Randvoorwaarden voor mariene bioassays Een overzicht van beschikbare data. door: J.F. Postma AquaSense B.V.

Transcriptie

1 Randvoorwaarden voor mariene bioassays Een overzicht van beschikbare data door: J.F. Postma AquaSense B.V.

2

3 1. Inleiding Om negatieve effecten, waargenomen in bioassays, op waarde te kunnen schatten is het van belang, dat de mogelijke invloed van zogenaamde randvoorwaarden achterhaald kan worden. Onder randvoorwaarden worden een aantal parameters verstaan, die negatieve effecten op organismen kunnen veroorzaken, maar die niets te maken hebben met de eigenlijke verontreinigingen, die bestudeerd worden. Hierbij valt bijvoorbeeld te denken aan een verhoogde sterfte door zuurstofgebrek of een vertraagde ontwikkeling doordat de ammonium concentratie te hoog is. In het rapport Baggerspecie, meer of minder schadelijk (Stronkhorst et al., 1997) is een tabel opgenomen, die voor een aantal van dergelijke parameters criteria weergeeft. Deze gegevens zijn echter vrij fragmentarisch verzameld, waardoor het onduidelijk was 1) waar de gegevens vandaan komen, 2) hoe betrouwbaar de voorgestelde criteria zijn en 3) of aanvullend onderzoek wenselijk is. Naar aanleiding hiervan heeft het RIKZ bij het samenstellen van het RIKZ handboek Toxiciteitstesten voor Zoute Baggerspecie aan AquaSense gevraagd om een samenvatting van de beschikbare resultaten te maken, om die vervolgens te integreren tot een nieuw overzicht met voorgestelde randvoorwaarden. Daar een vergelijkbare vraag op hetzelfde moment ook speelde bij het RIZA voor wat betreft de testen gericht op de zoetwater sedimenten als mede op het beoordelen van afvalwater, heeft AquaSense beide vragen gecombineerd. Het resultaat hiervan is een engelstalig artikel (Postma et al., in prep.), dat tevens integraal in dit handboek is opgenomen. Het huidige Nederlandse hoofdstuk is een samenvatting hiervan, waarbij de tabellen zijn gereduceerd tot die soorten, die van belang zijn bij het beoordelen van zoute baggerspecie. AquaSense 1

4 2. Methode Bij het opstellen van een overzicht van beschikbare gegevens werd allereerst gebruik gemaakt van de resultaten van experimenten, die de laatste jaren door AquaSense en het RIKZ werden uitgevoerd. Daarnaast is in de wetenschappelijke literatuur naar gegevens gezocht. De gevoeligheid voor onder andere genoemde randvoorwaarden kan sterke verschillen vertonen tussen (zelfs nauw verwante) soorten. Bij dit literatuur onderzoek is daarom als strikte voorwaarde gehanteerd dat het onderzoek betrekking diende te hebben op dezelfde soorten als op dit ogenblik worden gebruikt bij het beoordelen van zoute baggerspecie. Op basis van het overzicht werd nagegaan of en zo ja welke hiaten er in de gebruikte gegevens zitten en kan eventueel een lijst van prioriteiten worden opgesteld. Voor dit overzicht is gekeken naar de effecten van de volgende randvoorwaarden: zuurstof ph nitriet ammonium/ammoniak sulfide saliniteit / chloride op de drie volgende soorten Vibrio fischeri (Microtox test) Corophium volutator Echinocardium cordatum AquaSense 2

5 Informatie over randvoorwaarden criteria voor andere mariene organismen, die op dit ogenblik niet worden gebruikt bij het routinematig beoordelen van baggerspecie (zoals Brachionus plicatilis, Acartia tonsa, Crassostrea gigas, Psammechinus miliaris) worden hier niet besproken. Wel zijn de voorgestelde criteria opgenomen in de tabel aan het einde van dit hoofdstuk en worden deze testen besproken in het Engelstalige hoofdstuk. Daarnaast dient vermeld te worden, dat tenzij anders vermeld, de concentraties ammonium betrekking hebben op het totaal gehalte, dat wil zeggen de som van ammonium (NH 4 + ) en ammoniak (NH 3 ) en de concentratie sulfide op het Total Dissolved Sulfide. AquaSense 3

6

7 3. Resultaten N.B. Bij sommige randvoorwaarden parameters worden in de literatuur twee verschillende soorten criteria gepresenteerd. De ene is hierbij gericht op de ecologische mogelijkheden van de betreffende soort, terwijl het andere criterium meer is gericht op de wens van de onderzoeker om de variatie in een bepaalde parameter tijdens de test te minimaliseren. Als voorbeeld: Een verschillend zoutgehalte zal effecten hebben op de biologische beschikbaarheid van bijvoorbeeld metalen en daarmee op de ecotoxicologische effecten. Met het oog hierop zou een vrij strikt criterium gehanteerd kunnen worden. Wordt aan de andere kant gekeken naar bijvoorbeeld een soort als Corophium volutator, dan blijkt deze soort zonder problemen over een veel groter saliniteitsbereik te kunnen voorkomen. Dit laatste zou een veel ruimer criterium geven. Voor het huidige overzicht als mede het voorgestelde randvoorwaarden, is deze laatste werkwijze aangehouden. De voorgestelde criteria zijn dus zo strikt mogelijk afgestemd op de huidige kennis met betrekking tot concentraties waar effecten op de organismen te verwachten zijn. Vibrio fischeri (Microtox SP) ph Over de Microtox SP test konden weinig gegevens gevonden worden met betrekking tot de randvoorwaarden, terwijl over de waterfase test meer gegevens beschikbaar waren. Aangezien het hier hetzelfde organisme betreft zijn ook deze gegevens hier behandeld. Hierbij dient er echter rekening gehouden te worden met een mogelijk verschil in gevoeligheid afhankelijk van de gekozen wijze van blootstelling. Over de effecten van de ph konden weinig experimentele gegevens gevonden worden. De range van 6,0-8,0 is afkomstig uit de NVN norm 6516 (1993). In eigen onderzoek van het RIZA (gerefereerd in Bosch, 1995) werd echter geen lichtafname gevonden in een oplossing AquaSense 5

