Directoraat -Generaal Rijkswaterstaat. Trefwoorden: Amphipode, Hyalella azteca, sediment, toxiciteit, mortaliteit, lengte

Transcriptie

1 Ministerie van Verkeer en Waterstaat Directoraat -Generaal Rijkswaterstaat Rijksinstituut voor Kust en Zee/RIKZ Standaardvoorschrift Sediment toxiciteitstest met Hyalella azteca Trefwoorden: Amphipode, Hyalella azteca, sediment, toxiciteit, mortaliteit, lengte Inhoud 1. Onderwerp Toepassingsgebied Termen en definities Principe van de methode Reagentia en hulpstoffen Apparatuur en hulpmiddelen Monstername Werkwijze Voorzorgsmaatregelen Voorbehandeling van sediment Inzetten van de bioassay Voeren Periodieke controle Afbreken test Referentietoxicant Uitvoering kwaliteitstest met Kaliumchloride Randvoorwaarden Identificering en Kwantificering Germiddelde sterfte in de bioassay Gemiddelde lengte in de bioassay Berekening significante verschillen LC 50 waarde van de referentietoxicant Kentallen Rapportage Kwaliteitszorg Veiligheid Literatuur Bijlagen...10 Pagina nr. 1 van16 pagina's

2 1. Onderwerp Dit voorschrift beschrijft de methode voor het uitvoeren van de sedimenttoxiciteitstest met de epibenthische amphipode Hyalella azteca. In deze bioassay worden organismen blootgesteld aan mogelijk gecontamineerde sedimenten, waarbij lengte en mortaliteit als eindpunt worden gemeten. 2. Toepassingsgebied Met behulp van dit standaard voorschrift kan de toxiciteit van sediment worden bepaald uit het zoet- en brakwater milieu met een saliniteit tot circa 10 promille. 3. Termen en definities Controlesediment : Negatieve controle genoemd. Sediment dat dient als controle op de respons van de testorganismen. LC 50 : Lethal concentration. De concentratie van een toxicant waarbij 50% van de testorganismen dood gaat binnen een bepaalde blootstellingsduur. Mortaliteit : Sterfte van het testorganisme. De mortaliteit wordt meestal uitgedrukt in percentage ten opzichte van de inzet. Randvoorwaarden : Binnen de experimentele situatie geldende afgebakende grenzen voor saliniteit, temperatuur, ph, zuurstofgehalte, nitriet en ammonium, waarbinnen wordt verwacht dat geen negatieve effecten optreden als gevolg van deze parameters. Referentietoxicant : Toxische stof waarmee de gevoeligheid van de gebruikte testorganismen wordt vastgesteld. Sediment contaminatie : Vervuiling van sediment met zware metalen en/of organische microverontreinigingen. Pagina nr. 2 van16 pagina's

3 4. Principe van de methode In de bioassay worden Hyalella azteca organismen gedurende 10 dagen blootgesteld aan al dan niet gecontamineerde veldsedimenten. De toxiciteit van het sediment wordt vastgesteld op basis van de mortaliteit en de lengte. De resultaten van het gecontamineerde sediment worden vergeleken met de resultaten van controlesediment. 5. Reagentia en hulpstoffen 5.1 Dutch Standard Water (DSW), voor de samenstelling zie bijlage Hyalella azteca (gekweekt of bestellen bij een leverancier); leeftijd voor inzetten: 10 ± 2 dagen oud (leeftijdsverschil 2 dagen) 5.3 Schoon 500 µm gezeefd sediment (Drontermeer slib of speelzand; speelzand hoeft niet gezeefd voor gebruik) 5.4 Voersuspensie (Yeast Cerophyll Trout), voor de samenstelling zie bijlage Kaliumchloride 5.6 Ammoniumtest 5.7 Nitriettest 6. Apparatuur en hulpmiddelen 6.1 Klimaatruimte (23 ºC ± 2 ºC en 16 uur licht/8 uur donker) 6.2 Beluchtingsinstallatie 6.3 Glazen potten (200 ml) 6.4 Menginstallatie sedimentmonsters (RVS-mengers) 6.5 ph meter 6.6 Zuurstof/Temperatuur meter 6.7 Geleidbaarheidsmeter 6.8 Bovenweger 6.9 Zuigbuis 6.10 Zeef (220 en 500 µm) 6.11 NITEX-gaas 6.12 Aluminiumbakje 6.13 Droogstoof 6.14 Microscoop Pagina nr. 3 van16 pagina's

