COLOFON. Deze editie van het Microlabblad is geheel gewijd aan de onderzoekslijn van het Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek.

134435-MicroLabBlad 01-03-2005 11:32 Pagina 87 MICROL LABBLAD I N F O R M AT I E B U L L E T I N V A N H E T L A B O R AT O R I U M M I C R O B I O L O G I E T W E N T E A C H T E R H O E K Deze editie van het Microlabblad is geheel gewijd aan de onderzoekslijn van het Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek. Steekwoorden hierin zijn: operationele research en moleculair microbiologische technieken. Het laboratorium is verbonden met topklinische opleidingsziekenhuizen die tezamen de grootste niet-academische opleidingssetting in Nederland vertegenwoordigen. Deze ziekenhuizen bieden 14 opleidingen voor medisch specialist. Voor de opleiding tot basisarts lopen co-assistenten stage in deze Twentse ziekenhuizen. Er is een affiliatie met de Faculteit der Medische Wetenschappen in Groningen. Ons streven is om op termijn ook een A-opleiding medische microbiologie aan deze reeks specialisaties te kunnen toevoegen. Onderstaande artikelen moeten u een indruk geven van de onderzoekslijn zoals die op dit moment bestaat. I N H O U D S O P G AV E Voorwoord De diagnostiek van respiratoire infecties Protocolontwikkeling infectiepreventie Operationele research - het opzetten van een polymerase chain reaction (PCR) voor één bepaalde ESBL positieve Klebsiella pneumoniae stam Laboratoriumdiagnostiek van Trichomonas vaginalis De diagnostiek bij infecties van immuungecompromitteerde patiënten 88 89 91 93 97 100 COLOFON Micro Lab Blad is een uitgave van: Redactie: S.D. Meijer E. Roelofsen Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek Burgemeester Edo Bergsmalaan 1 7512 AD Enschede Telefoon: (053) 4313263, Telefax: (053) 4341631 E-mail: info@labmicta.nl Openingstijden: ma.t/m vr. 08:00-18:00 uur, za. en zo. 10:00-11:00 uur Derde jaargang Nummer 4 November 2003

VOORWOORD Ondanks een structurele onderbezetting op stafniveau, streeft ons laboratorium ernaar de A-opleiding Medische Microbiologie te verwerven. Door de visitatiecommissie voor de A-opleiding wordt nauwkeurig gekeken naar de aanwezigheid van consistente onderzoekslijnen, iets waar we de laatste twee jaar veel energie in gestoken hebben. Het hoeven dan wel geen fundamenteel wetenschappelijke onderzoeksinspanningen te zijn, maar ze moeten wel blijk geven van een hoog kennisniveau samen met een grote klinische toepasbaarheid. Binnen ons bedrijfje noemen we dat in slecht Nederlands research & development oftewel R&D. Vrij vertaald komt het erop neer dat we continu proberen de laatste ontwikkelingen binnen ons vakgebied, zowel laboratoriumtechnisch als klinisch, te implementeren. De belangrijkste randvoorwaarde hierbij is dat het zonder meer klinisch relevant moet zijn. Dus geen luchtfietserij voor extreem zeldzame patiënten, maar altijd oog voor het toepassingsgebied; zijn er voldoende patiënten, draagt onze inspanning bij aan de diagnostiek en/of behandeling, en vooral blijft de prijs-kwaliteit verhouding goed. Basis hiervoor blijft de beproefde wetenschappelijke benaderingswijze. Graag willen we u dan ook laten kennismaken met de diverse R&D projecten binnen onze vakgroep. Op het eerste gezicht lijken de onderwerpen zeer divers, en dat zijn ze ook wat de aandachtsgebieden betreft, echter de gemeenschappelijke basis is veelal te vinden in de moleculair microbiologische technieken die nodig zijn om de vraagstellingen te beantwoorden. Vooral deze technieken hebben de laatste 5 jaar een stormachtige ontwikkeling doorgemaakt. Eerst was het nog moeizaam en was de plaats in de diagnostiek onduidelijk, maar inmiddels nemen ze een niet meer weg te denken plaats in ons laboratorium in. Een mooi voorbeeld is dat tegenwoordig met enige regelmaat cito-diagnostiek voor tuberculose wordt aangevraagd waar enige tijd geleden een doorlooptijd van minstens 4 weken geaccepteerd was. De verwachting is dat de toepassing van deze technieken alleen maar zal groeien, en een voor de arts-microbioloog onmisbaar instrument wordt dat even goed en degelijk beheerst en beheerd dient te worden als bijvoorbeeld de algemene bacteriologie. Uit de bijdragen zal duidelijk worden dat er een consistente R&D lijn in ontwikkeling is. We hopen dat deze lijn aanspreekt en prikkelt tot participatie van vele vakgroepen. We nodigen u dan ook uit om, samen met ons, de vele mogelijkheden die deze lijn biedt verder te exploreren en tot beproefd diagnosticum te verheffen. Namens de medische microbiologie, Ron Hendrix 88

