Woord vooraf Dit eindwerk is tot stand gekomen dankzij de hulp van heel wat personen. Ten eerst bedank ik ten volste Dr. M. Haspeslagh en Dr. E. Steenkiste om mij de kans te geven onder hun leiding, een onderzoek uit te voeren in hun labo en daarbij gebruik te maken van de nodige apparatuur en toebehoren. Ze hebben mij meer dan voldoende bijgestaan om dit eindwerk te kunnen realiseren. De collega s van het labo wil ik eveneens bedanken voor de goede raad, de leuke samenwerking en het respect die ik kreeg als studente. Op de tweede plaats wil ik mijn promotor de heer P. Dedeckere bedanken voor de steun en de moeite die hij gedaan heeft om dit eindwerk tot een mooi geheel te brengen. Eveneens bedankt aan het hele team van de Hogeschool West-Vlaanderen, departement Simon Stevin te Brugge. 1
Samenvatting Wanneer een tumor wordt vastgesteld in het lichaam wil men weten waar de tumor zich bevindt en of de tumor afkomstig is van een metastase van een primaire tumor. Voor het onderzoek naar metastaseringen van borstcarcinoma s wordt, tijdens dit onderzoek, gebruik gemaakt van het antigen GCDFP-15 dat voorkomt in klieren met apocriene differentiatie. Om GCDFP-15 te kunnen aantonen in weefsels wordt een immunohistochemische kleuring uitgevoerd. Deze kleuring moet eerst op punt worden gesteld zodat storende achterkleuring kan worden gereduceerd. Het op punt stellen gebeurt door het aankleuren van positieve controles met verschillende concentraties van de antistof, namelijk 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 en 1/320. Men besluit om verder te werken met de 1/160 verdunde antistof. Na het op punt stellen van de kleuring wordt in een tweede stap de bruikbaarheid van GCDFP-15 onderzocht bij verschillende subtypes van borsttumoren, namelijk ductaal, tubulair, lobulair en medullair subtype. Er worden een aantal subtypes van borstcarcinoma s gekleurd en microscopisch bekeken in welke subtypes aankleuring te zien is. Dit gebeurd om later de kleuring eventueel te gebruiken als merker van borstorigine bij metastasen van ongekende primair origine. In de laatste stap wordt kwaadaardig prostaatweefsel gekleurd en de bruikbaarheid van GCDFP-15 als een merker voor kwaadaardigheid in prostaatweefsel onderzocht. 2
Lijst met afkortingen en symbolen Ab A.D. Ag AMACR DAB DCIS GCDFP-15 Ig IHC kd LCIS mrna NK-cellen NOS PSA TTF-1 VC antilichaam of antistof Gedemineraliseerd water antigen Alpha-methylacyl-CoA racemase 3,3 -diaminobenzidine Ductaal carcinoma in situ Gross Cystic Disease Fluip Protein (15 kd) immunoglobuline immunohistochemie kilodalton Lobulair carcinoma in situ messenger RNA Natural Killer cellen Not Otherwise Specified, terug te vinden bij invasief ductaal carcinoma Prostaat Specifiek Antigen Thyroid Transcription Factor-1 Vriescoupe 3
Verklarende woordenlijst Adenocarcinoma AIDS AMACR Androgenen Apocriene of eccriene klieren Carcinoom, carcinoma Celdifferentiatie Celproliferatie Commensale flora of commensalen Cyste Cytoplasma Ductaal borstcarcinoma Ductaal, ductus Dysplasie carcinoom dat ontstaat in klierweefsel (adeno-) Acquired immuno-deficiency syndrome Eiwit dat helpt bij de metabolisatie van verschillende vetzuren in het lichaam. Studies vertellen ons dat AMACR kan gebruikt worden als een prostaatkanker biomarker. Synoniem: P504S Mannelijke hormonen, bij de vrouw belangrijk als bouwstenen van oestrogenen vochtafscheidende klieren bijvoorbeeld melkklieren, zweetklieren in de oksel en speekselklieren kwaadaardige kanker van epitheliaal weefsel rijping van cellen naar een volwassen cel zonder celdeling vermeerdering van cellen door celdeling en celgroei biologische organismen die voorkomen en leven in de mens, zonder schade te veroorzaken blaas of holte met vloeibare, stroperige of taaie inhoud het deel van de cel buiten de kern en binnen de celwand, slijmachtig en bestaande uit eiwitten, koolhydraten, vet en water Specifiek subtype van borstkanker kanaal, lozingsgang abnormale groei en vorming van weefsel 4