8 Zuurstofgehalte Nitriet Ammonium Sulfide met een ph van hetzij 5 dan wel 9. Door het RIZA wordt daarom deze bredere range als randvoorwaarde aangehouden. Dit betreft echter de waterfase test. Door de fabrikant wordt voor de Microtox Solid Phase een ph range van 6,0-8,0 opgegeven, terwijl in de ISO norm (1998) een range van 6,0 8,5 wordt aangegeven. Er wordt dan ook voorgesteld om deze laatste range als randvoorwaarde voor de Microtox Solid Phase test te hanteren. N.B. Deze waarde heeft betrekking op de ph in het uitgangsmonster. De andere voor de Microtox test voorgestelde randvoorwaarden hebben betrekking op de waarden in het eigenlijke testsysteem. In dit testsysteem is de actuele ph waarde echter moeilijk vast te stellen, terwijl deze door het in min of meerdere mate optreden van bufferende werking ook niet te voorspellen is. AquaSense (1998) heeft onderzoek gedaan naar de gevoeligheid van de Microtox-test voor zuurstof. Het bleek echter heel moeilijk om de zuurstof concentraties op het benodigde lage niveau te houden (verloop van 1,2 naar 3,4 mg O 2 /l). Met deze kanttekening in het achterhoofd (en gebaseerd op gemiddelde concentraties) werd voorgesteld om de kritische grens van zuurstof voor Vibrio fischeri op een verzadiging van 30 % bij 15 C en zeewater te stellen. In eigen onderzoek van het RIZA werd een lichte stimulatie bij 50 mg/l gevonden, op grond waarvan de randvoorwaarde is gesteld op <50mg/l. Daarnaast werd er een EC 50 -waarde van 420 mg/l vastgesteld door Bulich et al. (1981) en een NOEC van 70 mg/l door AquaSense (1998). Er wordt dan ook voorgesteld om <70 mg/l als randvoorwaarde voor de Microtox Solid Phase test te hanteren. In eigen onderzoek van het RIZA (1993) werd vastgesteld, dat er geen verandering in bioluminescentie optrad bij een concentratie van 125 mg ammonium / liter in het oorspronkelijke monster (max. geteste concentratie was dus 45% van 125 = 56 mg/l). Op grond hiervan werd ammonium als zijnde niet kritisch beoordeeld. Op basis van gegevens van Qureshi et al. (1982, gerefereerd in AquaSense, in prep.) lijkt er echter wel sprake te zijn van een kritische grens (EC 50 -waarde van 3600 mg ammonium/l dan wel 1,5 mg ammoniak/l). Daarnaast heeft het RIKZ recent de gevoeligheid van de Microtox Solid Phase test voor ammonium onderzocht (zie validatie rapport, RIKZ/IT98.860x; Schot en Schipper, 1998). Aangezien zelfs bij een concentratie van 1 g/l nog geen duidelijke effecten werden geconstateerd en een sedimentmonster minimaal een factor 5 wordt verdund, voordat in de Microtox Solid Phase test het eventuele negatieve effect wordt bepaald, kan gesteld worden dat de Microtox Solid Phase test niet gevoelig is voor ammonium. Als randvoorwaarde werd 1 g/l voorgesteld. Deze waarde is echter zo hoog, dat de ammonium concentratie in te testen monsters niet gemeten hoeft te worden. Er zijn een tweetal gegevens over de gevoeligheid voor sulfide gevonden. Dit betreft allereerst een referentie in het handboek met toxiciteitsdata voor V. fischeri (Kaiser en Devillers, 1994). Op basis van een artikel van van Leeuwen et al. (1985) wordt hierin een EC 50 - waarde voor natrium sulfide vermeld van 4,3 mg/l. Dit komt overeen met circa 1,8 mg/l sulfide. Er is echter niet vermeld of er op basis van deze gegevens ook een NOEC-waarde kon worden bepaald. Daarnaast heeft het RIKZ recent de gevoeligheid van de Microtox Solid Phase test AquaSense 6

9 Saliniteit voor sulfide onderzocht (zie validatie rapport, RIKZ/IT98.860x; Schot en Schipper, 1998). Hierbij is gewerkt met een concentratie range van 19,5 µg/l tot 12,5 mg/l en werd statistisch een NOEC van 3,3 mg/l en een EC 50 -waarde van 8,5 mg/l vastgesteld. Deze waarden betreffen de concentraties tijdens de werkelijke blootstelling. Aangezien een sedimentmonster minimaal een factor 5 wordt verdund, voordat in de Microtox Solid Phase test het eventuele negatieve effect wordt bepaald, kan als randvoorwaarde voor poriewater een waarde van 5*3,3 = 16,5 mg/l worden voorgesteld. Aangezien deze laatste waarden zijn vastgesteld middels de Microtox Solid Phase test methode wordt voorgesteld om deze range als randvoorwaarde te hanteren. Het RIKZ heeft de gevoeligheid van de Microtox Solid Phase test voor verschillen in saliniteit onderzocht (zie validatie rapport, RIKZ/IT98.860x; Schot en Schipper, 1998). Daarnaast is in de ISO norm een maximale saliniteit gespecificeerd. Verder dient er gerealiseerd te worden, dat tijdens het uitvoeren van de Microtox SP test eventuele lage zoutgehaltes door het toevoegen van extra zout worden gecompenseerd. Er wordt voorgesteld om de range van als randvoorwaarde voor de Microtox Solid Phase test te hanteren. N.B. Deze range heeft dus betrekking op de waarde in het eigenlijke testsysteem. Door het toevoegen van zout is de range aan toegestane waarden voor de feitelijke monsters breder. Corophium volutator ph Zuurstofgehalte Er zijn geen directe gegevens over de ph tolerantie van C. volutator gevonden. Wel is er in een aantal studies met verschillende ph s gewerkt. Dit betreft onder andere een studie naar een aantal randvoorwaarden voor Corophium, waarbij de gevoeligheid voor ammonium en nitriet bij verschillende ph s werd onderzocht (AquaSense, 1995) alsmede een TIE-studie met een aantal haven sedimenten (Schot et al., 1997). In beide studies varieerde de ph van 7,0 tot 9,0 en werd er in de uitgevoerde controles geen verhoogde sterfte bij Corophium aangetoond. Bij een ph-waarde van 9,0 is de gevoeligheid voor ammonium echter zo groot, dat al bij waarden van enkele mg/l effecten verwacht kunnen worden. Een verlaging van de range van 9,0 naar 8,5 werd daarom aanbevolen. Wel dient opgemerkt te worden, dat het hier om driedaagse testen ging, waarbij de dieren zonder sediment worden blootgesteld. In aanvulling hierop werden in een onderzoek naar de bioaccumulatie van zeldzame aardmetalen (AquaSense, 1997) tiendaagse testen uitgevoerd met drie verschillende ph-waarden (7,1; 7,7 en 8,5). Hoewel er in dit geval geen controle sedimenten zijn gebruikt, was de overleving bij deze ph-waarden in het te testen sediment redelijk. Daar voor ammonium gehalten een apart criterium wordt gehanteerd, wordt voorgesteld om het criterium voor de ph range bij Corophium volutator voorlopig op 7 9 te zetten. De invloed van het zuurstofgehalte op Corophium volutator is, voor zover bekend, nooit direct onderzocht. Wel zijn er experimenten AquaSense 7

