Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid - Louis Pasteur Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Secretariaat Bioveiligheidsraad

Transcriptie

1 Bioveiligheidsraad Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Dr.W. Moens SECRETARIAAT ANTIBIOTICA-RESISTENTIEGENEN IN TRANSGENE PLANTEN DEVOS Y., RENCKENS S. Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid - Louis Pasteur Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Secretariaat Bioveiligheidsraad Depotnummer: D/2002/2505/28 WIV/1520/SR/

2 INHOUDSTAFEL 1. INLEIDING SITUATIE IN NEDERLAND Beleidsnota biotechnologie - antibiotica-resistentiegenen Wetenschappelijk advies COGEM en RIKILT (Nederland) RICHTLIJN 2001/18/EG GEBRUIK VAN ANTIBIOTICA IN BELGIË STANDPUNT VAN DE SBB BIJLAGEN...8 Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: suzy.renckens@sbb.ihe.be - ydevos@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ P 2/2-

3 1. INLEIDING Op 16 mei 2002 ontving de Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie (SBB) van het Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid (WIV) een groene nota van het kabinet van de Minister van Consumentenzaken, Volksgezondheid en Leefmilieu (referentie: 02/AB/MA/MV/KJ/pc/006/p7260) betreffende het gebruik van antibiotica-resistentiemerkergenen in transgene planten. De volgende vraag werd gesteld: "De SBB maakt een ontwerpvoorstel KB voor het onmiddellijk stopzetten van gebruik van antibioticaresistentiemerkergenen (zowel voor doelbewuste introductie als voor commercialisering) op basis van het wetsvoorstel in Nederland. De SBB vraagt dit wetvoorstel op en stuurt het met advies door naar het kabinet (kabinet van de minister van consumentenzaken, volksgezondheid en leefmilieu), uiterlijk tegen één juni 2002." Dit document bevat het antwoord van de SBB dat aan het kabinet van de Minister overgemaakt werd (referentie: WIV/1520/SR/ ). 2. SITUATIE IN NEDERLAND 2.1. Beleidsnota biotechnologie - antibiotica-resistentiegenen Het kabinetsbeleid met betrekking tot biotechnologie is in Nederland neergelegd in de Integrale Nota Biotechnologie van 28 september 2000, die door minister Pronk naar de Tweede Kamer gestuurd werd. Hij deed dit mede namens zijn collega's Jorritsma (Economische Zaken), Brinkhorst (Landbow, Natuurbeheer en Visserij), Borst (Volksgezondheid, Welzijn en Sport) en Hermans (Onderwijs, Cultuur en Wetenschappen). De nota geeft een overzicht van de ontwikkelingen van de laatste jaren en van de te verwachten ontwikkelingen op het gebied van moderne biotechnologie en in het bijzonder van genetische modificatie. In deze nota wordt onder meer ingegaan op het beleid ten aanzien van de toepassing van antibiotica-resistentiegenen (Ab R ) in genetisch gemodificeerde planten (punt 6.1 op p ; zie bijlage 1). De tekst in de beleidsnota luidt als volgt: Tegen deze achtergrond, uitgaande van het voorzorgsbeginsel en rekening houdend met bovengenoemde adviezen zal geen goedkeuring meer verleend worden aan grootschalige marktintroductie van genetisch gemodificeerde organismen die antibiotica-resistentiegenen bevatten. De toepassing van antibiotica-resistentiegenen in genetisch gemodificeerde organismen ten behoeve van veldproeven zal worden beperkt tot de genen nptii en hpt. Deze genen leiden tot resistenties tegen antibiotica die niet meer van belang zijn voor de humane en dierlijke gezondheidszorg en kunnen zonder risico op verminderde inzetbaarheid in veldproeven worden Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: suzy.renckens@sbb.ihe.be - ydevos@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ P 3/3-

4 toegepast. Conform de wens van de Tweede Kamer, neergelegd in de motie van 1 juli 1999, zal deze beleidslijn inzake antibiotica-resistentiegenen aan de Europese Commissie worden meegedeeld. nptii of neomycine fosfotransferase: resulteert in kanamycine, geneticine, paromomycine en neomycine resistentie hpt of hygromycine fosfotransferase: resulteert in hygromycine resistentie De integrale nota heeft echter geen kracht van wet. Het is een beleidsnota waaraan de ministers zich hebben gecommitteerd. Volgens onze Nederlandse collega s "dient men zich te realiseren dat de bewuste passage zich moeilijk wetenschappelijk laat onderbouwen en eerder op politieke gronden in de nota is gekomen. De passage is voorts ook voor meerdere uitleg vatbaar. In hoeverre het gevoerde beleid op GGO gebied met de nieuwe politieke samestelling na de verkiezingen in Nederland gaat wijzigen is nog niet duidelijk". Bijkomend werd ons vermeld dat "de parlementaire discussie over biotechnologie in Nederland niets aan de nota en aan dit beleidsstandpunt heeft veranderd." Conclusie beleidsnota biotechnologie - antibiotica-resistentiegenen Het beleid inzake antibiotica resistentiegenen, zoals beschreven in de Integrale Nota Biotechnologie, betekent dat antibioticaresistentiemerkers in transgene planten voor marktintroductie niet worden toegelaten in Nederland, en enkel de antibiotica-resistentiemerkers nptii en hpt in transgene planten voor veldproeven worden toegelaten. Er zal uitsluitend een toestemming verleend worden indien is aangetoond dat er in de planten geen andere antibiotica-resistentiegenen zijn ingebracht dan de nptii en hpt genen Wetenschappelijk advies COGEM en RIKILT (Nederland) De COGEM (Commissie Genetische Modificatie) heeft een gedetailleerd advies uitgebracht betreffende het toepassen van antibioticum resistentiegenen in transgene planten (zie bijlage 2). In dit advies werd dieper ingegaan op de gevolgen van eventuele horizontale verspreiding van deze genen voor de ontwikkeling van antibioticumreistentie in bacteriepopulaties en op de mogelijkheid dat het gebruik van dergelijke genen zou kunnen leiden tot verontkruiding of tot acute schadelijke effecten voor mens of dierbij incidentele blootstelling. Als resultaat van de geval per geval risicoevaluatie werd een lijst opgesteld van antibioticum resistentiegenen waarvoor geen bezwaar bestaat tegen de toepassing in transgene planten: nptii, nptiii, bla, hpt, aad; zie bijlage 2). De COGEM en het RIKILT (Rijksinstituut voor de Kwaliteit in de Land- en Tuinbouw) brachten op 18 september 2000 op vraag van de bevoegde Minister een gezamenlijk wetenschappelijk advies uit betreffende het gebruik antibiotica-resistentiegenen (bijlage 3). Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: suzy.renckens@sbb.ihe.be - ydevos@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ P 4/4-

5 De COGEM en het RIKILT concludeerden dat tegen de toepassing van de volgende antibioticaresistentiegenen in planten geen bezwaar bestaat voor wat betreft de gespecificeerde toepassing: nptii (kanamycine resistentie) voor teelt, incidentele consumptie en veevoedertoepassing, nptiii (amikacine resistentie) voor teelt, incidentele consumptie maar uitgezonderd veevoedertoepassing, bla (ampiciline- resistentie) voor teelt, incidentele consumptie en veevoedertoepassing, hpt (hygromycine resistentie) voor teelt, incidentele consumptie en veevoedertoepassing, In het advies wordt zeer duidelijk benadrukt dat deze evaluatie alleen aan de orde is indien het een grootschalige toepassing betreft van een genetisch gemodificeerd gewas, een teelt van groter dan 10 hectare ( m 2 ). Bij kleinschalige toepassing van genetisch gemodificeerde gewassen, waarbij geen sprake is van structureel gebruik voor humane dan wel dierlijke consumptie, is de eventuele impact alleen al door de geringe kwantiteit van het te introduceren materiaal voldoende ingeperkt. De COGEM en het RIKILT adviseerden dat: Het gebruik van de antibiotica-resistentiegenen nptii en hyg ook in de toekomst te blijven toestaan. De keuze voor deze twee merkergenen geeft een maximale zekerheid omtrent de veiligheid voor mens en milieu. Ook kunnen met deze twee merkersystemen zowel alle monocotyle als dicotyle planten gemodificeerd worden, waarmee eventuele praktische bedenkingen tegen het toestaan van het gebruik van slechts een beperkt aantal antibioticaresistentiegenen afdoende zijn beantwoord. Daarnaast is het van belang om vast te stellen dat het alleen zinvol is een gelimiteerd gebruik van antibiotica-resistentiegenen bij grootschalige introducties in het milieu en introducties tot de markt voor te schrijven. Beperkingen aan het gebruik in de kleinschalige onderzoeksfase is vanuit wetenschappelijk oogpunt op de risico s voor mens en milieu niet te verdedigen en zou bovendien leiden tot onomkeerbare en onproportionele schade aan het noodzakelijke onderzoeksklimaat in Nederland. Overigens ligt het in de lijn der verwachting dat indien het beleid een beperking van het aantal te gebruiken antibiotica-resistentiegenen aankondigt, dit op afzienbare termijn zal leiden tot het verdwijnen van de (al beperkte) diversiteit aan antibioticaresistentiegenen in kleinschalige veldproeven. Tot slot werd uitgelegd dat het veredelingsproces een proces is van lange adem. Nieuwe rassen kennen vaak een ontwikkelingstraject van 10 jaar of langer. In afgelopen periode zijn dan ook al vele keuzes gemaakt en veel investeringen gedaan om het ontwikkelingstraject te doorlopen. In het licht hiervan en het feit dat er voor de onder 'Huidige stand advisering' genoemde set aan resistentiegenen geen wetenschappelijke gronden zijn om deze op dit moment te verbieden adviseerde de COGEM en het RIKILT om alle marktaanvragen die op dit moment in behandeling zijn af te handelen conform het huidige standpunt. Dit is mede verantwoord door het theoretische karakter van het veronderstelde risico. Gezien het feit dat genetisch gemodificeerde rassen in de praktijk slechts een beperkte levensduur hebben, en als zij niet als kruisingsouder Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: suzy.renckens@sbb.ihe.be - ydevos@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ P 5/5-

6 gebruikt worden, zullen er slechts gedurende een beperkte periode rassen op de markt zijn die antibiotica-resistentiegenen kunnen bevatten anders dan de voorgestelde nptii en hpt sequenties. 3. RICHTLIJN 2001/18/EG Richtlijn 2001/18/EG voorziet een geleidelijke afbouw van het gebruik van bepaalde antibioticaresistentiegenen (die tot expressie komen) en welke resistentie bieden tegen bij medische of veterinaire behandelingen gebruikte antibiotica. Overweging (22) Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de kwestie van antibiotica-resistente genen wanneer de risicobeoordeling wordt uitgevoerd van GGO's die dergelijke genen bevatten. Artikel 4 2. De lidstaten en de Commissie dragen er zorg voor dat bij het verrichten van een milieurisicobeoordeling in het bijzonder wordt gelet op GGO's die genen bevatten welke resistentie tegen bij medische of veterinaire behandelingen gebruikte antibiotica tot expressie brengen, met het oog op het identificeren en geleidelijk elimineren van antibiotica-resistentiemerkers in GGO's die mogelijk negatieve effecten op de volksgezondheid en het milieu hebben. GGO's die overeenkomstig deel C in de handel zijn gebracht, worden per 31 december 2004 geleidelijk geëlimineerd en GGO's die zijn toegelaten overeenkomstig deel B, per 31 december Bijlage II Mogelijke schadelijke effecten van GGO's zullen per geval verschillen; mogelijke effecten zijn onder meer: (*) - het in gevaar brengen van preventieve of therapeutische medische, veterinaire of plantenbeschermingsbehandelingen, bijvoorbeeld door genenoverdracht waardoor er resistentie tegen in de menselijke en diergeneeskunde gebruikte antibiotica wordt gekweekt (zie b.v. de punten II A 11 e en II C 2 i en iv van bijlage III A); 4. GEBRUIK VAN ANTIBIOTICA IN BELGIË De SBB heeft naar aanleiding van de vraag van het Kabinet navraag gedaan bij de collega's van de dienst Epidemiologie van het WIV betreffende het gebruik van antibiotica in humane geneeskunde, diergeneeskunde en in de landbouw, vnl. de veevoeders. (zie bijlage 4). Op basis van deze gegevens dient een riscico-evaluatie te worden uitgevoerd m.b.t. het al dan niet toelaten van resistentiemerkers die in transgene planten worden aangewend. Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: suzy.renckens@sbb.ihe.be - ydevos@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ P 6/6-

7 5. STANDPUNT VAN DE SBB Rekening houdend met de bepalingen van de Europese richtlijn 2001/18/EG, die het gebruik van antibiotica-resistentiegenen als merker wil afbouwen de komende jaren, en de maatschappelijke bezorgdheden over het gebruik van dergelijke merkergenen, ondersteunt de SBB het idee geval per geval een grondige wetenschappelijke risico-evaluatie uit te voeren omtrent het gebruik van antibiota-resistentiemerkergenen in transgene planten. Onze ervaring, wetenschappelijke literatuur, ervaring van andere adviesorganen in deze materie onderstrepen dat het gebruik van deze genen in geen enkel geval op een arbitraire wijze beoordeeld kunnen worden. Bij deze risico-evaluatie zouden onder meer geval per geval de volgende aspecten besproken moeten worden: de frequentie waarmee de antibiotica-resistentiegenen eventueel overgedragen worden naar pathogenen die bestreden worden met het antibiotica of andere organismen (horizontale genenoverdracht); het spectrum aan antibiotica waartegen het genproduct resistentie verleent; de herkomst van het gen; het vóórkomen van de resistentie in het milieu (bijvoorbeeld darmflora, watermonsters en grondmonsters) en in het bijzonder bij klinische isolaten en veterinaire isolaten; het belang van het antibiotica voor medische of veterinaire toepassing; de aard van de vrijzetting (kleinschalige veldproef versus grootschalige marktintroductie). De geval per geval benadering sluit overigens aan met de bepalingen in richtlijn 2001/18 en met verschillende wetenschappelijke adviezen betreffende de aanwezigheid van antibiotaresistentiemerkergenen in transgene planten (Bijlage 5. 'Opinion of the Scientific Steering Committee on Antimicrobial Resistance'; bijlage 2: advies van COGEM; bijlage 6: advies van ZKBS; bijlage 7: advies AFSSA). Bijlagen 8 tot 11 bevatten uittreksels uit verslagen van internationale orgainsaties zoals de OESO, FAO, WHO en Codex Alimentarius over deze problematiek. Bijkomende wetenschappelijke discussie over dit onderwerp vindt u in bijlagen 12 tot 15. Het naar behoren uitvoeren van een aanvullende risico-evaluatie vraagt tijd. De door het kabinet opgelegde termijn liet de SBB niet toe het gewenste advies te formuleren. Bovendien moeten bij dergelijk advies verschillende Wetenschappelijke comités van de Bioveiligheidsraad betrokken worden. Om die reden vraagt de SBB de nodige tijd om de risico-evaluatie over het gebruik van antibiotica-resistentiemerkergenen in planten uit te kunnen voeren en pas op basis van een gefundeerd wetenschappelijk advies over te gaan tot bepaalde beleidsmaatregelen. Daarenboven vindt de SBB het veel meer aangewezen om deze discussie op Europees niveau te voeren. De Europese Commissie zou snel moeten voorzien in de oprichting van een wetenschappelijke werkgroep 'Antibiotica resistentie merkergenen' die het mandaat moet krijgen om te bepalen welke merkergenen al dan niet kunnen worden toegelaten overeenkomstig de Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: suzy.renckens@sbb.ihe.be - ydevos@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ P 7/7-