Elektron Elektronenacceptor Elektronendonor Epithiaal weefsel, epitheel Epitoop of determinant Exocytose Exogene stof Fibrose Fylogenese Gammaglobuline GCDFP-15/gp17 Gecoate objectglaasjes Globuline Glycoproteïnen Granulocyt zeer klein elementair deeltje met een negatieve lading dat om de positieve atoomkern cirkelt neemt elektronen, afkomstig van elektronendonor, op geeft elektronen af aan een elektronenacceptor bovenste laag van de huid en slijmvliezen, bedekt het uitwendige oppervlakte van het lichaam en vele lichaamsholten herkenningsplaats op het Ag dat specifiek kan worden herkend door Ab, die zich eraan binden een blaasje in het cytoplasma van de cel versmelt met het celmembraan waardoor de inhoud van het blaasje uit de cel kan lichaamsvreemde stof, ontstaat buiten het lichaam, tegengestelde van endogeen toename van bindweefsel in een orgaan het ontstaan en de ontwikkeling van een soort of ras de meeste antistoffen die zich na inenting of infectie vormen, bevinden zich in deze fractie van het bloedserum eiwit van GCDF dat wordt gesecreteerd door apocriene borsttumorcellen objectglaasje bedekt met een bepaalde stof bijvoorbeeld sylaan, specifieke antistoffen enzovoort eiwitachtige stof in het bloedplasma, spieren enzovoort eiwitmolecule (proteïne) waaraan een suikerketen (glyco-) is gebonden gekorrelde witte bloedcel, wordt onderscheiden in eosinofielen, neutrofielen en basofielen 5
Gross Immunoglobuline In situ Intracellulair Invasief Lobulair Lobulair carcinoom Lokaal Maligne tumor Mammectomie of mastectomie Medullair carcinoom Metastase, metastasering Monoklonaal antilichaam Mucineus, mucus Nevus sebaceus Paget s disease Pathologie, pathologisch Plasma met het blote oog zichtbaar zodat er macroscopisch kan worden onderzocht gammaglobulines in het bloedserum die als antilichamen aanwezig zijn in het lichaam ter plaatse in de cel, tegengestelde van extracellulair verspreiding in het omringend gezond weefsel kwabje, lobje Specifiek subtype van borstkanker plaatselijk kwaadaardige tumor, tegengestelde van benigne tumor borstamputatie Specifiek subtype van borstkanker uitzaaiing antilichaam dat een specifiek epitoop bindt op een antigen slijm Goedaardige huidtumor onder andere gekenmerkt door talgklierweefsel type borstkanker dat zich vormt in of rond de tepel ziekteleer; ziekelijk, afwijkend bloed zonder rode bloedcellen 6
Polyklonaal antilichaam Polymerisatie of polymeer Progressie PSA Ribosoom Sclerose Sereus vocht Serum Transcriptie Translatie Tubulus Tubulair carcinoom antilichaam dat verschillende epitopen bindt op een antigen de verbinding van moleculen van dezelfde soort tot één structuur zonder verandering van de bouw van de elementaire moleculen de vooruitgang van een aandoening eiwit gevormd in het klierweefsel van de prostaat zorgt voor de aanmaak van eiwitten (eiwitsynthese) verharding van bindweefsel bestaat voornamelijk uit bloedserum, door ontsteking gevormde of op andere wijze uitgezwete waterige vloeistof bloed zonder stollingsfactoren kopiëren van DNA naar mrna door het enzym RNApolymerase het vertalen van RNA in eiwitten buisje specifiek subtype van borstkanker 7
Lijst van tabellen en figuren Tabellen Tabel 1 - Immunohistochemie van GCDFP-15... 18 Tabel 2 - Positieve immunohistochemie voor AR... 19 Tabel 3 - Vergelijking resultaten RT-PCR en immunohistochemie... 21 Tabel 4 - Gebruikte reagentia... 26 Tabel 5 - Gebruikte reagentia en antilichamen voor de kleuringen met de Autostainer Plus... 33 Tabel 6 - Gebruikte reagentia en antilichamen voor de kleuring (verdunning 1/160) van tumorale borstweefsels met de Autostainer Plus... 35 Tabel 7 - Samenvattende tabel met de resultaten van de borstcarcinoma s... 40 Tabel 8 - Gebruikte reagentia en antilichamen voor de kleuring (verdunning 1/160) van prostaatweefsel met de Autostainer Plus... 41 Tabel 9 - Samenvattende tabel met de resultaten van de prostaatcarcinoma's... 42 Figuren Figuur 1 - Enzymgeconjugeerde immunohistochemie... 14 Figuur 2 - Werking EnVision... 15 Figuur 3 - Het Golgi-apparaat... 16 Figuur 4 - Eiwitsynthese... 20 Figuur 5 - Cassette met deksel... 22 Figuur 6 - Microm HMP 110... 23 Figuur 7 - Medite medizintechnik... 23 Figuur 8 - Microm HM 350 S... 24 Figuur 9 - Dako Autostainer Plus... 24 Figuur 10 - Shandon Varistain 24/4... 25 Figuur 11 - Zones op een draagglaasje... 28 8