10 Nitriet uitgevoerd, waarbij de toxiciteit van ammonium bij verschillende zuurstofgehalten werd onderzocht (AquaSense, 1995). Uit de uitgevoerde controles bleek, dat zelfs bij zuurstofpercentages van 20% er geen verhoogde sterfte of een gedragsverandering bij Corophium optrad. In de testen zelf werden aanwijzingen gevonden, dat de gevoeligheid van Corophium bij dergelijke lage zuurstofpercentages wellicht is toegenomen (alhoewel er een ph effect doorheen speelde). Op grond hiervan werd aanbevolen om als criteria >60% te hanteren, alhoewel de dieren bij lagere zuurstofpercentages geen directe problemen leken te ondervinden. In de praktijk zal een probleem met de zuurstof verzadiging niet snel optreden aangezien de bioassays permanent worden belucht. Mocht de beluchting tijdens de test uitvallen, dan zijn er tot aan 20% zuurstof geen directe effecten te verwachtten, alhoewel er rekening gehouden moet worden met een iets verhoogde gevoeligheid (AquaSense, 1995). Het uitgevoerde onderzoek betrof echter alleen driedaagse waterfase testen. De extrapolatie van deze gegevens naar tiendaagse sediment testen is niet onderbouwd. Voor alsnog lijkt het daarom aan te bevelen om de randvoorwaarde op 50% te stellen, met als opmerking dat een lichte en kortstondige overschrijding hoogstwaarschijnlijk geen invloed heeft. De toxiciteit van nitriet voor Corophium werd in driedaagse waterfase testen onderzocht bij verschillende ph-waarden (AquaSense, 1995). Uit deze gegevens bleek dat de toxiciteit bij oplopende ph (van 7,0 tot 9,0) duidelijk afnam. Tevens werd geconcludeerd, dat nitriet pas negatieve effecten veroorzaakt bij concentraties, die in een standaard bioassay niet snel zullen voorkomen. Hieronder zijn de gevonden NOECwaarden weergegeven, als mede de te hanteren criteria voor een tiendaagse test, die middels een extrapolatie verkregen werden. Deze extrapolatie is gebaseerd op AquaSense (1994), waarin een LC 50 - waarde voor nitriet van 504 mg/l na drie dagen (bij ph=8) en een LC 50 - waarde van 254 mg/l na 10 dagen wordt vermeld. Aangezien ook in de laagste testconcentratie een verhoogde sterfte werd aangetroffen konden er geen NOEC-waarden uit dit onderzoek worden afgeleid. Tevens dient opgemerkt te worden, dat de concentraties nitriet tijdens de test afnamen. De werkelijke extrapolatie factor wordt daardoor wellicht onderschat. ph-waarde NOEC (3 dagen) mg/l nitriet Criteria -10 daagse test mg/l nitriet 7, ,0 473 of < , Ammonium 1 : De NOEC op basis van sterfte is 473 mg/l. Indien echter ook op het gedrag gelet wordt blijkt de NOEC onder de 366 mg/l te liggen. 2 : exacte NOEC niet te berekenen doordat zelfs in de hoogste concentratie slechts een zeer gering (10-15%) effect optrad. NOEC ligt waarschijnlijk in de weergegeven range. In een door AquaSense uitgevoerd onderzoek (AquaSense, 1995) is de toxiciteit van ammonium bij verschillende ph-waarden onderzocht. De resultaten werden weergegeven als LC 50 -waarden, LC 10 -waarden en NOEC-waarden. Hierbij is de NOEC-waarde geschat door een sterfte AquaSense 8