8 bepalingen in de richtlijn. België zou deze vraag officieel kunnen stellen aan de bevoegde diensten van de Commissie. 6. BIJLAGEN 1. Integrale Nota Biotechnologie van 28 september Pp Antibioticum-resistentiegenen. 2. Standpunt van de COGEM ten aanzien van de toelaatbaarheid van het toepassen van antibioticum resitentiegenen in transgene planten (CGM/ ). 3. Advies COGEM en RIKILT betreffende antibiotica-resistentiegenen (CGM/ ) van 18 september E. Hendrickx, dienst Epidemiologie, WIV. Gebruik van antibiotica in België. 5. European Commission. Opinion of the Scientific Steering Committee on Antimicrobial Resistance - 28 May 1999 pp : 3.5. Antibiotic resistance marker genes in genetically modified plants. 6. Stellungnahme der ZKBS (Zentrale Kommission für die biologische Sicherheit) zur Biologischen Sicherheit von Antibiotika-Resistenzgenen im Genom gentechnisch veränderter Pflanzen (Az.: ) from the Robert Koch Institut. 7. Evaluation des risques relatifs à la consommation de produits alimentaires composés ou issus d'organismes génétiquement modifiés. AFSSA pp Safety aspects of genetically modified foods from plant origin. June Report of a Joint FAO/WHO expert consultation on foods derived from biotechnology. pp OECD. Task force for the safety of novel foods and feeds C(2000)86ADD1. Pp OECD. Report of the working group on harmonisation of regulatory oversight in biotechnology. C(2000)86/ADD2. pp Codex Alimentarius Draft guideline for the conduct of food safety assessment of foods derived from recombinant-dna plants. Section The biosafety of antibiotic resistance markers in plant transformation and the dissemination of genes through horizontal gene flow. Gay In 'Safety of genectically engineered crops'. VIB report. 13. Antibiotic resistance markers in GM crops. Briefing paper of the European Federation of Biotechnology 14. Belgian Biosafety Server: Interessante Links: *** Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Secretariaat Bioveiligheidsraad 31 mei 2002 Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: suzy.renckens@sbb.ihe.be - ydevos@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ P 8/8-

9 Bijlage 1 Integrale Nota Biotechnologie van 28 september Pp Antibioticumresistentiegenen. Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: helpsbb@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ Bijlagen

10 Hoofdstuk 6 Visie van de overheid op actuele onderwerpen In dit hoofdstuk wordt ingegaan op enkele actuele onderwerpen ten aanzien van de biotechnologie. Veel van deze onderwerpen overstijgen het terrein van de biotechnologie. Enkele voorbeelden van dergelijke brede discussies zijn de volgende: Wat zijn de kansen en perspectieven die nieuwe kennis en technologie bieden? Wat zijn daarvan de maatschappelijke en ethische consequenties? Is het veelvuldig gebruik van bestrijdingsmiddelen wel gewenst? In het kader van deze nota zijn onderdelen van deze brede discussies die betrekking hebben op biotechnologie, relevant. Kan bijvoorbeeld het gebruik van bestrijdingsmiddelen sterk worden teruggedrongen door genetische modificatie? Of: hebben we wel voldoende inzicht in de risico s die bestaan bij veldproeven met ggo s? Wil de samenleving wel alle ontwikkelingen die technisch mogelijk zijn? Brengt het veelvuldig gebruik van antibiotica door resistentieontwikkeling bij bacteriën het toekomstig gebruik van antibiotica voor menselijke doeleinden niet in gevaar? In de onderstaande paragrafen zullen onderdelen van dergelijke actuele onderwerpen in relatie tot biotechnologie worden behandeld. 6.1 Algemeen Antibioticum-resistentiegenen Antibioticum-resistentiegenen worden tijdens de genetische modificatie van planten toegepast om plantencellen of micro-organismen die de beoogde modificatie bevatten, te selecteren. De vraag die de aanwezigheid van dergelijke genen in planten heeft opgeroepen, is of die genen via de bodem of bij het verteren van dat plantenmateriaal intact kunnen worden overgedragen naar ziekteverwekkende bacteriën (zogenoemde horizontale overdracht ) in het maagdarmkanaal van mens en dier. Als een dergelijke overdracht kan plaatshebben, zou dit kunnen leiden tot toename van resistentie en daarmee een verminderde inzetbaarheid van antibiotica in de humane of veterinaire gezondheidszorg. Dergelijke horizontale overdracht van planten naar bacteriën is in de natuur en bij de teelt van gewassen slechts een enkele keer onder methodologisch onjuiste proefomstandigheden waargenomen. Dit betekent dat er uit deze experimenten geen conclusies getrokken kunnen worden met betrekking tot het voorkomen en de mogelijkheid van horizontale genoverdracht in 33

11 de natuur. Theoretisch zou een dergelijke overdracht echter kunnen voorkomen bij grootschalige, commerciële toepassingen. De vraag is vervolgens wat het effect van eventuele overdracht zou zijn op de mogelijke inzetbaarheid van antibiotica in de humane of veterinaire gezondheidszorg. Verschillende wetenschappelijke instellingen in binnen- en buitenland hebben het risico van genoverdracht bestudeerd, waaronder Commissie Genetische Modificatie (COGEM), Rijksinstituut voor de Kwaliteit in Land- en Tuinbouw van de Dienst Landbouwkundig Onderzoek (RIKILT-DLO), het Scientific Steering Committee van de Europese Commissie en de FAO/WHO. Hoewel de kans op overdracht als zeer gering wordt ingeschat, wordt uit voorzorg toch door de meeste instanties aanbevolen om antibioticumresistentiegenen uit genetisch gemodificeerde planten te verwijderen alvorens deze grootschalig in het milieu in te brengen. Tevens wordt aanbevolen het gebruik van die genen te vermijden die planten resistent maken tegen antibiotica die nog voor de humane of dierlijke gezondheidszorg relevant zijn. Tegen deze achtergrond, uitgaande van het voorzorgsbeginsel en rekening houdend met bovengenoemde adviezen zal geen goedkeuring meer verleend worden aan grootschalige marktintroductie van genetisch gemodificeerde organismen die antibioticum-resistentiegenen bevatten. De toepassing van antibioticum-resistentiegenen in genetisch gemodificeerde organismen ten behoeve van veldproeven zal worden beperkt tot de genen nptii en hpt. Deze genen leiden tot resistenties tegen antibiotica die niet meer van belang zijn voor de humane en dierlijke gezondheidszorg en kunnen zonder risico op verminderde inzetbaarheid in veldproeven worden toegepast. Conform de wens van de Tweede Kamer, neergelegd in de motie van 1 juli 1999, zal deze beleidslijn inzake antibioticum-resistentiegenen aan de Europese Commissie worden meegedeeld. Handhaving Handhaving en controle in relatie tot producten die tot de markt zijn toegelaten De overheid stimuleert de ontwikkeling van analysemethoden. De ministeries van LNV, VROM en VWS hebben in dit kader aan RIKILT-DLO de opdracht verstrekt een analysemethode te ontwikkelen voor detectie van genetische modificaties die is gebaseerd op de zogenaamde DNA-chiptechnologie. Deze technologie biedt een betere mogelijkheid tot routinematig gebruik, een hogere toetssnelheid en een eenvoudiger hanteerbaarheid van het testmateriaal dan bestaande methoden. Uit het RIKILT-DLO project voor multifunctionele detectiemethoden komt naar voren dat twee punten erg belangrijk zijn: 34

12 Bijlage 2 Standpunt van de COGEM ten aanzien van de toelaatbaarheid van het toepassen van antibioticum resitentiegenen in transgene planten (CGM/ ). Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: helpsbb@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ Bijlagen

13 Standpunt van de COGEM ten aanzien van de toelaatbaarheid van het toepassen van antibioticum resistentiegenen in transgene planten Vraagstelling In een groot aantal transgene gewassen die voor introductie tot het marktverkeer worden aangeboden bevinden zich antibioticum resistentiegenen. In deze notitie wordt ingegaan op de toelaatbaarheid van deze toepassing van antibioticum resistentiegenen. De opdracht van de COGEM is de risico-analyse van toepassingen van genetische modificatie, voor zover die risico s te maken hebben met de veiligheid van mens en milieu, bij incidentele blootstelling. Voor de COGEM valt de nadruk in deze discussie op de vraag: Wat kunnen de gevolgen zijn van deze toepassing voor de ontwikkeling van antibioticumresistentie in bacteriepopulaties, bij eventuele horizontale verspreiding van deze genen. Deze vraag wordt verder in deze notitie behandeld. Daarnaast heeft de COGEM de volgende vragen in beschouwing genomen, die in deze inleiding kort worden behandeld: Kan de aanwezigheid van de antibioticum resistentie leiden tot veronkruiding? Deze vraag is alleen relevant voor de situatie waarin het resistentiegen wordt gereguleerd door een plantenpromoter. Voor planten die een dergelijk gen dragen zou dat een selectief voordeel kunnen zijn, indien het relevante antibioticum in het milieu voor zou komen in concentraties die remmend zijn op de groei en ontwikkeling van planten. Dergelijke concentraties worden nooit gevonden: de concentratie van antibiotica in het milieu is onmeetbaar laag. Aanwezigheid van de resistentie zal dus niet leiden tot veronkruiding. Kan de aanwezigheid van een antibioticum resistentiegen leiden tot acute schadelijke effecten voor mens of dier bij incidentele blootstelling? Mogelijke acute schadelijke effecten zijn: toxische of allergische effecten van de genproducten of van omzettingsproducten geproduceerd onder invloed van de genproducten. De genproducten detoxificeren antibiotica, bijvoorbeeld door fosforylering of acetylering van het substraat, of door het openbreken van de moleculaire structuur van het substraat. Het zijn enzymen met een hoge mate van substraatspecificiteit. Er is geen reden om aan te nemen dat zij een toxische werking zouden kunnen hebben. Het substraat is onder de omstandigheden waaronder de planten normaliter worden gekweekt, niet aanwezig. Onder die omstandigheden worden er dus ook geen omzettingsproducten gevormd. De omzettingsproducten zijn bovendien niet meer toxisch dan het substraat. Er zijn daarom geen acute schadelijke effecten voor mens of milieu te verwachten. De toepassing van antibioticum resistentiegenen in transgene planten In veel gevallen worden de genen doelbewust aangebracht, en wel om getransformeerde plantencellen te kunnen selecteren. In die gevallen wordt de expressie van het gen gereguleerd door een promoter die in de plantencel actief is. In andere gevallen is het resistentiegen zonder bepaalde bedoeling in de plant gekomen. Het gaat dan meestal om genen die dienen om het genconstruct dat in de plant wordt gebracht, geselecteerd te kunnen houden in bacteriële gastheren. De expressie van het gen wordt dan gereguleerd door een bacteriële promoter. De aard van de promoter is in hoge mate bepalend voor het effect van het gen na overdracht naar een nieuwe gastheer. Een gen dat gereguleerd wordt door een plantenpromoter zal over het algemeen niet tot expressie komen in een bacterie, en wel in een plant; omgekeerd zal een gen dat wordt gereguleerd door een bacteriële promoter wel in (een aantal verwante) bacteriën tot expressie komen, maar niet in een plant. Horizontale genoverdracht Voor deze discussie gaan wij er vanuit dat toepassing van antibioticum resistentiegenen in transgene planten zal leiden tot verspreiding van die genen vanuit het planten DNA naar in het milieu voorkomende micro-organismen. De frequentie waarmee dit gebeurt, is onbekend. Volgens de berekeningen die hierover zijn uitgevoerd zal de frequentie waarmee dit gebeurt, erg laag zijn (zie bijlage 2, Schatting van de transformatiefrequentie van een micro-organisme in de bodem als gevolg van de teelt van kanamycine resistente tomaten, aan het eind van deze notitie). Het optreden van horizontale overdracht kan echter niet worden uitgesloten. Men dient zich te realiseren dat, als horizontale genoverdracht plaatsvindt in de bodem, alle DNA dat zich daar bevindt bij het proces betrokken is. Hoog moleculair DNA, geschikt voor opname in micro-organismen, is in grote hoeveelheden in de bodem aanwezig. Transgeen DNA heeft ten opzichte van het overige DNA geen bijzonder voordeel boven het andere hoog moleculaire DNA. Het succes van een gebeurtenis van horizontale genoverdracht zal in belangrijke mate afhangen van de expressie van het gen (dus van de gebruikte promoter, zie boven), en van de selectiedruk, i.e. van de concentratie aan antibiotica in het milieu. Hoewel deze onmeetbaar laag is, mag er vanuit worden gegaan dat er zeer plaatselijk microniches zijn waarin selectie kan bestaan. Impact van horizontale genoverdracht De kans op horizontale overdracht van antibioticum resistentiegenen is zeer laag. Dat betekent op zich nog niet dat de impact van het proces ook zeer laag is. Die impact zal afhankelijk zijn van de mate waarin resistentie tegen het antibioticum reeds in het milieu voorkomt. Hierbij zal bijzondere aandacht worden gegeven aan de vraag of het gaat om 1

14 een antibioticum dat medisch of veterinair van groot belang is, en of er in de medische of veterinaire praktijk reeds een hoge mate van resistentie tegen het antibioticum wordt geconstateerd. Afhankelijk van de argumentatie zal men soms geïnteresseerd zijn in het voorkomen van het betreffende gen; vaak gaat het echter om het voorkomen van het fenotype van resistentie / tolerantie tegen het betreffende antibioticum of tegen de groep van antibiotica waar het toe behoort. De gegevens voor de risico-analyse Om een risico-analyse van de toepassing van een antibioticum resistentiegen in gewassen te kunnen doen zijn de volgende gegevens van belang: Tegen welke antibiotica veroorzaakt het gen resistentie? Hoe breed is het spectrum van antibiotica waartegen het genproduct resistentie veroorzaakt? Wat is de herkomst van het gen? Op basis van deze informatie kan vaak al een conclusie getrokken worden over de natuurlijke verspreiding van het gen (bijvoorbeeld als het gen op een transposon voorkomt). Wat is bekend over het voorkomen van de resistentie in het milieu? Bij het beoordelen en vergelijken van verschillende studies op dit gebied zijn de volgende punten van belang: Het milieu waar gezocht is: bijvoorbeeld darmflora, watermonsters, grondmonsters. De kwaliteit van de gegevens: stond de onderzochte populatie onder antibioticumdruk; heeft men gekeken naar fenotypes (en hoe werd dan resistentie gedefinieerd), of heeft men gezocht naar een bepaald gen? Wat is de relevantie van de gegevens bezien tegen de eigenschappen van het gen (kruisresistenties) en bezien tegen de toepassing van de plant (al dan niet geconsumeerd). Wat is het belang van het antibioticum voor medische of veterinaire toepassing: gaat het bijvoorbeeld om een antibioticum dat een laatste redmiddel functie heeft, en wat bedoelt men in dat geval precies met de term laatste redmiddel ; wat is bekend over het vóórkomen van resistentie; vormt nu reeds voorkomende resistentie een belemmering voor antibioticumtherapie? Risico-analyses De COGEM heeft geadviseerd dat tegen toepassing van de volgende antibioticum resistentiegenen geen bezwaar bestaat, om de volgende redenen: nptii: Spectrum: smal, veroorzaakt resistentie tegen kanamycine en neomycine, niet tegen de nieuwe generaties aminoglycoside antibiotica. Herkomst: Tn5; dit transposon is wijd en zijd aangetroffen in allerlei gram negatieve organismen; het bevindt zich vaak op zelfoverdraagbare plasmiden. Voorkomen: de resistentie wordt in betrekkelijk hoge frequenties aangetroffen in het milieu (kweekbare bodemmicro-organismen) zonder dat er sprake is van verhoogde selectiedruk (bijvoorbeeld door het toevoegen van de antibiotica aan het milieu). Bij de selectie in het laboratorium wordt altijd gekeken naar de fractie die fenotypisch resistent is; als antibioticum wordt dan meestal kanamycine gebruikt, in relevante concentraties. Klinische toepassing van de antibiotica: voor humane toepassingen vrijwel volledig verdrongen door nieuwere generatie antibiotica; alleen nog relevant in veterinaire toepassingen. Conclusie: Resistentie tegen kanamycine en neomycine komt van nature reeds veel voor. De zeer geringe bijdrage die horizontale genoverdracht aan resistentieontwikkeling zal leveren, zal geen invloed hebben op de medische toepasbaarheid van het antibioticum. nptiii: Spectrum: breder dan nptii: naast kanamycine en neomycine resistentie ook amikacine resistentie. Echter, het klinisch belang van deze resistentie staat niet ondubbelzinnig vast. Het genproduct heeft geen erg hoge affiniteit voor het substraat; het gen zal een micro-organisme slechts een geringe mate van tolerantie geven. Voorkomen: over het voorkomen van nptiii is zijn geen duidelijke gegevens voorhanden: er zijn geen systematische studies gedaan naar het voorkomen van deze specifieke vorm van aminoglycoside resistentie. Uit de volgende gegevens kan de feitelijke situatie wel worden geëxtrapoleerd. Bij klinische toepassing treedt snel resistentie op. Dat betekent dat de resistentie reeds veelvuldig latent in de populatie aanwezig is. Het mechanisme van de resistentie is in die gevallen niet bekend. De snelle resistentieontwikkeling maakt dat amikacine slechts op beperkte schaal klinisch wordt toegepast. De potentiële, uiterst geringe, bijdrage aan deze resistentie die verwacht mag worden van toepassingen. Klinische toepassing: ondanks het snelle optreden van resistentie is het antibioticum medisch bruikbaar, in die gevallen waarin de patiënt in staat is de overblijvende resistente populatie via het immuunsysteem te bestrijden. Toepassing daarom alleen in de kliniek. Conclusie: Resistentie tegen amikacyne komt reeds zoveel voor dat het potentieel een probleem is. Het bestaande gevaar van resistentieontwikkeling wordt onderkend; in de gangbare medische praktijk speelt de resistentieontwikkeling geen rol. De zeer geringe bijdrage die horizontale genoverdracht aan resistentieontwikkeling zal leveren, zal geen invloed hebben op de medische toepasbaarheid van het antibioticum. bla: Spectrum: ampicilline en vergelijkbare ß-lactam antibiotica. Voorkomen: resistentie tegen ß-lactam antibiotica, meer in het bijzonder tegen ampicilline, wordt zeer breed aangetroffen, in zeer hoge percentages van de kweekbare micro-organismen. Percentages lopen op tot tientallen procenten, zelfs in populaties die ten tijde van het onderzoek niet onder antibioticumdruk staan, maar die waarschijnlijk wel met enige regelmaat aan het antibioticum worden blootgesteld (darmflora). 2