DE DIAGNOSTIEK VAN RESPIRATOIRE INFECTIES R ON H ENDRIX Binnen de diagnostiek van respiratoire infecties bij volwassenen neemt de patiëntengroep met COPD (chronic obstructive pulmonary disease) een belangrijke plaats in. Het aantal patiënten met COPD zal door de vergrijzing van de bevolking en het persistent roken de komende tientallen jaren sterk stijgen. Acute verslechteringen (exacerbaties) van COPD komen bij deze patiënten vaak voor. Ook zal in veel gevallen de restlongfunctie bij een exacerbatie verder achteruitgaan. Gemiddeld hebben patiënten één à twee exacerbaties per jaar, maar dit aantal kan per patiënt sterk variëren. De standaardbehandeling van deze exacerbaties is het geven van inhalatiecorticosteroïden en vaak antibiotica. De rol van bacteriën en andere micro-organismen, zoals virussen, in het ontstaan van deze exacerbaties is onduidelijk. Bij ongeveer de helft van de exacerbaties zijn bacteriën betrokken. Bij de andere helft lijken virussen, met name Rhinovirussen en Coronavirussen, maar ook Influenza- en Parainfluenzavirussen betrokken te zijn. De rol van de diverse organismen in het onderhouden van het chronische karakter van de ziekte is vooralsnog onduidelijk. Om de rol van micro-organismen in het verloop van COPD goed te kunnen onderzoeken, zijn in dit onderzoek COPD-patiënten langdurig gevolgd. Dit onderzoek is een intensieve samenwerking van de afdelingen epidemiologie en longziekten van het Medisch Spectrum Twente (MST) (Van der Palen, Monninkhof, Van der Valk), de Katholieke Universiteit Nijmegen (Zielhuis, Van Herwaarden) het Erasmus Medisch Centrum (Bogaert, Hermans) en het Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek. Van deze patiënten wordt er tijdens een exacerbatie sputum verzameld. Tevens worden er ook bloedmonsters afgenomen voor het verrichten van serologisch onderzoek. Deze studie die we Micros-COPE noemen is onderdeel van de COPE-studie naar self-management of COPD, including self-treatment of exacerbations in an outpatient population die binnen de afdeling longziekten van het MST loopt. De belangrijkste vragen die in dit onderzoek zullen worden beantwoord, luiden: wordt longfunctieverlies tijdens een exacerbatie veroorzaakt door bacteriën, virussen, schimmels en/of gisten of een combinatie van deze organismen. Wat is de waarde van de diverse microbiologische technieken voor het aantonen van deze organismen. Zijn er voorspellende factoren die het al dan niet voorschrijven van antibiotica beter kunnen onderbouwen. Inmiddels zijn er meer dan 170 goed gedocumenteerde exacerbaties beschikbaar voor verdere analyse. De eerste fase van dit onderzoek spitst zich toe op de detectie van bacteriële verwekkers. Van alle exacerbatiesputa zijn grampreparaten gemaakt en zijn er semi-kwantitatieve kweken uitgewerkt. Wanneer de resultaten van de kweek als gouden standaard voor een bacteriële infectie worden gehanteerd, komen er verrassende resultaten uit. Zo blijken patiënten die in het jaar voorafgaand aan de huidige exacerbatie 2 of meer exacerbaties hadden en tevens een positief grampreparaat hebben, ook overwegend een positieve kweek te hebben. Patiënten die niet aan deze beide criteria voldoen blijken overwegend een negatieve kweek te hebben. De vraag die je dan ook onmiddellijk dient te stellen is of deze tweede groep (ongeveer 60%) ook zonder antibiotica goed zal herstellen. Inmiddels is er een MICROLABBLAD 89