4 7. Monstername Voor de bemonstering dient gebruik te worden gemaakt van een geschikte richtlijn voor de bemonstering van zoetwater en/of brakke sedimenten. De uitvoering van de bioassay met Hyalella azteca vereist per monster circa ½ liter sediment. 8. Werkwijze 8.1 Voorzorgsmaatregelen Gebruik handschoenen en laboratoriumjas tijdens de uitvoering van de experimenten. Zie ook hoofdstuk 13 Veiligheid. 8.2 Voorbehandeling van sediment Het sediment wordt opgeslagen in het donker bij 4 ± 2 C Homogeniseer het sediment, bijvoorbeeld met een sedimentmixer Het sediment wordt gezeefd over een 500 µm zeef om grove delen en eventuele andere organismen te verwijderen. Indien het sediment te zandig is wordt gezeefd over 1000 µm. 8.3 Inzetten van de bioassay Bereid sediment/watermengsels Codeer per monster vijf 200 ml potjes (diameter 6 cm) met de monstercode en replicanr. (A t/m E). Weeg 30 gram sediment (circa 1,5 cm) af per potje. Giet vervolgens voorzichtig 120 ml DSW medium op het sediment zodanig dat het sediment zo min mogelijk mengt met het medium. Zet met viltstift een streep op het waterniveau. Sluit de potjes af met een deksel en plaats de sediment/watersystemen in de koeling tot 1 dag voor gebruik Maak per maximaal 5 monsters van één type sediment een referentiesediment: zand en/of slibhoudend zand een zandreferentie zanderig slib een zand- en een slibreferentie zandhoudend slib en/of slib een slibreferentie Meet de volgende randvoorwaarden in het bovenstaande water (1 potje per monster/referentie): zuurstof, ph, geleidbaarheid, ammonium, nitriet. Noteer de gemeten waarden op het randvoorwaardenformulier (bijlage 5). Indien er overschrijdingen plaats vinden, neem dan contact op met de projektleider. Belucht het sediment/watersysteem indien O 2 te laag is. Pagina nr. 4 van16 pagina's

5 8.3.5 Zet random 20 dieren per sediment/watersysteem in. Gebruik juvenielen van 10 ± 2 dagen oud (leeftijdsverschil 0 tot 2 dagen). Hiervoor kan het best gebruik gemaakt worden van een zuigbuis Maak een YCT-voersuspensie (zie bijlage 2) en voer met 1 ml voersuspensie per potje Plaats de potjes in de testruimte (23 ºC ± 2 ºC en 16 uur licht/8 uur donker). Dek ze, niet luchtdicht, af met een doorzichtige plaat Bepaal de lengte van minimaal 20 dieren op t=0 dagen met behulp van een microscoop. De lengte wordt gemeten van de basis van de derde uropode tot de basis van de eerste antenne. 8.4 Voeren Dagelijks (werkdagen) worden de organismen gevoerd met 1 ml YCT-voersuspensie per testsysteem. 8.5 Periodieke controle Controleer regelmatig de zuurstofconcentratie van enkele sediment/watersystemen. Indien het zuurstofniveau onder 60% daalt de potjes dagelijks 10 minuten beluchten, dan wel continu beluchten (afhankelijk van het zuurstofgehalte). Controleer regelmatig de verdamping. Voeg demiwater toe indien er zichtbaar verdamping is opgetreden. 8.6 Afbreken test Breek de test af na 10 dagen Meet de randvoorwaarden (bij testtemperatuur) en vul in op het formulier Spoel boven een plastic bak de inhoud van de vaatjes over een 220 µm zeef en vervolgens in een grote glazen petrischaal. Zorg dat er geen water door de gootsteen wordt gespoeld! Plaats de petrischaal op een lichtbak. Noteer het aantal teruggevonden amphipoden op het scoreformulier Bepaal de lengte van de dieren op t = 10 dagen met behulp van een microscoop. De lengte wordt gemeten van de basis van de derde uropode tot de basis van de eerste antenne. 8.7 Referentietoxicant Door middel van een referentietoxicant wordt de gevoeligheid van de testorganismen gecontroleerd. Deze kwaliteitstest wordt periodiek uitgevoerd indien een kweek wordt Pagina nr. 5 van16 pagina's

