Lokalisatie Aantal stalen Lokalisatie Aantal stalen

Het referentielaboratorium verantwoordelijk voor de bestudering van de resistentie tegen aminoglycosiden bevindt zich in het WIV Dpt Pasteur Instituut te Brussel. worden nog steeds veelvuldig gebruikt in het ziekenhuismilieu. Toxiciteit en de ontwikkeling van resistentie zijn de belangrijkste factoren die hun klinische bruikbaarheid beperken. Resistentie tegen aminoglycosiden kan te wijten zijn aan een (i) ribosomiale mutatie, (ii) de aanwezigheid van aminoglycoside-modificerende enzymen (AME), (iii) een verminderde opname en aan (iv) een verhoogde efflux van aminoglycosiden. AME-resistentie is veruit het belangrijkste mechanisme omdat de genetische determinanten meestal plasmide- of transposongebonden zijn. Dit laatste verklaart de belangrijke disseminatie van deze genen bij zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriën. bevatten in hun structuur amino- en hydroxylgroepen die enzymatisch geacetyleerd, gefosforyleerd en genucleotidyleerd kunnen worden. De enzymen die deze activiteit uitvoeren zijn dus aminoglycoside-n-acetyltransferasen (AAC), aminoglycoside-o-fosforyltransferasen (APH) en aminoglycoside-o-nucleotidyltransferasen (ANT). Deze drie groepen van enzymen worden nog verder ingedeeld in functie van de plaats van het C-atoom met de amino- of hydroxylgroep die gemodificeerd wordt door het enzym. De plaats van de modificatie wordt na de afkorting van het enzym tussen haakjes weergegeven door een cijfer. Verder kunnen de enzymen van een bepaalde groep nog worden onderscheiden op basis van het substraatprofiel. Deze subtypes worden weergegeven door een Romeins cijfer na het enzymtype en de plaats van modificatie: APH(3')-I, APH(3')-II, APH(3')-III, APH(3')-IV, APH(3')-V, APH(3')-VI. Ten slotte kunnen bepaalde enzymen worden gecodeerd door verschillende genen en de specificatie van dit gen wordt in de regel weergegeven door een kleine letter na het enzymtype, bijv. aac(6')ia, aac(6')ib, aac(6')ic, aac(6')if, aac(6')ig, enz. Analysen verricht in het kader van het referentiecentrum In 003 ontving het referentiecentrum 70 stammen voor onderzoek naar de aanwezigheid van een resistentiemechanisme en daarenboven nog eens 545 MRSA-stammen in het kader van een surveillancestudie. In tabel 1 staat de geografische herkomst van de 70 stammen op basis van de postcode van de patiënten. Tabel 1 : : geografische herkomst van de stalen* (N; 003) Lokalisatie Aantal stalen Lokalisatie Aantal stalen Sint-Truiden 15 Dilsen 1 Liège 7 Duras 1 Brasschaat 5 Eisden 1 Kapellen 5 Gingelegom 1 Ekeren 4 Herk de Stad 1 Hoevenen 4 Heusden-Zolder 1 Antwerpen 3 Laakdal 1 Genk 3 Landen 1 Essen Lommel 1 Lanaken Onhaye 1 Maasmechelen Velm 1 Opglabeek Walshoutem 1 Berendrecht 1 Wuustwezel 1 Brecht 1 Zoutleeuw 1 Totaal 70 *De herkomst van de MRSA-surveillancestammen (545) is niet in de tabel opgenomen In totaal betrof het dus 615 stammen waarvan 38 Enterobacteriaceae (6,%), 9 Pseudomonas aeruginosa-stammen of andere niet-fermenters (4,7%) en 548 Staphylococcus spp stammen (89,1%) (tabel ). Tabel : : overzicht van de micro-organismen (N; 003) Kiemen Aantal Kiemen Aantal Enterobacteriaceae : 38 Pseudomonas en non-fermenterts: 9 Escherichia coli 18 Pseudomonas aeruginosa 1 Proteus mirabiluis 7 S. maltophilia 6 Enterobacter aerogenes 5 A. baumannii 1 Serratia sp 3 A. xylosoxidans 1 C. freundii Enterobacter sp 1 Gram-positieve kokken: 548 Morganella morganii 1 Staphylococcus aureus 3 P. stuartii 1 MRSA surveillance study 545 Totaal 615 1