onderzoeksvoorstel om deze vraag dubbelblind en prospectief te gaan testen in voorbereiding. De tweede vraag die hieruit voortvloeit is of deze kweek-negatieve exacerbaties door virussen zijn veroorzaakt. De tweede fase van het onderzoek spitst zich dan ook toe op de detectie van de intracellulaire verwekkers.vanuit de klassieke microbiologie zijn hiervoor 2 methoden beschikbaar: virale kweek en serologie op een serumpaar. De virale kweek is bij dit soort patiënten zeer onbetrouwbaar gebleken. Een deel van de potentieel oorzakelijke virussen is niet, dan wel zeer moeilijk kweekbaar, terwijl een ander deel, hoewel goed kweekbaar, alleen met een zeer lage sensitiviteit aantoonbaar is. Om beide redenen is er in deze studie van virale kweken afgezien. Om toch een beeld van de niet-bacteriële verwekkers te krijgen zijn de beschikbare exacerbaties serologisch geanalyseerd. Dit is gedaan met de modernste serologische technieken die op dit moment beschikbaar zijn (ELISA). Twee verschillende testsytemen zijn gebruikt voor de detectie van Adenovirus, RSV, Influenzavirus A+B, Parainflunzavirus I-II-III, Mycoplasma en Legionella. Hoewel volgens de literatuur 20% van de nietbacteriële exacerbaties door deze organismen veroorzaakt zouden zijn, kunnen wij dat niet aantonen. Groot nadeel van dit deel van de studie is dat er geen betrouwbare serologische technieken voor de detectie van Rhinovirussen en Coronavirussen beschikbaar zijn. De derde fase van deze studie is dan ook een logisch vervolg op de tweede fase. Om toch een betrouwbaar beeld te krijgen van de niet-bacteriële verwekkers is het noodzakelijk een moleculair microbiologisch testsysteem op te zetten. Ook dit gebeurt weer met de modernste techniek: de realtime PCR. Inmiddels beschikken we over betrouwbare real-time PCR s om Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae en Influenza A+B in respiratoire materialen aan te tonen, en we hopen binnen 3 maanden deze lijn met Parainfluenzavirus, Adenovirus, Enterovirus, RSV, Rhinovirus en Coronavirus te kunnen uitbreiden. In een later stadium willen we humaan Metapneumovirus aan deze rij toevoegen. Zodra al deze parameters operationeel zijn worden alle exacerbatiesputa hiermee getest. Deze Micros-COPE studie heeft uiteraard niet alleen gevolgen voor COPD-patiënten. De diagnostische inzichten die hiermee verkregen worden zijn natuurlijk van toepassing op een veel breder scala aan pulmonale infecties. Vooral de moleculaire technieken kunnen bij atypische longbeelden, als deze oude term nog gebruikt mag worden, een belangrijke rol gaan spelen. Tot nu toe is alleen de Legionella sneltest, die binnen enkele uren na afname van urine een betrouwbaar resultaat kan geven, beschikbaar. Met het operationeel krijgen van de real-time PCR s voor de genoemde organismen wordt het mogelijk binnen 24-48 uur na afname van het respiratoire materiaal een betrouwbare diagnose te stellen. Op dit moment is daar voor een aantal organismen nog minstens 10 dagen voor nodig omdat de diagnostiek op (relatief onbetrouwbare) serologie gebaseerd is, terwijl er voor een aantal andere organismen gewoon geen niet-moleculair microbiologische diagnostiek beschikbaar is. In de toekomst zullen we middels ons blaadje graag meer aandacht geven aan deze nieuwe lijn van diagnostiek. 90

PROTOCOLONTWIKKELING INFECTIEPREVENTIE R ON H ENDRIX Binnen de ziekenhuizen, maar ook vaak erbuiten, worden regelmatig protocollen ontwikkeld met betrekking tot infectiepreventieprocedures. Deze protocollen worden vaak opgesteld door deskundigen die in de regel inhoudelijk goed op de hoogte zijn, maar weinig tot geen inzicht hebben in de referentiekaders van de personen die met deze protocollen moeten werken. Vanuit de vakgroep communicatiewetenschappen van de Universiteit Twente kwam het initiatief (Van Gemert) om deze materie te onderzoeken. Na een aantal discussies met ons laboratorium werd al snel gekozen om de protocollen rondom accidenteel bloedcontact en Methicilline Resistente Staphylococcus Aureus (MRSA) aan een nader onderzoek te onderwerpen. In vijf ziekenhuizen (waaronder het Medisch Spectrum Twente en in de voorbereidende fase het Streekziekenhuis Koningin Beatrix), verspreid over het land, is het totstandkomen en functioneren van deze protocollen onderzocht. Door middel van semi-gestandaardiseerde interviews is de totstandkoming en implementatie van de protocollen gereconstrueerd. Het functioneren van de protocollen is onderzocht aan de hand van een vragenlijstonderzoek en een performancetest afgenomen bij een gestratificeerde at random steekproef van de verschillende doelgroepen van de protocollen. Het blijkt dat de beide protocolsoorten voor de doelgroepen onvoldoende toegankelijk, begrijpelijk, acceptabel en toepasbaar zijn. Bij het totstandkomen van de protocollen is wel gestreefd naar inhoudelijke correctheid en legitimiteit maar er is onvoldoende rekening gehouden met verschillen in kennis, vaardigheden en werkwijze van de doelgroepen. Implementatie en evaluatie verlopen te weinig doel(groep)gericht. De infrastructuur voor een succesvolle implementatie ontbreekt door een geringe betrokkenheid van het management bij deze protocollen. Ter bevordering van het functioneren van de protocollen wordt aanbevolen deze op te splitsen in een organisatieprotocol met een verantwoordingsfunctie en doelgroepspecifieke protocollen met een gebruiksfunctie. Een systeem van training, reminders en feedback kan het bewustzijn in het eigen handelen bevorderen, terugval in oude routines doorbreken en adequate en tijdige signalering van multiresistente microorganismen mogelijk maken. Uiteraard zijn deze aanbevelingen gebaseerd op de vigerende theorie. Of ze in de gezondheidszorg zullen werken moet nog aangetoond worden. Om dit te onderzoeken heeft dezelfde onderzoeksgroep, versterkt met een aantal deskundigen, recent een voorstel geformuleerd en aangeboden ter beoordeling aan een subsidiegever (ZON). We hopen dat we spoedig met dit vervolgonderzoek kunnen starten waarbij het uiteindelijke doel het formuleren van een strategie is waarmee bruikbare en begrijpbare protocollen opgesteld kunnen worden die in de praktijk goed nageleefd kunnen worden. MRSA problematiek in de verpleeghuizen Tot voor enkele jaren werden in Nederland MRSA s geïmporteerd vanuit buitenlandse ziekenhuizen o.a. via repatriëring van Nederlandse patiënten. De laatste jaren zijn er steeds meer aanwijzingen dat er MRSA-stammen in Nederland zelf circuleren zonder verband met het buitenland, en dat juist deze Nederlandse MRSA-stammen secundaire besmettingen veroorzaken, mogelijk doordat ze niet zo MICROLABBLAD 91

