Typering van bloedgroepantigenen: nieuwe technologieën

Typering van bloedgroepantigenen: nieuwe technologieën Donortypering middels genotypering Typering van ongeboren kind met maternaal plasma Masja de Haas, Bloedvoorziening, divisie Research en Diagnostiek, Amsterdam Contact: m.dehaas@sanquin.nl ; tel: +31-20-512 3373

Erytrocyten (glyco)proteinen/lipiden dragen 29 bloedgroep systemen: > 270 antigenen ABO en D en nog veel meer.. ABO H Le a/b I, i P1 P MNSs Luth. LW XG Gerb. Indian Knops Rhesus Duffy Kidd Colton Kx Diego Kell NH 2 NH 2 COO H Cromer Yt Dombrock JMH COOH NH 2 COOH NH 2

Routinematig wordt een deel van de donors getypeerd Erytrocyten ABO, D CcEe, K, k, Fy a, Fy b, Jk a, Jk b, MNSs, P1, Le a, Le b, Lu a, Kp a, C w, Wr a, Co b Trombocyten HLA HPA 1, 2, 3, 5, 15 serologie DNA

Toekomst: van serologie naar DNA typering? extracellulair Serologie RhD Kpa/b Kk C Jsa/b N Fya/b Jka/b N C N C N C translatie Moleculair intracellulair transcriptie nucleus Single nucleotide polymorphisms (SNPs)

Single Nucleotide Polymorphisms Veranderingen die bloedgroepen geven

PCR: vermenigvuldigen van een deel van een gen multiplex PCR: tegelijkertijd veel genfragmenten FY-gen fragmenten JK-gen fragmenten KEL-gen fragmenten RHD-gen fragmenten RHCE-gen fragmenten

Principe van een multiplex PCR met universele primers (1) Gen-specifieke- tagged primers (beperkte hoeveelheid) A T C G T A Eerste PCR cycli: amplificatie via gen-specifieke deel

Principe van multiplex PCR (2): In reactiemengsel ook primers die aan tag binden (overmaat). Eerste cycli C G A T T A A T Latere cycli C G T A

Multiplex PCR met universele primers: robuuste PCR met voor ieder product een vergelijkbare opbrengst M no universal + universal no DNA One simple PCR 15 min 95 C 30 s 94 C 90 s 57 C 45 cycles 90 s 72 C 10 min 72 C 400 300 200 100 MN bigc RHDψ exon 2 C/c KEL1/2 GATA HPA-1 HPA-5 U RHD, JO HPA-15 exon 5 E/e FY1/2 HPA-3 HPA-4 HPA-2 KEL3/4 JK1/2 >30 gen fragmenten

Gen fragmenten aflezen op de array Allel specifieke oligo hybridisatie Verschillen in bindingssterkte tussen een perfecte match en een enkele mismatch bepalen signaal/geen signaal A T C G T A denaturatie hybridisatie Oligo CCCC A T T T TA Spacer Glass Spot 1 Spot 2

Microarray: vele manieren van vangen, labelen en lezen op vaste dragers en op bolletjes T A tag minisequencing ddatp, ddutp, ddgtp, ddgtp TA Tag array Product ja/nee Allel-specifieke verlenging (sequencing)

Bloedgroepgenotyperen het typeren van de toekomst? Transfusion The Journal of AABB May 2005 - Vol. 45 Issue 5 Page 651-824

BloodGen: to develop red blood cell typing microarray Design of BloodChip

BloodChip s multiplex PCRs MPX PCR 1 ABO + RHD MPX PCR 2 RHCE, KEL, JK, FY, MNSs CO, DI, DO Cy-3 label Cy-5 label Hybridiseren aan de BloodChip

High-throughput genotypering met DNA microarray microscoop glaasje Spots: allel-specifieke oligonucleotiden (probes) BloodChip: >6000 spots Typering voor 116 SNPs, 176 allelische varianten

High-throughput genotypering PCR product (gelabeld) opbrengen Wassen: alleen spots met een volledige match zullen duidelijke fluorescentie laten zien

Hyb station to standardize hyb conditions Neil D. Avent et al. (2007) The BloodGen project: toward mass-scale comprehensive genotyping of blood donors in the European Union and beyond. Transfusion :s1, 40S 46S