15 Klinische toepassing: zeer breed; in gevallen waarin men vreest voor resistentie past men samen met het antibioticum een ß-lactamase remmer toe. Conclusie: Resistentie tegen ß-lactam antibiotica komt reeds zoveel voor dat de geringe bijdrage die horizontale genoverdracht op resistentieontwikkeling zal hebben, geen enkele invloed zal hebben. hpt: Spectrum: het enzym werkt op hygromycine, dat geen klinische of veterinaire toepassingen heeft in verband met de toxiciteit van het antibioticum. De andere vragen zijn daarom hier niet relevant. Conclusie: Tegen toepassing van het gen bestaat geen bezwaar. aad: Spectrum: smal: streptomycine / spectinomycine resistentie. Voorkomen: breed, tot procenten in allerlei populaties (darmflora, oppervlaktewater) ook als die niet onder selectiedruk staan. Gegevens betreffen fenotypische bepalingen, waarbij streptomycine of spectinomycine in relevante concentraties worden toegepast. Klinische toepassing: beperkte medische en veterinaire toepassingen, vanwege de bijwerkingen; het is een standaardtherapie bij tuberculose, in combinatie met andere antibiotica. Conclusie: Resistentie tegen streptomycine en spectinomycine komt van nature reeds veel voor. De zeer geringe bijdrage die horizontale genoverdracht aan resistentieontwikkeling zal leveren, zal geen invloed hebben op de medische toepasbaarheid van het antibioticum. 3

16 BIJLAGE 1: DISCUSSIESTUK ANTIBIOTICUMRESISTENTIE IN PLANTEN (Uit het vergaderstuk ScM 19.6, behandeld in de Subcommissie Micro-organismen, ) In de aanvragen voor plaatsing op de markt en introductie in het milieu van genetisch gemodificeerde planten wordt in veel gevallen een antibioticum resistentiegen geïntroduceerd. Regelmatig wordt er bezorgdheid geuit door overheden en maatschappelijke groeperingen over de eventuele gevolgen van de introductie van deze genen. De COGEM heeft, indien dit punt expliciet aan de orde kwam hierover een aantal adviezen gegeven. Het is zinvol dat de commissie zich op dit moment beraadt over de benadering die in deze discussie gekozen wordt. In het onderstaande discussiestuk, dat een nadere uitwerking is van ScM 16.2, worden de hoofdpunten in beschouwing genomen die van belang zijn bij het bepalen of de toepassing van een antibioticum resistentie in transgene planten al dan niet onwenselijke gevolgen zal hebben. Per punt is geprobeerd om een conclusie op te stellen die als leidraad bij de beoordeling kan gelden. Samenvatting van de overwegingen in het discussiestuk, op grond waarvan geconcludeerd wordt dat een antibioticumresistentie aanvaardbaar is: 1) De aard van de promoter die de expressie van de resistentie bepaalt wordt niet in beschouwing genomen. 2) Verspreiding van de resistentie zou plaats kunnen vinden via horizontale genoverdracht; de frequentie wordt zeer laag geacht. Bijdrage aan de resistentieontwikkeling zal daarom zeer gering zijn, zeker in gevallen waarin er onder de in het milieu voorkomende populatie reeds een hoge mate van resistentie tegen het betreffende antibioticum bestaat. 3) Als het gaat om resistentie tegen een antibioticum dat van groot medisch belang is (laatste redmiddel) is echter zelfs een geringe kans op verhoging van de resistentie reeds onaanvaardbaar. (Geldt het complement ook: als het gaat om een resistentie tegen een antibioticum dat medisch niet wordt toegepast (hygromycine) dan bestaat er geen bezwaar tegen de toepassing? Moet er rekening worden gehouden met toekomstige ontwikkelingen, waardoor deze antibiotica wellicht toch toepasbaar worden?). Vraag: moet worden vastgehouden aan de criteria 2 én 3, of is 3 alleen voldoende; moeten er nog andere punten in beschouwing worden genomen? Discussiestuk antibioticumresistentie in planten Aandachtspunten voor risico-analyses voor de toepassing van antibioticum resistentiegenen in transgene planten. 1) Expressie in non-target organismen (micro-organismen) Het maakt verschil of een gen achter een plantenpromoter of achter een bacteriële promoter geplaatst is. Voor het inschatten van de kans op en de effecten van antibioticum resistentie overdracht van plant naar micro-organisme is het van belang om te weten of er regulatiesignalen zijn gebruikt die expressie in het non-target organisme kunnen beïnvloeden. Indien er plantspecifieke regulatiesignalen zijn gebruikt, zal de expressie in micro-organismen alleen kunnen plaatsvinden als het gen onder controle komt van een promoter in het micro-organisme. Conclusie: Indien bacteriële regulatiesignalen zijn gebruikt is de kans op expressie in micro-organismen, en daarmee het risico dat aan de toepassing verbonden is, groter. In de uiteindelijke afweging wordt de aard van de promoter echter niet meegenomen. 2) Frequentie van horizontale genoverdracht Horizontale genoverdracht (van plant naar micro-organismen) kan niet uitgesloten kan worden. Er zijn mondelinge mededelingen dat in één publicatie aanwijzingen te vinden zouden zijn dat een dergelijke overdracht kan plaatsvinden, maar dat het resulterende micro-organisme alleen onder constante, hoge selectiedruk wordt gevonden. Wij zijn er niet in geslaagd deze publicatie te achterhalen. Het milieu waarin de overdracht plaatsvindt bepaalt in hoge mate de frequentie van overdracht. a) De bodem. In het door het CPRO-DLO opgestelde rapport over de toepassing van het nptii gen (kanamycine resistentie) is een poging gedaan om de frequentie van overdracht in de bodem te schatten. Deze berekeningen kwamen op een frequentie van uit. Hierbij moet worden aangetekend dat bij de berekening wordt uitgegaan van 5% competentie; beter was geweest om 100 % competentie te veronderstellen zodat er een "worst case" berekening ontstaat. Daarnaast is in de calculatie alleen de overdracht van plant naar bacterie middels transformatie in beschouwing genomen. In het algemeen kan gezegd worden dat deze berekening een indicatie is voor het feit dat de frequentie van overdracht erg laag ligt. De berekening zal niet alleen opgaan voor kanamycine resistentie, omdat de factoren die in de berekening zijn meegenomen gelden voor iedere willekeurig gen. Conclusie: Genoverdracht van plant naar micro-organismen in de bodem is tot nu toe niet aangetoond; de frequentie zal zeer laag liggen. b) Na consumptie. Voor de overdracht van genetisch materiaal vanuit planten naar de darmflora zijn geen empirische gegevens bekend. De aanname tot op dit moment is dat de maagsappen en proteolytische activiteit in de darm het planten DNA grotendeels, binnen korte tijd zullen inactiveren. Hierdoor zou de mogelijkheden voor genoverdracht naar 4

17 de darmflora zeer sterk ingeperkt worden. Overigens is in de muis aangetoond dat oraal toegediend DNA (M13) niet volledig wordt afgebroken (Schubbert et al., abstract als bijlage hierbij). Conclusie: Genoverdracht van plant naar micro-organismen in de darm is tot nu toe niet aangetoond, de frequentie zal zeer laag liggen. 3) Medische toepassing van het antibioticum. Bij de beoordeling of de overdracht van een antibioticum resistentie al dan niet een risico met zich brengt is het van belang te weten in hoeverre de toepassing van het antibioticum van cruciaal belang is voor de geneeskunde. Er zijn drie situaties mogelijk: a) Het antibioticum wordt noch medisch noch veterinair toegepast. Een eventuele verhoging van de resistentiefrequentie is in die gevallen niet erg relevant. Voorbeeld: hygromycine resistentie; hygromycine kan niet medisch of veterinair worden toegepast vanwege de hoge toxiciteit. b) Het antibioticum wordt medisch / veterinair toegepast, maar er zijn redenen waarom een effect van de toepassing van een resistentiegen op de overall resistentiefrequentie als niet relevant wordt gezien. Voorbeeld: ampicilline resistentie. c) Verhoging van de resistentie frequentie is absoluut onwenselijk omdat het antibioticum een "laatste redmiddel" is waartegen de resistentie zich (nog) niet op grote schaal ontwikkeld heeft. In de medische literatuur worden diverse antibiotica genoemd die in deze situatie worden gebruikt: vancomycine, cefotaxime, ceftriaxone, imipenem. Conclusie: De eventuele gevolgen van het gebruik van een antibioticum resistentie hangt samen met het medisch gebruik van het antibioticum. In het volgende overzicht wordt een beeld gegeven van het gebruik van diverse belangrijke antibiotica. GEBRUIK VAN ANTIBIOTICA ANTIBIOTICIUM HUMAAN MEDISCHE TOEPASSING veterinaire toepassing kanamycine ja, soms als pre- en post-operatieve therapie ja, infecties met entero- en streptococcen neomycine ja, bacteriële infecties van ogen en huid, sterilisatie het darmkanaal ja, bacteriële infecties van ogen en huid, ook oraal tegen gastro-intestinale infecties bij kalveren, varkens en pluimvee ampicilline ja, breed spectrum antibioticum ja, breed spectrum antibioticum streptomycine/ spectinomycine amikacine ja, met name bij Mycobacterium tuberculosis ja, alleen in de kliniek; er treedt snel resistentie op. ja, leptospira, chronical respiratory disease, infectious sinusitis en intestinale infecties neen bleomycine ja, behandeling stamcel kanker neen Chloramphenicol ja, behandeling meningitis en typhus ja, uitsluitend bij gezelschapsdieren tetracycline ja, veelgebruikt breed spectrum antibioticum ja, veelvuldig voor luchtweg- en darminfecties hygromycine nee nee 4) Voorkomen van de resistentie Naast het gebruik van het antibioticum is ook het voorkomen van de natuurlijke resistentie van belang, hierbij kunnen drie niches worden onderscheiden: a) de bodemflora b) de humane darmflora c) de dierlijke darmflora Het verzamelen van de relevante gegevens over het voorkomen van antibioticumresistenties in deze niches vergt een uitgebreidere literatuurstudie dan wij hebben kunnen uitvoeren. Eén obstakel is dat van veel literatuurgegevens niet gedocumenteerd is of het populaties betreft die onder antibioticumdruk staan of hebben gestaan. Anderzijds is veelal niet beschreven met welke concentratie van het antibioticum de resultaten zijn verkregen waardoor onduidelijk is of er sprake is van werkelijke resistentie of tolerantie. Globaal kan gesteld worden dat de volgende resistenties veel (i.e. procenten van de populatie in darmflora, frequentie rond 10-5 in de bodem) voorkomen: kanamycine / neomycine / amikacine, streptomycine / spectinomycine, ampicilline, chloramphenicol en tetracycline. Resistentie tegen bleomycine en hygromycine komen minder voor. Conclusie: In het algemeen kan gesteld worden dat indien een resistentie al in redelijke mate aanwezig is in één van deze niches, door genoverdracht de resistentie frequentie niet in significante mate zal worden verhoogd in de betreffende niche. 5

18 5) Hoogte selectiedruk Om micro-organismen die een antibioticum resistentie hebben verkregen door overdracht vanuit plantenmateriaal een selectief voordeel te geven ten opzichte van "onaangepaste" micro-organismen moet er een voldoende hoge selectiedruk aanwezig zijn in de niche waarin dit micro-organisme zich bevindt. Voor de humane darmflora en dierlijke darmflora zal deze selectiedruk samenhangen met het al dan niet gebruiken van het antibioticum. Voor bodemmicro-organismen wordt de antibioticum concentratie bepaald door meerdere factoren: a) het antibioticum wordt door andere micro-organismen gemaakt. Zo ja, wat is de concentratie en verspreiding van het antibioticum. b) het antibioticum wordt via dierlijke mest aan de grond toegevoegd. Dit kan alleen indien het betreffende antibioticum daadwerkelijk werd toegepast als geneesmiddel of als toevoeging aan diervoeders (zie brief van Van den Bogaard aan Bergmans, d.d. 20 juli 97). Het kanamycine rapport geeft voor deze situatie een grove schatting, waarbij de berekening ervan uit gaat dat al het verkochte antibioticum (kanamycine en neomycine) over 75% van het Nederlandse landbouw areaal wordt verspreid, er wordt geen adsorptie en biologische afbraak van het antibioticum verondersteld bij deze berekening. De berekening kwam uit op 0.13 microgram/ml grond. De verwachting is dan ook dat de werkelijke waarde nog lager zal liggen. Conclusie: In het algemeen zal het hierbij om zeer lage concentraties antibioticum gaan die alleen in zeer bepaalde micro-niches tot selectieve concentraties zullen leiden. 6