snel worden ontdekt. Uit buitenlandse literatuur blijkt dat verpleeghuizen een waarschijnlijke bron van deze stammen zijn. Zelfs in de ons omringende landen zijn prevalentiecijfers voor MRSA in de verpleeghuizen van 20% heel normaal. Op een vraag van de inspectie heeft het RIVM (De Neeling) dan ook het initiatief genomen de Nederlandse situatie te onderzoeken. In de periode 2000-2002 is onderzoek gedaan naar het vóórkomen van MRSA in verpleeghuizen in de regio s Amsterdam, Enschede, Heerlen en Den Bosch. Bij 1218 verpleeghuisbewoners werd een neuskweek afgenomen. Acht personen (0,7%) bleken MRSA bij zich te dragen. Dit percentage is laag, maar nog altijd 7 maal zo hoog als in de open populatie (<0,1%). In de verpleeghuizen in onze regio die deelnamen aan dit onderzoek hebben we vanuit het Laboratorium Microbiologie ook gekeken naar dragerschap van de normale S. aureus. Deze bacterie kon zoals verwacht bij ongeveer 50% van de bewoners worden aangetroffen. Op dit moment worden deze stammen moleculair getypeerd om te achterhalen of er binnen de verpleeghuizen dominante stammen aanwezig zijn, of dat iedere bewoner een eigen unieke stam bij zich draagt. Voorlopige resultaten wijzen erop dat alle met S. aureus gekoloniseerde bewoners een eigen uniek isolaat bij zich dragen. Dit duidt erop dat S. aureus en dus ook de MRSA zich vrijwel niet in de verpleeghuizen verspreiden. De verpleeghuizen zijn dan ook waarschijnlijk niet de bron van de Nederlandse MRSA s. Waar ze dan wel vandaan komen blijft vooralsnog onduidelijk. MRSA-patiënten in de ziekenhuizen Binnen de ziekenhuizen in onze regio hebben we inmiddels ruime ervaring opgedaan met MRSA gekoloniseerde patiënten. Een relatief grote groep van deze MRSA gekoloniseerde patiënten hebben we inmiddels een aantal jaren kunnen volgen. Deze patiënten zijn in twee groepen onder te verdelen. Een groep (ongeveer 50%) die kortdurend, en hooguit enkele weken, met een MRSA gekoloniseerd is en waarbij de MRSA daarna nooit meer wordt aangetroffen. En een andere groep (de overige 50%) die jarenlang gekoloniseerd blijft met dezelfde soort MRSA zoals uit moleculaire typering blijkt. Bij deze laatste groep patiënten is het goed mogelijk dat de MRSA gedurende een langere periode (tot zeker een jaar) niet meer aantoonbaar is en dan ineens, na bijvoorbeeld een antibioticumkuur of een ingreep, weer duidelijk aanwezig is. Uit moleculaire analyse blijkt dat het nog steeds om de oorspronkelijke MRSA gaat. Sommige van deze patiënten zijn indertijd, conform de geldende richtlijnen, negatief verklaard waarbij het vaker voorkwam dat ze zonder isolatiemaatregelen ineens positief op een verpleegafdeling lagen met een aantal secundaire kolonisaties bij kamergenoten tot gevolg. Dit heeft ertoe geleid de regel eens MRSA altijd MRSA in het leven te roepen. Zolang het een klein aantal patiënten betreft is deze regel goed hanteerbaar, echter het betreft tegenwoordig meerdere tientallen patiënten. Tevens is deze regel onethisch want we weten dat ongeveer de helft van deze patiënten onterecht in isolatie wordt verpleegd; we weten alleen niet welke individuele patiënten het betreft. Om toch meer over individuele patiënten te kunnen zeggen zijn we nu bezig (Van t Veer) alle klinische kenmerken van deze patiënten op het moment dat ze een MRSA verwierven in kaart te brengen. We hopen op grond hiervan een profiel voor een snel negatieve en een langdurig positieve patiënt te kunnen opstellen zodat een groot deel van de patiënten niet meer in isolatie hoeft te worden opgenomen. We hopen deze analyse deze winter te voltooien. 92