11 van meer dan 10% als eerste effect te zien. Deze waarden kwamen echter goed overeen met de berekende LC 10 -waarden en kunnen daarmee gebruikt worden om randvoorwaarde criteria aan te geven. Hieronder zijn daarom de NOEC-waarden weergegeven. Daarnaast dient gerealiseerd te worden, dat het hier om driedaagse waterfase testen ging. Om te komen tot randvoorwaarden voor de tien daagse sediment test is daarom een extrapolatie toegepast. Deze is gebaseerd op gegevens over ammonium toxiciteit uit AquaSense (1994), waarbij een tiendaagse LC 50 -waarde werd gevonden die op 40% van de driedaagse waarde lag. Er is vervolgens vanuit gegaan, dat de afname van een LC 50 -waarde overeen komt met de afname van de NOEC. De op basis van deze extrapolatie berekende randvoorwaarden zijn hieronder weergegeven en komen overeen met de waarden zoals opgenomen in de gehanteerde tabellen. Wel dient gerealiseerd te worden, dat in het stage onderzoek, waarop deze extrapolatie is gebaseerd (AquaSense, 1994) de concentratie ammonium tijdens de test afnam. De werkelijke extrapolatie factor wordt daardoor wellicht onderschat. ph-waarde NOEC (3 dagen) mg/l ammonium totaal Voorlopig criterium - 10 daagse test mg/l ammonium totaal NH 3 (mg/l) 7, ,21 7, ,36 8, ,63 8, ,63 9,0 3 1,5 0,32 Verder dient opgemerkt te worden, dat er in dit onderzoek (AquaSense, 1995) aanwijzingen zijn gevonden, dat de toxiciteit niet volledig door ammoniak (NH 3 ) werd veroorzaakt zoals vaak wordt aangenomen, maar dat (zeker bij ph waarden onder de 8) ook ammonium (NH 4 + ) een toxisch effect kan veroorzaken. Dit blijkt ook indien de randvoorwaarde voor NH 3 wordt berekend op basis van het bekende verdelingsevenwicht en de randvoorwaarde voor de ammonium totaal concentratie zoals hierboven werd voorgesteld. Bij lagere ph waarden ligt het criterium voor NH 3 namelijk lager. Iets dat niet te verwachten valt indien de gehele toxiciteit door NH 3 wordt veroorzaakt. Daarnaast lijkt de gevoeligheid van Corophium bij een ph van 9 ook toegenomen te zijn. Daar de hierboven voorgestelde randvoorwaarden criteria zijn gebaseerd op een extrapolatie vanuit 3-daagse waterfase testen en verhoogde ammonium concentraties veel in de praktijk worden tegen gekomen, is aanvullend gekeken naar actuele waarden in routinematig uitgevoerde testen waarbij geen negatief effect op de overleving van Corophium werd vastgesteld. Hieruit blijkt, dat de hoogst gemeten ammoniumconcentratie zonder effect 67,3 mg NH 4 + /l bij ph 8,7 op t=10 dagen was. Op t=0 was de ammoniumconcentratie in dit monster 16,3 bij ph 8,3. Dit is opmerkelijk aangezien bovenstaand voorstel voor een randvoorwaarde criterium is gesteld op 24 mg NH 4 + /l bij ph=8,0 en 8 mg NH 4 + /l bij ph=8,5. Ook bij andere monsters werden de AquaSense 9

12 randvoorwaarden ruim overschreden zonder effecten te veroorzaken: een ammonium concentratie van 33,4 mg NH 4 + /l bij ph 8,6 op t=10 en 16,2 mg NH 4 + /l bij ph 8,4 op t=0 gaf geen effect. Evenzo liet een ammonium concentratie van 22 mg NH 4 + /l bij ph 8,6 op t=10 en 12,1 mg NH 4 + /l bij ph 8,4 op t=0 geen effecten zien. Er wordt daarom geconcludeerd, dat bovenstaand voorstel voor een randvoorwaarde voor ammonium te scherp is gesteld. Dit wordt wellicht veroorzaakt door de gehanteerde extrapolatie van een 3-daagse naar een 10-daagse test. Op basis van de praktijkmetingen worden daarom de volgende criteria voorgesteld. ph-waarde Criterium 7,0 <100 7,5 <100 8,0 <75 Sulfide 8,5 <25 Zoals vermeld kennen deze voorgestelde waarden de nodige onzekerheden. In de nabije toekomst zal daarom aanvullend experimenteel onderzoek naar deze randvoorwaarde worden uitgevoerd. De toxiciteit van sulfide voor Corophium werd onder andere vastgesteld middels driedaagse waterfase testen (AquaSense, 1995). Het constant houden van de sulfide concentratie en tegelijkertijd het op peil houden van de zuurstofconcentratie bleek echter niet te kunnen. Er is daarom allereerst een concentratie reeks met sulfide gemaakt onder anaerobe condities. Bij het inzetten van de dieren werd vervolgens de zuurstofconcentratie omhoog gebracht middels perslucht. Daarmee begint ook direct de oxidatie van sulfide richting sulfaat. Na 24 uur bleek deze oxidatie vrijwel compleet te zijn. Bij het uitwerken is gewerkt met de actuele concentraties op t=0. Daarnaast bleek, dat een deel van de effecten (vooral bij hoge sulfide concentraties) waarschijnlijk door optredend zuurstofgebrek werden veroorzaakt. De hieronder weergegeven data moeten daarom als indicatief worden beschouwd. Aan de andere kant valt een probleem met sulfide in de praktijk niet snel te verwachten, aangezien de testsystemen reeds 24 uur van te voren worden belucht, waardoor eventueel sulfide reeds geoxydeerd zal zijn, voordat de dieren worden toegevoegd. ph-waarde NOEC (3 dagen) mg/l sulfide Criteria -10 daagse test mg/l sulfide 7,5 0, : De eerste effecten werden pas bij 5 mg/l aangetoond. Ook Meadows (1981) heeft de toxiciteit van sulfide op Corophium volutator bestudeerd. Uit deze studie bleek dat Corophium zich minder begon in te graven bij poriewater concentraties van 18 mg/l. Poriewater met een concentratie van 2 mg/l had echter geen effect op het ingraafgedrag. In deze experimenten was de blootstellingsperiode echter slechts 1 uur, waardoor de vertaling van deze resultaten naar de standaard bioassay bemoeilijkt wordt. Daarnaast blijkt uit intern AquaSense 10