Figuur 12 - Microscopisch beeld van een speekselklier bij concentratie 1/20 (100x)... 34 Figuur 13 - Microscopisch beeld van een ductaal borstcarcinoma (100x)... 35 Figuur 14 - Microscopisch beeld van een lobulair borstcarcinoma (400x)... 36 Figuur 15 - Microscopisch beeld van een tubulair borstcarcinoma (400x)... 38 Figuur 16 - Microscopisch beeld van een medullair borstcarcinoma (100x)... 38 Figuur 17 - Microscopisch beeld van een prostaattumor (400x)... 42 9
Inhoudsopgave Woord vooraf... 1 Samenvatting... 2 Lijst met afkortingen en symbolen... 3 Verklarende woordenlijst... 4 Lijst van tabellen en figuren... 8 Inhoudsopgave... 10 1 Inleiding, situatieschets en probleemstelling... 13 2 Literatuurstudie... 14 2.1 Immunologie... 14 2.1.1 Aangeboren aspecifieke immuniteit... 14 2.1.2 Verworven specifieke immuniteit... 15 2.2 Immunohistochemie... 16 2.2.1 Enzymgeconjugeerde immunohistochemie... 16 2.2.2 Gebruik van EnVision... 17 2.3 GCDFP-15... 18 2.3.1 Voorkomen... 18 2.3.2 Aantonen... 19 2.3.3 Resultaten uit enkele onderzoeken... 19 10
3 Materiaal en methode... 24 3.1 GCDFP-15: op punt stellen van de immunohistochemische kleuring... 24 3.2 Materialen... 24 3.2.1 Apparatuur en benodigdheden... 24 3.2.2 Reagentia... 27 3.3 Methoden... 28 3.3.1 Bewerking van het staal... 28 3.3.2 Immunohistochemie... 29 3.3.3 Tegenkleuren... 31 4 Onderzoeken en resultaten... 33 4.1 Inleiding: de resultaten worden bekomen in drie stappen... 33 4.2 Voorstelling van het resultaat... 33 4.3 Onderzoek en resultaten... 34 4.3.1 Immunohistochemische kleuring op punt stellen... 34 4.3.2 Immunohistochemische kleuring van tumorweefsel afkomstig van de borst... 37 4.3.3 Immunohistochemische kleuring van prostaattumoren... 42 5 Discussie... 45 6 Conclusie... 48 Literatuurlijst... 49 Boeken... 49 Internet... 50 Bijsluiter... 54 11
Bijlagen... 55 Bijlage 1 Bijsluiter DakoCytomation EnVision + Dual Link System-HRP... 56 Bijlage 2 Bijsluiter DakoCytomation Liquid DAB+ Substrate Chromogen System... 57 Bijlage 3 Bijsluiter NCL-L-GCDFP-15 (kloon 23A3)... 58 Bijlage 4 - Bijsluiter DakoCytomation Peroxidase Blocking Reagent Ready-to-Use code S2001... 60 Voor akkoord verklaring... 61 12
Inleiding 1 Inleiding, situatieschets en probleemstelling Het onderzoek werd uitgevoerd in het labo anatomie-pathologie in het Stedelijk Ziekenhuis te Roeselare. Dit werd met zorg begeleid door Dr. M. Haspeslagh en Dr. E. Steenkiste. Het onderzoek naar tumoren is sterk geëvolueerd. Het stellen van de diagnose vraagt steeds verdere verfijning. Specifieke kleurtechnieken waarbij gebruik gemaakt wordt van antigenen (immunohistochemie) zijn hierbij een goede hulp. Recent werd de immuunkleuring GCDFP-15 aangekocht door het labo voor het onderzoek naar metastaseringen van borstcarcinoma s en eventueel gebruik bij prostaattumoren. De kleuring diende nog op punt te worden gesteld door middel van positieve controles. Speciale aandacht gaat naar storende achtergrondkleuring. Na het op punt stellen van de kleuring werd in een tweede stap de bruikbaarheid van GCDFP-15 onderzocht bij verschillende subtypes van borsttumoren. Er werden een aantal subtypes borstcarcinoma s gekleurd en microscopisch bekeken in welke subtypes eventueel aankleuring te zien was. Dit gebeurde om later de kleuring eventueel te gebruiken als merker van borstorigine bij metastasen van ongekend primair origine. In de laatste stap werd kwaadaardig prostaatweefsel gekleurd en de bruikbaarheid van GCDFP-15 als een merker voor kwaadaardigheid in prostaatweefsel onderzocht. 13
