Karber methode gebruikt. Voor deze methode zijn verschillende softwarepakketten voorhanden. Het aanbevolen softwarepakket is TOXCALC. 9.2 Berekening percentage mortaliteit A 1 +B 1 +C 1 +D 1 M %= *100 % Waarin: A 0 +B 0 +C 0 +D 0 M = Percentage mortaliteit A 1 = Aantal dode zeeklitten in replica A na 14 dagen blootstelling A 0 = Aantal ingezette zeeklitten in replica A op t=0 A, B, C, D = Replica s A, B, C en D 9.3 Berekening percentage niet-normaal-ingraafgedrag a 1 +b 1 +c 1 +d 1 NI %= *100 % A 0 +B 0 +C 0 +D 0 Waarin : NI = Percentage zeeklitten dat een niet-normaal-ingraafgedrag vertoont op het controlesediment, na 14 dagen blootstelling (d.w.z. nog niet ingegraven binnen 30 minuten). a 1 - d 1 = Aantal zeeklitten dat een niet-normaal-ingraafgedrag vertoont op het controlesediment in replica A, na 14 dagen blootstelling (d.w.z. nog niet ingegraven binnen 30 minuten). A 0 - D 0 = Aantal ingezette zeeklitten in replica A (D)op t=0 Pagina nr. 10 van20 pagina's

11 9.4 Berekening percentage totaal effect (a 1 +b 1 +c 1 +d 1 )+( A 1 +B 1 +C 1 +D 1 ) TE %= *100 % A 0 +B 0 +C 0 +D 0 Waarin: TE = Percentage gemiddeld totaal effekt na 14 dagen blootstelling t.o.v. de inzet A 1 = Aantal dode zeeklitten in replica A na 14 dagen blootstelling A 0 = Aantal ingezette zeeklitten in replica A op t=0 a 1 = Aantal zeeklitten dat een niet-normaal-ingraafgedrag vertoont op het controlesediment in replica A, na 14 dagen blootstelling (>30 minuten). A, B, C, D = Replica s A, B, C en D 10. Kentallen Bij rapportage van de Echinocardium cordatum data, worden de kentallen van de analyse weergegeven in de analysekarakteristiek (voorbeeld bijlage 1). 11. Rapportage De volgende informatie dient te worden gerapporteerd: Sediment, monsterlocatie en bemonstering gegevens (volgens bijlage 2). De mortaliteit van het testorganisme in de sediment toxiciteits test (volgens bijlage 2). Indien randvoorwaardenoverschrijding plaatsvindt, deze rapporteren De volgende informatie dient op verzoek beschikbaar te zijn: Gemeten randvoorwaarden parameters (bijlage 3). De berekende LC 50 waarde voor de referentietoxicant en de sterfte in het controlesediment (volgens bijlage 2). Shewhartcontrolekaart van referentietoxicant. Analysekarakteristiek (volgens bijlage1). Pagina nr. 11 van20 pagina's

12 12. Kwaliteitszorg Om de kwaliteit van de Echinocardium cordatum analyse te kunnen waarborgen dient de assay te voldoen aan de volgende kwaliteitscriteria: 1. Controlesediment < 10% mortaliteit 2. Referentietoxicant 96h-LC 50 (NH + 4 ): norm 10 mg/l tot 32 mg/l. Noteren op Shewhart controle kaart 3. Acclimatisatie tijd > 2 weken 4 Opslagtijd sediment Maximaal 4 weken 5. Testdataformulier Invullen bijlage 2 6. Randvoorwaardenformulier Noteren van ammonium concentraties. Invullen bijlage 3 7. Analysekarakteristiek Noteren van o.a. herhaalbaarheid, detectiegrens, afrondingsinterval, 1 e /2 e /3 e -lijns controle. Invullen bijlage 1 8. Overschrijding van QA-criteria: Overleg met betrokken projectleider wanneer overschrijding plaatsvindt van: opslagtijd sediment norm zeeklitgewicht tussen gram 9. Test verwerpen: Bij overschrijding op de Shewhart controle kaart van de 3s-grens met het referentietoxicant. 10 % mortaliteit in controlesediment. 13. Veiligheid 13.1 Dragen van labjas en handschoenen is tijdens de uitvoering van de sediment toxiciteitstest en het referentietoxicant verplicht Verontreinigd sediment, blootgestelde testorganismen en referentietoxicant worden als chemisch afval beschouwd en als zodanig afgevoerd Met de referentietoxicant ammoniumchloride dient zorgvuldig te worden omgegaan. Zie voor toxiciteit gegevens de internetsites: of Pagina nr. 12 van20 pagina's

