Chromosomen en ploïdie: basisbegrippen voor de plantenveredelaar
Ploïdie: veroorzaakt soms problemen in kruisingsveredeling Ploïdie: biedt mogelijkheden voor veredelaars 2
Overzicht Basisbegrippen Kwantificeren: Chromosoomaantal Ploïdiegetal Genoomgrootte Veredeling: Chromosoomstudies Ploïdie Genoomgrootte Praktijkvoorbeelden 3
Basisbegrippen 4
Basisbegrippen Somatische cel Gameten: eicel en pollen 5
Overzicht Basisbegrippen Kwantificeren: Chromosoomaantal Ploïdiegetal Genoomgrootte Veredeling: Chromosoomstudies Ploïdie Genoomgrootte Praktijkvoorbeelden 6
Kwantificeren 1. Chromosoomaantal: totale aantal chromosomen in een celkern 2. Ploïdiegetal: aantal chromosoomsets in een celkern 3. Genoomgrootte: totale hoeveelheid DNA in een celkern 7
1. Chromosoomaantal Wat? Totale aantal chromosomen in een celkern Bepaling: microscopische telling Notatie: bv. x=24; 2x=48 8
Microscopie Worteltip Metafase Arbeidsintensief Chromosoomtelling
2. Ploïdiegetal Wat? Aantal chromosoomsets in een celkern Bepaling: microscopisch tellen of afgeleid via flow cytometrie Notatie: bv. 2n=4x 10
Ploïdiegetal Kleinste DNAinhoud Monoploïd= 1 set van chromosomen Diploïd= 2 sets van 7 chromosomen Triploïd= 3 sets van 7 chromosomen Grootste DNAinhoud Tetraploïd= 4 sets van 7 chromosomen 11
Terminologie polyploïden Autopolyploïden: hebben éénzelfde basisstel chromosomen meer dan tweemaal (bv.aaaa); homo- of homeologe chromosomen kunnen paren bij de meiose (ook bij verwante interspecies kruisingen) = polysomische overerving Allopolyploïden: hebben minstens 2 verschillende genomen (bv. AABB) enkel paring tussen homologe chromosomen van hetzelfde genoom bij de reductiedeling (gameten vorming) = disomische overerving 12
Voorbeeld aardbei Octoploïde aardbei: AAA A BBBB: chromosomen van het A en A genoom erven disomisch over, die van B polysomisch Disomisch: uitsplitsing zoals bij diploïden Polysomisch: uitsplitsing is in meer combinaties mogelijk (ook vorming aneuploïden mogelijk) 13
Terminologie Aneuploïd: afwijking in chromosoomaantal bv. 1 chromosoom ontbreekt Haploïd: het ploïdiegetal in de gameten = de helft van het ploïdiegetal in de somatische cel (haploïd monoploïd) 14
Bepaling ploïdiegetal Microscopie: Telling aantal chromosomen, exacte bepaling Bepaling basisgetal: omrekening uit voorkomende hoeveelheden bv. 12, 18, 24, 36: basisgetal 6 Niet altijd een eenduidig basisgetal bv. Begonia: x=11, 13 of 14 15
Bepaling ploïdiegetal Flow cytometrie: relatieve bepaling van de DNA-inhoud 16
Flow cytometrie Cellen worden gekleurd een fluorescente kleurstof (DAPI) die bindt op het DNA Meer fluorescentie = meer DNA inhoud Metingen zijn relatief tegenover een gekende referentie van dezelfde plantensoort!!! 17
Principe 18
19
Ruis Histogram Aantal deeltjes Piek fluorescentie 20
Voorbeeld metingen: diploïd triploïd tetraploïd
Staal voorbereiding staal: <1 cm² jong blad materiaal buffer 1: 400 µl (citroenzuur + tween) choppen filter 100 µm buffer 2: 700 µl (DAPI + Na2HPO4) Voorbereidingstijd: 3 min.