De gegevens van 545 MRSA-stammen uit de surveillancestudie zijn samengevat in tabel 7. De gegevens weergegeven in de andere tabellen (tabellen 3 tot 6) hebben dus betrekking op de 70 stammen ontvangen in het kader van de reguliere activiteit van het referentiecentrum. Urine (4,9%) en sputum (40,0%) waren de meest voorkomende stalen, gevolgd door etter (10,0%) (tabel 3). Tabel 3 : : overzicht van de afgenomen stalen* (N; 003) Afgenomen stalen N Afgenomen stalen N Urine 30 Bloed 3 Sputum 8 Onbekend Etter 7 Totaal 70 * De afgenomen stalen van de MRSA-surveillancestammen (545) zijn niet in de tabel opgenomen Door middel van een microdilutietest werd de gevoeligheid van deze 70 stammen bepaald tegenover klinisch belangrijke aminoglycosiden, nl. Amikacine (Ak), Gentamicine (Gm), Isepamicine (Ip), Netilmicine (Nt) en Tobramycine (Tm). Op basis van deze gevoeligheidsbepaling, uitgevoerd volgens de NCCLS-criteria, werden de fenotypische resistentieprofielen vastgelegd (tabel 4). Tabel 4 : : aanwezigheid van aminoglycoside-resistentiefenotypen (AGRP) 1 in de verschillende kiemen (003) AGRP Enterobacteriaceae Niet-ferment Gram-positief Totaal AkGmIpNtTm 0 18 0 18 GmNtTm 1 5 1 18 AkIpTm 0 0 1 1 GmTm 6 0 1 7 NtTm 5 1 0 6 Gm 6 0 0 6 Tm 1 0 0 1 Gevoelig (S) 7 5 0 1 Niet getest (NG) 1 0 0 1 Totaal 38 9 3 70 1 De resultaten van de MRSA surveillance stammen (545) zijn niet opgenomen in de tabel Aminoglycoside-Resistentie Profiel: Ak = Amikacine; Gm = Gentamicine; Ip = Isepamicine; Nt = Netilmicine; Tm = Tobramycine Twaalf stammen (17,1%) die ons werden toegestuurd, bleken gevoelig te zijn voor de geteste aminoglycosiden. Een stam werd niet getest omdat deze niet meer kweekbaar bleek te zijn. In totaal was het fenotypische resistentieprofiel van 57 stammen beschikbaar. Van deze stammen bleken er 51 (89,5%) resistent tegen Tobramycine, 49 (86,0%) tegen Gentamicine, 4 (73,7%) tegen Netilmicine, 19 (33,3%) tegen Amikacine en Isepamicine. De meest voorkomende resistentieprofielen binnen de groep van de resistente stammen waren AkGmIpNtTm en GmNtTm (beide 31,6%). Geïsoleerde resistentie werd enkel gevonden voor Gm (10,5%) en Tm (1,8%). Resistentie tegen 3 of meer aminoglycosiden werd gevonden in 64,9% van de stammen. De verschillende resistentiemechanismen die werden gevonden in de diverse kiemen zijn weergegeven in tabel 5. In totaal werd er in 65 stammen een potentieel resistentiemechanisme gedetecteerd. Voor deze resistentiemechanismen waren globaal 86 resistentiegenen verantwoordelijk. Een resistentiemechanisme kon niet worden gedetecteerd in 5 stammen waarvan 1 resistente stam, 1 stam die niet gegroeid was en 3 gevoelige stammen. Dit impliceert dat een resistentiemechanisme aanwezig was in 9 fenotypisch gevoelige stammen. In het merendeel van de stammen (38/65; 58,5%) vonden we alleen de aanwezigheid van een modificerend enzym (AME-genen), in 15 stammen (3,0%) vonden we alleen permeabiliteitsresistentie, terwijl in 1 stammen (18,5%) de permeabiliteitsresistentie geassocieerd was met een AME-gen. Het meest gedetecteerde mechanisme was het aac(3)-iic gen (18,5%) gevolgd door de permeabiliteitsresistentie al dan niet door MexZGH (3,0%) en het aac(6 )-Ib gen (10,%). De permeabiliteitsresistentie (41,5%) werd alleen waargenomen bij de niet-fermenters en 63,0% van deze stammen bleken positief voor het MexZGH (efflux) gen. Een combinatie van resistentiegenen werd gevonden in 17 stammen (6,%).

