NEDERLANDSE SAMENVATTING ACHTERGROND Klinische aspecten van dikke darmkanker Dikke darmkanker is een van de meest voorkomende vormen van kanker in de westerse wereld. Als we kijken naar aan kanker gerelateerde sterfte, dan staat deze vorm van kanker op de tweede plaats. In Nederland komen er jaarlijks circa 8000 nieuwe patiënten bij. Ongeveer de helft daarvan komt te overlijden binnen 5 jaar. Dikke darmtumoren worden ingedeeld in vier stadia (stadium I tot en met IV) volgens het zogenoemde TNM classificatie systeem (zie Tabel 1). Deze stadia worden bepaald op basis van drie factoren te weten, de diepte van tumorgroei in of door de darmwand (T -voor tumor- component), de aanwezigheid van tumorpositieve lymfklieren (N -voor nodescomponent) en de aanwezigheid van uitzaaiingen op afstand, zoals metastasen in lever of longen (M -voor metastases- component). Het stadium waarin een tumor zich bevindt, heeft prognostische waarde en met name de factor tumorpositieve klieren wordt gebruikt als maat voor het geven van adjuvante therapie. Zo komt een 5-jaars overleving voor bij 90% van de patiënten met een stadium I tumor, bij 75 % van de patiënten met een stadium II tumor, bij 50% van de patiënten met een stadium III tumor bij minder dan 5% van de patiënten met een stadium IV tumor. Tabel 1:TNM classificatie systeem Stadium TNM 5-jaars overleving % I T1 of T2 tumor groeit IN de darmwand >90% N0 en M0 geen metastasen in lymfklieren of op afstand II T3 of T4 tumor groeit DOOR de darmwand tot in 75% N0 en M0 geen metastasen in lymfklieren of op afstand III T1-T4 tumor groeit in de darmwand eventueel tot in 50% N1 1-3 lymfkliermetastasen N2 4 of meer lymfklier metastasen M0 geen metastasen op afstand IV T1-T4 tumor groeit in de darmwand eventueel tot in <5% N1-2 1-3/ 4 of meer lymfkliermetastasen M1 metastasen op afstand (in bijv. lever of longen) De behandeling van patiënten met dikke darmkanker bestaat voornamelijk uit het operatief verwijderen van de primaire tumor (en in stadium IV waar mogelijk ook het operatief verwijderen van de metastasen op afstand). Patiënten met een stadium III (en soms ook met stadium II) dikke darmkanker, krijgen na die operatie (d.w.z. adjuvant) ook een chemotherapie behandeling, meestal op basis van 5-fluorouracil (5-FU). Ook vele patiënten met een stadium IV dikke darmkanker krijgen chemotherapie en/of radiotherapie 1
LIST OF PUBLICATIONS (bestraling), maar dan meer palliatief (bedoeld ter verlichting van de symptomen) dan curatief (bedoeld ter genezing). Het geven van adjuvante chemotherapie in patiënten met een stadium III tumor vermindert de kans dat de kanker terugkomt (recidief) en verbetert daarmee de prognose (d.w.z. verlengt de ziekte-vrije overleving). In deze groep van patiënten geeft het een absolute overlevingswinst van 12%-15%. Ook al is de ziekte-vrije overleving in deze groep dus verbeterd gedurende de afgelopen decennia, toch komt bij ongeveer de helft van de patiënten de ziekte weer terug, meestal in de vorm van levermetastasen. Vandaag de dag is het nog steeds niet mogelijk om te voorspellen welke patiënt met een stadium III tumor baat zal hebben bij deze adjuvante chemotherapie. Dit proefschrift richt zich dan ook op de vraag: Kunnen we op moleculair niveau eigenschappen (markers) vinden die bruikbaar zijn bij het voorspellen van het ziekte verloop, markers die iets zeggen over de ziekte-vrije overleving van deze patiënten? In hoofdstuk 1 van dit proefschrift wordt beschreven dat er veel onderzoek is en wordt verricht naar het vinden van prognostische en voorspellende factoren met name voor patiënten met stadium II en III dikke darmkanker. Helaas