Literatuurstudie 2 Literatuurstudie 2.1 Immunologie Bij inenting en bij infectie, door een virus bijvoorbeeld, komen exogene stoffen het lichaam binnen. Deze lichaamsvreemde stoffen worden antigenen genoemd en komen voor in virussen, bacteriën, weefsels... Antigenen hebben het vermogen om beschermende antistoffen of immunoglobulines (Ig) in het lichaam op te wekken en met deze een specifieke binding aan te gaan. Met specifiek bedoelt men dat een immunoglobuline gericht is tegen één bepaald antigen en dus één antigen bindt. Dit wordt de afweer- of immuunreactie genoemd. Het resultaat is dat de antigenen worden verwijderd zodat bijvoorbeeld de infectie voorbij is. Algemeen is de belangrijkste functie van het immuunsysteem het lichaam te verdedigen tegen infecties. Immuniteit is dus het in een bepaalde mate beschermd zijn van het organisme tegen invloeden van buitenaf. De immuniteit kan ofwel aangeboren ofwel verworven zijn. Beide systemen werken samen. 2.1.1 Aangeboren aspecifieke immuniteit Deze onvatbaarheid voor infecties is aangeboren. Dit wil zeggen dat elke persoon vanaf de geboorte immuun is, niet voor één maar een hele groep micro-organismen en dit voor het hele leven. Enkele beschermende barrières van het lichaam zijn: de huid die, indien intact, de meeste micro-organismen tegenhoudt; het zuur maagsap dat bacteriën doodt; de commensale flora, die de groei van pathogene bacteriën en schimmels onderdrukken. In lichaamsvochten komen stoffen voor die helpen het lichaam te beschermen. Voorbeelden hiervan zijn: Lysozymen die de glycoproteïnen in de celwand van bacteriën aanvallen; 14
Literatuurstudie Acute fase eiwitten. Hun concentratie stijgt bij infecties. Een voorbeeld is interferon, dat geproduceerd wordt door viraal geïnfecteerde cellen en de naburige cellen beschermd tegen intracellulaire virale replicatie. In het lichaam komt er een proces voor dat zorgt voor de opname en vertering van microorganismen. Het heet fagocytose en komt tot stand door twee belangrijke celtypes, namelijk granulocyten en macrofagen. Granulocyten vormen een circulerend verdedigingssysteem en zijn vooral actief tegen ettervormende bacteriën. Macrofagen zorgen voor de lokale verdediging door hun aanwezigheid in weefsels en zijn vooral actief in de strijd tegen bacteriën en virussen die intracellulair kunnen leven. Een laatste bescherming gebeurt met de hulp van Natural Killer cellen (NK-cellen). Deze cellen zijn dodelijk voor viraal geïnfecteerde cellen en tumorcellen. De natuurlijke, niet-specifieke immuniteit zorgt voor tijdswinst die nodig is om de verworven, specifieke immuunreactie op gang te laten komen. 1 2.1.2 Verworven specifieke immuniteit De verworven, specifieke immuniteit volgt na de aangeboren, aspecifieke verdediging en verhoogt de efficiëntie van het niet-specifieke immuunsysteem. Wanneer het lichaam voor de eerste maal geïnfecteerd wordt, komen vreemde antigenen het lichaam binnen en vormt het organisme antilichamen tegen deze antigenen. Een eerste contact met een lichaamsvreemd antigen laat een herinnering na. Bij een volgend contact met hetzelfde antigen zal dit leiden tot een snellere en sterkere reactie van het lichaam. Lichaamseigen stoffen worden normaal niet aangevallen. Bij auto-immuniteit reageert het immuunsysteem overactief, waarbij het lichaam antistoffen vormt, gericht tegen de eigen lichaamsweefsels. 1 1 Referentie 4 en 8 in literatuurlijst 15