13 14. Literatuur 1. Bowmer, C.T. (1993, niet gepubliceerd) PARCOM sediment reworker ring-test, 1993: Method for the assessment of acute toxicity of contaminated sediment using the sea urchin Echinocardium cordatum, 11p. 2. Bowmer, C.T. (1993). Paris Commission Sediment Reworker Ring-test, IMW-R 93/317, 42 pp. 3. AquaSense (1995). De toxiciteit van ammonia, nitriet en sulfide voor Corophium en Echinocardium o.i.v. het zuurstof gehalte en de ph. In opdracht van: Rijksinstituut voor Kust en Zee. Rapportnr.: , 49pp. 4. Schot, M.E. & C.A. Schipper (1998). Validatie rapport Echinocardium cordatum bioassay, Werkdocument RIKZ/IT X. 5. Kater, B. (1999). Statistiek voor bioassays, RIKZ/OS x 6. Aquasense (1998). Randvoorwaarden voor mariene bioassays, rapport AquaSense (2001). Aanvullend validatieonderzoek met de zeeklitbioassay. Volgens RIKZ/Specie-03: mogelijke effecten van korrelgrootte, de aanwezigheid van dode dieren en dynamische veldsedimenten. Rapport Bijlagen Bijlage 1: Voorbeeld van analysekarakteristiek Bijlage 2: Testdataformulier sediment Bijlage 3: Randvoorwaardenformulier sediment Bijlage 4: Sediment-, mortaliteit- en niet-normaal-ingraafgedrag formulier Bijlage 5: Referentietoxicant formulier Bijlage 6: Schema Testopstelling Bijlage 7: Wijzigingsformulier Pagina nr. 13 van20 pagina's

14 Bijlage 1. Voorbeeld van analysekarakteristiek Echinocardium cordatum 01 Test Matrix Sediment 02 Analysevoorschrift Nummer : Specie-03 Versie :.. Datum :.. 03 Testcode. 04 Beginsel van de methode Directe blootstelling tussen sediment en de zich met sediment voedende zeeklit Echinocardium cordatum 05 Monster opslagtemp. C 06 Monsteropslagtijd..dagen 07 Meetbereik..% mortaliteit 08 Detectiegrens.. % mortaliteit 09 Afrondingsgrens..% 10 Herhaalbaarheid sediment toets:..% (%r = 2 2 *CV*%) waterfasetest met NH 4 + :.. % 11 Reproduceerbaarheid. 12 Referentietoxicant 13 Controlesediment. 14 Controlekaarten Shewhartkaart van referentietoxicant NH e lijn controle Controlekaart:.. 2 e lijn controle Gecertificeerd sediment:.. 3 e lijn controle Ringonderzoek: 16 Storende componenten NOEC NH 4 + :.. Pagina nr. 14 van20 pagina's

15 Bijlage 2. Testdataformulier Echinocardium cordatum Testcode: Projekt: Naam uitvoerder: REFERENTIETOXICANT: Ammoniumchloride LC 50 = mg/l Echinocardium cordatum Afkomstig: Locatie: Gewicht Datum Datum Incubatie % Gem. % Gem. Lab.nummer Monster organisme Bemon- analyse tijd/temp. Mortaliteit NIET- % Gem locatie stering (min/ C) Ingraven Totaal EFFEKT Pagina nr. 15 van20 pagina's

16 Bijlage 3. Randvoorwaarden sedimenten Sediment: Testdag Datum ph Zuurstof Temp Saliniteit NH 4 + [mg/l] ) Opmerkingen: Maak een notitie wanneer een randvoorwaarde is overschreden! Overzicht gewichten zeeklitten Gemiddelde gewicht per 5 organismen (gram): Duplo nr. 5 g/l 10 g/l 20 g/l 36 g/l 60 g/l I II III IV Pagina nr. 16 van20 pagina's

17 Bijlage 4. Sediment Mortaliteit en Ingraafgedrag-formulier Echinocardium cordatum GEMIDDELDE MORTALITEIT EN INGRAAFGEDRAG LAB NUMMER: SEDIMENT : TESTCODE: Testdag Datum Dood per replica Niet-normaalingraafgedrag per replica Gem. DOOD per replica Gem. NIET- INGRAAF gedrag per replica Gem.TOTAAL EFFECT t.o.v inzet A B C D A B C D % % % Opmerking : Codes ingraafgedrag van de testorganismen per testbak: < normaal ingraafgedrag; dwz. binnen 30 minuten ingegraven. = nog niet ingegraven binnen 30 minuten is echter wel bezig met ingraven. # sterfte van testorganisme Ø verlies stekels Pagina nr. 17 van20 pagina's

18 Bijlage 5. Waterfaseformulier referentietoxicant: Echinocardium cordatum Referentietoxicant: ammoniumchloride Tijdstip Conc. (mg/l) Mortaliteit per replica Niet-normaal-ingraafgedrag per replica Totaal effect tov. inzet per replica [uren] Duplo nr. A B C D gem% A B C D gem % A B C D Gem % Berekende96h- LC 50 : 95 % Betrouwbaarheids interval: Randvoorwaardentabel Referentietoxicant: Ammoniumchloride Testtijd [uur/conc] Datu m p H Zuurstof Temp Saliniteit NH 4 + [mg/l] 0/ 0mg/l 0/ 60 mg/l 96/ 0mg/l 96/ 60mg/l Pagina nr. 18 van20 pagina's

19 Bijlage 6. Schema testopstelling Pagina nr. 19 van20 pagina's

20 Bijlage 7. Voorstel wijzigingen Betreft RIKZ/ SV Nr.: Versie: Datum uitgave: Naam Organisatie: Naam : Adres: Telefoon: Omschrijving Wijzigingsvoorstel Naam analist Paraaf Labhoofd Datum Verwerkt door: RIKZ: Datum: Pagina nr. 20 van20 pagina's