19 BIJLAGE 2 (deze bijlage is overgenomen uit het rapport Kanamycine resistentie in transgene planten, inventarisatie en evaluatie van mogelijke risico s, J.F.M. Bijvoet en J.P.H. Nap, CPRO-DLO, 1991). Schatting van de transformatiefrequentie van een micro-organisme in de bodem als gevolg van de teelt van kanamycine resistente tomaten. Belangrijke parameters voor het schatten van een transformatiefrequentie in de bodem zijn (a) de concentratie van het DNA in de bodem en (b) de mogelijkheid tot opname van dat DNA. (a) Schatting van de concentratie DNA in de bodem. Voor de schatting is uitgegaan van de volgende veronderstellingen. 1. De totaal in Nederland geproduceerde hoeveelheid tomaat bedraag 5*10 8 kg per jaar op een areaal van 1600 hectare (CBS, 1991). 2. De volledige tomateplant, inclusief vrucht, wordt gebruikt als groenbemester. 3. De massaverhoding vrucht : plant is 2 : 1, zodat per jaar (5*10 8 kg)*(1.5))/(1600 ha) = 4.7*10 5 kg/ha tomatemateriaal in de bodem terecht komt. 4. De gemiddelde dichtheid van een plantecel is 1 g/cm 3 (DT). 5. De gemiddelde grootte van een volwassen plantecel bedraagt 1.25*10-7 cm 3 (VT). 6. De grootte van het haploïde genoom bedraagt 7*10 5 kb. 7. De DNA inhoud per cel is ((7*10 5 kb)*(660 g/mol bp)*(10 3 )*(2))/(6.02*10 23 /mol) = 1.5*10-12 g/cel (DI). 8. Het plantaardige materiaal wordt 30 cm ondergeploegd. 9. De dichtheid van de bodem is 1.5 g/cm 3 (Brady, 1974). 10. De bodemmassa tot 30 cm diepte per hectare bedraagt (10 8 cm 2 /ha)*(30 cm)*(1.5 g/cm 3 ) = 4.5*10 9 g/ha. 11. Van het DNA in de bodem blijft 10% intact (Greaves & Wilson, 1970) (A1). 12. Uit het plantaardig materiaal komt 10% van het DNA vrij. (Aardema et al., 1983) (A2). 13. De relatieve vochtigheid van de grond is 20%, zodat de hoeveelheid bodemwater (0.2ml H 2 O/g)*(4.5*10 9 g/ha) = 9.0*10 8 ml/ha is (A3). De jaarlijkse belasting van een hectare landbouwgrond met tomate-dna kan nu berekend worden volgens: DM = (PM * DI) / (VT * DT) met: -DM = hoeveelheid DNA per jaar per hectare in de bodem (kg/jaar/ha). -PM = hoeveelheid plantaardig materiaal per jaar per hectare (4.7*10 5 kg/jaar/ha). -DI = DNA gehalte tomatecel (1.5*10-12 g/cel). -VT = volume tomatecel (1.25*10-7 cm 3 /g). -DT = dichtheid tomatecel (1 g/cm 3 ). Dit geeft: DM = ((4.7*10 5 )*(1.5*10-12 ))/((1.25*10-7 )*(1)) = 5.6 kg/jaar/ha. De concentratie van het DNA in de bodem volgt dan uit: DB = DM * A1 * A2 * A3 Dit geeft: DB = (5.6)*(0.1)*(0.1)/(9.0*10 8 ) = 6.2*10-2 µg/ml. (b) Schatting van de hoeveelheid DNA die wordt opgenomen. De opname van van vrij DNA door bodemmicro-organismen is van een groot aantal factoren afhankelijk. De volgende veronderstellingen gaan uit van een organisme dat efficiënt getransfromeerd kan worden (zie ook Calgene, 1990). 1. In de bodem is 10% van de organismen transformeerbaar. 2. Van de transformeerbare cellen is 5% competent (Cahn & Fox, 1968). 7

20 3. De natuurlijke transformatiefrequentie is 0.02 (Cahn & Fox, 1968). 4. Indien [DNA]<10 µg/ml moet de transformatiefrequentie gecorrigeerd worden met een factor [DNA]/0.1. In dit geval is dit 6.2* Alle DNA fragmenten zijn 1 kb of groter en bevatten altijd de volledige apha2 informatie, of geen apha2-dna. 6. De transgene planten bevatten 10 copiën van het apha2-gen. 7. Het te transformeren apha2-dna fragment is 1 kb, zodat de fractie apha2-dna 10*1/7*10 5 = 1.4*10-5 van het totaal bedraagt. 8. Het gen wordt niet geïnactiveerd tijdens integratie. 9. Het gen komt na integratie tot expressie. 10. Het acceptor-organisme is niet resistent tegen kanamycine. 11. Er is geen ivloed van de genoomcomplexiteit. De frequentie waarmee in de bodem kanamycine resistentie naar een micro-organisme wordt overgedragen is nu te schatten volgens: FT = B1 * B2 * B3 * B4 * B5 met: -FT = transformatiefrequentie kanamycine resistentie. -B1 = transformeerbaarheid bodemorganismen (0.1). -B2 = competentie transformeerbare bodemorganismen (0.05). -B3 = natuurlijke transformatiefrequentie (0.02). -B4 = correctiefactor natuurlijke transformatiefrequentie (6.2*10-3 ). -B5 = fractie apha2-dna (1.4*10-5 ). Dit geeft : FT = (0.1)*(0.05)*(0.02)*( 6.2*10-3 )*(1.4*10-5 ) = 8.7*10-12 Indien er zich 10 7 levensvatbare microben per gram in de bodem bevinden, dan betekent deze frequentie dat er 8.7*10-5 transformanten per gram zullen ontstaan. Volgens Henschke & Schmidt (1990) bevinden zich van nature 1600 kanamycine resistente organismen in een gram grond, zodat de bijdrage door de transformatie met transgeen apha2- DNA 5.4*10-6 % bedraagt. Deze bijdrage aan de hoeveelheid kanamycine resistente organismen ligt in de orde van grootte van de natuurlijke mutatiefrequentie (IFBC, 1990). 8

21 Bijlage 3 Advies COGEM en RIKILT betreffende antibiotica-resistentiegenen (CGM/ ) van 18 september Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: helpsbb@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ Bijlagen

22 Plaatsvervangend voorzitter: Prof.dr.ir. E Jacobsen Bezoekadres: RIVM, Anthonie van Leeuwenhoeklaan MA Bilthoven Postadres: Postbus AN Bilthoven Tel.: , Telefax: cogem@rivm.nl Aan de minister van Volkshuisvesting, Ruimtelijke Ordening en Milieu, Aan de minister van Landbouw, Natuurbeheer en Visserij Uw kenmerk Uw brief van Kenmerk Datum CGM/ september 2000 Onderwerp Advies antibioticumresistentiegenen Geachte minister, In het verleden heeft de Cogem u meerdere malen geadviseerd over de eventuele risico s verbonden aan het gebruik van antibioticumresistentiegenen als markersysteem tijdens de genetische modificatie van planten. De Cogem heeft u voor de beoordeling van de veiligheid van het gebruik van dergelijke genen een aantal overwegingen gegeven welke zij in haar advies van d.d. 29 september 1998, CGM/ , aan u heeft doen toekomen. Ook het RIKILT heeft in het verleden geadviseerd over de toelaatbaarheid van het gebruik van antibioticumresistentiegenen in planten, dit door middel van beoordelingsrapporten met betrekking tot de veevoederveiligheid van specifieke dossiers. Recentelijk hebben Cogem en RIKILT, tezamen met het RIVM, u een gezamenlijk advies doen toekomen over de toelaatbaarheid van het gebruik van het npt-iii gen in aardappelen. Door middel van het onderhavige advies willen COGEM en RIKILT u een gezamenlijk algemeen advies doen toekomen over het gebruik van antibioticumresistentie genen in planten. Beoordelingskader Aan werkzaamheden met genetisch gemodificeerde planten worden met betrekking tot de implementatie van het voorzorgsprincipe de volgende beoordelingsvelden onderscheiden: 1. de veiligheid voor milieu; 2. de veiligheid voor de volksgezondheid; 3. de veiligheid bij gebruik als diervoeder; 4. de veiligheid bij gebruik voor humane consumptie. De beoordelingsvelden 1, 2 en 3 zijn aan de orde in het kader van de beoordeling krachtens het Besluit genetisch gemodificeerde organismen, en vormen tot op heden dan ook de basis voor de advisering van de COGEM en het RIKILT. 1

23 Huidige stand van advisering Ter recapitulering hierbij een korte weergave van de advisering tot op heden. Zowel Cogem als RIKILT gaan bij de beoordeling van de veiligheid van het gebruik van antibioticaresistentiegenen in planten er vanuit dat het risico van deze genen gelegen is in het feit dat door horizontale genoverdracht tussen planten en micro-organismen, pathogene micro-organismen resistent kunnen worden tegen antibiotica. Therapeutica zouden hierdoor onwerkzaam kunnen worden. De eerste vraag die tijdens de risico-analyse opkomt is de vraag hoe groot de kans op de feitelijke horizontale genoverdracht daadwerkelijk is. Hierover zijn geen experimentele gegevens beschikbaar, wel is duidelijk dat de mogelijkheid van overdracht bestaat maar dat de frequentie waarschijnlijk zeer laag zal zijn. Deze genen zullen steeds weer opnieuw ontstaan door het natuurlijke proces van mutatie. Van belang voor het vaststellen van de veiligheid van het gebruik van antibioticaresistentiegenen zijn dan ook de eigenschappen van het gen zelf en het al aanwezig zijn hiervan in het milieu. Vragen die hierbij aan de orde komen zijn: Wat is het spectrum aan antibiotica waartegen het genproduct resistentie veroorzaakt? Waar komt het gen vandaan? Wat is bekend over het voorkomen van de resistentie in het milieu. Bij het beoordelen en vergelijken van verschillende studies zijn de volgende punten van belang: - Het milieu waar gezocht is bv.: darmflora, watermonsters, grondmonsters - De kwaliteit van de gegevens - Wat is de relevantie van de gegevens bezien tegen de eigenschappen van het gen (kruisresistenties) en bezien tegen de toepassing van de plant (al dan niet geconsumeerd). Wat is het belang van het antibioticum voor medische of veterinaire toepassing. De antwoorden op deze vragen zijn voor de verschillende antibioticumresistentiegenen, die door middel van aanvragen om advies door zowel de Cogem als het Rikilt zijn beoordeeld, vergeleken en de Cogem en het Rikilt zijn daarbij tot de conclusie gekomen dat tegen toepassing van de volgende antibioticumresistentiegenen in planten geen bezwaar bestaat voor wat betreft de gespecificeerde toepassing: Npt-II (kanamycine resistentie) voor teelt, incidentele consumptie en veevoedertoepassing, Npt-III (amikacine resistentie) voor teelt, incidentele consumptie maar uitgezonderd veevoedertoepassing, bla (ampiciline- resistentie) voor teelt, incidentele consumptie en veevoedertoepassing, hpt (hygromycine resistentie) voor teelt, incidentele consumptie en veevoedertoepassing, Met nadruk wordt er op gewezen dat deze evaluatie alleen aan de orde is indien het een grootschalige toepassing betreft van een genetisch gemodificeerd gewas, een teelt van groter dan 10 hectare. Bij kleinschalige toepassing van genetisch gemodificeerde gewassen, waarbij geen sprake is van structureel gebruik voor humane dan wel dierlijke consumptie, is de eventuele impact alleen al door de geringe kwantiteit van het te introduceren materiaal voldoende ingeperkt. Advisering toekomst Inmiddels is duidelijk dat er maatschappelijk zorg bestaat over het gebruik van antibioticaresistentiegenen in planten. Het ligt dan ook in de lijn der verwachting van de Cogem en het RIKILT dat het beleid een keuze zal maken voor een beperkte toepassing van antibioticumresistentiegenen in planten. De Cogem en het RIKILT willen u daarbij adviseren om tot een weloverwogen besluit te kunnen komen. De Cogem en het RIKILT adviseren u om het gebruik van de antibioticaresistentiegenen npt-ii en hyg ook in de toekomst toe te blijven staan. De keuze voor deze twee genen is gebaseerd op de volgende gegevens. 2

24 Npt-II Het npt II gen betreft een smal spectrum antibioticumresistentiegen. Het gen is afkomstig van Tn5 en verleend resistentie tegen met name de antibiotica kanamycine en neomycine. Dit is een transposon dat wijd en zijd aangetroffen wordt in allerlei gram negatieve organismen. De resistentie wordt dan ook in betrekkelijk hoge frequenties aangetroffen in het milieu (kweekbare bodemmicro-organismen) zonder dat er sprake is van verhoogde selectiedruk. De klinische relevantie van kanamycine en neomycine is, voor humane toepassingen vrijwel volledig verdrongen door nieuwere generatie antibiotica, alleen nog beperkt relevant in veterinaire toepassingen. Hyg (hpt) Het hpt gen is eveneens een smal spectrum antibioticumresistentiegen. Het gen verleent alleen resistentie tegen hygromycine B. Het gen kan onder meer geïsoleerd worden uit Escherichia coli, een bacterie die algemeen voorkomt in de dierlijke darmflora en bij de humane darmflora. Er is geen algemene klinische en veterinaire toepassing voor hygromycine B, dit in verband met de toxiciteit van het antibioticum. Frequenties van voorkomen van het resistentiegen in het milieu zijn daardoor ook vaak niet bekend omdat de klinische relevantie voor monitoring er niet is. Hygromycine wordt dan ook niet als een oraal ingenomen antibioticum toegepast en komt daarmee niet voor in handboeken over medisch toegepaste antibiotica. De keuze voor deze twee markergenen geeft een maximale zekerheid omtrent de veiligheid voor mens en milieu. Ook kunnen met deze twee markersystemen zowel alle monocotyle als dicotyle planten gemodificeerd worden, waarmee eventuele praktische bedenkingen tegen het toestaan van het gebruik van slechts een beperkt aantal antibioticumresistentiegenen afdoende zijn beantwoord. Daarnaast is het van belang om vast te stellen dat het alleen zinvol is een gelimiteerd gebruik van antibioticaresistentiegenen bij grootschalige introducties in het milieu en introducties tot de markt voor te schrijven. Beperkingen aan het gebruik in de kleinschalige onderzoeksfase is vanuit wetenschappelijk oogpunt op de risico s voor mens en milieu niet te verdedigen en zou bovendien leiden tot onomkeerbare en onproportionele schade aan het noodzakelijke onderzoeksklimaat in Nederland. Overigens ligt het in de lijn der verwachting dat indien het beleid een beperking van het aantal te gebruiken antibioticaresistentiegenen aankondigt, dit op afzienbare termijn zal leiden tot het verdwijnen van de (al beperkte) diversiteit aan antbioticaresistentiegenen in kleinschalige veldproeven. Tot slot het volgende. Het veredelingsproces is een proces van de lange adem. Nieuwe rassen kennen vaak een ontwikkelingstraject van 10 jaar of langer. In afgelopen periode zijn dan ook al vele keuzes gemaakt en veel investeringen gedaan om het ontwikkelingstraject te doorlopen. In het licht hiervan en het feit dat er voor de onder Huidige stand advisering genoemde set aan resistentiegenen geen wetenschappelijke gronden zijn om deze op dit moment te verbieden adviseren de Cogem en het RIKILT u om alle marktaanvragen die op dit moment in behandeling zijn af te handelen conform het huidige standpunt. Dit is mede verantwoord door het theoretische karakter van het veronderstelde risico. Gezien het feit dat genetisch gemodificeerde rassen in de praktijk slechts een beperkte levensduur hebben, en als zij niet als kruisingsouder gebruikt worden, zullen er slechts gedurende een beperkte periode rassen op de markt zijn die antibioticumresistentiegenen kunnen bevatten anders dan de voorgestelde npt-ii en hpt sequenties. 3

25 Gezien de ontwikkelingen binnen de EU om tot een afbouw te komen van het gebruik van antibioticumresistentiegenen als merker, is er reeds nu sprake van een verminderde toepassing van dit type merkergenen in genetisch gemodificeerde gewassen. Hopende u hiermee voldoende geïnformeerd te hebben. Namens de Commissie Genetische Modificatie Namens het Rijks-Kwaliteitsinstituut voor Land en Tuinbouwproducten-DLO Prof.dr.ir. E. Jacobsen Plaatsvervangend Voorzitter Dr. H.A. Kuiper 4

26 Bijlage 4 E. Hendrickx, dienst Epidemiologie, WIV. Gebruik van antibiotica in België. Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: helpsbb@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ Bijlagen