Literatuurstudie 2.2 Immunohistochemie 2.2.1 Enzymgeconjugeerde immunohistochemie Tijdens een immunohistochemische kleuring bindt een primair antilichaam op specifieke antigenen aanwezig in het weefselpreparaat. Een secundair antilichaam bindt op het primair antilichaam. Als secundair antilichaam wordt een monomeer immunoglobuline of een polymeer (zie 2.2.2 Gebruik van EnVision ) gebruikt. Aan dit secundaire antilichaam wordt een enzymcomplex met een chromogeen substraat gebonden. Telkens worden verschillende wasstappen tussenin uitgevoerd om niet gebonden antilichamen en reagentia weg te wassen. De enzymatische activiteit van het chromogeen resulteert in een zichtbare reactie op de plaats van het antigen (zie figuur 1). De verkregen resultaten worden onder de lichtmicroscoop door een patholoog geïnterpreteerd en dienen als hulp bij de diagnose van pathologische processen in het onderzochte biopt. 2 Figuur 1 Enzymgeconjugeerde immunohistochemie 3 2 Referentie 37 in literatuurlijst 3 Referentie 3 in literatuurlijst 16
Literatuurstudie 2.2.2 Gebruik van EnVision Tijdens de immunohistochemische kleuring wordt een primair antilichaam gebonden op de antigenen aanwezig in het weefselpreparaat. Als secundair antilichaam wordt gebruik gemaakt van EnVision. Dit is een enzymgeconjugeerd polymeer dat secundaire antilichamen draagt (zie figuur 2). Figuur 2 Werking EnVision 4 Als enzym draagt het polymeer Horseradish Peroxidase (HRP), dat uit mierikswortel wordt bereid. Detectie van dit enzym gebeurt met diaminobenzidine (DAB) en H 2 O 2. DAB dient als elektronendonor voor HRP. Het enzym HRP draagt de gekregen elektronen over aan H 2 O 2. Door deze elektronenoverdracht wordt DAB gepolymeriseerd tot een onoplosbare bruine neerslag die met een lichtmicroscoop gemakkelijk te detecteren is. 5 4 Referentie 3 in literatuurlijst 5 Referentie 3, 34 en 35 in literatuurlijst 17
Literatuurstudie 2.3 GCDFP-15 2.3.1 Voorkomen Gross Cystic Disease Fluid (GCDF) is een secretie afkomstig van apocriene klieren in onder andere de borst. Het secreet bestaat uit verschillende glycoproteïnen (antigenen) waaronder GCDFP-15. GCDFP-15 is een monomeer eiwit met een moleculair gewicht van vijftien kilodalton (kd). Het werd ongeveer dertig jaar geleden geïdentificeerd door Haagensen en collega s. 6 Vaak wordt in plaats van GCDFP-15, over PIP gesproken, wat staat voor prolactin-inducible protein. Het wordt teruggevonden in het Golgi-apparaat en cytoplasmatische granules van cellen. Het Golgi-apparaat komt voor in het cytoplasma van een cel en kan stoffen produceren waarna deze uitgescheiden worden door de cel (zie figuur 3). Figuur 3 Het Golgi-apparaat 7 Transportblaasjes met eiwitten, gemaakt door ribosomen, worden vervoerd naar de ciszijde van het Golgi-apparaat. Aan deze zijde geven de blaasjes hun eiwitten af binnen het Golgi-apparaat. Ze worden er bewerkt tot een eindproduct. Hierna bereiken de eiwitten de trans-kant van het Golgi-apparaat. Ze vormen blaasjes die als secreetkorrels richting het celmembraan getransporteerd worden. Wanneer de blaasjes versmelten met het celmembraan komen de eiwitten vrij, buiten de cel (exocytose). In kliercellen is het Golgi- 6 Referentie 5 in literatuurlijst 7 Referentie 17 in literatuurlijst 18
Literatuurstudie apparaat doorgaans goed ontwikkeld. Vooral de cellen van secretie-organen zullen veel Golgi-apparaten bezitten. 8 2.3.2 Aantonen GCDFP-15 kan worden aangetoond via een immunohistochemische kleuring op formol gefixeerde, paraffine ingebedde weefsels (zie 2.2 Immunohistochemie). 2.3.3 Resultaten uit enkele onderzoeken In normaal borstweefsel is er een positieve reactie voor GCDFP-15 in de epitheelcellen van blaasjes (lobulair) en smalle kanalen (tubulair). Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat GCDFP-15 een specifieke merker is voor apocriene differentiatie, wat onder meer kan worden waargenomen in de borstklieren. 