Symposium Moleculaire Biologie Dr. Apr. Biol. Walter Verstrepen Klinisch Laboratorium ZiekenhuisNetwerk Antwerpen
Dagelijkse kost of delicatesse? 2
Wat is biologie? tak van de biologie basis van biologische activiteit interacties tussen moleculen meer een aanpak dan arsenaal technieken DNA maakt RNA maakt eiwit 3
Hoe het begon 1938 Weaver: biologie verklaarbaar door processen 1944 Avery: verband tussen genen en DNA 1953 Watson & Crick: dubbele DNA helix 1958 Crick: DNA maakt RNA maakt eiwit 1961 Jacob & Monod: messenger RNA 1966 Khorana: genetische code ontcijferd 1983 Mullis: uitvinding PCR 1990 eerste commerciële PCR assay (HLA) 1995 beschrijving TaqMan PCR 4
Opzuivering van DNA en RNA ultracentrifugatie op CsCl-gradiënt 5
Opzuivering van DNA en RNA phenol chloroform extractie (Trizol) 6
Opzuivering van DNA en RNA anionenuitwisseling op (spin) kolommen (Qiagen) 7
Opzuivering van DNA en RNA (magnetische) silica extractie (Boom) 8
(Semi-)automatische extractie Nuclisens minimag Nuclisens easymag 9
(Semi-)automatische extractie MagNA Pure reeks 10
(Semi-)automatische extractie QiaCube QiaSymphony 11
Amplificatie door klonering 12
Southern blot 13
Southern blot om specifieke DNA sequenties op te sporen vraagt relatief veel DNA van goede kwaliteit omslachtig en tijdrovend analoge terminologie andere moleculen: Northern: RNA Western: eiwitten Southwestern: DNA-bindende eiwitten Eastern: posttranslationele modificaties (suikers/lipiden) 14
Hybrid Capture technologie 15
Fluorescent In Situ Hybridization 16
Polymerase chain reaction Kary Mullis 17
PCR enzymatische amplificatie van het substraat veel sneller resultaat minder gevoelig voor DNA degradatie (korte fragmenten) slechts kleine hoeveelheden DNA nodig toegankelijk voor labs niet gespecialiseerd in biologie 18
Low tech PCR 19
Iets minder low tech 20
Automatisatie 21
Eerste commerciële thermocycler Perkin Elmer Cetus 480 22
Verdere evolutie 9600 Perkin Elmer PTC-200 MJR C1000/S1000 Bio-Rad Veriti Life Technologies 23
Kwantitatieve PCR 24
Amplicon hybridizatie LIne Probe Assay 25
NASBA / TMA Isotherme amplificatie EasyQ BioMérieux 26
Strand Displacement Amplification Isotherme amplificatie 27
Loop mediated isothermal amplification (LAMP) Illumigene Meridian Biosciences 28
LAMP http://vimeo.com/13391184 29
Real-time PCR homogeen assay formaat amplificatie en detectie in dezelfde tube signaal opbouw tijdens de reactie sneller want geen post-pcr detectie minder risico op contaminatie kwantitatief verlaagde drempel voor implementatie 30
TaqMan versus Sybr Green 31
Kwantitatieve assay aantal cycli (Ct) is omgekeerd evenredig met logaritme van oorspronkelijke template 32
Förster Resonance Energy Transfer 33
Molecular beacons 34
Scorpions 35
Minor Groove Binder verhoogde smelttemperatuur kortere probe gevoeliger aan mismatchen opsporen van mutaties 36
Combinaties 37
Combinaties 38
High Resolution Melting 39
Eerste real-time PCR cycler 40
De opvolging ABI 5700 ABI 7700 Rotorgene LightCycler 480 ABI 7900 HT 41
Gericht op medische labo s Cobas Amplicor BD Probetec Cobas TaqMan 48 42
De pioniers verschillende platformen verschillende firma s verschillende assay condities beperkt aanbod weinig standardisatie in-house assays 43
Zelf koken? relevante sequenties opzoeken www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank geschikte regio zoeken in uitgelijnde sequenties blast.ncbi.nlm.nih.gov primers en probes ontwerpen volgens bepaalde richtlijnen optimalisatie assay condities methode validatie 44
Wat schaft de pot? enterovirus HSV1&2 en VZV parechovirus B. burgdorferi (Lyme) hmpv N. meningiditis en S. pneumoniae B. pertussis en parapertussis Influenzavirus A en B M. pneumoniae, C. pneumoniae en L. pneumophila T. gondii adenovirus prothrombine mutatie FV Leiden BCL1 translocatie BCL2 translocatie 45