6 onderhouden of per batch organismen indien de dieren bij een leverancier besteld worden. Deze controle omvat een 4-daagse waterfasetest met de stof kaliumchloride. 8.8 Uitvoering kwaliteitstest met Kaliumchloride De kwaliteitstest wordt uitgevoerd door Hyalella azteca gedurende 96 uur bloot te stellen aan verschillende concentraties kaliumchloride. Dit kan gedaan worden door bijvoorbeeld een stockoplossing van 1 g/l aan te maken in DSW en dit door te verdunnen tot de volgende concentratiereeks: mg/l Deze waterfase test wordt uitgevoerd met 100 ml oplossing in een glazen 200 ml potje (in drievoud). In ieder testsysteem worden 10 amphipoden (10 ± 2 dagen oud) geplaatst met behulp van een zuigbuis. Daarnaast wordt aan ieder systeem een stukje NITEX-gaas (ca 1 x 1 cm) toegevoegd dat dient als vervanging voor sediment. De dieren worden gedurende 96 uur bloot gesteld bij 23 ºC ± 2 ºC en 16 uur licht/8 uur donker. Meet voor het inzetten en uithalen van de test het zuurstofgehalte, ph en geleidbaarheid in de blanco en de hoogste testconcentratie. De dieren worden op dag 0 en 2 gevoerd met 1 ml YCT per testvat. Tel na 96 uur het aantal overlevende H. azteca per testvat. Het overlevingspercentage dient in de controle 90% te zijn. Bepaal op basis van de overleving de 96h- LC 50 waarde De 96h-LC 50 waarde dient te liggen in de range: mg KCl /l (ASTM, 1995) N.B. Range opgesteld voor Borgmann medium. Dit heeft een hardheid die ongeveer met de hardheid van DSW overeenkomt. 8.9 Randvoorwaarden De parameters die gemeten worden in het bovenstaande water van de sediment/watersystemen en van het referentietoxicant moeten gedurende de blootstellingsperiode binnen de volgende grenzen blijven: Temperatuur: 23 ºC ± 2 ºC Geleidbaarheid: < 10 1 Zuurstof: > 60 % verzadiging Licht: 16 uur licht/8 uur donker ph: 5 8,5 Pagina nr. 6 van16 pagina's

7 Ammonium: <130mg/l (ph 6,5) < 90 mg/l (ph 7,5) < 15 mg/l (ph 8,0) Nitriet: < 25 mg/l (overleving) 1 indien langzaam wordt geacclimatiseerd wellicht te verhogen tot ± 15 en natuurlijk niet van toepassing voor de referentietest met KCl. 9. Identificering en Kwantificering 9.1 Germiddelde sterfte in de bioassay Het percentage sterfte wordt berekend door per sediment het aantal dode organismen te delen op het aantal ingezette organismen en te vermenigvuldigen met 100. De resultaten van de verschillende replica s worden gemiddeld tot 1 waarde. 9.2 Gemiddelde lengte in de bioassay De gemiddelde lengte wordt berekend op basis van de lengte van de individuele dieren. 9.3 Berekening significante verschillen Met behulp van de ANOVA- en de post-hoc Bonferoni T-test wordt getoetst of de waarnemingen voor één van de volgende parameters significant (P 0,05) verschilt van de referentie: gemiddelde sterfte lengte van de testorganismen. Hierbij wordt aanbevolen om gebruik te maken van het SPSS-softwarepakket. Indien niet aan de voorwaarden voor parametrische testen wordt voldaan, worden de gegevens loggetransformeerd. Indien ook na transformatie niet kan worden voldaan aan de randvoorwaarden voor het mogen uitvoeren van parametrische testen, wordt gebruik gemaakt van de verdelingsvrije (niet-parametrische) Kruskal-Wallis test. Voor de toekomst valt het aan te raden om ook voor dit organisme een statistische analyse op basis van de binomiaal verdeling op te stellen. 9.4 LC 50 waarde van de referentietoxicant Voor de berekening van de LC 50 wordt de trimmed Spearman-Karber methode gebruikt. Voor deze methode zijn verschillende softwarepakketten voorhanden. Het aanbevolen softwarepakket is TOXCALC. Pagina nr. 7 van16 pagina's