134435-MicroLabBlad 01-03-2005 11:32 Pagina 93 O P E R AT I O N E L E R E S E A R C H Het opzetten van een polymerase chain reaction (PCR) voor één bepaalde ESBL positieve Klebsiella pneumoniae stam EVELINE ROELOFSEN Als een probleem in de praktijk zo vaak voorkomt dat het de moeite waard is hiervoor een structurele oplossing te zoeken wordt dit operationele research genoemd. Een dergelijk probleem is het detecteren van bijzonder resistente micro-organismen zoals MRSA (Methicilline Resistente Staphylococcus Aureus) of een extended spectrum betalactamase (ESBL) producerende Gram-negatieve staaf zoals Klebsiella pneumoniae. In Nederland wordt een "search and destroy" beleid gevoerd ten aan zien van deze pathogenen. Zie ook de richtlijnen van de landelijke werkgroep infectiepreventie: www.wip.nl. Onderzoek naar zo'n bijzonder resistent micro-organisme duurt tussen de 2 en 5 dagen. Op dag 1 worden inventarisatiekweken afgenomen, een keel-, huid - of rectumkweek door middel van een Culturette. Dit onderzoeksmateriaal wordt in een buis met bouillon geplaatst. Deze bouillon bevat antibiotica die bacteriën, anders dan de gezochte, doden of onderdrukken. Dag 2: deze bouillon wordt afgeënt op selectieve voedingsbodems die ook weer alleen de gezochte stam selecteren. Op dag 3 wordt bekeken of er al dan niet wat groeit. Groeit er niets, dan is duidelijk dat de patiënt de gezochte bacterie niet bij zich heeft. Als er wel iets op de plaat gegroeid is en de kolonies zijn er ieder afzonderlijk af te enten, vindt er nadere determinatie van de bacteriën en onderzoek naar de gevoeligheid voor antibiotica plaats. Liggen de kolonies niet los van elkaar dan moet er eerst rein gekweekt worden. Determinatie en gevoeligheid zijn dus op dag 4 of dag 5 bekend. Het vermoeden dat het om een ongewenst micro-organisme gaat, wordt nu door de dienstdoende arts-microbioloog doorgebeld naar de behandelend arts. Echter dit vermoeden moet nog bevestigd worden. Bij de Klebsiella wordt gekeken of het een extended spectrum beta-lactamase vormt. Op dag 5 of 6 gaat dan de schriftelijke uitslag de deur uit. Klebsiella pneumoniae is een normale bacterie die als commensaal in onze darmen voorkomt. Het wordt een potentiële pathogeen als de weerstand van de patiënt verlaagd is. En kan dan een nosocomiale infectie veroorzaken. Meestal in de vorm van een longontsteking, (lijn)sepsis of een urineweginfectie. Vaak zijn dit patiënten die op de intensive care liggen. Zo'n patiënt wordt dan geïsoleerd verpleegd. Om verspreiding te voorkomen is het belangrijk zo snel mogelijk te weten wie van de andere patiënten die bacterie al dan niet heeft en waar in de omgeving deze bacterie zich verstopt. Inventarisatie is de eerste stap in de richting van probleembeheersing: hoe groot is het probleem, welke beslissingen moeten er worden genomen en wat is het effect van die beslissingen. In de IC van het Medisch Spectrum Twente (MST) komt sinds augustus 2001 endemisch een Klebsiella pneumonie voor die resistent is voor alle antibiotica behalve de carbapenems (duur) en colistine (bijwerkingen). Deze stam is opgestuurd naar Italië (Dept. Of Pathology, University of Verona) om nader gedetermineerd te worden. Daar ontdekte mevrouw Mazzariol dat deze Klebsiella een extended spectrum beta-lactamase (ESBL) bezit met twee puntmutaties. Deze puntmutaties zijn ieder afzonderlijk wel gevonden in andere bacteriën, maar nog nooit eerder samen. Veel soorten bacteriën vormen beta-lactamasen. MICROL LABBLAD 93

Het hardnekkig voorkomen van deze speciale Enschedese Klebsiella noopt ons om naar snellere detectiemethoden te zoeken. Jan Arends, arts-microbioloog verbonden aan het academisch ziekenhuis in Groningen (AZG), toonde aan dat het ESBL-gen op een integron lag van 700 bp. Wat is een integron? Een integron is een stukje DNA dat moleculair biologisch herkenbaar is doordat een gencassette geflankeerd wordt door twee geconserveerde stukjes DNA. Beide uiteinden van deze geconserveerde gebieden bevatten stukjes DNA (inverted repeats) die maken dat dit integron altijd wel ergens, of het nu linksom of rechtsom wordt afgelezen, is in te passen in een groter stuk DNA (b.v. chromosomaal DNA of een plasmide). Een integron bevat meestal geen transpositiegenen, dit in tegenstelling tot een transposon. Maar beide uiteinden van een integron zijn zo gevormd dat als er een set transposases aanwezig is in de cel, het integron kan worden overgebracht naar een ander stuk DNA. Ook kan het in circulaire vorm voorkomen als een soort miniplasmide. Inverted repeat geconserveerde deel gencassette geconserveerde deel Inverted repeat Fig 1. Integron Op dit voor deze Klebsiella specifieke integron van 700 bp ligt een trimethoprim resistentie gen. Deze combinatie van specifiek integron en gen, kunnen we als surrogaatmarker gebruiken in een PCR. Voor de PCR wordt een specifiek nucleïnezuurfragment van het DNA van de bacterie in grote hoeveelheden gerepliceerd. In dit geval dus het trimethoprim resistentie gen met wat aangrenzende nucleotiden. Hiervoor zijn primers nodig die complementair zijn aan een aantal nucleotiden voorafgaand aan het stukje dat je wilt detecteren (zie de aangehechte blokjes in figuur 2). Fig. 2. Principe van de Polymerase chain reaction 94