27 From: "Erik Hendrickx" Organization: I.H.E.-Epidemiology,BRUSSELS,BELGIUM To: William Moens Date: Tue, 28 May :39: Subject: Re: Fwd: Listes d'antibiotiques Priority: normal Content-type: text/plain Content-description: Mail message body Geachte Dr. Moens, In verband met diergeneeskundige antimicrobiële middelen die in België mogen gebruikt worden, kan een officiële lijst gevonden worden op de web site (algmene farmaceutische inspectie). Deze lijst is georganiseerd per chemische klasse. Wat betreft het gebruik van antibiotica groeipromotoren in de voedselproductie: deze lijst werd erg beperkt onder invloed van Europese directieven en een verdere volledige phasing out is geprogrammeerd (voor 2006?). Momenteel zijn nog toegelaten: Flavomycin (bambermycin, moenomycin) Avilamycin Efrotomycin Wat betreft de ionoforen en coccidiostatica: mijn collega veearts (CODA/CERVA) zal me zodra mogelijk een lijstje sturen. Antibiotica en anti-infectieuze geneesmiddelen die in de humane geneeskunde gebruikt worden, kunt u terugvinden in bijgevoegde Excel file die geëxtraheerd werd uit de ATC-classificatie van het WHO collaborating centre for drug statistics methodology (versie 2002). ATC staat voor Anatomical-Therapeutical-Chemical. Voor antibiotica is de subgroep J01 de belangsrijkste (systemisch toegediende geneesmiddelen). Tenslotte, wat betreft antibiotica die vaak geassocieerd zijn met het voorkomen van multiresistentie: hierover heb ik geen gedetailleerde informatie. Algemeen kan gezegd worden dat het fenomeen multiresistentie erg verschilt van kiemsoort tot kiemsoort en van de locale antimicrobiële selectiedruk. Bovendien beschouwt men best de vandaag gekende en geïdentifieerde multiresistenties als een momentopname van de bacteriële evolutie. Via gekende en onbekende genetische uitwisselingsmechanismen, hebben de bacteriën immers tijdens de laatste 55 jaar getoond dat ze bijzonder snel zijn in het ontwikkelen en verspreiden van een grote variëteit efficiënte multiresistenties. Dit zal waarschijnlijk niet ophouden. Met vriendelijke groeten, Erik Hendrickx Epidemiologie WIV On 28 May 2002 at 10:20, William Moens wrote:

28 >Date: Mon, 27 May :26: >To: >From: William Moens >Subject: Listes d'antibiotiques >Cc: >Bcc: >X-Attachments: > >Cher Herman, > >le cabinet me demande une projet de cahier de charge d'un AR visant >l'interdiction de l'utilisation de gènes de résistance aux >antibiotiques dans les OGM alimentaires humain ou animal en tant que >marqueurs de sélection. > >J'ai besoin d'une liste des antibiotiques utilisés en médecine >humaine et vétérinaire, éventuellement aussi en agriculture à titre >de facteurs de croissance d'élevage ou de phytopharmaceutique. > >La liste serait classée en famille chimiques (tetracycline, > >penicilline, gentamycine, etc...) correspondant à des familles de > >gènes que nous connaissons. > > > >Il serait idéal que la liste mentionne ceux parmi les antibiotiques > >qui sont associés à des épidémiologies de poly-résistance. > >On peut commencer avec une liste provisoire, mais je dois l'avoir >pour le 1er juin!!! > >Merci d'avance, > >A charge de développement en collaboration comme déjà envisagé. > >W. Moens >Chef de SEction Dr. Erik Hendrickx Scientific Secretariat Co-ordination Commission for Antibiotic Policy Epidemiology Department Institute for Public Health J. Wytsmanstraat Brussel Belgium Tel: 32-(0) Fax: 32-(0) Content-type: text/plain; charset=us-ascii Content-disposition: inline Content-description: Attachment information. The following section of this message contains a file attachment prepared for transmission using the Internet MIME message format.

29 If you are using Pegasus Mail, or any another MIME-compliant system, you should be able to save it or view it from within your mailer. If you cannot, please ask your system administrator for assistance File information File: 2002ATC-ABs-Moens.xls Date: 28 May 2002, 13:35 Size: bytes. Type: Excel-sheet Attachment converted: Hard Disk:2002ATC-ABs-Moens.xls (XLS4/XCEL) (0005DFA1)

30 Bijlage 5 European Commission. Opinion of the Scientific Steering Committee on Antimicrobial Resistance - 28 May 1999 pp : 3.5. Antibiotic resistance marker genes in genetically modified plants. Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: helpsbb@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ Bijlagen

31 antibiotics may enter the environment having been excreted in the faeces and / or urine of treated animals. Antibiotic run off from plant applications is also possible. Animals have also been shown to acquire antibiotic tissue residues from contact with an environment in which other animals have been treated with sulphadimidine and furazolidone. Similarly, oxilinic acid has been detected in crabs and mussels in the vicinity of fish farms for up to 13 days after treatment (Coyne et al (1997) and antibiotic resistant bacteria have also been recovered from sediment from fish farms (Kerry et al 1994, Depaola et al 1995) Impact on health Bacterial gene transfer is now thought to occur not only in the human and animal intestine but throughout the biosphere, especially in nutrient-rich sites such as aquatic systems, sediments, soils, in the vicinity of plant roots, and in the sludge of the biological sewage treatment systems. Resistant bacteria can be isolated from all of these sites. Resistance may also be spread from bacteria borne onplants and vegetables treated with antimicrobials or fertilised with wastes containing animal or human faecal residues or derived from fish farms. Resistance should therefore be taken as a phenomenon of global genetic ecology. A number of reservoirs and habitats may be sites for the emergence and maintenance of antimicrobial resistant microorganisms. These include hospitals, farms, aquaculture, human or animal commensal bacteria, and habitats where faeces and urine from humans and animals are found. Sewage from humans and livestock given antimicrobials is a mechanism of spreading resistance genes. Antimicrobials excreted by humans and animals are found in sewage water and may degrade slowly and exert a continuous selection pressure. In a similar way, antimicrobials used in plant protection are washed into the soil and ground water where they may select resistant bacteria, so favouring the dissemination of resistance genes. The US EPA recognises that there are deficiencies in the present knowledge of the environmental fate and ecological effect of streptomycin (EPA Pesticide Fact Sheet, 1988, updated). No information is currently available on its breakdown in soil and water. Also the Agency is unable to assess the potential for oxytetracycline to contaminate groundwater because the environmental fate of oytetracycline has not been characterised, and neither is it able to assess the ecological effects of oxytetracycline on terrestrial or aquatic wildlife, again because no data are available. Common factors between the four ecological compartments (humans, animals, plants and soil-water) are the antimicrobials, the bacteria and the genes that code for resistance. The genes move between the bacteria in each compartment, and the bacteria may move between the compartments Antibiotic resistance marker genes in genetically modified plants Genetic modification of plants usually involves two steps where selectable markers are being used: 1) engineering of the gene construct which is used to transform the plant; this will normally be done in E. coli; 2) transformation of the plant and selection of transformants. Markers are used for selecting the 38

32 desired transformants among the non-transformed individuals. Some of the antibiotic resistance marker genes encode resistance to: ampicillin, chloramphenicol, kanamycin, streptomycin, amikacin, tetracycline, hygromycin, gentamicin and phleomycin resistance markers The fate of plant DNA in the gastro-intestinal tract Consumed as a component of e.g. fresh fruit or vegetable, antibiotic resistance marker genes are treated in the gastro-intestinal (GI) tract in a similar way to any other gene present in food of plant or animal origin. During movement in the GI tract, plant DNA is rapidly degraded into small fragments. According to an estimate, 1 g of maize tissue will yield no more than 100 µg of genomic DNA in the gut, and estimated 50 pg intact marker gene in transgenic maize. About 1-2% of orally ingested M13 DNA persists transiently as fragments between 1 and 7 h after feeding in the gut and faeces of mice (Schubber et al., 1994). The bulk of these fragments are bp in size (the size of the gene which codes for TEM-1 beta-lactamase is <900 bp). The small intestine contains about % (1-8 h after feeding), the cecum % (2-18 h), the large intestine % (2-8 h) of the DNA orally administered. A few percent (<5%) of the ingested DNA (up to 1700 bp) may be excreted as fragments in the faeces (Schubbert et al., 1994, 1997) The potential for integration of DNA from food into intestinal microorganisms Transformation of intestinal bacteria with food-derived plant DNA has never been demonstrated and attempts to transform competent E. coli bacteria with plant DNA in vitro have been unsuccessful. In nature, the processes of integration, heterologous transcription and translation, and not DNA flux, are likely to be the limiting factors in functional gene exchange. Recombination is probably the most serious barrier to functional inter-specific gene transfer. Because of this, gene transfer events mediated by natural transformation are most likely to occur between members of the same or closely related species. It is important to note that most transgenic plants have puc 18 plasmid, which does not have homology to most bacterial genomes, and no transfer functions. Thus it seems unlikely that puc18 DNA could sucessfully transform bacteria pathogenic to man The probability of expression of an integrated gene in intestinal microorganisms The antibiotic resistance marker genes used for selection of plant transformants have regulatory sequences that may not function in gut microorganisms; in those cases, recombination would have to occur to restore functionality. Complicated rearrangements, especially under selective pressure, may bring a prokaryotic promoter in front of the marker gene, leading to its expression. The expression of antibiotic resistance marker genes which serve to facilitate the selection of transformants is under the control of regulatory sequences. In principle, these regulatory sequences might allow the marker genes to be expressed at least in some types of intestinal bacteria. However, promoters of genes from one phylogenetic 39

33 group of bacteria usually do not work in a member of another phylogenetic group (Salyers 1997). A silent resistance can become activated by insertion of an insertion sequence in the promoter region or mutations in the promoter region that cause it to become active. Only if a selective pressure is present, which gives an advantage to the recipient of the gene, will the gene transfer event have any concrete consequences The protein encoded by antibiotic resistance gene in plant as a potential safety issue A special concern with respect to antibiotic resistance genes is the theoretical possibility that clinical therapy could be compromised due to inactivation of an oral dose of antibiotic as a result of consumption of food derived from the transgenic plant. Any such risk arising as a result of the protein should correlate with the amount of enzyme remaining functionally active in the GI tract. This, on the other hand, depends on a) the estimated daily intake (EDI) and thus the level of the active protein in food, and b) stability of the protein in the GI tract. FDA calculated that the EDI of APH(3 )II (kanamycin resistance gene) was 480 µg/person/day (FDA 1994). Proteins present in food and entering the GI tract are broken down to smaller peptides and amino acid constituents by digestive enzymes. The purified APH(3 )-II protein was degraded in 10 seconds in in vitro assays developed to simulate the human GI environment. Tomato extract and non-fat milk, added to determine whether the presence of additional food-source proteins might slow the proteolytic degradation of the enzyme, did not prevent the effective degradation of the protein. It has been calculated that, under conditions where the maximum amount of kanamycin could be inactivated by the marker protein in ingested tomatoes, the loss of antibiotic efficacy would be 1.5% of a 1 g dose of neomycin (Redenbaugh et al. 1993, 1994), and only after oral administration Impact on human health, on animal health and animal production In general, it can be concluded that: (1) Most, if not all, of the antibiotic resistance genes ingested (in the form of plants) will be degraded in the gastrointestinal tract before reaching the critical areas where potential transformation of microorganisms take place. (2) Even if intact DNA is present, the probability that competent microorganisms will be naturally transformed by this exogenous DNA in humans, animals or environment is very low. The probability that gene transfer between plant and microorganisms occurs and creates health problems seems to be extremely low and needs to be considered only in special cases where the antibiotic is administered by the oral route and there is also heavy selection pressure. The nature of the gene and its expression product as well as the conditions in the GI tract will determine whether or not a food safety problem exists. Aspects to consider are the importance of the substrate antibiotics in human and animal therapy 40

34 and whether there are alternatives (e. g. vancomycin, other glycopeptides, fluoroquinolones, tetracycline, gentamicin, newer derivatives of beta-lactam antibiotics), frequency of use (probability of selection pressure) and route of administration. The substrate profile of enzymes should be carefully analysed to see whether there is any chance that they may catalyse the inactivation of an important antibiotic used in human therapy. Use of the antibiotic in the environment may cause additional selection pressure; e.g. streptomycin and oxytetracycline are used as pesticides. Hence, although the risk of gene transfer is extremely small, each plant containing antibiotic resistance genes should be evaluated on a case-by-case basis. The main emphasis should be on the evaluation of the selection acting on the bacterial recipients after possible horizontal gene transfer. Assessment of potential for transfer of antibiotic resistance marker genes from plant into the bacterial community should be examined more closely. 41

35 Bijlage 6 Stellungnahme der ZKBS (Zentrale Kommission für die biologische Sicherheit) zur Biologischen Sicherheit von Antibiotika-Resistenzgenen im Genom gentechnisch veränderter Pflanzen (Az.: ) from the Robert Koch Institut. Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: helpsbb@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ Bijlagen

36 Monday, June 3, 2002 Stellungnahme der ZKBS zur Biologischen Sicherheit von Antibiotika- Resistenzgenen im Genom gentechnisch veränderter Pflanzen Page: 1 Allgemeine Stellungnahme der ZKBS Az.: Stellungnahme der ZKBS zur Biologischen Sicherheit von Antibiotika-Resistenzgenen im Genom gentechnisch veränderter Pflanzen I. Einleitung Als Methoden zur Transformation von Kulturpflanzenarten haben sich die indirekte Übertragung von Genkonstrukten mittels Agrobacterium tumefaciens und das direkte Einbringen von Genkonstrukten in Protoplasten oder Zellen bewährt. Im Einzelfall ist es möglich, daß aufgrund der speziellen Eigenschaften der jeweiligen Kulturpflanze derzeit nur die Transformation mittels Agrobacterium tumefaciens erfolgreich ist. Für die direkte Transformation von Protoplasten wie auch für die Transformation mittels Agrobacterium tumefaciens werden die DNA-Konstrukte in der Regel zusätzlich mit Marker-Genen gekoppelt, um jeweils nach Teilschritten der Transformation diejenigen Zellen (bei der direkten Transformation von Protoplasten die Pflanzenzellen; bei der Transformation mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens zuerst E. coli, dann Agrobacterium tumefaciens und später die Pflanzenzellen) sicher und schnell identifizieren zu können, in deren Genom das DNA-Konstrukt inseriert worden ist. Als Selektionsmarker-Gene für den letzten Schritt (s.o.) sind bestimmte Antibiotika-Resistenzgene bakteriellen Ursprungs (in den meisten Fällen das nptii - oder das hph -Gen) gebräuchlich, die zusammen mit dem Ziel-Genkonstrukt in geeignete Ti-Plasmid-Vektoren inseriert werden. Bei dem Transformationsverfahren mit Agrobacterium tumefaciens können jedoch gelegentlich auch solche Antibiotika-Resistenzgene aus Vektorabschnitten in das pflanzliche Genom übertragen werden, welche sich außerhalb der in das Ti-Segment inserierten DNA aus Ziel-Genkonstrukt und Selektionsmarker-Gen befinden und u.u. der Bakterien-Selektion im ersten und zweiten Schritt (s.o.) dienten. Auf der Grundlage von bisherigen Stellungnahmen im Einzelfall nimmt die ZKBS im Folgenden allgemein Stellung zu der Frage der Biologischen Sicherheit von gentechnisch veränderten Pflanzen, in deren Genom Antibiotika-Resistenzgene vorhanden sind. II. Antibiotika-Resistenzgene, die in das Genom transgener Pflanzen mittels gentechnischer Methoden inseriert worden sind II.1. Antibiotika-Resistenzgene mit Selektionsmarker-Funktion II.1.1. Das nptii -Gen Das nptii -Gen stammt aus dem Transposon Tn5 (Garfinkel et al.,