13 Saliniteit AquaSense onderzoek, dat concentraties in de ordegrootte van enkele tientallen mg TDS/l poriewater (kleiner dan circa 50 mg/l) geen negatief effect op Corophium veroorzaken. Bij de uitvoering van bioassays zal sulfide na 24 uur acclimatisatie uit de waterfase verdwenen zijn. In de anaerobe laag van het sediment kan sulfide echter blijven voorkomen. Völckel (1995) geeft sulfide concentraties tot 8 mg/l in het intergetijdegebied. Voor Corophium kan, uitgaande van de resultaten van AquaSense (1995) en Meadows (1981), een maximaal toelaatbare concentratie van 2 mg/l in het bovenstaande water gebruikt worden. Vermoedelijk zal deze waarde iets verhoogd kunnen worden voor een ph van 8, daar deze waarde werd vastgesteld bij een ph van 7,5 en sulfide bij oplopende ph minder toxisch wordt. Schot (1995) heeft onderzoek gedaan naar de invloed van saliniteit op de resultaten van bioassays met sedimenten uit het Haringvliet. Zij kwam hierbij tot de conclusie, dat de toxiciteit van de sedimenten afnam naarmate de saliniteit toenam. Dit had deels te maken met verschillen in de biologische beschikbaarheid. Daarnaast werd ook de sterfte van Corophium op een referentiesediment onderzocht (Oesterput). Hieruit bleek, dat de sterfte (na 10 dagen) in alle gevallen onder de 20% bleef, maar dat deze bij de laagst geteste waarde (2 promille) iets hoger was (circa 18%) dan bij de hoogste waarde (32 promille, circa 5% sterfte). Dit betekent, dat de randvoorwaarde op >2 promille gezet kan worden, maar dat er, bij deze lage saliniteiten, rekening gehouden dient te worden met een iets hogere controle sterfte. Bij het in de praktijk uitvoeren van bioassays zal het belang van deze randvoorwaarde echter niet zo groot zijn, aangezien de test wordt uitgevoerd met volledig zeewater. Zelfs als van een zoet sediment gebruik gemaakt wordt, zal de saliniteit na toevoegen van de juiste hoeveelheid zeewater (ver) boven deze ondergrens van 2 promille liggen. In aanvulling hierop wordt door Ciarelli (1994) voorgesteld om een saliniteit tussen de 10 en 30 promille te gebruiken, alhoewel tevens wordt medegedeeld dat C. volutator een range van 2 tot 50 promille kan overleven (ruwe gegevens echter niet vermeld). Waarschijnlijk zijn deze gegevens afkomstig van onderzoek van McLusky (1967). Dit onderzoek wordt gerefereerd in Environmental Canada (1992), waarin wordt aangegeven dat C. volutator inderdaad instaat is om dergelijke saliniteiten te overleven. Daarnaast staat hier vermeld, dat de groei maximaal was bij 15 promille, en (slechts) enigszins lager bij 4 dan wel 31 promille. Onder de 4 promille begon de groei echter duidelijk af te nemen. Ook de zuurstofconsumptie bleek niet te veranderen bij een brede reeks aan saliniteiten (McLusky, 1969), maar experimenten gaven aan dat een saliniteitsrange van 10 tot 30 promille geprefereerd wordt (McLusky, 1970). Samengevat, als niet alleen de sterfte maar ook andere parameters of de algehele conditie van het organisme meegewogen worden bij het vaststellen van de randvoorwaarde, dan kan worden aanbevolen om als randvoorwaarde een range van >4 tot <40 promille aan te houden. Daarnaast valt te overwegen of naast deze randvoorwaarde ook grenzen gesteld moeten worden voor de maximale spreiding gedurende het experiment (bijv. + of - 2 promille). AquaSense 11

14 Echinocardium cordatum ph Zuurstofgehalte De ph tolerantie van Echinocardium cordatum is voor zover bekend nooit direct onderzocht. Wel is er in een studie met verschillende ph s gewerkt, waarbij de uitgevoerde blanco s informatie over de ph tolerantie geven. Dit betreft een studie naar een aantal randvoorwaarden voor Echinocardium, waarbij onder andere de gevoeligheid voor ammonium en nitriet bij verschillende ph s werd onderzocht (AquaSense, 1995). In deze studie varieerde de ph van 7,0 tot 9,0. Uit de resultaten blijkt, dat de sterfte van deze dieren (gedurende een driedaagse sediment test) niet werd beïnvloed door de ph range, maar dat er bij zowel ph=7,0 als ph=9,0 wel een effect op het heringraafgedrag van deze dieren aan het einde van de test kan worden waargenomen. Het effect bij ph=7 wordt waarschijnlijk direct door de ph veroorzaakt, terwijl ook een hogere gevoeligheid voor ammonium werd waargenomen in vergelijking met een ph van 7,5. Het effect bij een ph van 9 heeft waarschijnlijk niet zozeer te maken met de ph waarde, maar eerder met de hoge toxiciteit van ammonium. Een natuurlijk voorkomende concentratie van circa 3 mg/l blijkt al toxische effecten te veroorzaken. Voor bioassays met Echinocardium valt daarom aan te raden om als ph criterium voor de parameter heringraafgedrag 7,5 tot 8,5 te hanteren. In de praktijk wordt hier meestal aan voldaan aangezien bioassays met Echinocardium middels een doorstroomsysteem worden uitgevoerd, waardoor de ph meestal rond de 8 blijft. Wel dient echter opgemerkt te worden, dat het hier om driedaagse testen gaat. De extrapolatie van deze range naar tiendaagse sediment testen kan tot nu toe nog niet worden onderbouwd met experimentele data. De invloed van het zuurstofgehalte op Echinocardium cordatum is, voor zover bekend, nooit direct onderzocht. Wel zijn er experimenten uitgevoerd, waarbij de toxiciteit van ammonium bij verschillende zuurstofgehalten werd onderzocht (20, 40, 60 en 80%; AquaSense, 1995). Uit deze experimenten bleek dat alleen bij een zuurstofverzadiging van 20% een licht verhoogde sterfte werd waargenomen (circa 10%). Dit betrof echter waterfase testen. In sedimenttesten, die in hetzelfde onderzoek werden uitgevoerd, werd geen verhoogde sterfte bij 20% zuurstof waargenomen. Wellicht wordt dit verschil veroorzaakt door de extra stress die het afwezig zijn van een geschikt sediment veroorzaakt. Daarnaast werd in dit onderzoek waargenomen dat de dieren bij verlaagde zuurstof verzadigingspercentage (20 en 40%) een hogere gevoeligheid voor ammonium hadden. Wellicht is ook hier sprake van een stress op stress situatie. Tevens zijn er duidelijke effecten van de zuurstofspanning op de graafactiviteit van de dieren waar te nemen, vooral rond 20% verzadiging (AquaSense, 1995). Bij een verzadingingspercentage van 25-26% zijn alle dieren binnen een half uur in het sediment verdwenen. Na verloop van tijd daalde het zuurstofgehalte naar zo'n 20% en kwamen de dieren dichter naar het sediment oppervlak met hun AquaSense 12