9 2.3.3.1 Onderzoek 1 In het onderzoek 10 kleurden veertien van dertig borstcarcinoma s positief voor GCDFP- 15. Van zestien carcinoma s met apocriene oorsprong kleurden er twaalf positief (zie tabel 1). De cijfers van immunohistochemische aankleuring variëren in de literatuur van ongeveer 50% tot 90% voor borstcarcinomen 11. Benigne en maligne regio s van andere weefsels (colon, maag enzovoort) vertoonden geen immunoreactiviteit. De enige cellen die afkomstig zijn van niet-apocrien weefsel en GCDFP-15 bevatten, zijn sereuze cellen van de slijm- en speekselklieren in de mond en keel, klieren in het bindweefsel van de bronchi en traanklieren. Deze weefsels hebben fylogenetische gelijkenissen met apocriene klieren. Dit onderzoek leidt tot het besluit dat GCDFP-15 als een weefselspecifieke merker 8 Referentie 8 in literatuurlijst 9 Referentie 11, 17 en 30 in literatuurlijst 10 Referentie 21 in literatuurlijst 11 Referentie 6 in literatuurlijst 19
Literatuurstudie voor apocrien epitheel kan gebruikt worden. Recent werd ook positiviteit aangetoond in een subgroep van longcarcinomen. 12 Aantal positieve stalen voor GCDFP-15 Soort weefsel 14/30 Borstcarcinoma s 12/16 Apocriene borstcarcinoma s Positiviteit in weefsel met fylogenetische gelijkenissen als deze van apocriene klieren Andere weefsels vertoonden geen positiviteit Tabel 1 Immunohistochemie van GCDFP-15 2.3.3.2 Onderzoek 2 Voor een onderzoek 13 naar het voorkomen van antilichamen tegen GCDFP-15/gp17, werden drie soorten stalen van vrouwen onderzocht: borstcarcinoma s; benigne borstaandoeningen bij gezonde vrouwen; tumoren met een ander origine dan de borst. De hoogste concentratie anti-gcdfp-15/gp17 antilichamen werd terug gevonden bij patienten met hoog kwaadaardige ductale of lobulaire carcinoma s van de borst en bij patiënten met fibrocystische veranderingen (fibreuze dysplasie). Er is geen verband tussen het voorkomen van het antilichaam en de grootte van de tumor of de leeftijd van de patiënt. Het besluit van dit onderzoek is dat er mogelijkheid is dat de anti-gcdfp-15/gp17 immuunreactie als hulpmiddel kan worden gebruikt bij onderzoek van de progressie van borstaandoeningen. 14 12 Referentie 6 in literatuurlijst 13 Referentie 23 in literatuurlijst 14 Referentie 23 in literatuurlijst 20
Literatuurstudie 2.3.3.3 Onderzoek 3 Een ander onderzoek 15 gaat over de expressie van GCDFP-15 in borsttumoren met coexpressie van androgeen receptor (AR) en prostaat specifiek antigen (PSA) expressie. Androgenen reguleren via AR-gemedieerde mechanismen de proliferatie van borsttumorcellen. Tijdens het onderzoek werden 72 primaire borsttumoren immunohistochemisch gekleurd en werd gekeken naar de expressie van AR en twee androgeen-gereguleerde eiwitten, namelijk PSA en GCDFP-15. AR immunoreactiviteit wordt teruggevonden in de kernen van borsttumorcellen en wordt in verband gebracht met oestrogeen receptor (ER) en progesteron receptor (PR). PSA en GCDFP-15 worden teruggevonden in het cytoplasma van tumorcellen. 85% van de borsttumoren vertoonden positiviteit voor AR. 98% van de PSA-positieve tumoren en 92% van de GCDFP-15-positieve tumoren waren ook positief voor AR (zie tabel 2). Soort weefsel positief voor AR Procent Borsttumoren 85 % PSA-positieve tumoren 98% GCDFP-15-positieve tumoren 92% Tabel 2 Positieve immunohistochemie voor AR Een positieve reactie voor PSA in de prostaat en GCDFP-15 in borsttumoren is sterk afhankelijk van AR, maar onafhankelijk van de leeftijd de patiënt, ER en PR. PSA immunoreactiviteit wordt meer bemerkt in sterk gedifferentieerde tumoren en is geassocieerd met GCDFP-15 immunoreactiviteit. Als besluit wordt aangenomen dat de PSA en GCDFP-15 immunoreactiviteit afhankelijk is van het voorkomen van AR, maar niet van ER of PR in primaire borsttumoren. 16 15 Referentie 19 in literatuurlijst 16 Referentie 19 in literatuurlijst 21