3. Genoomgrootte Wat? Totale hoeveelheid DNA in een celkern (DNA-inhoud, C-waarde) Bepaling: flow cytometrisch Notatie: bv. 2C = 2,5 pg 1 pg = 986,9 Mbp = 0.9869 x 10 9 bp 23
DNA-inhoud Verschillen in DNA-inhoud/genoomgrootte binnen een soort: Grote verschillen: ploïdie verschil? Kleine verschillen: Aneuploïdie? Verschil in chromosoomgrootte? Aanwezigheid sexchromosoom bij tweehuizigen Aanwezigheid van verschillende genomen bij allopolyploïden bv. triploïde banaan AAB en ABB onderscheiden 24
Flow cytometrie: DNA-inhoud Ploïdie: Bepaling met DAPI Binding op A en T in het genoom Genoomgrootte: Bepaling met propidium iodide Binding op C T A en G in het genoom PI Dapi 25
File: staal_001_014 Date: 03-02-2006 Time: 13:57:48 Particles: 2015 Acq.-Time: 271 s 100 partec PAS Aantal deeltjes counts 80 60 40 20 Meting gebaseerd op propidium iodide kleuring (A-T C-G) eventueel baseverhouding met DAPI (A-T) 0 0 50 100 150 200 25 0 FL1 Fluorescentie: DNA-inhoud 26
Genoomgroottes staal Verhouding tot referentieplanten: totale genoomgrootte uitgedrukt in pg of Mbp Aantal deeltjes Fluorescentie: DNA-inhoud Referentie plant Referentieplant: bv. erwt 2C=9,39 pg piek op 280; staal piek op 210 => 2C=(210/280)*9,39=7,04 pg
Ter vergelijking Mens: x=23; 1C=3,5 pg Fruitvlieg: x=4; 1C=0,2 pg Hond: x=39; 1C=2,88 pg Buddleja davidii: x=19; 1C=1,34 pg Lelie: x=12; 1C=35,20 pg Bij de angiospermae: 1C=0,1 pg Fragaria viridis tot 127,4 pg Fritillaria assyriaca 28
Notaties Bv. een tetraploide plant met genoomgrootte 4,2 pg en 76 chromosomen in een celkern In een somatische cel: 2n=4x=76, 2C=4Cx=4,2 pg In een gameet: n=2x=38, 1C=2Cx=2,1 pg Opmerking: triploïden fictieve waarde 29
http://data.kew.org/cvalues/ 30
31
32
Overzicht Basisbegrippen Kwantificeren: Chromosoomaantal Ploïdiegetal Genoomgrootte Veredeling: Chromosoomstudies Ploïdie Genoomgroottes Praktijkvoorbeelden 33
Chromosoomstudies in de veredeling Voorbeeld interspecies kruising: verschillend chromosoomaantal Paard x Ezel Ezel x Paard 2n=64 2n=62 2n=62 2n=64 Muilezel / Muildier 2n=63 n=? (steriliteit door aneuploïdie) 34
Fenotypering X Oiseau Blue Red Heart CV Hibiscus syriacus Hibiscus paramutabilis H. syr. Oiseau Blue x H. syr. Red Heart CV H. paramutabilis x H. paramutabilis 1 2 3 4 35
Genotypering: Chromosoomstudies GISH: Genomische In Situ Hybridisatie: bekijken van de introgressie van chromosoomfragmenten
Ploïdie in de veredeling Wijzigen van het ploïdiegetal Verlagen Verhogen Naar een oneven aantal 37
Verlagen van het ploïdiegetal Halveren van het ploïdiegetal: haploïden uit geslachtscellen Opnieuw verdubbelen van haploïden: dihaploïden (homozygotie, snelle inteeltlijn) 38
Vaak steriliteit Oneven ploïdiegetal Langere houdbaarheid van bloemen is soms mogelijk (geen zaadvorming) Kwekersrechter beter beschermd bij steriliteit Geen ongewilde verspreiding (invasieve plant) Vruchten: geen ongewilde zaden (watermeloen, banaan) 39
Onven ploïdiegetal Via kruising bv. 2x X 4x Gameten: x X 2x = 3x Triploid block: verhinderd vorming van triploïden komt vaak voor Triploïden vaak steriel of verlaagde fertiliteit, maar niet altijd en overal! 40
Pollen van triploïde rozen 1600 50 µm pollen opp. (µm²) 1200 800 400 0 The Fairy 2n=2x Bingo Meidiland 2n=3x R. chinensis 2n=2x Heidetraum 2n=3x Bonica 2n=4x Maria Mathilda 2n=4x Lage kieming: 1-2 % maar voldoende voor geslaagde kruisingen 41
Optioneel: sorteren 42