15 Nitriet 'kuifstekels' boven het sediment. Daalt het zuurstofgehalte verder naar zo'n 15% dan komen de dieren boven maar blijven over het sediment heen kruipen. Daalt het zuurstofgehalte nog verder dan vertonen ze nog maar weinig activiteit. Beneden de 10% verzadiging wordt de toestand van de dieren kritiek, een korte periode van 7-9% zuurstof wordt nog overleefd, duurt dit echter langer dan een paar uur dan begint er sterfte op te treden. Wanneer het zuurstofpercentage weer bijgesteld wordt naar ongeveer 25% dan treden de verschijnselen in omgekeerde volgorde op, waarbij na circa 2 uur alle dieren weer ingegraven zijn. Bij een gemiddeld opgetreden zuurstofpercentage van 35% treedt geen sterfte op en blijven de dieren gedurende de test ingegraven. Ze lijken echter minder actief door het sediment te bewegen dan de dieren bij 60 en 80%. Aangezien het hier om driedaagse testen ging en het (her)ingraafgedrag als beoordelingsparameter wordt meegenomen in de bioassays, wordt aanbevolen om een extra zekerheid in te bouwen en de randvoorwaarde op 60% te stellen, met als opmerking dat een lichte onderschrijding waarschijnlijk geen negatieve invloed heeft. De toxiciteit van nitriet voor Echinocardium werd in driedaagse waterfase testen onderzocht bij verschillende ph-waarden (AquaSense, 1995). Uit deze gegevens bleek dat de toxiciteit bij oplopende ph (van 7 tot 9) duidelijk afnam. Tevens werd geconcludeerd, dat nitriet pas negatieve effecten veroorzaakt bij concentraties, die in een standaard bioassay niet snel zullen voorkomen. Hieronder zijn de gevonden NOEC-waarden weergegeven, als mede de te hanteren criteria voor een veertiendaagse test, die middels een extrapolatie verkregen werden. ph-waarde NOEC (3 dagen) mg/l nitriet sterfte NOEC (3 dagen) mg/l nitriet heringraafgedrag Criteria -14 daagse test mg/l nitriet 7, , ? 200 9,0 > : Resultaat van een range finding Ammonium Deze extrapolatie is gebaseerd op AquaSense (1994), waarin voor Corophium een LC 50 -waarde voor nitriet van 504 mg/l na drie dagen en een LC 50 -waarde van 254 mg/l na 10 dagen wordt vermeld. In hoeverre deze extrapolatie ook voor NOEC-waarden en/of voor Echinocardium geldt is echter niet bekend. In een door AquaSense uitgevoerd onderzoek (AquaSense, 1995) is de toxiciteit van ammonium bij verschillende ph-waarden onderzocht. De resultaten werden weergegeven als L(E)C 50 -waarden en NOECwaarden. Daarnaast dient vermeld te worden, dat er zowel waterfase als sediment testen zijn uitgevoerd, waarbij de dieren in beide gevallen gedurende drie dagen werden blootgesteld. Aangezien de dieren in de sediment testen er beter en minder gestresst uitzagen dan de dieren in de waterfase test wordt hieronder alleen aandacht aan de sediment testen besteed. In deze testen bleek er geen verhoogde sterfte als gevolg van de ammonium concentratie te zijn waargenomen. Wel waren er AquaSense 13

16 effecten op het heringraafgedrag op schoon, zandig sediment na afloop van de test (zie onderstaande tabel). ph-waarde NOEC (3 dagen) mg/l ammonium sterfte NOEC (3 dagen) mg/l ammonium heringraafgedrag Criteria -14 daagse test mg/l ammonium 7,0 > ,5 > ,0 > ,5 > ,0 > 28 1 < : Ligt waarschijnlijk slechts iets hoger dan deze waarde Sulfide 2 : Dit is de concentratie in de blanco, die bij deze ph ook een effect veroorzaakte De hierbij gebruikte extrapolatie factor is gebaseerd op AquaSense (1994), waarin voor Corophium een tiendaagse LC 50 -waarde werd gevonden die op 40% van de driedaagse waarde lag. In hoeverre deze extrapolatie ook voor NOEC-waarden en/of voor Echinocardium geldt is echter niet bekend. Verder dient opgemerkt te worden, dat er aanwijzingen zijn gevonden (AquaSense, 1995), dat de toxiciteit niet volledig door ammoniak (NH 3 ) werd veroorzaakt zoals vaak wordt aangenomen, maar dat (zeker bij ph waarden onder de 8) ook ammonium (NH 4 + ) een toxisch effect kan veroorzaken. Omdat er in dit onderzoek werd gekeken naar effecten op het heringraafgedrag van Echinocardium waren de geteste concentraties te laag om een verhoogde sterfte te veroorzaken. De toxiciteit van sulfide voor Echinocardium werd vastgesteld middels driedaagse testen (AquaSense, 1995). Het constant houden van de sulfide concentratie en tegelijkertijd het op peil houden van de zuurstofconcentratie bleek echter niet te kunnen. Er is daarom allereerst een concentratie reeks met sulfide gemaakt onder anaerobe condities. Bij het inzetten van de dieren werd vervolgens de zuurstofconcentratie omhoog gebracht middels perslucht. Daarmee begint ook direct de oxidatie van sulfide richting sulfaat. Na 24 uur bleek deze oxidatie compleet te zijn. Bij het uitwerken is gewerkt met de actuele concentraties op t=0. Daarnaast bleek, dat een deel van de effecten (vooral bij hoge sulfide concentraties) waarschijnlijk door optredend zuurstofgebrek werden veroorzaakt. De hieronder weergegeven data moeten daarom als indicatief worden beschouwd. Aan de andere kant valt, juist door deze snelle oxidatie, een probleem met sulfide in de praktijk niet of nauwelijks te verwachtten. ph-waarde NOEC (3 dagen) mg/l sulfide Criteria -14 daagse test mg/l sulfide 7, : De eerste effecten werden pas bij 50 mg/l aangetoond. AquaSense 14