Literatuurstudie 2.3.3.4 Onderzoek 4 In een laatste onderzoek 17 wordt de expressie van PIP (GCDFP-15) nagegaan, op RNA niveau, in benigne epitheelweefsel en adenocarcinoma van de prostaat. Er wordt gebruik gemaakt van de Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Hierbij wordt een kleine hoeveelheid DNA of mrna via PCR vermeerderd. DNA bestaat uit nucleotiden. Tijdens de eiwitsynthese (zie figuur 4) wordt de code van de genen overgeschreven naar messenger RNA (mrna). Dit heet transcriptie en vindt plaats in de kern. Het mrna wordt door ribosomen afgelezen. Drie nucleotiden (codon) worden vertaald naar één aminozuur. Een reeks verbonden aminozuren vormen een eiwit. Door het gebruik van RT-PCR kan men een grotere hoeveelheid mrna aanmaken waardoor deze hoeveelheid detecteerbaar is. 18 Figuur 4 Eiwitsynthese 18 De dectectie vindt plaats met behulp van fluorescentie. Tijdens het onderzoek wordt, met behulp van RT-PCR, een kleine hoeveelheid (6%) aan PIP mrna teruggevonden in het normale prostaatweefsel. Indirecte immunohistochemie, waarbij gebruik gemaakt wordt 17 Referentie 29 in literatuurlijst 18 Referentie 24 in literatuurlijst 22
Literatuurstudie van een monoklonaal antilichaam 3E7, vertoonde positiviteit voor het benigne epitheelweefsel in 29,6%. Hoewel, bij het gebruik van de indirecte methode (immunohistochemie) bij primaire prostaatcarcinoma s steeg het percentage naar 56,1%. Kwantitatieve RT-PCR toonde aan dat de graad aan PIP-transcriptie hoger was in tumorweefsel, in vergelijking met normaal prostaatweefsel (zie tabel 3). Normaal prostaatweefsel Prostaatcarcinoma PIP mrna (RT-PCR) 6 % > 6% 3E7 (immunohistochemie) 29,6 % 56,1 % Tabel 3 Vergelijking resultaten RT-PCR en immunohistochemie Als besluit werd gesteld dat benigne prostaatepitheel weinig PIP tot expressie brengt, in vergelijking met prostaatcarcinoma s die PIP teveel tot expressie brengen. 16 23
Materiaal en methode 3 Materiaal en methode 3.1 GCDFP-15: op punt stellen van de immunohistochemische kleuring De eerste stap in dit onderzoek is de expressie van GCDFP-15 nagaan in normaal weefsel dat het antigen tot expressie brengt. De gebruikte immunohistochemische kleuringtechniek wordt hiermee op punt gesteld. Er wordt gezorgd dat de achtergrondkleuring minimaal is door aanpassen van de concentratie van het antilichaam (1/20, 1/40, 1/80, 1/160 en 1/320) en er enkel kleuring is waar GCDFP-15 aanwezig is in het biopt met de sterkst mogelijke intensiteit. Drie stalen, waarvan men weet dat het weefsels zijn die GCDFP-15 tot expressie brengen, worden gebruikt als positieve controles voor de kleuring. Ten tweede wordt nagegaan welke subtypes van borsttumoren GCDFP-15 tot expressie brengen. De verschillende onderzochte subtypes zijn ductale, lobulaire, tubulaire en medullaire carcinomen. Hiervoor worden verschillende stalen behandeld met anti-gcdfp-15 (NCL-L-GCDFP-15) en wordt microscopisch gekeken of er al dan niet kleuring te zien is. Uit dit onderzoek besluit men welke borstcarcinoma s al dan niet positief kleuren en of er eventueel een patroon kan worden herkend. Een derde stap is nagaan of anti-gcdfp-15 kan gebruikt worden als merker voor maligniteit in prostaatweefsels. Er worden enkele stalen, afkomstig van de prostaat met normaal en kwaadaardig weefsel, immunohistochemisch gekleurd en daarna bekeken. Men besluit of GCDFP-15 wel of niet kan gebruikt worden bij onderzoek naar prostaattumoren. 3.2 Materialen 3.2.1 Apparatuur en benodigdheden Cassettes en bijhorende dekseltjes Figuur 5 Cassette met deksel 24
Materiaal en methode Microm HMP 110 Paraffinetoestel waarin de cassettes worden geparaffineerd. Figuur 6 Microm HMP 110 Medite medizintechnik Met dit toestel worden de biopten vanuit de cassettes manueel ingebed in vloeibare paraffine en ondergaan stolling op de koelplaat waardoor een paraffineblokje gevormd wordt. Figuur 7 Medite medizintechnik Microm HM 350 S Met de hulp van dit automatisch toestel (microtoom) worden van de paraffineblokjes coupes gesneden met een dikte van ongeveer 5 μm. Figuur 8 Microm HM 350 S 25