8 10. Kentallen Bij de rapportage van de Hyalella azteca data worden ook de prestatie kenmerken van de analyse weergegeven in een analysekarakteristiek (voorbeeld bijlage 3). 11. Rapportage De volgende informatie dient te worden gerapporteerd: Analysekarakteristiek De mortaliteit van het testorganisme na blootstelling aan het sediment De groei van het testorganisme na blootstelling aan het sediment Gemeten randvoorwaarden parameters 12. Kwaliteitszorg Om de kwaliteit van de Hyalella azteca analyse te kunnen waarborgen dient de assay te voldoen aan de volgende kwaliteitscriteria: 1. Controlesediment 20% sterfte 2. Controle kwaliteitstest 10% sterfte (waterfasetest) 3 Referentietoxicant mg KCl /l 13. Veiligheid 13.1 N.B. Hyalella azteca is een uitheemse diersoort, die voorkomt in Noord en midden Amerika. Om met een uitheemse soort te mogen werken is een ontheffing nodig voor de flora en fauna wet en dient het uitvoerende laboratorium de nodige voorzorgsmaatregelen te nemen om introductie van deze uitheemse organismen in het Nederlandse milieu te voorkomen. Voor het uitvoeren van de sediment toxiciteitstest met Hyalella azteca dienen de volgende voorzorgsmaatregelen te worden genomen: 13.2 De overgebleven testorganismen na het inzetten van de toxiciteitstest en het gebruikte water dienen in een plastic pot te worden verzameld en vervolgens minimaal 24 uur in een vriezer bij 20 C geplaatst. Al het gebruikte glaswerk zoals de zuigbuizen, grote en kleine petrischalen dienen gedurende 2 uur in een stoof van 100 C te worden geplaatst om alle eventueel aanwezige dieren te doden. Pagina nr. 8 van16 pagina's

9 13.3 Aan het einde van de toxiciteitstest dient men bij het meten van de randvoorwaarden goed op te letten dat er geen dieren aan de meters plakken, de meters veelvuldig af te spoelen en dit water op te vangen De sedimentwatersystemen dienen boven een grote plastic bak over een 220 µm zeef uitgespoeld te worden. Hierbij zal zo min mogelijk kraanwater worden gebruikt en zal geprobeerd worden om zoveel mogelijk te spoelen met het water dat reeds in de plastic bak is verzameld. Dit in tegenstelling tot toxiciteitstesten met inheemse toetsdieren waarbij de sedimentwatersystemen boven de gootsteen worden gezeefd met een ruime hoeveelheid kraanwater. Al het water (inclusief het water dat is gebruikt voor het spoelen van de randvoorwaardenmeters) zal uiteindelijk worden verzameld in plastic vaten en vervolgens minimaal 48 uur in een vriezer bij 20 C geplaatst worden. De plastic bak met eventueel achtergebleven restanten van het sediment zal ook in de vriezer worden gezet. Nadat het water en sediment ingevroren is geweest kan het water worden weggespoeld en zal het sediment in een emmer worden afgevoerd als chemisch afval, waarbij het zal worden verbrand. Indien geen groeimetingen worden uitgevoerd zullen ook alle testorganismen verzameld worden en in de vriezer worden gedood Al het tijdens de toxiciteitstest gebruikte glaswerk, zoals de testvaten, zuigbuizen en petrischalen, zal minimaal twee uur in een stoof van 100 C worden geplaatst om alle eventueel aanwezige dieren te doden. Vervolgens zal het glaswerk in het zuurbad worden geplaatst en dezelfde behandeling krijgen als het overige laboratoriumglaswerk Dragen van labjas en handschoenen is tijdens de uitvoering van de toxiciteitstest met sediment en het referentietoxicant verplicht Verontreinigd sediment wordt als chemisch afval beschouwd en als zodanig afgevoerd. Pagina nr. 9 van16 pagina's

10 14. Literatuur 1. American Society for Testing and Materials (1995). Standard test methods for measuring the toxicity of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. E b. In: Annual Book of ASTM Standards, Vol 11.05, Philadelphia, PA, pp NPR 6503 (1980). Water. Benodigdheden, werkwijze en medium voor het kweken van Daphnia magna en van de hiervoor als voedsel benodigde algen 3. U.S. Environmental Protection Agency (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/094. Duluth, MN 15. Bijlagen Bijlage 1. Samenstelling Dutch Standard Water Bijlage 2. Samenstelling Yeast Cerophyll Trout (YCT) Bijlage 3. Voorbeeld van een analysekarakteristiek Bijlage 4. Scoreformulier voor de 10-daagse sedimenttest Bijlage 5. Randvoorwaardenformulier Bijlage 1. Samenstelling Dutch Standard Water (DSW) Pagina nr. 10 van16 pagina's

11 Stof Stock (g) Medium (ml) oplossen per liter Demiwater toevoegen per 25 liter Demiwater stockoplossing I: CaCl 2.2H 2 O stockoplossing II: MgSO 4.7H 2 O stockoplossing III: NaHCO KHCO 3 10 De stockoplossingen zijn gekoeld 12 maanden houdbaar en bij kamertemperatuur 6 maanden. Het DSW medium behoudt gedurende 1 maand dezelfde samenstelling. Het DSW medium dient continue te worden doorborreld met tevoren door watten en actieve kool gefiltreerde en met water verzadigde lucht. Na aanmaak en beluchting (min. 1 uur) dient de ph van het medium gemeten te worden (± 8,4). Pagina nr. 11 van16 pagina's