17 Saliniteit In verband met de snelle oxidatie van sulfide zijn de experimentele gegevens voor de driedaagse testen ook gehanteerd als voorlopige randvoorwaarde voor langdurige testen (AquaSense, 1995). Alleen in het geval van zeer slibrijke sediment monsters kan het zo zijn, dat een zekere hoeveelheid sulfide gedurende de gehele test aanwezig is. Om de eventuele effecten hiervan vast te stellen, is echter aanvullend onderzoek met sediment systemen noodzakelijk. Over de gevoeligheid van zeeklitten voor verschillen in het zoutgehalte zijn geen directe gegevens gevonden. De randvoorwaarde van 28 promille is gebaseerd op het PARCOM protocol. De achterliggende experimentele gegevens konden echter niet achterhaald worden. Hetzelfde geldt voor de maximale waarde van 36 promille, zoals die tot nu toe was opgenomen in de RIKZ SOP. Op dit ogenblik lijkt het daarom alleen mogelijk om als randvoorwaarde te hanteren, dat de saliniteit in het bovenstaande water tijdens de test groter dan 28 promille moet zijn. Aanvullend onderzoek is dan ook wenselijk. Bij het in de praktijk uitvoeren van de bioassay zal de invloed van deze randvoorwaarde echter niet zo groot zijn. Aangezien de test wordt uitgevoerd met volledig zeewater, kunnen ook sedimenten met een saliniteit, die lager is dan 28, goed getest worden. AquaSense 15

18 4. Randvoorwaarden criteria In dit hoofdstuk worden voorstellen gedaan voor de te hanteren randvoorwaarden. Deze voorstellen zijn samengevat in onderstaande tabel. De gegevens uit het voorgaande hoofdstuk zijn hiertoe geïntegreerd. Verder dient vermeld te worden, dat tenzij anders vermeld, de concentraties ammonium betrekking hebben op het totaal gehalte, dat wil zeggen de som van ammonium (NH 4 + ) en ammoniak (NH 3 ). Bij het voorstellen van randvoorwaarden voor sulfide (gemeten als Total Dissolved Sulfide) dient gerealiseerd te worden, dat ook de toxiciteit voor sulfide afhankelijk is van de ph waarde. Over deze relatie is echter te weinig bekend, waardoor op dit ogenblik geen gedifferentieerde randvoorwaarden kunnen worden voorgesteld. Indien in de toekomst meer inzicht in de toxiciteit van sulfide verkregen wordt zouden de randvoorwaarde wellicht wel naar ph waarden gedifferentieerd moeten worden. AquaSense 16

19 Tabel. Voorstel tot criteria voor randvoorwaarden in mariene bioassays (afkomstig uit Postma et al., in prep) Als er geen opmerkingen bij staan voor wat betreft de ph, temperatuur of saliniteit, dan werden de experimenten uitgevoerd onder de voor die test geldende standaard condities. Criteria die zijn berekend op basis van andere waarden zijn schuin gedrukt weergegeven. Soort ph O 2 NO 2 - NH NH 3 sulfide 1 Cl - geleidbaarheid saliniteit (% sat.) (mg/l) (ph) (mg/l) ( C, ph, sal) (mg/l) (g/l) (µs/mm) ( ) Vibrio fischeri >30 p <70 <1000 (15,8,32) <3.3 <20 < Corophium volutator 7-9 >50 p <30 p (7.0) <200 p (8.0) <200 p (9.0) <100 p (15,7.0,32) <100 p (15,7.5,32) <75 p (15,8.0,32) <25 p (15,8.5,32) <2 e Echinocardium cordatum p >60 p <50 p (7.0) <200 p (8.0) <200 p (9.0) <25 p (15,7.5,32) <15 p (15,8.0,32) <5 p (15,8.5,32) -: geen gegevens beschikbaar; n.r.: niet relevant; e : eerste ruwe schatting; p : voorlopige waarde <5 e >16 p >3500 p >28 p 1 : concentration weergegeven als totaal sulfide; 2 : criteria hebben betrekking op de waarden in het actuele testsysteem met uitzondering van de ph. Afhankelijk van de verdunningsfactoren kunnen deze waarden worden omgerekend naar waarden geldend voor bijvoorbeeld onverdund poriewater; 17