worden veel tegenstrijdige onderzoeksresultaten gevonden. Deze tegenstrijdige bevindingen zouden verklaard kunnen worden door velerlei factoren. Veelal wordt gekeken naar tumoren uit verschillende tumorstadia (I-IV) tezamen, of wordt er gekeken in betrekkelijk kleine groepen. Maar ook wordt er op verschillende manieren naar eenzelfde marker gekeken. Al met al is er tot nu toe nog geen enkele moleculaire marker gevonden die voorspellend is met betrekking tot prognose of therapie en relevant genoeg is om te gebruiken in de kliniek. Somatisch-genetische aspecten van het ontstaan van dikke darmkanker Van dikke darmkanker is bekend dat die zich ontwikkelt via een opéénstapeling van meerdere afwijkingen in het DNA (het genoom), d.w.z door een vorm van genomische instabiliteit. De twee meest bekende vormen van genomische instabiliteit zijn chromosomale instabiliteit (CIN) en microsatelliet instabiliteit (MIN) (Fig. 1). Figuur 1: Belangrijke CIN en MIN kenmerken van dikke darmtumoren genomische instabiliteit chromosomale instabiliteit (CIN) grote DNA veranderingen op chromosoom niveau (LOH) afwijkend aantal chromosomen vaak mutaties in TP53, KRAS en APC komt voor in 85% van de tumoren tumoren meest linkszijdig tumoren niet-verslijmend tumoren goed gedifferentieerd slechte prognose microsatelliet instabiliteit (MIN) kleine DNA veranderingen op DNA base niveau (MSI-H) normaal aantal chromosomen (2n;46) weinig mutaties in TP53, KRAS en APC komt voor in 15% van de tumoren tumoren meest rechtszijdig tumoren vaak verslijmend tumoren slecht gedifferentieerd betere prognose
Chromosomale instabiliteit wordt gevonden in ongeveer 85% van alle sporadische dikke darmkankers en wordt gekenmerkt door afwijkingen op chromosoom niveau, d.w.z. een afwijkend aantal chromosomen en/of het vóórkomen van deleties en/of duplicaties van delen van chromosomen. Een gezonde normale cel(kern) bevat 22 chromosomen in tweevoud en twee geslachtschromosomen, tweemaal X bij een vrouw en een X en een Y bij een man. In CIN tumoren zie je dus een afwijkend aantal chromosomen. Naast het vinden van een afwijkend aantal chromosomen worden in deze tumoren ook veel spontane, nieterfelijke (somatische) kleine DNA veranderingen (base veranderingen) gevonden en dan met name in oncogenen, zoals KRAS, en in tumorsuppressor genen, zoals TP53 en APC. Microsatelliet instabiliteit (MIN) komt voor in ongeveer 15% van de gevallen en wordt gekenmerkt door kleine afwijkingen (inserties of deleties) op DNA base niveau, meestal in repeterende DNA base volgordes, ook wel microsatellieten genoemd, zoals (CA) n. Deze vorm van instabiliteit wordt dan ook microsatelliet instabiliteit genoemd (MSI+ of MSI-H, H voor hoog). De oorzaak van het CIN fenotype is onbekend. Voor het MSI-H fenotype weten we dat er een defect DNA reparatiesysteem (MMR, mismatch repair, genoemd) aan ten grondslag ligt. Dit reparatiesysteem is betrokken bij het herstel van DNA fouten, die ontstaan tijdens het DNA replicatieproces. Wat we dus zien is niet gerepareerd DNA. In dit proefschrift richtten wij ons speciaal op stadium III tumoren en het zoeken naar prognostische factoren, gebaseerd op specifieke moleculaire tumorkenmerken, zoals afwijkingen in het DNA (mutaties) of aan- of afwezigheid van bepaalde eiwitten. Deze moleculaire prognostische factoren kunnen hopelijk behulpzaam zijn bij het onderscheiden van patiënten met een korte dan wel lange tijd van overleving. Om deze factoren te kunnen identificeren hebben we een grote goedgedefinieerde groep patiënten met stadium III dikke darmkanker verzameld (N=391), allen adjuvant behandeld met chemotherapie met 5-fluorouracil. RESULTATEN