BloodChip resultaat

BloodChip typering ABO : 33 Genotypes RHD : 87 Genotypes (D-null, partial D, weak D and Del) RHCE : 9 alleles: C/c; E/e; Cw; Cx; VS, cear, r s KEL : 8 alleles: K/k; Kpa/Kpb/Kpc; Jsa/Jsb; Kmod JK : 4 alleles: Jka; Jkb; Jknull1N5; Jknull871 FY : 4 alleles: Fya; Fyb; FyGATA: Fyx MNSs: 9 alleles: M; N; S; s; MNS230; MNS790; MNS-IVS5+5 DI : 2 alleles: Dia; Dib DO: 2 alleles: Doa; Dob CO: 2 alleles: Coa; Cob MNSs Do Jk Di Co ABO Fy K RHCE RHD

BloodChip resultaten eerste 531 BloodGen samples In 529 cases: serologie in complete overeenstemming met chip 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 A B A B O D pos D u/d el/part D ne g C C C c cc C w EE Ee ee K K K k Genetisch D pos, serologisch D neg, n=1 kk Genetisch B, serologisch O, n=1

BloodChip resultaten eerste 531 BloodGen samples In 529 cases: serologie in complete overeenstemming met chip 250 200 150 100 50 0 Fy(a+b-) Fy(a+b+) Fy(a-b+) Fy(a-b-) Jk(a+b-) Jk(a+b+) M+N+ M-N+ Jk(a-b+) M+N- S+s- S+s+ S-s+ Genetisch Fyx, serologisch Fy(a+b-), n=2

Bloedgroep genotypering wordt nu alleen gebruikt als het niet anders kan : Geen erytrocyten beschikbaar Na transfusie Prenatale typering Serologische typering niet mogelijk is door autoantistoffen Bloedgroep variant Geen typeringsreagens

Patient met RhD typering probleem Zwakke expressie van het D antigeen. D variant of zwak D antigeen? Huidige work-up: 1) Serologische analyse: twee sets typeringsreagentia 2) DNA analyse: MPX-D 3) RHD sequencing TC CG G G A C 7 A C

Bloedgroepgenotypering High-throughput genotypering: Onbeperkt aantal bloedgroepantigenen in een keer Hoog-frequente antigenen Trombocyten antigenen HLA???? Varianten in een keer geanalyseerd Complete bloedvoorraad volledig uittyperen! Cave silent allelen, ABO altijd serologisch! Nooit meer zoeken naar een byzondere donor

Foetale RHD, RHc, RHE, K1 of HPA-1a typering met DNA geisoleerd uit maternaal plasma

Moederlijke irregulaire erytrocyten antistoffen (IEA) kunnen hemolytische ziekte bij de foetus veroorzaken Kans op afbraak: indicatie foetale bloedgroepantigeentypering

Apoptotische syncytiotrofoblast is waarschijnlijk de bron van foetale DNA in moederlijk plasma Foetaal DNA al aanwezig voor de aanleg van een foetoplacentaire circulatie (vanaf 5 weken zwangerschapsduur) Hoge turn-over rate van de trofoblast tijdens de zwangerschap: ongeveer 3 g wordt per dag in de moederlijke circulatie losgelaten (Ikle 1958) Snelle klaring na de bevalling (t1/2=15 min)

Non-invasive fetal RHD typing in maternal blood Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum Lo et al., Lancet, 1997. Detection of fetal RhD-specific sequences in maternal plasma. Faas et al., Lancet, 1998 Prenatal diagnosis of fetal RhD status by molecular analysis of maternal plasma. Lo et al., New England Journal of Medicine, 1998 Foetale RHD typering met DNA geisoleerd uit maternaal bloed, diagnostische typering sinds 2004

Voorbeeld positief test resultaat 450 pg 45 pg Threshold Erboven positief signaal 4500 pg Maternaal plasma sample Positief Ct 37