Het DNA is uit de bacterie geïsoleerd door het simpelweg op te koken met een eiwitafbrekend enzym en een beetje detergens. De bovenstaande vloeistof bevat dan het dubbelstrengs DNA. Door nogmaals te verhitten (denaturatie) maken de beide DNA-strengen zich los van elkaar. Bij een relatief lage temperatuur worden de primers en nucleotiden in overmaat toegevoegd (hybridisatie/annealing). De enkele ketens worden nu verdubbeld vanaf het punt waar de primer zich gehecht heeft (elongatie fase). De cyclus denaturatie/ hybridisatie en elongatie wordt 25 tot 30 keer herhaald. Dit gebeurt in een thermocycler. Dit is een apparaat dat in een paar seconden de temperatuur van heel hoog naar heel laag kan brengen. Er is nu een PCR-product ontstaan waarin heel veel kleine stukjes zitten van het DNA dat wij zoeken. Dit PCR-product is zichtbaar te maken door een gel-electroforese. Agarose wordt opgekookt en uitgegoten in een plaatje waar het kan stollen tot een gel. Een kam die in de vloeibare agar wordt gehangen zorgt ervoor dat er uitsparingen ontstaan in de agarose-gel. Deze gel wordt in een bak gelegd waarin een buffervloeistof zit. Elk PCR-produkt wordt in een uitsparing gepipetteerd. In de bak zijn een negatieve en een positieve electrode aangebracht. Door een bepaalde spanning te laten lopen door de buffer en dus de agar, loopt het negatief geladen DNA naar de positieve pool. Omdat wat ethidiumbromide is mee opgebracht in de uitsparingen kunnen we het DNA m.b.v ultraviolet zichtbaar maken. Een trapje van stukjes DNA van bekende grootte wordt meegenomen om te zien hoe groot ons geïsoleerd stukje DNA is. Fig. 3. De d.m.v. PCR geamplificeerde DNA fragmenten zijn zichtbaar in de agarose gel. Laan 1 t/m 5; DNA van bekend positieve patiënten, laan 6,12,18.en 24 zijn DNA-ladders met fragmenten van bekende grootte.laan 7 t/m 11; opgekookte stam van bekend positieve patiënten. Laan 13 t/m 17; bouillons van bekend positieve patienten. Laan19 t/m 23; Klebsiella pneumoniae ESBL+ maar niet de endemische stam. MICROLABBLAD 95

Hier boven ziet u resultaten van de PCR zoals Jan Arends en Niek Arents (AZG) die hebben ontworpen. De eerste vijf laantjes zijn bekende positieve stammen waarvan het DNA al eerder is gezuiverd voor een andere typeringstest. Deze zouden dus allemaal zo'n dikke witte band moeten geven als in laan 3 en 4. Waarom dit niet is gebeurd, is niet duidelijk. Na het trapje in laan 6 volgen 5 stammen van positieve patiënten die alleen opgekookt zijn om het DNA vrij te maken. Dit was een poging om de tijd te beperken die nodig is voor het opwerken van het materiaal. Het was mooi geweest als ze allemaal een dikke witte band lieten zien. Na weer een trapje op positie 12 volgen er nu 5 bouillonnen van positieve patiënten. Alleen even opgekookt om het DNA vrij te maken. Tot onze verrassing zien we hier drie banden. De laatste 5 lanen zijn gevuld met Klebsiella pneumoniae stammen die ESBL positief zijn maar niet onze Enschedese stam. Deze mogen geen banden laten zien en gelukkig is dat ook zo. Om de test te optimaliseren moet er nog veel werk gedaan worden. Een test mag niet vals positief of vals negatief zijn. Ook moet het duidelijk zijn wat de gevoeligheid is van een test. Met bovenstaande PCR zijn we nog niet klaar. Toch loont het de moeite om er zo veel tijd, geld en moeite in te steken. De tijdwinst die deze test zal opleveren komt niet alleen de patiënt ten goede, maar zal er ook voor zorgen dat het probleem en de omvang ervan sneller bekend worden, beslissingen meer gefundeerd genomen kunnen worden en interventies onderbouwd kunnen plaatsvinden. 96