12 Bijlage 2. Bereiding voersuspensie Yeast Cerophyll Trout (YCT) Verteerde trouvit (Trout Chow) suspensie (1 week bereidingstijd) Weeg, in een glazen infuusfles, 5,0 gram gemalen (maalmolen) trouvit af en voeg 1 liter demiwater toe. Voeg een roermagneet toe en plaats een schroefdop met beluchtingsmogelijkheid (slang met glazen buis) op de fles. Zet de fles op een roermotor in een zuurkast (licht uit) en sluit perslucht via een gas/wasfles aan op de dop. Belucht en roer continue. Decanteer, na bezinking (1 uur), de bovenstaande vloeistof af. De oplossing dient een week onder de bovengenoemde condities te worden gehouden. De oplossing is na bereiding maximaal twee weken houdbaar in de koelkast. Gistsuspensie Weeg, in een bekerglas, 5,0 gram droog bakkergist (bv. dr. Oetker) af en voeg hieraan 1 liter demi water toe. Roer met behulp van een roermotor en magneet zolang, dat de gist goed is verdeeld. De oplossing is na bereiding maximaal twee weken houdbaar in de koelkast. Konijnenvoer suspensie (Cerophyll), bereidingstijd 1 dag Weeg, in een bekerglas, 5,0 gram gemalen (maalmolen) konijnenvoer af en voeg hieraan 1 liter demi water toe. Roer de suspensie, met behulp van een roermotor en magneet, gedurende een avond en een nacht. Laat de ontstane suspensie ongeveer 1 uur bezinken. De oplossing is na bereiding maximaal twee weken houdbaar in de koelkast. Samenstelling YCT Laat de suspensies van de verteerde trouvit, gist en het konijnenvoer gedurende 1 uur bezinken. Schenk de bovenstaande vloeistoffen af. Voeg gelijke volumes van de nabehandelde suspensies bij elkaar en meng goed. Vul plastic potjes met ongeveer 250 ml YCT en bewaar de potjes voor maximaal drie maanden in de vriezer. Een voedselcontrole kan worden uitgevoerd door het drooggewicht te bepalen van YCT. Dit zou 1,7 tot 1,9 g/l moeten zijn. Pagina nr. 12 van16 pagina's

13 Bijlage 3. Voorbeeld van analysekarakteristiek Hyalella azteca 01 Test Matrix Sediment 02 Analysevoorschrift Nummer: Versie: Datum:: 03 Testcode 04 Beginsel van de methode 05 Monster opslagtemp. ºC 06 Monsteropslagtijd dagen 07 Meetbereik % mortaliteit 08 Detectiegrens % mortaliteit 09 Afrondingsgrens % 10 Herhaalbaarheid (%r = 2 2 * CV * %) Sediment toets: % Waterfasetest met KCl: % 11 Reproduceerbaarheid 12 Referentietoxicant 13 Controlesediment 14 Controlekaarten Shewartkaart van referentietoxicant KCl 15 1 e lijn controle Controlekaart: 2 e lijn controle Gecertificeerd sediment: 3 e lijn controle Ringonderzoek: 16 Storende componenten Pagina nr. 13 van16 pagina's

14 Bijlage 4. Scoreformulier voor de 10-daagse sedimenttest project Inzetdatum: weeg- Monstercode Aantal Aantal Lengte van individuele dieren cupje D0 D10 A B C D E A B C D E A B C D E A B C D E A B C D E Pagina nr. 14 van16 pagina's

15 Bijlage 5. Randvoorwaardentabel: toxiciteit Hyalella azteca inzetdatum: Projekt: Monster: nr. 1: nr. 2: nr. 3: nr. 4: nr. 5: nr. 6: nr. 7: nr. 8: nr. 9: nr.10: ref 1: ref 2: Monster Tijdstip O 2 ph Temp Geleidbaarheid NO 2 - NH4 + + NH 3 Opmerkingen/ dagen % C mg/l (mg/l) ( C, ph) paraaf > ,5 < 10 < 25 < 130 (23, 6.5) > 60 2 < 90 (23, 7.5) < 15 (23, 8.0) voor na voor na 1 : criteria geldt voor de parameter sterfte 2 : criteria geldt voor de parameter groei/reproductie Pagina nr. 15 van16 pagina's Gewijzigd door Aquasense Inhoudelijk goedgekeurd door: : B. Kater

16 Pagina nr. 16 van16 pagina's Gewijzigd door Aquasense Inhoudelijk goedgekeurd door: : B. Kater