Tabel 5 : : aanwezigheid van aminoglycoside-resistentiemechanismen 1 (003) Resistentiemechanismen Enterobacteriaceae Niet-fermenters Gram-positief Totaal Aac ( ) 1 0 0 1 Aac(3) IIc 1 0 0 1 Aac(3)-IV a 3 0 0 3 Aac(6 )-Ib 9 0 0 9 Aac(6 )-Ic 3 0 0 3 Ant( )-Ia 3 0 0 3 Ant(4, 4 ) 0 0 1 1 Aph( )-aac(6 ) 0 0 1 1 Aph( )-aac(6 )+aph(3 ) 0 0 1 1 Aac(3)-Ia+aph(3 )-Via 0 1 0 1 Aac(3)-Iic+aac(6 )-Ib 0 0 Aac(6 )-I+aac(6 )-IIa 0 1 0 1 Impermeabiliteit 0 8 0 8 Impermeabiliteit + aac(6 )-Ib 0 0 MexZGH (Impermeabiliteit) 0 7 0 7 MexZGH + aac (6 )- Ib 0 6 0 6 MexZGH +aac(6 )- I l 0 1 0 1 MexZGH +aac(6 )- IIa 0 1 0 1 MexZGH +aac(6 )- Il+aac(6 )- IIa 0 0 Niet gedetecteerd : R-stammen 1 0 0 1 Niet gedetecteerd : S-stammen 3 0 0 3 Niet gedetecteerd : NG-stammen 1 0 0 1 Totaal 38 9 3 70 1 De resultaten van de MRSA surveillance stammen (545) zijn niet opgenomen in de tabel R/S = Restistente/gevoelige stammen; NG = niet getest voor AGRP Tabel 6 verstrekt informatie over de relatie tussen de verschillende resistentiemechanismen en de fenotypische expressie van de resistentie. In 9 van de 1 gevoelige stammen bleek toch een resistentiemechanisme aanwezig te zijn nl. een aac(6 )-Ib gen (4 stammen) en een MexZGH gen (5 stammen). Anderzijds blijkt ook uit deze tabel dat de aanwezigheid van een resistentiemechanisme niet noodzakelijk leidt tot een fenotypische expressie van de resistentie. Tabel 6 : : verband tussen resistentiemechanisme en resistentiefenotype 1 (003) Resistentiemechanisme Totaal Resistentiefenotypen AkGmIpNtTm GmNtTm AkLpTm GmTm NtTm Gm Tm S* NG* aac( ) 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 aac(3)-iic 1 0 5 0 1 0 6 0 0 0 ac(3)-iva 3 0 3 0 0 0 0 0 0 0 aac(6 )-Ib 9 0 0 0 3 0 0 4 0 aac(6 )-Ic 3 0 0 0 0 0 1 0 0 ant( )-Ia 3 0 0 0 3 0 0 0 0 0 ant(4, 4 ) 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 aph( )-aac(6 ) 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 aph( )-aac(6 ) + aph(3 ) 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 aac(3)-ia+aph(3 )-VIa 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 aac(3)-iic+aac(6 )-Ib 0 0 0 0 0 0 0 0 aac(6)-il + aac(6 )-IIa 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Impermeabiliteit 8 7 1 0 0 0 0 0 0 0 Impermeabiliteit + aac(6 )-Ib 1 1 0 0 0 0 0 0 0 MexZGH (Impermeabiliteit) 7 0 0 0 0 0 0 5 0 MexZGH + aac (6 )-Ib 6 3 0 0 1 0 0 0 0 MexZGH + aac (6 )-Il 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 MexZGH + aac (6 )-IIa 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 MexZGH +aac(6 )-Il+aac(6 )-IIa 0 0 0 0 0 0 0 0 Niet gedetecteerd: R-stammen 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 Niet gedetecteerd: S-stammen 3 0 0 0 0 0 0 0 3 0 Niet gedetecteerd: NG-stammen 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 Totaal 70 18 18 1 7 6 6 1 1 1 1 De resultaten van de MRSA-surveillancestammen (545) zijn niet opgenomen in de tabel R/S = Restistente/gevoelige stammen; NG = niet getest voor AGRP 3