Verhogen van het ploïdiegetal Polyploïde planten komen in de natuur zeer frequent voor (35% van de angiospermen), ontstaan via 2n-gameten Gewijzigde eigenschappen bij tri- of tetraploïden bv. grotere bloemen, kortere, stevigere bloemstengel, dikker (bloem)blad, inhoudsstoffen, opbrengst (DS), Herkenning: meer huidmondjes, groter pollen, grotere cellen, Effect van polyploïdie op bepaalde eigenschappen is vaak weinig onderzocht bv. ziekteresistentie Herstellen van fertiliteit Ploïdie-optimum 43
Verhogen van het ploïdiegetal Mitotische polyploïdisatie: Somatische chromosoom verdubbeling Colchicine, trifluraline, oryzaline, Geen homeologe recombinatie Meiotische polyploïdisatie: 2n-gameten FDR of SDR 44
Polyploïdiseren Voorbeeld: cichorei tetraploïd diploïd diploïd diploïd diploïd triploïd tetraploïd Naar specifieke voordelen van tri- of tetraploïden 45
Polyploïdiseren Behandelingen met mitose-inhibitoren: colchicine meristeembehandeling oryzalin trifluralin
Polyploïdiseren zaadbehandeling 47
Polyploïdiseren scheutbehandeling 48
Voorbeeld: in vitro polyploïdiseren Buddleja 2x 4x 49
Resultaten Flow cytometrische analyse op jonge (in vitro) scheuten Mogelijkheid tot ploïdiechimeren of mixoploïden Vaak nemen de cellen met het originele ploïdiegetal weer de overhand 50
Polyploïdiseren: ongereduceerd pollen 51
Opmerking Bij het mitotisch wijzigen van het ploïdiegetal van een kwekersrechterlijk beschermde cultivar (zonder het uitvoeren van een kruising) valt deze gewijzigde cultivar onder het kwekersrecht van de oorspronkelijke cultivar = Essentialy Derived Variety (EDV) 52
Genoomgroottes in de veredeling Interspecieskruisingen: Genoomgrootte verschillen mogelijk Herkenning interspecifieke hybriden Incompatibiliteit? 53
Voorbeeld: interspecies kruisingen Buddleja - genoomgroottes 54
Voorbeeld: interspecies kruisingen Buddleja - genoomgroottes Buddleia davidii 2n=4x=76 chromosomen: 2C=2,76 pg B. x weyeriana: 2n=4x=76 chromosomen: 2C=3,50 pg B. x weyeriana x B. davidii: 2C=3,04 pg 55
Voorbeeld: interspecies kruisingen Buddleja - genoomgroottes Buddleia davidii 2n=4x=76 chromosomen: 2,76 pg B. x weyeriana: 2n=4x=76 chromosomen: 3,50 pg B. davidii x B. x weyeriana: 2,39 tot 2,76 pg 56
Voorbeeld: interspecies kruisingen Buddleja - genoomgroottes Buddleia davidii 2n=4x=76 chromosomen: 2,76 pg B. lindleyana: 2n=2x=38 chromosomen: 1,84 pg B. davidii x B. lindleyana: 2,94 tot 3,32 pg Met 76 chromosomen!!! (ongereduceerde gameten) 57
Overzicht Basisbegrippen Kwantificeren: Chromosoomaantal Ploïdiegetal Genoomgrootte Veredeling: Chromosoomstudies Ploïdie Genoomgroottes Praktijkvoorbeelden 58
Merkwaardige mozaiek 2n=2x 2n=2x Midden 2n=2x Rand 2n=4x 2n=4x 59
Uitgebreid praktijkvoorbeeld: Triticale 60
Triticum monococcum (AA) x Aegilops speltoides (BB) 2n=2x=14 2n=2x=14 Steriel hybride (AB) Spontane verdubbeling Fertiel hybride Triticum turgidum var. durum (AABB) 2n=4x=28 T. turgidum var. durum (AABB) x T. tauchii (DD) 2n=4x=28 2n=2x=14 Spontane verdubbeling Steriel hybride (ABD) T. turgidum var. durum x Secale cereale 2n=4x=28 (AABB) 2n=2x=14 (RR) Spontane verdubbeling Triticale (AABBRR) allohexaploïd 2n=6x=42 Fertiel hybride (AABBDD) x Secale cereale (RR) 2n=6x=42 2n=2x=14 Spontane verdubbeling Triticale (AABBDDRR) allo-octaploïd 2n=8x=56 61
Samenvatting: gebruik van flow cytometrie in de veredeling Haploïden: bv. uit antheren cultuur Ploïdiebepaling ouderplanten Nakomelingen uit interploïdiekruisingen Ploïdieverdubbeling Herkenning interspecifieke hybriden Zuiverheid zaadloten Moeilijker: aneuploïden, sex chromosoom bij tweehuizigen, verschillende genomen 62
Demo flow cytometrie Later deze avond 63