37 Monday, June 3, 2002 Stellungnahme der ZKBS zur Biologischen Sicherheit von Antibiotika- Resistenzgenen im Genom gentechnisch veränderter Pflanzen ) und kodiert für eine Neomycin-Phosphotransferase. Die Neomycin-Phosphotransferase ist eine Aminoglycosid-3'-Phosphotransferase des Typs II (APH(3')II), welche die ATP-abhängige Phosphorylierung der 3'-Hydroxyl-Gruppe des Aminohexose-Rings bestimmter Aminoglycosid-Antibiotika kataly-siert und sie damit inaktiviert. Das Enzym zeichnet sich durch eine hohe Substratspezifität aus (Nap et al., 1992). Page: 2 II.1.2. Das hph -Gen Das hph -Gen stammt aus Escherichia coli und kodiert für eine Hygromycin-Phosphotrans-ferase. Diese inaktiviert spezifisch das Antibiotikum Hygromycin durch Phosphorylierung (Gritz und Davies, 1983). Andere Aminoglycosid-Aminocyclitol-Antibiotika wie Kanamycin oder Geneticin werden nicht umgesetzt. II.2. Antibiotika-Resistenzgene ohne Selektionsmarker-Funktion II.2.2. Das aada (Strep/Spec R )-Gen Das aada (Strep/Spec R )-Gen stammt aus dem Plasmid R538-1 von Escherichia coli und kodiert für eine Streptomycin-Adenyltransferase (Davies und Smith, 1978). Tomalsky und Crosa (1987) wiesen das aada (Strep/Spec R )-Gen auch auf dem Multiresistenz-Transposon Tn1331 in Klebsiella pneumoniae nach. Die Streptomycin-Adenyltransferase modifiziert die 3 -OH Position des Streptomycin-N-methyl-L-glucosamin-Rings bzw. eine 9-OH Position des Spectinomycins. Untersuchungen von Hollingshead und Vapnek (1985) haben gezeigt, daß das aada (Strep/Spec R )-Gen bei der Konstruktion von Vektoren verwendet werden kann. II.2.1. Das amp r -Gen Das amp r -Gen kodiert für die weit verbreitete TEM-1 ß-Laktamase (Sanders und Sanders, 1992) [TEM = Thomas Edison Murphy]. Etwa 35% der klinischen E. coli -Isolate besitzen heute eine Ampicillinresistenz (Kresken et al, 1999). Diese ist überwiegend, d.h. zu etwa 90 %, durch den ß-Laktamasetyp TEM-1 bedingt (Livermore, 1995), der ebenfalls bei anderen Enterobakterien-Spezies, sowie bei Haemophilus und bei Neisseria gonorrhoeae nachgewiesen wurde. Im molekularbiologischen Sprachgebrauch wird es als amp r oder bla (TEM-1) bezeichnet und liegt auf einer Reihe von Klonierungsvektoren vor (pbr322-derivate, puc-serien etc.). Dieses TEM-1-Enzym hat gegen neuere Cephalosporine nur eine sehr geringe Aktivität und ist durch ß-Laktamase-Hemmer wie Clavulansäure oder Tazobactam inhibierbar. Jedoch kann bei E. coli eine hohe Expressionsrate Resistenzen gegen Amoxicillin / Tazobactam und gegen andere Kombinationen von ß-Laktamen mit ß-Laktamase-Inhibitoren hervorrufen (Sanders und Sanders, 1992). Mutationen der ß-Laktamase (z.b.tem-30 bis TEM-41) können weiterhin dazu führen, daß die veränderten Enzyme nur schlecht durch Clavulansäure inhibierbar sind. Im Klassifizierungsschema von Bush et al. (1995) wurden solche Varianten als eigene Unterklasse 2br eingeführt. Bisher wurden diese "inhibitor resistant TEM-

38 Monday, June 3, 2002 Stellungnahme der ZKBS zur Biologischen Sicherheit von Antibiotika- Resistenzgenen im Genom gentechnisch veränderter Pflanzen ß-laktamases" (IRT) nur in E. coli und vereinzelt in Proteus mirabilis oder Klebsiella gefunden (Bermudes et al., 1997). Page: 3 In vielen Fällen ist der Gebrauch von Ampicillin heute nur dann angezeigt, wenn zuvor die Ampicillin-Sensitivität im Test nachgewiesen ist. Jedoch wird Ampicillin bei Infektionen, z.b. mit Enterokokken oder mit Listeria monocytogenes weiterhin als Mittel der Wahl betrachtet. II.2.3. Das nptiii -Gen Das nptiii (= aphaiii )-Gen stammt aus Enterococcus faecalis und kodiert für eine Amino-glycosid-3 -Phosphotransferase des Typs III, die nicht nur eine Resistenz gegen Kanamycin und Neomycin, sondern auch gegenüber dem Antibiotikum Amikacin und weiteren Substan-zen dieser bedeutsamen Klasse verleiht. II.2.4. Das cm R -Gen Das cm R -Gen stammt aus dem Transposon Tn9 und kodiert für eine Acetyltransferase, die eine Acetyl-CoA-abhängige Acetylierung des Antibiotikums Chloramphenicol katalysiert und damit dessen antibakterielle Wirkung aufhebt (Proctor und Rownd, 1982). II.2.5. Das teta -Gen Das teta -Gen stammt aus dem Transposon Tn10 und kodiert für ein Membranprotein, das die Ausschleusung von Tetracyclinen bewirkt (Bryan, 1984). Die Tetracycline sind chemisch sehr nahe untereinander verwandt und leiten sich vom Naphthacen-Gerüst ab. III. Übertragbarkeit der Antibiotika-Resistenzgene aus transgenem Pflanzenmaterial auf Mikroorganismen (Horizontaler Gentransfer) In die Sicherheitsbewertung von gentechnisch veränderten Pflanzen sind die übertragenen Antibiotika-Resistenzgene mit einzubeziehen. Hierbei ist auch eine mögliche Übertragung der Antibiotika-Resistenzgene auf andere Organismen (z. B. Mikroorganismen) zu beachten. Ein solcher Transfer könnte z.b. im Tierpansen, im Magen-Darmtrakt von Säugern, in Silagen, in Komposten, Kläranlagen oder im Boden stattfinden. Ein Ablauf von folgenden Schritten wäre dazu erforderlich: 1. Freisetzung des Antibiotikum-Resistenzgens in intakter Form aus der Pflanzenzelle, [Bei Freisetzung von DNA aus pflanzlichen Geweben wird diese durch pflanzeneigene Nukleasen effektiv degradiert. Auch im Pansen und Verdauungstrakt von Säugern ist ein hoher Spiegel an DNAsen vorhanden, ebenso im Boden und in anderen von Mikroorganismen besiedelten Habitaten.] 2. Aufnahme durch kompetente Bakterien, [Die Fähigkeit, natürlicherweise freie DNA aufzunehmen, wurde erst bei relativ wenigen Bakterien beobachtet (Lorenz und Wackernagel, 1994). Die Aufnahme und stabile Expression von DNA im natürlichen Habitat wurde bislang bei zwei Bodenbakterienarten nachgewiesen (Nielsen et al, 1997; Sikorski et al., 1998). Darüber hinaus ist die Entwicklung zur DNA-Aufnahmefähigkeit unter den physiologischen Bedingungen des jeweiligen Habitats selbst bei diesen ein sehr seltenes Ereignis.] 3. Etablierung eines transformierten DNA-Fragments in der Bakterienzelle

39 Monday, June 3, 2002 Stellungnahme der ZKBS zur Biologischen Sicherheit von Antibiotika- Resistenzgenen im Genom gentechnisch veränderter Pflanzen a. durch Integration ins Genom mittels legitimer oder illegitimer Rekombination b. in seltenen Fällen durch Ringschluß zu einem Plasmid, falls das transformierte DNA-Fragment die Genausstattung zur Plasmidreplikation trägt, [Die Bildung eines Plasmid-Replikons in einer Zelle, z.b. durch Verknüpfung der Enden des DNA-Fragmentes, könnte erfolgreich nur durch sehr seltene Ereignisse erfolgen, etwa ein illegitimes cross-over.] 4. erfolgreiche Expression des übertragenen Antibiotikum-Resistenzgens. [Die für eine Genexpression erforderlichen Regulationsabschnitte müssen in geeigneter Anordnung vorliegen und in der neuen Wirtszelle erkannt werden.] Page: 4 Das gemeinsame Eintreffen all dieser, jeweils einzeln als sehr selten eingeschätzter Ereignisse macht einen Gentransfer der Antibiotika-Resistenzgene von Pflanzen auf Bakterien sehr unwahrscheinlich (rev. Dröge et al., 1998; Nielsen et al., 1998). Nach Berechnungen von Schlüter und Potrykus (1996) liegt z. B. die Wahrscheinlichkeit der Transformation von Bodenbakterien mit dem kan r -Gen aus Ernterückständen transgener Pflanzen bei bakteriellen Rezipienten, die wie Bacillus subtilis ein effizientes Transformationssystem, aber keine Homologie zur aufgenommenen DNA besitzen, bei 2 x bis 2,7 x 10-17, und bei bakteriellen Rezipienten, die wie Agrobacterium tumefaciens kein effizientes Transformationssystem, aber Homologie zur aufgenommenen DNA besitzen, bei 2 x bis 1,3 x IV. Bewertung der Biologischen Sicherheit der Antibiotika-Resistenzgene im Genom transgener Pflanzen Von grundsätzlicher Bedeutung für die Bewertung der Biologischen Sicherheit der Antibiotika-Resistenzgene im Genom transgener Pflanzen ist es, die Wahrscheinlichkeit der Transformation von Bodenund Enterobakterien durch die aus dem Genom transgener Pflanzen freigesetzten Antibiotika-Resistenzgene in Relation zu sehen zu der Wahrscheinlichkeit der Übertragung solcher Antibiotika-Resistenzgene durch Konjugation von Bakterium zu Bakterium. Da (a) die Wahrscheinlichkeit der Gen-Übertragung von transgenen Pflanzen auf Bakterien auf 2 x bis 1,3 x pro Bakterium geschätzt wird (siehe unter III), jedoch die der Gen-Übertragung durch Konjugation zwischen Boden- und Enterobakterien bei 10-1 bis 10-8 pro Spenderzelle liegt (Dröge et al, 1998), (b) Freisetzungsexperimente mit gentechnisch veränderten Pflanzen zeitlich und räumlich begrenzt sind und (c) gentechnisch veränderte Pflanzen aus Freisetzungsexperimenten nicht für Lebens- oder Futtermittelzwecke vorgesehen sind, stellt die ZKBS fest, daß aufgrund des Vorhandenseins der oben aufgeführten Antibiotika-Resistenzgene in gentechnisch veränderten Pflanzen, die für Freisetzungsexperimente vorgesehen sind, keine schädlichen Einwirkungen auf Leben und Gesundheit von Menschen, Tiere, Pflanzen sowie die sonstige Umwelt in ihrem Wirkungsgefüge und Sachgüter ( 1 GenTG) zu erwarten sind. Im Hinblick auf das Inverkehrbringen solcher Pflanzen wird ferner festgestellt, daß von den o.g. Antibiotika-Resistenzgenen (bzw. von deren Genprodukten) kein allergenes Potential ausgeht und daß es keine Hinweise für die Aufnahme funktionsfähiger DNA in Epithelzellen gibt (U. S. Food and Drug Administration, 1998).

40 Monday, June 3, 2002 Stellungnahme der ZKBS zur Biologischen Sicherheit von Antibiotika- Resistenzgenen im Genom gentechnisch veränderter Pflanzen Page: 5 IV.1. Gruppeneinteilung der Antibiotika-Resistenzgene nach ihrer Verbreitung und nach dem derzeitigen Stand der therapeutischen Bedeutung der relevanten Antibiotika Wenn überhaupt die Übertragung eines Antibiotika-Resistenzgenes aus dem Genom einer transgenen Pflanze in das eines Bakteriums eintreten sollte, müßte man dieses sehr seltene Ereignis vor dem Hintergrund der gegebenen Verbreitung des jeweiligen Antibiotikum-Resistenzgens in Boden- und Enterobakterien und in Bezug auf seine Bedeutung für den therapeutischen Einsatz der relevanten Antibiotika sehen. Aufgrund dieser beiden Bewertungskriterien werden für die o. g. Antibiotika-Resistenzgene drei Gruppen zugeordnet: Gruppe I Die Gruppe I enthält Antibiotika-Resistenzgene, die (a) in Boden- und Enterobakterien bereits weit verbreitet sind und (b) deren relevante Antibiotika keine oder nur geringe therapeutische Bedeutung in der Human- bzw. Veterinärmedizin besitzen, so daß davon ausgegangen werden kann, daß - wenn überhaupt -das Vorhandensein dieser Antibiotika-Resistenzgene im Genom transgener Pflanzen keine Auswirkung auf die Verbreitung dieser Antibiotika-Resistenzgene in der Umwelt zur Folge hat. Dabei handelt es sich um folgende Antibiotika-Resistenzgene: nptii -Gen: Zu den Substraten der APH(3')II-Enzyme zählen die Antibiotika Kanamycin, Neomycin, Geneticin, Butirosin, Gentamicin A und B sowie Paromomycin. Die in der Humanmedizin therapeutisch bedeutsamen Amikacin, Gentamicin (vorwiegend C 1, C 1α und C 2) und sonstige Aminoglycoside und Aminocyclitole gehören nicht zum Substrat-spektrum der APH(3')-II-Enzyme (Trieu-Cuot et al., 1987; Davies, 1991; Simon und Stille, 1989). hph -Gen: Hygromycin wird in der Humanmedizin nicht verwendet (WHO, 1993); eine Kreuzresistenz mit anderen in der Humanmedizin gebräuchlichen Antibiotika besteht nicht. cm R -Gen: Chloramphenicol wird aufgrund des Risikos, aplastische Anämie hervorzuru-fen, humantherapeutisch heute nur noch in sehr wenigen Fällen eingesetzt und ist in der EU für die Anwendung an Tieren zur Erzeugung von Nahrungsmitteln nicht zugelassen. Chloramphenicol-resistente Mikroorganismen sind in der Umwelt weit verbreitet. Gruppe II Die Gruppe II enthält Antibiotika-Resistenzgene, die (a) in Mikroorganismen verbreitet sind und (b) deren relevante Antibiotika nur noch in Teilbereichen der Human- bzw. Veterinärmedizin therapeutische Anwendung finden, so daß davon ausgegangen werden kann, daß wenn überhaupt - das Vorhandensein dieser Antibiotika-Resistenzgene im Genom transgener Pflanzen nur sehr geringe Auswirkung auf die Verbreitung dieser Antibiotika-Resistenzgene in der Umwelt zur Folge hat. Es handelt sich um folgende Antibiotika-Resistenzgene:

41 Monday, June 3, 2002 Stellungnahme der ZKBS zur Biologischen Sicherheit von Antibiotika- Resistenzgenen im Genom gentechnisch veränderter Pflanzen Page: 6 - amp r -Gen: Es ist anzunehmen, daß fast jeder Mensch, auch ohne ß-Laktam-Antibiotika exponiert zu sein, im Intestinaltrakt E. coli- Zellen beherbergt, die das amp r- Gen besitzen. Dies wird durch die Beobachtung gestützt, daß etwa 35 % aller klinischen E. coli- Isolate resistent gegen Ampicillin sind (Kresken et al., 1999) davon wieder 90% durch TEM-1 ß-Laktamasen bedingt (Livermore, 1995). Untersuchungen (BgVV, 1997) zeigten auch, daß Ampicillin-Resistenzen bei E. coli- Isolaten von Rindern und Schweinen in etwa 74 % aller Proben auftreten. aada-gen : Streptomycin und Spectinomycin werden nur begrenzt in der Humanmedizin eingesetzt (WHO, 1993), besitzen aber durchaus noch für die Behandlung der Tuberkulose (Streptomycin) oder der Gonorrhoe (Spectinomycin) nennenswerte humanmedizinische Bedeutung. Gruppe III Die Gruppe III enthält Antibiotika-Resistenzgene, deren relevante Antibiotika in der Humanmedizin von therapeutischer Bedeutung sind, und deshalb im Genom transgener Pflanzen einem hohen Maß an Vorsorge folgend vermieden werden sollten. Es handelt sich um folgende Antibiotika-Resistenzgene: - nptiii -Gen: Für den Einsatz in der Humantherapie ist Amikacin ein wichtiges Reserve- Antibiotikum, dessen therapeutische Bedeutung nicht einmal potentiell durch die Verwendung des nptiii -Gens bei der Etablierung von gentechnisch veränderten Pflanzen ge-schmälert werden sollte. - teta -Gen: Tetracycline sind durch ein breites Wirkungsspektrum ausgezeichnet und sind in der Humanmedizin therapeutisch weiterhin von Bedeutung; sie werden u.a. gegen Brucella, Chlamydia, Mycoplasma, Rickettsia und Vibrio eingesetzt. IV.2. Bewertung der Biologischen Sicherheit der Antibiotika-Resistenzgene im Genom transgener Pflanzen, die für Freisetzungsexperimente vorgesehen sind. Die ZKBS ist grundsätzlich der Auffassung, daß künftig bei gentechnisch veränderten Pflanzen, die für Freisetzungsexperimente vorgesehen sind, die eingeführten heterologen Gene beschränkt werden sollten auf diejenigen Gene, welche für die angestrebte Veränderung funk-tionell als Ziel- oder Markergene erforderlich sind. IV.3. Bewertung der Biologischen Sicherheit der Antibiotika-Resistenzgene im Genom transgener Pflanzen, die in Verkehr gebracht werden sollen. Die ZKBS ist grundsätzlich der Auffassung, daß künftig bei gentechnisch veränderten Pflanzen, die in Verkehr gebracht werden, die eingeführten heterologen Gene auf diejenigen Gene zu beschränken sind, welche für die angestrebte Veränderung funktionell als Ziel- oder Markergene erforderlich sind. Die zukünftige Entwicklung in den Verkehr zu bringender gentechnisch veränderter Pflanzen, die für die Herstellung von Lebens- oder

42 Monday, June 3, 2002 Stellungnahme der ZKBS zur Biologischen Sicherheit von Antibiotika- Resistenzgenen im Genom gentechnisch veränderter Pflanzen Futtermittel Verwendung finden sollen, muß darauf abzielen, Gene, die Resistenzen gegen therapeutisch bedeutende Antibiotikaklassen bewirken, zu vermeiden. Page: 7 Literatur: Bermudes H, Jude F, Arpin C, Quentin C, Morand A und Labia R (1997) Characterization of inhibitor-resistant TEM (IRT) ß-lactamases in a novel strain of Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 41:222. BgVV, Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin Resistenzsituation Deutsches Tierärzteblatt. 1/1997:84 Bryan LE (1984) Antimicrobial drug resistance. Academic Press, pp Bush K, Jacoby GA und Medeiros AA (1995) A functional classification scheme for ß-lactamases and its correlation with molecular structur. Antimicrob. Agents. Chemother. 39: Davies JE (1991) Aminoglycoside-aminocyclitol antibiotics and their modifying enzymes. In: Lorian V (Hrsg.) Antibiotics in laboratory medicine. Williams and Wilkins, Baltimore, 3. Aufl., pp Davis JE und Smith D (1978) Plasmid-determined resistance to antimicrobial agents. Annu Rev Microbiol 32: Dröge M, Pühler A und Selbitschka W (1998) Horizontal gene transfer as a biosafety issue: A natural phenomenon of public concern. J Biotechnol 64:75-90 Garfinkel DJ, Simpson RB, Ream LW, White FF, Gordon MP, Nester EW (1981) Genetic analysis of crown gall: fine structure map of the T-DNA by site-directed mutagenesis. Cell 27: Gritz L und Davies J (1983) Plasmid-encoded hygromycin B resistance: the sequence of hygromycin B phosphotransferase gene and its expression in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Gene 25: Hollingshead S und Vapnek D (1985) Nucleotide sequence analysis of a gene encoding a streptomycin/specti-nomycin adenyltransferase. Plasmid 13: Kresken M, Hafner D und von Rosenstiel N (1999) Zeitliche Entwicklung der Antibiotikaresistenz bei klinisch wichtigen Bakterienspezies in Mitteleuropa. Bundesgesundheitsblatt, Jahrgang 42, Heft 1, pp Livermore DM (1995) ß-Lactamases in laboratory and clinical resistance. Clinical Microbiology Reviews 8: Lorenz MG, Wackernagel W (1994) Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment. Microbiol Rev 58: Nap JP, Bijvoe J, Stiekema WJ (1992) Biosafety of kanamycin-resistant transgenic plants. Transgenic Res 1:

43 Robert Koch - Institut, Monday, June 3, 2002 Stellungnahme der ZKBS zur Biologischen Sicherheit von Antibiotika- Resistenzgenen im Genom gentechnisch veränderter Pflanzen Page: 8 Nielsen KM, Bones AM, Smalla K und van Elsas JD (1998) Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria a rare event? FEMS Microbiol Rev 22: Proctor GN und Rownd RH (1982) Rosanilins: indicator dyes for chloramphenicol-resistant enterobacteria containing chloramphenicol acetyltransferase. J Bacteriol 150: Sanders C und Sanders WE (1992) ß-Lactam resistance in gram-negative bacteria: Global trends and clinical impact. Clin Infect Dis 15: Schlüter K und Potrykus I (1996) Horizontaler Gentransfer von transgenen Pflanzen zu Mikroorganismen (Bakterien und Pilzen) und seine ökologische Relevanz. In: E Schulte und O Käppeli (eds) Gentechnisch veränderte krankheits- und schädlingsresistente Nutzpflanzen. Eine Option für die Landwirtschaft? Publikation des Schwerpunktprogrammes Biotechnologie des Schweizerischen Nationalfonds, Bern, pp Sikorski J, Graupner S, Lorenz MG, Wackernagel W (1998) Natural genetic transformation of Pseudomonas stutzeri in a non-sterile soil. Microbiology 144: Simon GW und Stille W (1989) Antibiotiktherapie in Klinik und Praxis. Schattauer, Stuttgart, New York, 8. Aufl. Tomalsky ME und Crosa JH (1987) Tn1331, a novel multiresistant transposon encoding resistance to amikacin and ampicillin in Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 31: Trieu-Cuot P, Arthur M und Courvalin P (1987) Origin, evolution and dissemination of antibiotic resistance genes. Microbial Sciences 4: U. S. Food and Drug Administration (1998) Guidance for industry: Use of antibiotic resistance marker genes in transgenic plants WHO (1993) Health aspects of marker genes in genetically modified plants. WHO/FNU/FOS/ 93.6, pp Für fachliche Rückfragen steht Ihnen das Zentrum Gentechnologie gerne zur Verfügung. Antworten auf häufig gestellte Fragen, eine Suchmaschine, die Themenübersicht, technische Hinweise sowie eine -Adresse bei technischen Problemen finden Sie hier. weitere Themengebiete zur Gentechnik: ZKBS Freisetzungen Internet-Forum FAQ s Links Haftungsausschluß Datenschutzerklärung Themenübersicht

44 Bijlage 7 Evaluation des risques relatifs à la consommation de produits alimentaires composés ou issus d'organismes génétiquement modifiés. AFSSA pp Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: helpsbb@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ Bijlagen

45 Question 2 : Quels sont les risques liés à la consommation humaine et animale d'ogm contenant des gènes de résistance aux antibiotiques? L'émergence de bactéries pathogènes résistantes à de nombreux antibiotiques depuis plus d'une décennie est un sujet de préoccupations en pathologie humaine et vétérinaire. Ceci explique que l'opinion publique et les scientifiques soient aujourd'hui, à juste titre, préoccupés par l'apparition et l'utilisation de plantes transgéniques porteuses de gènes de résistance aux antibiotiques comme marqueurs de sélection dans la préparation de ces nouvelles plantes. Les gènes de résistance aux antibiotiques introduits dans le génome d'une plante transgénique sont-ils susceptibles, dans différentes situations écologiques, de retourner vers des bactéries et conduire à une extension des résistances aux antibiotiques susceptibles d'avoir des effets préjudiciables sur la santé humaine? Cette question a déjà été examinée par un collège d'experts dans le cadre d'un séminaire conjoint des commissions du génie génétique et du génie biomoléculaire en janvier 1999 et conduit à la signature en janvier 2000 d'un avis conjoint de ces deux instances scientifiques [9,10]. Dans la mesure où la présence de gènes de résistance aux antibiotiques dans les bactéries de l environnement est un risque objectif mais que la probabilité de transfert de ces gènes à partir d'une plante vers les bactéries du sol est un risque potentiel, il convient de comparer et d évaluer ces deux risques en examinant les points suivants : A B C D E Quelles sont les conditions d utilisation de gènes de résistance dans les plantes génétiquement modifiées? Quelles sont les conditions du transfert d un gène d une plante à une bactérie? Bien que ce transfert n ait jamais été observé, est-il envisageable? Quelle est la contribution du réservoir naturel de gènes de résistance aux antibiotiques au développement et/ou à la dissémination de gènes de résistance aux antibiotiques? L'utilisation massive d'antibiotiques en médecine humaine et vétérinaire crée une pression de sélection en faveur de bactéries ayant acquis des gènes de résistance. Un élargissement possible du spectre de résistance au cours des transferts successifs de gènes doit-il être pris en considération? Quel risque supplémentaire apporterait la transgénèse végétale par rapport à la situation actuelle au regard du développement des résistances aux antibiotiques constaté? Dans la mesure où, à l heure actuelle, les seuls OGM sur le marché sont des plantes, les éléments d évaluation développés ci-dessous porteront sur le cas des plantes. Cependant, bien qu aucun microorganisme génétiquement modifié ne soit encore utilisé en alimentation humaine ou animale, nous évoquerons les risques liés à l utilisation de gènes de résistance à un antibiotique comme marqueurs de sélection dans le cas des microorganismes. A Quelles sont les conditions d utilisation de gènes de résistance dans les plantes génétiquement modifiées? Il convient de différencier l'utilisation des gènes de résistance à un antibiotique selon que ces gènes sont utilisés : i) comme marqueurs au moment de la construction des plasmides transformants, 23

46 l'ampicilline étant dans ce cas, et ii) pour la sélection des cellules végétales transformées, la kanamycine étant le plus utilisé. Les gènes de résistance à des antibiotiques sont ainsi utilisés comme marqueurs pour la sélection : - du vecteur de la séquence génique d intérêt ; dans ce cas, le gène de résistance à l'antibiotique (type ampicilline) est sous contrôle d un promoteur bactérien, - des éléments transformés de la plante destinés à générer les plantes transgéniques recherchées ; dans ce second cas, le gène de résistance à l'antibiotique (type kanamycine) est sous contrôle d un promoteur de type eucaryote végétal. L'évaluation des risques liés à l'utilisation de ce type de gènes marqueurs se situe maintenant dans un cadre réglementaire un peu différent puisque la nouvelle directive 2001/18/CE [3] prévoit dans ses dispositions (article 4-2) "..d'éliminer progressivement des OGM les marqueurs de résistance aux antibiotiques qui sont susceptibles d'avoir des effets préjudiciables sur la santé humaine et l'environnement." Le texte précise que cette élimination progressive aura lieu d'ici le 31 décembre 2004 dans le cas des OGM mis sur le marché conformément à la partie C (autorisation de mise sur le marché d'ogm) et d'ici le 31 décembre 2008 dans le cas des OGM autorisés en vertu de la partie B (dissémination volontaire à tout autre fin que la mise sur le marché). Concernant les marqueurs utilisés pour la sélection du vecteur de la séquence génique d intérêt, en dehors du maïs BT 176 (construction ancienne) qui contient un gène de résistance à l'ampicilline, il est à noter que les constructions récentes autorisées ont été débarrassées des gènes marqueurs utilisés pour la construction du plasmide transformant. En ce qui concerne les marqueurs de sélection des cellules végétales transformées, l utilisation en médecine humaine comme en médecine vétérinaire de la kanamycine est devenue très limitée. Il a été avancé que l utilisation de gène de résistance à la kanamycine pourrait provoquer l apparition d une résistance à l amikacine par des mutations ponctuelles du gène NPTII ou augmenter son niveau de résistance. Cependant, d une part l'amikacine 14 est un mauvais substrat pour l'enzyme d'inactivation NPTII (néomycine phospho-transférase), d autre part, ces mutations ont été obtenues chez Escherichia coli, exclusivement au laboratoire dans des conditions de sélection très contraignantes [11-16]. L'hygromycine, susceptible d'être utilisé dans de futurs constructions, n'est plus utilisée en thérapeutique humaine (communication du Dr P. Berche). B Quelles sont les conditions du transfert d un gène d une plante à une bactérie? Bien que ce transfert n ait jamais été observé, est-il envisageable? La mobilisation d'une séquence génique de résistance à un antibiotique à partir de plantes GM vers des bactéries du sol, du tractus intestinal des herbivores ou de l homme implique une cascade de processus de transferts horizontaux interspécifiques [17]. De plus il sera nécessaire que la séquence soit intégrée chez l hôte final dans des conditions où elle pourra s'exprimer. Ces étapes sont les suivantes : - libération de l'adn de la plante dans le milieu ; - persistance de fragments d'adn dans le milieu ; - transformation de bactéries compétentes (état physiologique à un moment donné de certaines bactéries qui leur permet d incorporer dans leur cytoplasme des fragments d acides nucléiques) par l'adn conservé (l'adsorption de l'adn sur les argiles [18,19] dans le sol peut favoriser la conservation des fragments d'adn mais rend ceux-ci moins disponibles pour la transformation) ; 14 Les enzymes de résistance inactivant l'amikacine sont essentiellement des acétylases et des adénylases ou nucléotidyl-transféranses et non des phosphotransférases (NPT). Les gènes codant pour ces enzymes d'inactivation sont différents et il semble peu probable qu'un gène tronqué de NPTII, tel que présent dans certaines constructions, conduise à une résistance à l'amikacine. 24

47 - intégration (ou maintien) dans le génome bactérien de cet ADN provenant de la plante transformée ; cette étape est limitante du fait de l'existence de systèmes de restriction efficaces (après passage dans la plante, un ADN d'origine bactérienne n'est plus reconnu comme un ADN bactérien), de la nécessité de séquences homologues pour qu'il y ait recombinaison, et généralement de l'absence d'origine de réplication ; - expression/sélection ; la pression de sélection qui peut exister dans le sol au niveau des microniches, peut jouer un rôle important. La réunion de ces conditions rend la réalisation d'un tel transfert très peu probable. Les calculs pour estimer les fréquences de transfert de séquences géniques d'origine procaryotique à partir de plantes GM vers des bactéries sont peu convaincants. Ces transferts sont théoriquement envisageables, mais aucune étude publiée à ce jour n'a démontré un tel transfert. De plus, aucune donnée ne conduit à supposer que des séquences géniques d'origine non végétale introduites dans le génome de la plante se comporteraient différemment des autres séquences géniques végétales quant à la pénétration et à l effet des enzymes de restriction. C Quelle est la contribution du réservoir naturel existant de gènes de résistance aux antibiotiques au développement (ou à la dissémination?) de gène de résistance aux antibiotiques? Les antibiotiques sont des substances, synthétisées par des organismes vivants, en particulier, certains champignons, qui ont la propriété de stopper la croissance des microorganismes. Afin de se protéger des effets délétères de ces substances, certains microorganismes ont ainsi développés des résistances à ces antibiotiques. Les bactéries du sol contiennent naturellement des gènes de résistance aux antibiotiques qu elles ont acquis sous la pression de sélection. Ces gènes sont le plus souvent portés par des éléments génétiques mobiles de la cellule bactérienne (transposons, plasmides). Ainsi, dès avant l'utilisation de la plupart des antibiotiques, l'existence de résistance aux antibiotiques avait été reconnue [20]. Une étude [21] montre que les tubes digestifs de l'homme et de l'animal contiennent déjà beaucoup de plasmides portant des gènes de résistance aux antibiotiques, même chez le nouveau né, deux jours après la naissance. D L'utilisation massive d'antibiotiques en médecine humaine et vétérinaire crée une pression de sélection en faveur de bactéries ayant acquis des gènes de résistance. Un élargissement possible du spectre de résistance au cours des transferts successifs de gènes doit-il être pris en considération? Les antibiotiques sont largement utilisés en thérapeutique humaine et vétérinaire. Ils sont également administrés sous contrôle vétérinaire en traitement prophylactique chez les animaux à des doses proches des doses thérapeutiques. Enfin, ils ont été très utilisés comme facteur de croissance en alimentation animale à des doses beaucoup plus faibles. Cette cause potentielle de résistance devrait diminuer à l'avenir puisque sur 8 antibiotiques qui avaient été autorisés au titre de la directive 70/524/CEE [22]comme facteur de croissance, seulement 4 sont encore autorisés dont 2 ionophores. L'ensemble de ces emplois contribue à accroître la sélection des résistances. Dans le domaine vétérinaire, l'évolution des résistances aux antibiotiques est relativement bien connue [23, 24] et régulièrement suivie au travers des plans de surveillance réalisés dans le cadre du contrôle des médicaments vétérinaires. 25