of toch uit eten? Kits en reagentia Artus >> Qiagen Argene >> BioMeriéux Diagenode -Becton Dickinson Nanogen >> Elitech Tibmolbiol -Roche Seegene Platform met reagentia Roche Qiagen BioMérieux Abbott Cepheid Becton Dickinson 46
Waar gaan we naartoe? consolidatie door uitbreiding aanbod integratie extractie opzetten reactie assay meerdere targets tegelijk eenvoudig te bedienen apparatuur 47
Drie gangen Cobas 4800 Abbott m2000 QiaSymphony SP/AS 48
Multiplex Ligation-Dependent Amplification 49
MLPA in real-time 50
Het buffet Doelwit Interne amplificatiecontrole Rhinovirussen/Enterovirussen Influenza A Influenza B Influenza AH1N1v Humaan metapneumovirus Adenovirus Parainfluenza 1 Parainfluenza 2 Parainfluenza 3 Parainfluenza 4 RSV-A RSV-B Corona NL63 Corona OC43 Corona 229E Corona HKU1 Bocavirus Chlamydophila pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila Bordetella pertussis Gen Polyproteïne gen van encephalomyocarditis virus 5 UTR Matrix proteïne gen (M1) Matrix proteïne gen (M1) Neuraminidase gen Nucleocapsid proteïne gen (NP) Hexon gen (H) Haemagglutinin-neuraminidase gen (HN) Haemagglutinin-neuraminidase gen (HN) Haemagglutinin-neuraminidase gen (HN) Haemagglutinin-neuraminidase gen (HN) Major nucleocapsid proteïne gen (NP) Major nucleocapsid proteïne gen (NP) Nucleocapsid proteïne gen (NP) Nucleocapsid proteïne gen (NP) Nucleocapsid proteïne gen (NP) Nucleocapsid proteïne gen (NP) Noncapsid (NP1) gen Major outer membrane (OmpA) gen Cytadhesin proteïne gen (P1) Macrophage inhibitor potentiator gen (mip) Pertussis toxin promoter gen (PT) 51
xtag technologie 52
MassTag technologie 53
Plex-ID PCR/ESI-MS 54
Fast food GeneXpert modulair instrument afgesloten cartridge extractie, amplificatie en detectie in één enkele minuten hands-on time beperkte opleiding niet goedkoop aanbod aan testen groeiende MRSA VRE MTB + rifar C. difficile GBS Influenzavirus enterovirus FII mutatie en FV Leiden BCR-ABL 55
Nieuwe tent 56
Opening soon Biocartis 57
Alles in één FilmArray 58
Makkelijk nu beschikbaar Respiratory panel 24 targets in ontwikkeling Blood ID panel: bacteria/fungi GI panel: bacteria/virus/protozoa Biothreat panel 59
Sanger sequencing 60
Capillaire sequencers ABI 310 ABI 3500 ABI 3730 61
Next Generation Sequencing Verschillende platformen 62
Next Generation Sequencing Werkwijze 63
Next Generation Sequencing GS Junior Roche Helicos 64
Next Generation Sequencing 65
Emulsie PCR 66
Emulsie PCR 67
Pyrosequencing 68
Pyrosequencing 69
Pyrosequencing 70
Next Generation Sequencing Specificaties 71
Next Generation Sequencing 72
Next Generation Sequencing krachtige maar complexe technologie capaciteit enorm gestegen (500x) goedkoop per base, nog duur per run vereist expertise in biologie en bio-informatica zal technisch nog sterk evolueren reeds verspreid in medische genetica mogelijke toepassingen in medisch laboratorium voorlopig nog beperkt: somatische mutaties (personalized medicine) pharmacogenomics? 73
Digital PCR 74
Nabije toekomst geïntegreerde systemen één platform automatiseerbaar hogere throughput contaminatie? flexibiliteit? grotere schaal centraal black box instrumenten eenvoudige bediening gesloten systeem weinig interpretatie geen speciale opleiding nodig geen speciale omgevingseisen random access dringende en 24/7 onderzoeken kleinere labo s perifere sites 75
Start to PCR? behoefte/meerwaarde? aantal aanvragen? doorlooptijd? frequentie? alleenstaand of in panel? graad van automatisatie? koppeling met LIS? flexibiliteit? open of gesloten architectuur? gespecialiseerd personeel? KOSTPRIJS! 76
Dagelijkse kost of delicatesse? 77