Cel-vrij foetaal DNA in moederlijk plasma Extreem lage concentratie: 16e week: 23 genoom equivalenten/ml (range 3-145 geq/ml) 30e week: 79 genoom equivalenten/ml (range 3-700 geq/ml) Overmaat moederlijk cel-vrij DNA: 11-17 weken : 3,4 % foetaal DNA (range: 0,4-12%) 37-43 weken : 6,2 % foetaal DNA (range: 2,3% - 11,4%) Range of Fetal DNA 30 th week 16th week numbers 60 50 40 30 20 10 0 0-50 100-200 300-400 500-600 700-800 900-1000 1100-1200 1300-1400 1500-2000 >2500 DNA concentration (Pg/ml)

Detectie van foetale RHD sequenties is relatief simpel omdat het moederlijke RHD allel afwezig is RHD homoloog met RHCE allel, maar wel mogelijk: TaqMantechnologie RHD-exon-7-specifieke forward primer RHD-exon-7-specifieke reverse primer RHD-exon-7-specifieke probe Fetal RHD sequence Fetal RHc sequence Maternal RHC sequence

Detectie van foetale RHD sequenties is relatief simpel omdat het moederlijke RHD allel afwezig is Foetale RHc PCR (Finnig, IBGRL, UK): Allel-specifieke forward primer Allel-specifieke reverse primer Probe niet specifiek Foetale RHE PCR (Finnig, IBGRL,UK) Allel-specifieke forward primer Reverse primer en probe niet allel-specifiek Fetal RHD sequence Foetale K1 en HPA-1a PCR (): Allel-specifieke reverse primer Forward primer en probe niet allel-specifiek Met blokkerende PNA probe Fetal RHc/RHE/K1 /HPA-1a sequentie Maternal RHC/RHe/K2/ HPA-1b sequentie

Y-chromosoom specifieke PCR (SRY) Te gebruiken in 50% van de zwangerschappen STR-PCR (forensisch onderzoek/vaderschapsonderzoek) Niet gevoelig genoeg foetale DNA is < 5% van het plasma DNA Bi-allelische insertie/deletie polymorphismen Stretches van >4 nucleotiden verschil Allel frequentie: 0.5

Foetale RHD typering met moederlijk plasma RHD PCRs en SRY PCR RHD-PCRs positief RHD-PCRs negatief SRY-PCR positief SRY-PCR negatief RhD-positief RhD-negatief

Detectie van paternale merker met DNA geisoleerd uit maternaal plasma met biallelische merker S6 NB sensitiviteit merker =sensitiviteit SRY/RHD PCRS

Foetale RHD typering met moederlijk plasma RHD PCRs and SRY PCR RHD-PCRs positief RHD-PCRs negatief SRY-PCR positief SRY-PCR negatief Paternale merker typering DNA moeder en vader Paternale merker positief Paternale merker niet beschikbaar RhD-positief RhD-negatief Geen conclusie

Toekomst: Universele foetale DNA merker? Tumor-suppressor genen uitgezet in placenta Hypermethylated RASSF1A in maternal plasma: A universal fetal DNA marker that improves the reliability of noninvasive prenatal diagnosis. Chan et al., Clin Chem. 2006 Dec;52(12):2211-8 Plasma DNA digesteren met methylering-gevoelige restrictie enzymen: alleen foetale RASSF1A sequenties resistent en vervolgens amplificeerbaar

Uitkomsten diagnostisch protocol (2004-tot 1 jan 2007; n=122)* test RHD SRY SPM Number Fetal RHD Pos Pos nt 26 n=65 Pos Neg nt 17 Neg Pos nt 10 Neg Neg Pos 11 Neg Neg Not avail./ Neg/Inconcl. 1 Fetal Sex nt Pos nt 29 n=57 nt Neg Pos 22 nt Neg Not avail./ Neg/Inconc. 6 N=206 op 1/7/2007

Laboratorium-en klinische vervolgdiagnostiek op basis van niet-invasieve antigeentypering van de foetus IEA specificiteit Anti-D, c, E, K Overige IEA specificiteiten Foetale D, c, E, of K typering in maternaal plasma Typering vader Kind negatief Kind positief Geen vervolg diagnostiek Vervolg titer en ADCC Evt klinische diagnostiek

Vervolg tabel uitkomsten diagnostisch protocol 2004-augustus 2006 Geen conclusie: 7 gevallen: Geen paternale merker beschikbaar (n=1) Alleen heterozygote paternale merkers met negatief plasma resultaat (n=3) Aspecifieke amplificatie moederlijk DNA in controle (n=3) In alle gevallen meisje geboren. Indien uitkomst bekend (RhD fenotype en sexe): 81/122, altijd conform. 35 / 65 RhD status 46 / 57 geslachtstyperingen Gestreefd naar terugvragen 100% uitkomstgegevens

Wat was de winst?

