Bloedgroeptypering op DNA

Transcriptie

1 Bloedgroeptypering op DNA Barbera Veldhuisen Immunohematologie Experimenteel (IHE) Immunohematologie Diagnostiek (IHD) Sanquin Amsterdam March 4,

2 Van belang bij: Typeren van bloedgroepen Transfusies - patiënten - donoren voorkomen van transfusiereacties Prenatale diagnostiek - zwangeren voorkomen van hemolytische ziekte van de foetus en pasgeborene (HZFP)

3 Bloedgroeptypering Typering op erytrocyten serologisch typering rode bloedcellen + antistoffen tegen bepaald antigeen Typering op DNA moleculaire typering witte bloedcellen voor DNA isolatie voorspelling van fenotype op rode bloedcellen

4 Bloedgroepen: verschillen in DNA direct Bloedgroep antigenen mrna eiwit transcriptie translatie DNA mrna enzym Bloedgroep antigenen indirect Genotypering Serologie

5 Bloedgroep - polymorfismes Single nucleotide polymorphisms (SNP) aminozuur verandering eiwit (b.v. Jk a /Jk b ) A B Verschillende haplotypes verschil in functie van eiwit/enzym (b.v. ABO) Genuitwisselingen (b.v. RH) RHD RHE RHD r s allel ( ()ce s ) (3.6%) Gendeleties of nulmutaties (b.v. RHDneg of Fy a /Fy b negatief) gata Fy a /Fy b

6 RH bloedgroepsysteem 1 D-negatief RHD gen RHE gen 1 chromosoom 1 RHD gen deletie r s allel - ()cde s RHD pseudogen - RHDΨ

7 International Society of Blood Transfusion (ISBT) 30 verschillende bloedgroepsystemen MN S LU LW XG GE IN KN OK S N KEL Lan Jr(a) RH JK O XK DI GIL RAPH FY RHAG ROM YT DO JMH GPI N H/RG: binding aan RB ABO H LE I GLOB P1 Vel At(a) Emm AnWj Sd(a) Pel ABTI MAM N N Sanquin

8 DNA isolatie uit volbloed entrifugeren van volbloed Bloedplasma: moederlijk en foetaal celvrij DNA Buffy coat: genomisch DNA Rode bloedcellen: serologische typering

9 Wanneer moleculair typeren (genotyperen)? Geen erytrocyten beschikbaar na transfusie na beenmerg- of stamceltransplantatie foetus positieve DAT sterke auto-agglutinatie Geen testreagentia b.v. Do a / Js a Bij (zeldzame) varianten RHD varianten ABO varianten FY varianten Bij grote series b.v. bloeddonoren

10 Allelische discriminatie test Genotypering d.m.v. allelische discriminatie (real-time PR test) DAR gen chromosoom 1 Fy a 5' 3' 3' 5' SNP Fy a /Fy b Fy b

11 Real-time PR test Sample Name controle controle cc controle cc controle c controle c controle NT NT Sample1 Sample1 Sample2 Sample2 cc c t: -test 28,81 28,75 Und Und 29,18 28,95 Und Und Und Und 29,81 29,84 t: c-test Und Und 26,75 26,70 27,25 27,36 Und Und 26,90 26,88 27,74 27,78

12 Wanneer moleculair typeren (genotyperen)? Geen erytrocyten beschikbaar na transfusie na beenmerg- of stamceltransplantatie foetus positieve DAT sterke auto-agglutinatie Geen testreagentia b.v. Do a / Js a Bij grote series b.v. bloeddonoren Bij zeldzame varianten RHD varianten ABO varianten FY varianten

13 asus: typeren zeldzame antigenen Vrouw Antistoffen tegen: Do a, Fy a en K Anti-Do a : mogelijke afbraak erytrocyten Donor die Do a en Fy a en K negatief is Serologische typering Fy a en K van donoren mogelijk Geen commercieel anti-do a reagens genotyperen van donoren (SNP in ART4 gen chr12) d.m.v. allelische discriminatie test

14 asus: typeren van zeldzame antigenen Genotypering donoren: selectie compatibele donoren mogelijk Inmiddels groot aantal donoren getypeerd voor Do a en Do b Vergelijkbare situatie voor Js a Genotypering i.p.v. fenotypering i.v.m. ontbreken reagens

15 Wanneer moleculair typeren (genotyperen)? Geen erytrocyten beschikbaar na transfusie na beenmerg- of stamceltransplantatie foetus positieve DAT sterke auto-agglutinatie Geen testreagentia b.v. Do a / Js a Bij grote series b.v. bloeddonoren Bij zeldzame varianten RHD varianten ABO varianten FY varianten