20 Een laatste opmerking betreft het medium waarin de randvoorwaarden worden gemeten. Voor de Microtox SP is dit het onverdunde poriewater, terwijl bij testen met Corophium en Echinocardium in het bovenstaande water wordt gemeten. Dit leidt tot de vraag aan welke waarden van de genoemde randvoorwaarden parameters de proefdieren werkelijk blootgesteld worden. Zijn dat de waarden zoals die voorkomen in het bovenstaande water of liggen deze dichter bij de waarden van het poriewater? Bij Echinocardium is bij een vorig project al eens het water in de leefruimte van het dier bemonsterd en doorgemeten; het ammoniumgehalte bleek verhoogd t.o.v het bovenstaande water. In de leefruimte werd 4,5 mg/l ammonium gemeten, terwijl in het bovenstaande, doorstroomde zeewater slechts 0,15 mg/l aanwezig was. Dit geeft aan dat de blootstelling van opgeloste stoffen uit het sediment waarschijnlijk hoger is dan in het bovenstaande water van een testsysteem wordt gemeten. De huidige criteria waar de randvoorwaarden van een bioassay aan moet voldoen worden gemeten in het bovenstaande water en geven daarmee wellicht niet de juiste waarde voor de daadwerkelijke blootstelling van het dier. Tot slot Naar aanleiding van bovenstaande tabel kunnen ter afronding nog een tweetal algemene opmerkingen gemaakt worden. De voorgestelde randvoorwaarden voor nitriet zijn voor alle bioassays zo hoog, dat deze in de praktijk waarschijnlijk nooit overschreden zullen worden bij het uitvoeren van bioassays met sedimentmonsters. Het meten van deze randvoorwaarde zou daarom achterwege kunnen blijven. Verhoogde sulfide concentraties worden eigenlijk alleen in (anaeroob) poriewater aangetroffen. Zodra het testsysteem belucht wordt zal sulfide oxyderen en verdwijnen. Het meten van sulfide is daarom vooral zinvol voor de Microtox SP, omdat deze test direct na het maken van het testsysteem wordt uitgevoerd, waardoor er onvoldoende tijd verstreken kan zijn om alle sulfide te laten oxyderen. Het meten van sulfide in het bovenstaande water van de Corophium en/of Echinocardium test lijkt weinig zinvol. Dat wil niet zeggen dat sulfide in dergelijke testsystemen niet toxisch kan zijn, maar dan zou naar de concentraties in het poriewater gekeken moeten worden en daarover bestaat op dit ogenblik te weinig inzicht om reeds nu tot een goede randvoorwaarde te komen. AquaSense 18

21 5. Literatuur AquaSense (1994). Ontwikkeling van een chronische sediment toxiciteitstoets voor de amphipode Corophium volutator. Stageverslag J.J. Snijder, maart AquaSense (1995). De toxiciteit van ammonium, nitriet en sulfide voor Corophium en Echinocardium o.i.v. het zuurstofgehalte en de ph. In opdracht van: Rijksinstituut voor Kust en Zee. Rapportnr AquaSense (1997). De biobeschikbaarheid van zeldzame aardmetalen voor Corophium volutator. In opdracht van: Rijksinstituut voor Kust en Zee. Rapportnr AquaSense (1998). Randvoorwaardenonderzoek acute toxiciteitstesten. In opdracht van: Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer en Afvalwaterbehandeling (RIZA). Rapportnr American Society for Testing and Materials E 1367 (1999). Standard guide for conducting 10-day static sediment toxicity tests with marine and estuarine amphipods. In 1999 Annual Book of ASTM Standards. Vol , ASTM E : Bulich, A.A., Greene, M.W., Isenberg, D.L. (1981). Reliability of the bacterial luminescence assay for determination of the toxicity of pure compounds and complex effluents. In: Pearson, J.G., Foster, R.B., Bishop, W.E. (Eds.), Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fourth conference, American Society for Testing and Materials, ASTM STP 766, Ciarelli, S. (1994). Guideline for conducting 10-day static sediment toxicity tests using marine or estuarine amphipods. Report RIKZ Environment Canada (1992). Biological test method: Acute test for sediment toxicity using marine or estuarine amphipods. Environmental Protection Series. Report nr. EPS 1/RM/26. Kaiser, K.L.E. en J. Devillers (1985). Ecotoxicity of chemicals to Photobacterium phosphoreum. Gordon and Beach Sciene Publishers. 879 pp. McLusky, D.S. (1967). Some effects of salinity on the survival, moulting and growth of Corophium volutator (Amphipoda). J. Mar. Biol. Ass. U.K. 47: McLusky, D.S. (1969). The oxygen consumption of Corophium volutator in relation to salinity. Comp. Biochem. Physiol. 29: McLusky, D.S. (1970). Salinity preference in Corophium volutator. J. Mar. Biol. Ass. U.K. 50: AquaSense 19

22 Meadows, P.S., E.A. Deans and J.G. Anderson (1981). Responses of Corophium volutator to sediment sulphide. J. Mar. Biol. Ass. 61: NVN 6516 (1993). Water - Bepaling van de acute toxiciteit met behulp van Photobacterium phosphoreum. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft, augustus Postma, J.F., S. de Valk, M. Dubbeldam, J.L. Maas, M. Tonkes, C.A. Schipper and B.J. Kater (2000) in prep. Confounding factors in bioassays with freshwater and marine organisms. Schipper, C.A. en J. Stronkhorst (1999). RIKZ Handboek. Toxiciteitstesten voor Zoute Baggerspecie. RIKZ rapport nr Schot, M.E. (1995). Rapportage van mariene sediment bio-assays met de amphipode Corophium volutator uitgevoerd in het kader van de Milieu Effect Rapportage (MER) Haringvliet. Werkdocument RIKZ, RIKZ\OS X. Schot, M.E., M. Dubbeldam, J. Stronkhorst, P. Schout, J. Postma en W. Vonck (1997). Identificatie van de toxiciteit in poriewater van Nederlandse haven sedimenten volgens de mariene TIE methode met Corophium volutator, Mysidopsis bahia, Psammechinus miliaris en Photobacterium phosphoreum. RIKZ werkdocument, RIKZ/AB X. Deel 1, tekst 102 pp. Schot, M.E. en C.A. Schipper (1998). Validatierapport Microtox Solid Phase. Werkdocument RIKZ/IT X. Stronkhorst, J., J.L. Maas, C. van de Guchte, J. Hartnack, J.M. Lourens en A.P.M.A. Vonck (1997). Baggerspecie, meer of minder schadelijk. FWVO nota pp. Völckel, S., et al., (1995). Sulphide stress and tolerance in the lugworm Arenicola marina during low tide. Mar. Ecol. Prog. Ser. 122: AquaSense 20