Landelijk preventieprogramma: antenatale en postnatale anti-d immunoglobuline profylaxe bij RhD-negatieve vrouwen. Huidige programma, antenatale anti-d profylaxe zwangerschap 12e week ABO, D typering IEA screen 30e week ABO, D typering IEA screen Antenatale anti-d profylaxe; indien nog geen levend kind Na de geboorte ABO, D typering van navelstrengbloed Anti-D-Ig indien kind D positief 40% van de D-negatieve vrouwen is zwanger van D negatief kind anti-d is bloedproduct afkomstig uit plasma van vrijwillig gehyperimmuniseerde donors

Routine foetale RHD typering om antenatale anti-d profylaxe te kunnen beperken tot de risico-groep: D-negatieve zwangeren die een D-positief kind dragen. Doel van de NWO-ZONMw doelmatigheidsstudie (vdschoot/bonsel): Ontwikkeling en validatie van een niet-invasieve, high-throughput, geautomatiseerde foetale RhD typeringsassay Ingesloten aantal samples: n=2500 1000 copie s 10 copies 100 copies Barcode-gestuurde pipetteerrobot DNA-isolatie robot (MagNaPure, Roche) Real-time kwantitatieve PCR (ABI, TaqMan)

Foetale RHD typering in week 28-32: 99.1% van de genotyperingen in overeenkomst met serologische typering (n=1257) Navelstreng bloed D+ Navelstreng bloed D- PCR D+ PCR D- 787 5 3 458

Met foetale RHD typering in moederlijk plasma; alternatief scenario zwangerschap 12e week ABO, D typering IEA screen 27e week ABO, D typering IEA screen Foetale RHD typering 30e week Anti-D-Ig; Indien zwanger van D positief kind Alle zwangeren? Geen levend kind? Na de geboorte ABO, D typering van navelstrengbloed Anti-D-Ig indien kind D positief alle zwangeren? Geen levend kind?

Met foetale RHD typering in moederlijk plasma; alternatief scenario zwangerschap 12e week ABO, D typering IEA screen 27e week ABO, D typering IEA screen Foetale RHD typering alle zwangeren? Geen levend kind? 30e week Anti-D-Ig; Indien zwanger van D positief kind Alle zwangeren? Geen levend kind? Na de de geboorte ABO, D typering van navelstrengbloed indien foetale D typering negatief Anti-D-Ig indien kind D positief Direct anti-d-ig indien kind D positief bij foetale D typering of na navelstrengbloedtypering

Conclusies Niet-invasieve foetale RhD genotypering in 30e week is minstens zo betrouwbaar als serologische bepaling in navelstrengbloed (>99% diagnostische accuratesse).

Test-eisen verschillen voor niet-invasieve foetale RHD typering ten behoeve van: Screening voorafgaand aan anti-d Ig profylaxe versus Risicoschatting bij alloimmunisatie Beperkt aantal fout-negatieve en fout-positieve uitslagen is aanvaardbaar Screen in week 27-30 Bij negatieve RHD PCRs; bevestiging aanwezigheid foetaal DNA niet nodig Sensitiviteit van 100% (fout-positieve resultaten minimaliseren) Week 12-16 Bij negatieve RHD PCR uitslag: bevestiging van aanwezigheid van foetaal DNA vereist

Met dank aan: Goedele Cheroutre Sigrid Beiboer Ellen van der Schoot Research Research Research Bernadette Bossers Lianne Schuitemaker Peter Ligthart Diagnostiek Diagnostiek Diagnostiek Chantal Nijman Marijn Bogaerts Petra Maaskant-van Wijk Bloodgen Consortium ZW ZW ZW Speciale groet van de Nederlandse Vereniging voor de Bloedtransfusie, NVB