Om te beginnen hebben we de tumoren ingedeeld op basis van aan- of afwezigheid van microsatelliet instabiliteit (MIN) en op de aan- of afwezigheid van TP53 en KRAS mutaties, mutaties die vrijwel altijd samen samengaan met chromosomale instabiliteit (CIN), zoals beschreven in hoofdstuk 2. Microsatelliet instabiliteit (MSI-H) werd gevonden in 16% (44/273) van de onderzochte dikke darmtumoren. Dit MSI-H fenotype bleek geassocieerd te zijn met een rechtszijdige locatie van de tumor, een slechte cellulaire differentiatie en een verslijmend histologisch karakter. Verder vonden we in een univariate analyse (d.w.z. een statistische analyse waarin enkel één variabele wordt bekeken) dat MSI-H geassocieerd was met een langere ziektevrije overleving, een positieve prognostische factor. Wanneer we echter corrigeerden voor een aantal andere variabelen, te weten het aantal tumorpositieve lymfklieren, het wel of niet verslijmende karakter, de diepte van tumorgroei en de mate van differentiatie (een multivariate analyse), was de associatie van MIN met ziekte-vrije overleving niet langer statistisch significant. Dit is niet verrassend gezien de lage frequentie van het MSI-H fenotype (ongeveer 15%) en het ontstaan van vele verschillende subgroepen bij een multivariate analyse, waardoor de groepen te klein worden om nog significante conclusies te kunnen trekken (gebrek aan power).
LIST OF PUBLICATIONS We vonden wel zowel in een univariate als in een multivariate analyse, dat het hebben van een mutatie in TP53 geassocieerd is met een korte ziekte-vrije overleving, dus een negatieve prognostische factor is. TP53 mutaties kwamen voor in 53% (116/220) van de onderzochte tumoren. Het hebben van een TP53 mutatie was ook geassocieerd met het vaker voorkomen van een niet-verslijmend karakter van de tumor. Een gecombineerde analyse voor het al dan niet in de tumor aanwezig zijn van MSI-H en een TP53 mutatie had een relatief lage statistische power door het toegenomen aantal subgroepen. Om tot betrouwbare uitspraken daarover te komen, is een grotere groep(sgrootte) zeker een vereiste. Wel hebben we kunnen aantonen dat de voorspellende waarde van de al dan niet aanwezigheid van een TP53 mutatie voor de ziekte-vrije overleving hoger is dan die van het al dan niet voorkomen van MSI-H. De effectgroottes van de MSI en TP53 status worden beschreven in hoofdstuk 6. Ze blijken klein tot gemiddeld te zijn en daarmee kleiner dan het effect van het aantal tumorpositieve lymfklieren maar groter dan de effecten van drie histopathologische kenmerken, te weten het wel of niet verslijmende karakter van de tumor, de diepte van tumorgroei en de mate van differentiatie, met betrekking tot ziekte-vrije overleving. Duiden TP53 en KRAS mutaties op CIN? Omdat 9 van de 25 MSI-H tumoren (36%) ook een TP53 mutatie bleek te hebben (hoofdstuk 2), bestaat er een wezenlijke overlap tussen een MSI-H fenotype en de aanwezigheid van een TP53 mutatie. Dus karakteristieken die tegengesteld leken (namelijk aanwezigheid van een TP53 mutatie als CIN karakteristiek en van MSI-H als MIN karakteristiek), sluiten elkaar niet uit. Daarom hebben wij de mate van chromosomale instabiliteit in MSI-H tumoren met een TP53 mutatie bepaald zoals beschreven in hoofdstuk 3. Wij hebben aangetoond dat de aanwezigheid van een TP53 mutatie in MSI-H tumoren niet kan worden beschouwd als een indicator voor chromosomale instabiliteit zoals bepaald met behulp van subtelomeer (uiteinden van chromosomen)-specifieke CGH arrays. We hebben laten zien dat het aantal chromosomale afwijkingen in MSI-H tumoren laag is en duidelijk afwijkt van de microsatelliet stabiele (MSS) tumoren en dat tumoren die zowel een MSI-H fenotype als een TP53 mutatie hebben, bijna geen chromosomale instabiliteit vertonen. Enige overlap werd ook gevonden tussen het hebben van een KRAS mutatie en een MSI-H status. Er werden KRAS mutaties gevonden in 4/25 MSI-H tumoren (16%) vergeleken bij 42/126 MSS tumoren (33%) (hoofdstuk 2). Naar aanleiding van het vinden van een overlap tussen KRAS mutaties en een MSI-H fenotype in sporadische tumoren, hebben we de KRAS mutatie frequentie ook in erfelijke MSI-H (HNPCC) dikke darmtumoren onderzocht. De KRAS mutatie frequenties in erfelijke (HNPCC) en sporadische (MSI-H en MSS) dikke darmkanker worden beschreven in hoofdstuk 4. De KRAS mutatie frequentie in MSI-H tumoren blijkt wel lager dan die in MSS en HNPCC tumoren, maar van een negatieve correlatie is geen sprake. Die bleek afhankelijk te zijn van de MLH1 methylatie status, want gemethyleerde MSI-H tumoren lieten de laagste mutatie frequentie zien (18%), terwijl de niet-gemethyleerde MSI-H tumoren een mutatie frequentie hadden van 36%, wat overeenkomt met de mutatie frequenties van MSS en HNPCC tumoren. Dus een KRAS mutatie als CIN kenmerk en MSI-H als MIN kenmerk, sluiten elkaar eveneens niet uit.
In hoofdstuk 6 wordt beschreven dat de aanwezigheid van een KRAS mutatie in MSI-H tumoren, evenals de aanwezigheid van een TP53 mutatie, niet beschouwd kan worden als een indicator voor chromosomale instabiliteit, omdat we met onze arrays in 100% (3/3) van de KRAS gemuteerde MSI-H tumoren geen chromosomale instabiliteit (m.a.w. minder dan 3 chromosomale afwijkingen) hebben gevonden. Opvallend is dat zelfs twee van deze drie MSI-H tumoren ook een TP53 mutatie hadden. Vervolgens hebben we ook de prognostische waarde van specifieke chemotherapie gevoelige eiwitten onderzocht, zoals TS en DPD (hoofdstuk 5). TS en DPD zijn betrokken bij de werking en de afbraak van 5-FU, het chemotherapeuticum. De werking van TS wordt geremd doordat het een complex vormt met een geactiveerde vorm van 5-FU. Dit leidt tot remming van de DNA synthese en tot het stoppen van celdeling of tot celdood. DPD is het enzym dat zorgt voor de afbraak van 5-FU. Dit vindt met name plaats in de lever. De mate van TS en DPD eiwitexpressie zijn bepaald door middel van immunohistochemische analyse op weefsel microarrays. Deze weefsel-arrays bevatten alle 391 verzamelde primaire tumoren en een deel van de bijbehorende lymfkliermetastases. Een lage TS eiwitexpressie bleek geassocieerd met een verslijmende tumor histologie en een lage DPD eiwitexpressie met een jongere leeftijd van de patiënt. TS en DPD expressie in zowel primaire tumoren als in lymfkliermetastases bleek geen prognostische waarde te hebben in deze met 5-FU behandelde groep patiënten met stadium III dikke darmkanker. CONCLUSIES We hebben aangetoond, dat een TP53 mutatie een middelgrote negatieve prognostische factor is in patiënten met stadium III dikke darmkanker, adjuvant behandeld met 5-FU chemotherapie. Een MSI-H status lijkt een positieve prognostische indicator, hoewel dat vanwege het te kleine aantal MSI-H tumoren niet bevestigd kon worden in een multivariate analyse (gebrek aan power). In tegenstelling tot MSI en TP53 (mutatie) status, hebben KRAS (mutatie) status en TS en DPD expressie geen prognostische waarde in met 5-FU adjuvant behandelde patiënten met stadium III dikke darmkanker. Verder heeft ons onderzoek uitgewezen dat TP53 en KRAS mutaties niet beperkt zijn tot het CIN fenotype, zoals vaak is gesuggereerd. We hebben echter geen aanwijzingen gevonden dat chromosomale instabiliteit en microsatelliet instabiliteit samen kunnen voorkomen in één tumor.