16 Grootschalige genotypering Grootschalige genotypering voor grote series: - Veel monsters; veel bloedgroepantigenen in 1 test typeren - Per test voor elk monster veel antigenen tegelijkertijd B.v. Bloodchip (IDore+) Progenika BLOOD GROUP GENOTYPES PHENOTYPES RhE x, w,, c, E, e, r s, cear x, w,, c, E, e, VS Kell K, k, Kpa, Kpb, Kmod-1, Jsa, K, k, KPA, KPB, Kmod-1, JSA, JSB Jsb Kidd JKA, JKB, Jknull(IVS5-1G>A), Jknull (871T>) Jka, Jkb Duffy FYA, FYB, FyGATA, Fyx Fya, Fyb MNS M, N, S, s, GYPB del, GYPB(230>T), GYPB(IVS5+1G>A), M, N, S, s, U, Mia GYPB(IVS5+5G>T), GpMur Diego DIA, DIB Dia, Dib Dombrock DOA, DOB, HY, JO Doa, Dob, Hy, Joa olton OA, OB oa, ob artwright YTA, YTB Yta, Ytb Van DNA tot uitslag 5-6 uur

17 IDcore+ results genotype fenotype

18 Grootschalige bloedgroepgenotypering Platform Beadchip Bedrijf BioArray Solutions, USA Array Beads Bloedgroepen MNS, RHE LU, KEL, FY, JK, DI, DO, O, S, LW Antigenen 24 SNPs 18 Duur 96 samples in 5 uur Referentie Hashmi et al. 2005, 2007 BLOODchip IDore+ Progenika Biopharma Spain Glass Beads ABO, MNS, RHD, RHE KEL, FY, JK, DI, DO, O > samples/10 uur 96 samples/5 uur Avent et al GenomeLab SNPstream GenomeLab SNPstream Beckman 384 wells oulter, USA plate Beckman 384 wells oulter, USA plate MNS, RHD, RHE, KEL, FY, JK, DI HPA1 MNS, RHE, KEL, FY, JK, HPA1,2 en samples in 36 uur 600,000 genotypes per dag Denomme et al Montpetit et al Luminex xmap Luminex orp., USA Beads MNS, KEL, FY, JK, O, LU x 96 samples in 1 dag per bloedgroep Karpasitou et al. 2008

19 Wanneer moleculair typeren (genotyperen)? Geen erytrocyten beschikbaar na transfusie na beenmerg- of stamceltransplantatie foetus positieve DAT sterke auto-agglutinatie Geen testreagentia b.v. Do a / Js a Bij grote series b.v. bloeddonoren Bij (zeldzame) varianten RHD varianten ABO varianten FY varianten

20 asus: typeren van RHD variant Vrouw, 27 weken zwanger Serologisch: RHD negatief Foetale RhD typering positief (celvrij DNA plasma) t exon 5: 34 / 35 / 34 t exon 7: 28 / 28/ 29 Real-time PR moeder (buffy coat) positief voor exon 7 negatief voor exon 5 Heeft deze zwangere een RhD variant? Genotyperen voor definitieve RhD bepaling

21 MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification genomisch DNA mutatie 1 mutatie 2 A G T T hybridisatie probes PR primer paren mutatie-specifieke probes stuffer sequentie variabele lengte genomisch DNA mutatie 1 mutatie 2 ligatie amplificatie met fluorescent gelabelde PR primer paren Totale tijd 20 uur: 16 uur hybridisatie 2 uur hands-on time

22 MLPA RHD / RHE gen D D D D D D D/E D D D c controle probes D/E RhD/E specifieke probes D D D D D D D D D E D negatief RHD gen afwezig

23 asus: typeren van RHD variant MLPA results Sample: 676: 0 copies 676G: 2 copies ee : 0 copies cc 514A: 0 copies pseudogene M609A: 1 copy pseudogene ontrol sample: Dd cc Ee pseudo gene pseudo gene ee

24 MLPA: RHD zygotiebepaling cc DD EE Oranje: controle monster (Dd) Blauw: test monster 1x controle pieken 2x D D D D D RhD pieken E geen mutatie pieken Test monster heeft 2 RHD genen

25 Voor- en nadelen genotypering Typering uit te voeren als er geen erytrocyten beschikbaar zijn Typeringen mogelijk bij tekort aan serologische reagentia Typering van varianten mogelijk Typering van grote aantallen mogelijk Prenatale typering mogelijk Genotype is voorspelling van het fenotype: Het missen van nulmutaties geeft een foutieve typering Geen probleem voor donoren, wel voor ontvangers Duur??? Ideaal: combinatie serologie en genotypering

26 Wat is er nu mogelijk? D cee D zygotie K1K2 FYAB + GATA-box JKAB MN Ss HPA 1 HPA 2 HPA 3 / 9 HPA 4 / 16 HPA 5 HPA 6 / 7 HPA 12 HPA 13 HPA 15 DOAB JSAB HNA 1 HNA 3 HNA 4 HNA 5

27 Hoe snel kan het??? Meeste typeringen kunnen in 1 werkdag! Spoed: gestreefd naar 1 werkdag. Geen spoed: binnen een week schriftelijke uitslag

28 Acknowledgements Sanquin IHD: Goedele heroutre Peter Ligthart Bernadette Bossers Johan Koster Remco Jonkers Sacha Jansen Sonja de Jong Ahmed Tissoudali Esther Ormskerk-Mochtar Roos Schreuder Tony van Beijeren Margriet Vredeveld Peter Kooyman Mirjam Liberman Heleen Woortmeijer Masja de Haas Sanquin IHE Lonneke Wigman Peter Scheffer Ellen van der Schoot MR-Holland (MLPA) Martin Loden March 4,