LABORATORIUMDIAGNOSTIEK VAN TRICHOMONAS VAGINALIS B ERT M ULDER Inleiding Trichomonas vaginalis infectie is wereldwijd de meest voorkomende niet-virale SOA. Trichomonas infectie vormt een risicofactor voor de verspreiding van HIV. Bij vrouwen geeft Trichomonas infectie aanleiding tot vaginitis met als mogelijke symptomen: overvloedige, hardnekkige fluor met een karakteristieke (vis)geur, jeuk en een brandend gevoel. De klassieke manier om een Trichomonas vaginalis infectie vast te stellen is het zogenaamde natte preparaat ( wet mount ), waarin bij direct microscopisch onderzoek typische, zeer beweeglijke micro-organismen worden gezien. In de huidige praktijk ontbreekt het de behandelend arts veelal aan de tijd om dit onderzoek zelf te verrichten. Sensitivity of Techniques for Identifying Trichomonas vaginalis in Genital Specimens Technique Sensitivity (%) Wet mount 49-80 fluorescent antibody 64-90 Gram stain <1 Acridine orange stain ~66 Giemsa stain 35-60 Latex fixation 56-90 Enzyme-linked immunosorbent assay 77-93 DNA probe 86-91 Polmerase chain reaction 92-100 Cervical cytologic appearance 56-70 Vaginal Culture 85-98 Male urethral culture 80 Male first-void urine culture 68 Bron: Mandell, Douglas, and Bennet s Principles & Practice of Infectious Diseases, 5 th Edition, 2000. Laboratoriumonderzoek door middel van kweek op T. vaginalis wordt momenteel als gouden standaard gehanteerd. Mogelijk wordt de overleving van Trichomonas en daarmee de sensitiviteit van dit onderzoek negatief beïnvloed door de transporttijd naar het laboratorium. Dit zou het lage percentage positieve kweken kunnen verklaren. Jaar N N pos (%) 1999 2133 28 (1,3) 2000 2059 29 (1,4) 2001 2065 25 (1,2) 2002 2331 22 (0,9) Tabel : aantal laboratoriumonderzoeken Trichomonas vaginalis EIA Trichomonas vaginalis In eerste instantie werd op 171 ingestuurde monsters onderzocht of de mogelijk te lage gevoeligheid van de kweek met een antigeendetectie door middel van een EIA voor Trichomonas vaginalis (TV MICROLABBLAD 97

Screen ) kon worden verbeterd. Dit leek het geval te zijn aangezien van deze 171 monsters er in de Trichomonas vaginalis kweek 4 (2,3%) positief bleken, terwijl in de Trichomonas vaginalis EIA 12 monsters (7,0%) een positieve uitslag te zien gaven. Dit suggereerde een bijna verdrievoudiging van het percentage positieve uitslagen met een EIA test, die overigens in een dagdeel goed uitvoerbaar was. Bovendien zou hiermee de diagnostiek ten opzichte van de kweek ook nog aanzienlijk worden versneld. Voor we besloten de test op het laboratorium te gebruiken wilden we deze resultaten eerst met een PCR onderzoek bevestigen. Conventionele PCR Trichomonas vaginalis Uit de eerste tabel bleek al dat de PCR als enige techniek een sensitiviteit van 100% benadert. Volgens de huidige inzichten is PCR diagnostiek de optimale methode voor de detectie van Trichomonas vaginalis. Een grote studie uitgevoerd in Rotterdam liet zien dat in vergelijking met de PCR, de sensitiviteit van de kweek veel lager was (96 vs70%).2 Vergelijking van kweek en PCR resp. PCR en ELISA leverde het volgende verrassende beeld: Vergelijking kweek PCR Vergelijking EIA en PCR PCR + PCR - PCR + PCR - Kweek + 4 0 EIA + 3 8 Kweek - 1 68 EIA - 2 60 Sensitiviteit kweek 80% Sensitiviteit EIA 60% Specificiteit kweek 100% Specificiteit EIA 68% Pos. voorspellende waarde 100% Pos. voorspellende waarde 27% Neg. voorspellende waarde 98,5% Neg. voorspellende waarde 97% Concluderend kon de schijnbaar grotere sensitiviteit van de EIA niet bevestigd worden met de als gouden standaard geldende conventionele PCR op Trichomonas vaginalis. Met PCR als gouden standaard geeft de conventionele kweek wel goede resultaten en heeft de EIA geen meerwaarde als aanvulling of vervanging van de kweek. Een mogelijke verklaring voor de vals-positieve EIA uitslagen kwam naar voren uit het verdere microbiologisch onderzoek van de 8 patiënten met PCR negatieve en EIA positieve uitslagen: 7 van deze 8 patiënten bleken een positieve kweek te hebben met Candida albicans. Het mag duidelijk zijn dat bij een vrouw met fluorklachten een EIA onderzoek op Trichomonas vaginalis niet vals positief mag worden op grond van Candida albicans. Real time PCR Trichomonas vaginalis De vraag rijst of PCR onderzoek zelf geen meerwaarde heeft voor de routinediagnostiek van Trichomonas vaginalis. In de laatste CBO richtlijn SOA wordt laboratoria aanbevolen de PCR methode voor routinediagnostiek beschikbaar te maken. Hiervoor dient het onderzoek wel op een praktische en snelle manier te kunnen worden uitgevoerd. De conventionele PCR had als nadeel dat de techniek inclusief DNA opwerking enkele werkdagen kostte. De komst van geautomatiseerde DNA isolatieapparatuur en van real-time PCR onderzoek maakt het praktisch mogelijk dit onderzoek in 1 werkdag uit te voeren. Hiervoor werd een bruikbare real-time PCR ontwikkeld. 98

Real time PCR amplificatie-plot: positieve monsters geven een duidelijk signaal, negatieve monsters blijven op de nullijn. Uit de literatuur komt naar voren dat het mogelijk is om in navolging van de diagnostiek van Chlamydia, ook de Trichomonas diagnostiek door middel van PCR onderzoek van urinemonsters uit te voeren. Het vervolg van dit onderzoek naar de verbetering van de laboratoriumdiagnostiek van Trichomonas vaginalis zal eruit bestaan dat in een (multi-center) studieverband wordt gekeken naar de meerwaarde van deze vorm van diagnostiek voor de patiënt. MICROLABBLAD 99