Van de 545 MRSA-stammen uit de surveillancestudie werden er 5 geëlimineerd zodat er uiteindelijk 540 stammen werden getest op de aanwezigheid van een resistentiemechanisme. Van deze stammen beschikten we niet over de informatie betreffende de geografische herkomst of de staalafname. Ze werden ook niet getest voor hun in vitro gevoeligheid. De resultaten van de gendetectie zijn weergegeven in tabel 7. Tabel 7 : : Overzicht van de gegevens van de MRSA survey stammen (003) Stammen Aantal Total 545 Geen groei/contaminatie 5 Getest 540 Resistentiegenen Aantal Totaal aantal stammen met een gen 11 Totaal aantal genen getecteerd 93 Ant(4,4 ) 195 Aac(6 )-aph( ) 88 Aph(3 )-III 10 Geen gen gedetecteerd 39 Resistentiemechanismen in 540 stammen Aantal (%) Ant(4,4 ) 13 (,8) Aac(6 )-aph( ) 9 (1,7) aac(6 )-aph( )+ant(4,4 ) 69 (1,8) Aac(6 )-aph( )+aph(3 )-III 7 (1,3) Aac(6 )-aph( )+ant(4,4 )+aph(3 )-III 3 (0,5) Geen gen gedetecteerd 39 (60,9) In 11 van deze 540 stammen (39,1%) werd een resistentiemechanisme gedetecteerd. In 39 stammen (60,9%) werd dus geen gen gevonden. In de 11 gen-positieve stammen werden er globaal 93 genen waargenomen. In de totale populatie van stammen kwam het ant(4,4 ) gen (36,1%) het meest frequent voor, gevolgd door het bifunctionele aac(6 )-aph( ) gen (16,3%). Het fosforylerende aph(3 )-III gen werd slechts gevonden in 1,9% van de stammen. Het meest voorkomende resistentiemechanisme was het geïsoleerde ant(4,4 ) gen (in,8% van de stammen) gevolgd door de combinatie van aac(6 )- aph( )+ ant(4,4 ) (in 1,8% van de stammen). Een combinatie van genen werd gevonden in 79 van de gen-positieve stammen (37,4%) wat neerkomt op 14,6% van de stammen. Detectie van Aminoglycoside-Resistentiemechanismen in Methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) isolaten Deze studie werd uitgevoerd in samenwerking met het referentiecentrum voor Faagtypering (Dr. Sc. C. Godard) in het WIV- Dpt Pasteur Instituut van Brussel. De stammen die in deze studie werden geanalyseerd werden verzameld in het jaar 00. In totaal werden er 1160 S. aureus-stammen onderzocht. De laboratoria uit Gent, Aalst, Veurne, Hasselt, Oostende, Herentals en Ieper leverden iets meer dan ¾ van de stammen, nl. 77,1% (tabel 8). In totaal waren 67 stammen (3,0%) afkomstig uit etter. Verder werden 19 stammen (18,8%) geïsoleerd uit een neusuitstrijkje dat werd afgenomen om dragers op te sporen (tabel 9). Tabel 8 : : geografische herkomst van MRSA stammen (003) Lokalisatie Aantal (%) Lokalisatie Aantal (%) Gent 5 (1,8) Brussel 33 (,8) Aalst 151 (13,0) Torhout 33 (,8) Oostende 114 (9,8) St.-Truiden 3 (,8) Veurne 106 (9,) Waregem 31 (,7) Herentals 10 (8,8) Brasschaat 17 (1,5) Hasselt 91 (7,8) Gilly 1 (0,1) Ieper 78 (6,7) Roeselare 1 (0,1) Genk 56 (4,8) Onbekend 1 (1,0) Bonheiden 50 (4,3) Totaal 1160 4