Materiaal en methode Gecoate draagglaasje en dekglaasjes (24 x 32mm) Product Merk Lotnr. Ref.nr. Vervaldatum Silanized Slides DakoCytomation 00009242 S3003 2012-04 Verwarmplaat op ongeveer 37 C Microgolf op 360 Watt of 600 Watt Droogstoof op ongeveer 60 C Dako Autostainer Plus Toestel en de bijhorende software die instaan voor de immunohistochemische kleuring van draagglaasjes. Serial no. S38-7146 Firma: DakoCytomation Figuur 9 Dako Autostainer Plus Shandon Varistain 24-4 Dit toestel kan verschillende programmaties bevatten, zoals kleuren waar een volledige cyclus wordt doorlopen, maar ook deparaffineren waar enkel de eerste zes stadia worden uitgevoerd (zie figuur 10). 26
Materiaal en methode Figuur 10 Shandon Varistain 24/4 3.2.2 Reagentia Product Merk Ref. nr. Lotnummer Vervaldatum Gevaarssymbool Methanol Brenntag 1230 / / Tolueen (Toluol) Brenntag 1294 / / Paraffine Labonord 700914 6148431 2012-03 Licht ontvlambaar/ giftig Licht ontvlambaar/schadelijk Formaldehyde 35 % VWR 71250502 902.409. 010 Stick-on Ethanol 99% Labonord Klinipath 23461001 8 72920202 5 1104760 0 KP RS04834 0043 2010-09 Giftig 2005-01 / 2009-11 Licht ontvlambaar Alcohol 90 % Conforma 07H02/V2 8552 756D419 F11 2010-07 Licht ontvlambaar Alochol 70% Conforma 07F19/V2 8216 756D967 F11 2010-06 Licht ontvlambaar 27
Materiaal en methode Ammoniak VWR 07C2005 10 11.331.0 00 2009-03 Corrosief/ Schadelijk voor het milieu 01C1300 HCl min. 37% UCB / 2006-02 25 Corrosief Dako REAL Antibody Diluent Dako 00039006 S2022 2009-06 / Dako Wash Buffer 10 Dako 00037563 S3006 2008-09 / Dako REAL Target Retrieval Solution Dako 00035900 S2031 2008-07 / (10x), ph 6 Dako Target Retrieval Solution, ph 9 (10x) Dako 00040234 s2367 2009-01 / Canadabalsem Hematoxyline Eosine VWR 07/12050 6 Wordt zelf gemaakt Wordt zelf gemaakt 21.776.1 83 Tabel 4 Gebruikte reagentia 2012-09 Ontvlambaar 3.3 Methoden 3.3.1 Bewerking van het staal Biopsies, die in 3,5% formol gefixeerd zijn, worden macroscopisch bekeken. Indien nodig worden stukken versneden tot een maximale dikte van 3-4 mm zodat ze in cassettes passen. Dit wordt afgesloten met een dekseltje en terug in 3,5% formol gebracht. Hierna volgt het automatisch paraffineren in de Microm HMP 110: Zes bakjes met methanol, telkens gedurende 1u Eén bakje met methanol, gedurende 1u30 Twee bakjes met toluol, telkens gedurende 1u 28
Materiaal en methode Eén bakje met toluol, gedurende 1u30 Twee bakjes met paraffine (60 C), telkens gedurende 2u De geparaffineerde cassettes worden ingebed in paraffine. Zo komt men tot een paraffineblokje waarin het te onderzoeken biopt aanwezig is. Van deze blokjes worden coupes gesneden op een dikte van 6 μm met behulp van de microtoom en met Stick-on geplakt op een draagglaasje. Dit draagglaasje wordt op een verwarmplaat van ongeveer 37 C gelegd waardoor de coupe zich zal strekken. Indien nodig worden plooien in de coupe rechtgetrokken door de laborant. Daarna worden de coupes gedroogd in de microgolf gedurende zeven minuten bij 360 Watt en extra gedroogd in een droogstoof bij ongeveer 60 C, over nacht. De volgende dag worden de draagglaasjes gedeparaffineerd in de Shandon Varistain: Twee bakjes met toluol, telkens gedurende 4 minuten Eén bakje met ethanol 99%, gedurende 4 minuten Eén bakje met alcohol 90%, gedurende 4 minuten Eén bakje met alcohol 70% met ammoniak NH 3, gedurende 4 minuten Na het deparaffineren worden de draagglaasjes terug in gedemineraliseerd water (A.D.) gebracht. Vanuit A.D. worden ze in een 10 maal verdunde buffer geplaatst, ofwel bij ph 6 ofwel ph 9 (afhankelijk van de te gebruiken antistof) en tweemaal 5 minuten verwarmd bij 600 Watt. Na het verwarmen laat men de draagglaasjes 20 minuten rusten in de warme buffer. Hierna worden ze gedurende 10 minuten overgebracht in een buffer die 0,05% Tween 20 bevat. Na deze stap zijn de draagglaasjes klaar om immunohistochemisch gekleurd te worden. 3.3.2 Immunohistochemie Voor de immunohistochemische kleuring wordt gebruik gemaakt van de Autostainer Plus. Het aantal stalen dat moet worden gekleurd wordt in het software programma van de Autostainer Plus ingegeven, zo ook de nodige antistoffen. Bij elk staal moeten de zones op 29