DE DIAGNOSTIEK BIJ INFECTIES VAN IMMUUNGECOMPROMITTEERDE PATIENTEN R ON H ENDRIX De laatste jaren is een autologe stamceltransplantatie standaard behandeling geworden voor een aantal oncologische en hematologische aandoeningen. Daarnaast vinden uiteraard in de academische centra veel allogene beenmergtransplantaties plaats. De laatste patiëntengroep komt voor post-transplantatie controle steeds vaker naar onze ziekenhuizen. Een belangrijke complicatie van deze behandelingen is een soms levensbedreigende infectie. In 50% van deze infecties, die gepaard gaan met hoge koorts en algemeen ziek zijn, wordt er met standaard microbiologische technieken, waaronder bloedkweken, niets gekweekt. Hiervoor zijn 4 mogelijke redenen aan te voeren; Door het gebruik van antibiotica is de bacteriële celwand sterk verzwakt waardoor het niet mogelijk is deze bacteriën in een kunstmatig milieu als in een bloedkweekflesje in leven te houden. Waarschijnlijk is het wel goed mogelijk bacteriële nucleïnezuren in de bloedbaan aan te tonen. Hoewel de kliniek duidt op een systemische infectie zijn er geen kweekbare organismen in de bloedbaan aanwezig. Dit kan voorkomen bij een aspergillusinfectie. In dat geval zijn er wel eiwitten en nucleïnezuren van de schimmel in de bloedbaan aanwezig. Er zijn aanwijzingen voor een systemische virusinfectie maar er zijn geen gevoelige virologische kweektechnieken beschikbaar om het oorzakelijke virus aan te tonen. Dit doet zich vooral voor bij CMV-infecties. Vaak kunnen wel virale nucleïnezuren worden aangetoond. Vanuit de algemene microbiologie weten we dat hooguit 5% van de bekende bacteriën met de huidige kweektechnieken aantoonbaar is. 95% groeit gewoon niet in een bloedkweekfles. Tijdens infecties is het waarschijnlijk wel mogelijk bacteriële nucleïnezuren van deze slechte groeiers in de bloedbaan aan te tonen. Om dan toch een goed inzicht te krijgen in de mogelijke verwekkers van infecties binnen deze patiëntengroep lijkt het zinvol met moleculair microbiologische technieken naar deze patiënten te kijken. Om deze analyse mogelijk te maken is van een aantal patiënten, die een autologe perifere stamceltransplantatie onderging, op regelmatige basis conform het normale beleid kweken afgenomen en indien mogelijk buisjes volbloed ingevroren. Dit onderzoek wordt in nauwe samenwerking met de hematologen van het Medisch Spectrum Twente (MST) uitgevoerd. De verzamelde buisjes bloed vormen het startmateriaal voor een moleculaire analyse waarbij met een kwantitatieve real-time PCR gekeken wordt naar de aanwezigheid van Cytomegalovirus, Aspergillus, en bacteriën. Allereerst is er een PCR opgezet voor de detectie van Aspergillus soorten. Deze PCR is gericht op het 18S-RNA gen, een gen dat bij alle eukaryoten voorkomt. Het is een onderdeel van een groot genencomplex dat voor de werking van de ribosomen codeert. Door een slimme primerkeuze is deze PCR specifiek gemaakt voor het genus Aspergillus waartoe de voor neutropene patiënten gevaarlijke soort Aspergillus fumigatus behoort. Inmiddels is deze PCR operationeel en zijn we in staat hiermee Aspergillus DNA in het bloed van patiënten met een Aspergillus pneumonie aan te tonen. Inmiddels is er ook een kwantitatieve real-time PCR voor de detectie van CMV in bloed ontwikkeld, die nu gevalideerd wordt. Uitdagender is de ontwikkeling van een real-time PCR voor de detectie van bacteriële nucleïnezuren 100

in het bloed van immuungecompromitteerde patiënten. We zijn reeds een hele periode bezig een goede PCR hiervoor te ontwikkelen waarbij we echter met veel tegenslagen te maken kregen. Met de introductie van de real-time PCR technologie gaat het nu veel beter. Ook hier is de PCR gericht op het genencomplex dat codeert voor de werking van de ribosomen, maar dan het zogenaamde 16S- RNA gen. Dit gen komt alleen voor bij bacteriën. De verwachting is dat we binnen enkele weken een 16S-RNA PCR operationeel hebben. Het uiteindelijke doel van dit lopende onderzoek is een adequate strategie te ontwikkelen om deze kwetsbare patiëntengroep te kunnen monitoren met betrekking tot het voorkomen van bacteriële, CMV en Aspergillus infecties. Deze real-time technologie maakt het mogelijk binnen 24 uur na binnenkomst van het bloed een betrouwbare analyse te verrichten waar met de standaardtechnieken geen diagnose verwacht mag worden. Niet alleen hematologische patiënten komen voor deze technieken in aanmerking. Te denken valt ook aan AIDS-patiënten en IC-patiënten met onbegrepen koorts, maar ook aan grote groepen andere patiënten die fors immuunsupressieve therapie krijgen voor reumatische aandoeningen of andere ernstige auto-immuunziekten. MICROLABBLAD 101