Een totaal van 87 stammen bleken geen MRSA te zijn en werden niet weerhouden voor verder onderzoek. De volgende resultaten hebben dus betrekking op een totaal van 1073 stammen. Tabel 9 : : overzicht van de afgenomen stalen van MRSA stammen (003) Staal Aantal (%) Etter 67 (3,0) Neusuitstrijk 19 (18,8) Sputum 06 (17,8) Urine 16 (14,0) Bloed 47 (4,1) Perineum 4 (3,6) Keeluitstrijk 3 (,0) Feces 16 (1,4) Kather 14 (1,) Vagina 5 (0,4) Andere 119 (10,) Onbekend 40 (3,5) Totaal 1160 Door gebruik te maken van een microdilutietechniek en volgens de criteria van de NCCLS werden voor alle stammen de Minimale Inhibitorische Concentraties (MIC) bepaald van Amikacine, Gentamicine, Isepamicine, Netilmicine en Tobramycine. De resultaten van deze bepalingen zijn samengevat in tabel 10. Met uitzondering van Tobramycine hebben de aminoglycosiden op gewichtsbasis een vergelijkbare activiteit. Voor Netilmicine zijn met 99,6% van de stammen gevoelig (MIC 8 µg/ml) terwijl voor Amikacine, Isepamicine (beide MIC 16 µg/ml), Gentamicine en Tobramycine (beide MIC 4 µg/ml) de gevoeligheid respectievelijk 99,3%, 99,%, 9,8% en 69,5% bedraagt. De modus voor Gentamicine, Netilmicine en Tobramycine is 0,5 µg/ml terwijl dit voor Amikacine en Isepamicine 1 µg/ml is. De MIC90 (MIC voor 90% van de stammen) voor Netilmicine bedraagt 0,5 µg/ml. Gentamicine, Amikacine en Isepamicine hebben een MIC90 van resp. 1 µg/ml, 4 µg/ml en 4 µg/ml terwijl deze waarde voor Tobramycine oploopt tot 64 µg/ml. Tabel 10 : : in vitro gevoeligheid voor aminoglycosiden van 1073 MRSA stammen (003) Minimale Inhibitrische Concentraties (µg/ml) Aminoglycoside <0,5 0,5 1 4 8 16 3 64 18 56 Amikacine 1 343 30 183 61 15 0 5 1 1 Gentamicine 89 135 1 9 10 14 4 16 6 7 Isepamicine 7 5 36 4 181 59 16 3 4 1 0 Netilmicine 814 158 3 9 5 11 0 0 0 Tobramycine 616 80 18 10 34 41 90 81 44 37 Door gebruik te maken van de PCR hebben we getracht de genen die coderen voor aminoglycosidemodificerende enzymen te detecteren in de 1073 MRSA-stammen. Hiervoor hebben we gebruik gemaakt van sets van primers die specifiek zijn voor het ant(4,4 )-I, het bifunctionele aac(6 )-aph( ) en het aph(3 )-III gen. In 749 MRSA-stammen (69,8%) kon geen gen worden aangetoond terwijl in de overige 34 stammen een totaal van 364 genen werd gedetecteerd (tabel 11). Het belangrijkste resistentiemechanisme was het geïsoleerde ant(4,4 )-I gen (,8%). Dit mechanisme werd overigens gevonden in 75,6% (45/34) van de gen positieve stammen. In 39 van de gen positieve stammen (1,0%) werd een combinatie van genen gevonden. Dit betekent dat een gencombinatie slechts aanwezig is in 3,7% van de totale onderzochte populatie (tabel 1). Tabel 11 : Detectie van AME* genen in 1073 MRSA stammen (003) Gen Aantal Ant(4,4 )-I 50 Aac(6 )-aph( ) 75 Aph(3 )-III 39 Geen AME gen 749 *AME: Aminoglycoside Modificerend Enzym 5

Tabel 1 : : detectie van resistentiemechanismen in 1073 MRSA stammen (003) Gen Aantal (%) Ant(4,4 )-I 45 (,8) Aac(6 )-aph( ) 36 (3,3) Aph(3 )-III 4 (0,4) Aac(6 )-aph( )+ Aph(3 )-III 34 (3,) Aac(6 )-aph( )+ Ant(4,4 )-I 4 (0,4) Aac(6 )-aph( )+ Aph(3 )-III+Ant(4,4 )-I 1 (0,1) Geen AME gen 749 (69,8) Tabellen 13 en 14 geven het verband weer tussen de aanwezigheid van genen die coderen voor een AME en de fenotypische expressie van deze genen. Uit tabel 13 blijkt in de eerste plaats dat ondanks de aanwezigheid van een AME-gen de graad van ongevoeligheid (stammen die intermediair of resistent zijn) laag is. Voor Tobramycine is er duidelijk wel een hogere graad van ongevoeligheid (88,8%) terwijl dit ook het geval is voor Gentamicine (1,9%), zij het dan in veel mindere mate. Het is wel duidelijk dat MRSA-stammen met een AME-gen in de regel een hogere graad van ongevoeligheid voor aminoglycosiden hebben dan MRSA-stammen zonder AME-gen. Uit tabel 14 blijkt dat de aanwezigheid van een resistentiemechanisme niet noodzakelijk resulteert in een fenotypische expressie. De aanwezigheid van bijvoorbeeld het ant(4,4 )-I gen, dat codeert voor een AkIpTm-resistentie, geeft slechts een hoge graad van ongevoeligheid voor Tobramycine (89,5%). Het aac(6 )-aph( ) gen dat codeert voor resistentie tegen de vijf aminoglycosiden wordt blijkbaar slechts voldoende geuit voor Gentamicine (94,4%) en Tobramycine (83,3%). Tabel 13 : : % stammen ongevoelig* voor aminoglycosiden (003) Stammen Aantal Amikacine Gentamicine Isepamicine Netilmicine Tobramycine Totaal 1073 0,7 7, 0,8 0,4 30,5 AME positief gen 34 1, 1,9 1, 1, 88,8 AME negatief gen 749 0,4 0,8 0,5 0 5, MIC I/R µg/ml (NCCLS)* 3 8 3 16 8 * I= Intermediair; R= Resistent; NCCLS= National Committee for Clinical Laboratory Standards Tabel 14 : : % van stammen ongevoelig voor aminoglycosiden in functie van het resistentiemechanisme (003) Isepamicine Netilmicine Tobramycine Totaal S/I/R 1073 0,7 7, 0,8 0,4 30,5 Ant(4,4 ) AkIpTm 45 0,4 0 0,8 0 89,5 Aac(6 )-aph( ) AkGmIpNtTm 36 0 94,4 0,8 83,3 Aph(3 )-III AkIp 4 0 0 0 5 5 Aac(6 )-aph( )+Aph(3 )-III AkGmIpNtTm 34 8,8 100 5,9 5,9 97,1 Aac(6 )-aph( )+Ant(4,4 ) AkGmIpNtTm 4 0 50 0 0 75 Stammen Fenotype* Aantal Amikacine Gentamicine Aac(6 )-aph( )+Aph(3 )- III+Ant(4,4 ) AkGmIpNtTm 1 0 100 0 0 100 AME-gen negatief S 749 0,4 0,8 0,5 0 5, MIC< I/R µg/ml (NCCLS)* 3 8 3 16 8 *Ak= Amikacine; Gm= Gentamicine; Ip= Isepamiciene; Nt= Netilmicine; Tm= Tobramycine; S= Gevoelig; I= Intermediair; R= Resistent; NCCLS= National Committee for Clinical Laboratory Standards 6