48 Dans le domaine humain, bien que la recherche des résistances aux antibiotiques chez l'homme adulte n'ait pas fait l'objet d'études très larges, un certain nombre d'études multicentriques ayant pour but d'évaluer la sensibilité aux antibiotiques de souches courantes prélevées chez des patients en médecine de ville [25] ou en services hospitaliers [26] ont été réalisées. Ces études montrent, dans la limite des types d'infections étudiés, de la nature des germes isolés et des antibiotiques utilisés, une évolution vers la résistance des souches d'e.coli à certaines β-lactamines, aussi bien en pratique de ville qu'hospitalière, en particulier dans les associations amoxicilline-acide clavulanique ; la résistance aux quinolones et aux aminosides serait plus marquée chez les souches d'origine hopitalière en raison d'une moindre utilisation des quinolones en pratique de ville. Par ailleurs, le suivi des résistances aux antibiotiques dans les hôpitaux est assuré par les comités de lutte contre les infections nosocomiales (CLIN). E Quel risque supplémentaire apporterait la transgénèse végétale par rapport à la situation actuelle au regard du développement des résistances aux antibiotiques constaté? A partir des éléments développés ci-dessus, il apparaît que : - le risque de transfert de séquences géniques d origine procaryotique à partir de plantes transgéniques vers des microorganismes du sol est un risque théorique mais qu'il n'a pas de réalité à ce jour. Il n'a été démontré ni en conditions naturelles ni en conditions expérimentales. ; - la probabilité de transfert d'un gène de résistance à un antibiotique de la plante vers les bactéries est très faible compte tenu de la réunion de l'ensemble des conditions qui permettrait qu'un tel transfert ait lieu ; - la prévalence naturelle des gènes de résistance à la kanamycine et à l'ampicilline est très élevée dans les bactéries telluriques, le tractus digestif de l'animal et de l'homme ; - l'utilisation d'antibiotiques comme facteur de croissance en nutrition animale et leur emploi en médecine humaine et vétérinaire sont reconnus comme une source majeure d'émergence et de diffusion des résistances aux antibiotiques, sans commune mesure avec le risque hypothétique lié à la présence d'un gène de résistance à un antibiotique dans une plante génétiquement modifiée. En l'état actuel des connaissances, la consommation par l'homme ou les animaux de produits alimentaires composés ou issus de plantes génétiquement modifiées contenant des gènes de résistance à la kanamycine et/ou à l'ampicilline ne présente en conséquence qu'un risque théorique et en tout état de cause négligeable pour la santé humaine et animale au regard de la présence de ces gènes de résistance aux antibiotiques dans les bactéries de l environnement. Si les constructions avec l'ampicilline comme marqueur de sélection du vecteur transformant sont désormais débarrassées de ce genre de marqueur, les méthodes substitutives qui permettraient de s'affranchir de marqueur de sélection végétale (type kanamycine) sont encore en développement et nécessitent d'être validées. Pour les constructions à venir, comme le prévoit la directive 2001/18/CE [3], il convient de recommander d'éviter, la présence, dans des plantes génétiquement modifiées destinées à la consommation humaine et animale, de gènes de résistance à un antibiotique susceptible d'avoir des effets préjudiciables sur la santé humaine et animale. Cas des microorganismes génétiquement modifiés Il convient de ne pas mettre sur le même plan le risque de transfert de gène de résistance à un antibiotique à partir des plantes qui est très peu probable et celui à partir des microorganismes qui pourrait présenter un risque beaucoup plus élevé, les barrières génétiques (telles que promoteurs eucaryote/procaryote, présence de système de restriction) n existant plus ou n étant plus aussi efficaces. 26

49 Bien qu'aucun microorganisme génétiquement modifié destiné à la consommation humaine et animale n'ait encore reçu d'autorisation de mise sur le marché dans l'union européenne, il convient d'être beaucoup plus restrictif, sur l'utilisation de gènes de résistance à un antibiotique comme marqueur de sélection, chez des microorganismes 15 destinés à la consommation humaine ou animale ; le risque de transfert de ces gènes à des bactéries de la flore intestinale serait alors non négligeable. 15 Certains microorganismes utilisés en production alimentaire possèdent des résistances intrinsèques à des antibiotiques. Il n'y a pas de raison d'exclure de tels microorganismes comme organisme receveur pour autant qu'il aura été vérifié que ces gènes de résistance ne sont pas portés par des éléments génétiques mobiles (plasmides, transposons et intégrons) du microorganisme. 27

50 CONCLUSIONS QUESTION 1 Quels sont les points sensibles de l'évaluation des risques sanitaires liés à la consommation humaine et animale d'ogm ou de produits qui en sont issus et quels sont les éléments pertinents de cette évaluation? Informations relatives à la modification génétique et à la plante génétiquement modifiée La réflexion scientifique conduite au sein de l'agence française de sécurité sanitaire des aliments a été centrée sur les points sensibles de l'évaluation de l'innocuité des OGM ou des produits qui en sont issus, destinés à la consommation humaine et animale, au regard des dispositions réglementaires prévues par la directive 90/220/CEE (ou 2001/18/CE qui remplacera la directive 90/220/CEE en octobre 2002) et le règlement (CE) n 258/97 (Recommandations de la Commission du 29 juillet 1997) et des projets de révision des lignes directrices européennes ou internationales (Codex alimentarius). Les informations relatives à la modification génétique, d une part, et les informations toxicologiques, d autre part, sont essentielles pour établir l innocuité a priori d un nouvel aliment. Pour quelques uns de ces points sensibles, l'afssa a identifié un certain nombre de données actuellement manquantes ou insuffisamment documentées qui peuvent aider à affiner l'évaluation de la sécurité alimentaire des OGM ou des produits qui en sont issus avant leur mise sur le marché. Les données habituellement fournies dans les dossiers décrivant les séquences d'adn insérées ou supprimées devraient être complétées par la séquence 1616 du transgène et des régions faisant la jonction avec le génome. Ces données supplémentaires auront pour but : - de vérifier si le fragment inséré est bien identique à celui qui avait été introduit dans le vecteur transformant ; - d'examiner l'environnement du gène inséré ; - de localiser l'insert dans le génome de la plante. Provenance des plantes génétiquement modifiées Evaluation de la toxicité subchronique du produit de gène sur animal de laboratoire Compte tenu de l influence des facteurs environnementaux sur la croissance végétale, cette évaluation doit porter sur des plantes cultivées pendant au moins deux saisons dans des sites différents et représentatifs de divers environnements. A quelques exceptions près, les seuls éléments disponibles relatifs à la toxicité ont été obtenus par des administrations uniques (toxicité aiguë) à des animaux de laboratoire, réalisées avec la protéine purifiée. Le fait que l'exposition animale ou humaine aux OGM soit chronique, impose que l'on procède à des expositions, elles aussi, de type chronique. Elles permettent en effet de révéler, avec une meilleure probabilité, des effets potentiels sur les systèmes vitaux, notamment immunitaires, hormonaux et reproducteurs et de possibles effets liés à des phénomènes d'accumulation. 16 Afin de faciliter la comparaison des séquences fournies avec des bases de données, il serait souhaitable de mettre à la disposition de l'évaluateur ces séquences sur support informatique. 28

51 Un essai de toxicité subchronique 90 jours du produit de gène sur animal de laboratoire (rat, souris, cobaye) vise à mettre en évidence de potentiels effets délétères sur le développement d'organes ou systèmes vitaux lors d'une exposition à long terme. Evaluation sur animal de la tolérance au produit fini L'objectif de ces études, réalisées avec le produit OGM ou issu d'ogm (parties de la plante ou produits dérivés destinés à la consommation), est de mettre en évidence des effets potentiels d une consommation régulière d un produit par l homme ou l animal, et des effets toxiques inattendus ou non intentionnels qui ne se seraient pas révélés dans les études de toxicité aiguë ou subchronique. Deux types d'études permettraient de mettre en évidence de tels effets : - des études de la toxicité/tolérance sur animal de laboratoire des parties de la plante destinées à la consommation ou de leurs produits dérivés ; - des études de tolérance, d'alimentarité et de digestibilité sur animal cible des parties de la plante destinées à la consommation ou de leurs produits dérivés. Les résultats de tels essais pourraient ne pas être statistiquement significatifs en raison d'un effectif trop limité d'animaux testés. Il convient donc de prendre considération la notion de puissance statistique d'un essai (voir annexe 1). Les effectifs d'animaux, leur stade physiologique (stade de la lactation, âge/poids en début d'essai, ), les paramètres choisis pour le suivi et la durée de l'essai devront être définies de manière à pouvoir mettre en évidence une différence éventuelle d un écart-type entre les traitements avec une puissance statistique d'au moins 80 %. Les limites des essais Limites liées à la mise en œuvre de nouvelles techniques Limites liées à la faisabilité de certains essais Aussi approfondie que soit l'évaluation a priori qui vise, notamment, à mettre en évidence des effets potentiels inattendus et à prévoir d'éventuels effets à long terme, elle présente des limites de trois niveaux différents : limites liées à la mise en œuvre de nouvelles techniques encore au stade de la recherche, limites liées à la faisabilité de certains essais, limites de l'évaluation des effets à long terme chez l'animal et des effets chez l'homme. Certains aspects de l'évaluation des risques pourront être approfondis dans le futur en utilisant les nouvelles techniques ou méthodes analytiques et statistiques qui se développent actuellement. Elles pourraient permettre d'avoir une vision globale des modifications induites par la modification génétique introduite sur la synthèse des ARNm, des protéines (notamment la création de protéines de fusion ou l'expression d'autres gènes) et des métabolites (notamment de détecter un effet inattendu sur d'autres ou entre différentes voies métaboliques (amplification, suppression). Les essais de tolérance, d'alimentarité et de digestibilité sur animaux cibles comportent des contraintes ou des difficultés pratiques liées à : - la nécessité d'un effectif suffisamment important d'animaux pour avoir une probabilité de mettre en évidence une différence statistiquement significative ; - la préparation de matériel à tester en quantité suffisante pour exposer les animaux pendant de longues périodes dans la mesure où les produits, soumis à des essais dans le cadre de l évaluation avant la mise sur le marché, ne sont autorisés que dans le cadre d'une dissémination expérimentale, ne faisant donc appel qu'à des parcelles de taille limitée. 29

52 Limites de l'évaluation des effets à long terme L'évaluation des effets toxiques à long terme sur animal de laboratoire présentent de nombreuses difficultés de réalisation : - on ne connaît pas, a priori, l'élément potentiellement toxique et ses conséquences éventuelles ; - ce type d'essai nécessite, pour espérer observer un effet, l'administration des doses élevées, tout en respectant l'équilibre nutritionnel de l'animal, alors que l'élément potentiellement toxique est généralement synthétisé en quantité très faible, et d'utiliser un effectif important d'animaux. L'évaluation des effets chez l'homme par des protocoles d'études de type essais cliniques apparaît moins bien adaptée à l'évaluation des risques que le renforcement des études sur animaux tel qu'évoqué dans cet avis. Leur mise en œuvre nécessiteraient, en effet, de pouvoir surmonter de nombreuses limites théoriques, éthiques et pratiques. Cependant, dans le cas d un OGM destiné à l alimentation qui revendiquerait un bénéfice pour la santé, la réalisation de tels essais se justifierait pleinement pour démontrer l allégation avancée 17 (dimension non développée dans cet avis relatif à l'évaluation des risques. Cette réflexion pourrait d ailleurs être élargie, au delà des OGM, aux nutriments tels que les vitamines ou les minéraux parfois consommés en quantités importantes sous forme concentrée. La conception et la mise en place d'un plan de surveillance pour le suivi des OGM après leur mise sur le marché (cf directive 2001/18/CE et projet de règlement relatif aux denrées alimentaires issues d'ogm) devrait permettre la mise en évidence d'éventuels effets néfastes qui pourraient se révéler chez des sujets ou des populations particulièrement sensibles. QUESTION 2 Quels sont les risques liés à la consommation humaine et animale d'ogm contenant des gènes de résistance aux antibiotiques? Antibiotiques utilisés comme marqueurs pour la sélection En d'autres termes, les gènes de résistance aux antibiotiques introduits dans le génome d'une plante transgénique sont-ils susceptibles, dans différentes situations écologiques, de retourner vers des bactéries et conduire à une extension des résistances aux antibiotiques susceptibles d'avoir des effets préjudiciables sur la santé humaine? Dans la construction des OGM, les gènes de résistance à des antibiotiques sont utilisés comme marqueurs pour la sélection : - du vecteur de la séquence génique d intérêt ; dans ce cas, le gène de résistance à l'antibiotique (type ampicilline) est sous contrôle d un promoteur bactérien, - des éléments transformés de la plante destinés à générer les plantes transgéniques recherchées ; dans ce second cas, le gène de résistance à l'antibiotique (type kanamycine) est sous contrôle d un promoteur de type eucaryote végétal. 17 cf actes du colloque Afssa 17/ "OGM et alimentation : peut-on évaluer des bénéfices pour la santé?" 30

53 Afin de répondre à cette question 18, les experts de l'afssa ont examiné les points suivants Quelles sont les conditions d utilisation de gènes de résistance dans les plantes génétiquement modifiées? Quelles sont les conditions du transfert d un gène d une plante à une bactérie? Bien que ce transfert n ait jamais été observé, est-il envisageable? Quelle est la contribution du réservoir naturel de gènes de résistance aux antibiotiques au développement et/ou à la dissémination de gènes de résistance aux antibiotiques? L'utilisation massive d'antibiotiques en médecine humaine et vétérinaire crée une pression de sélection en faveur de bactéries ayant acquis des gènes de résistance. Un élargissement possible du spectre de résistance au cours des transferts successifs de gènes doit-il être pris en considération? Quel risque supplémentaire apporterait la transgénèse végétale par rapport à la situation actuelle au regard du développement des résistances aux antibiotiques constaté? Les experts ont considéré que le risque de transfert de séquences géniques d origine procaryotique à partir de plantes transgéniques vers des microorganismes du sol est un risque théorique mais qu'il n'a pas de réalité à ce jour. Il n'a été démontré ni en conditions naturelles ni en conditions expérimentales ; la probabilité de transfert d'un gène de résistance à un antibiotique de la plante vers les bactéries est très faible compte tenu de la réunion de l'ensemble des conditions qui permettrait qu'un tel transfert ait lieu ; la prévalence naturelle des gènes de résistance à la kanamycine et à l'ampicilline est très élevée dans les bactéries telluriques, le tractus digestif de l'animal et de l'homme ; l'utilisation d'antibiotiques comme facteur de croissance en nutrition animale et leur emploi en médecine humaine et vétérinaire sont reconnus comme une source majeure d'émergence et de diffusion des résistances aux antibiotiques. En l'état actuel des connaissances, la consommation par l'homme ou les animaux de produits alimentaires composés ou issus de plantes génétiquement modifiées contenant des gènes de résistance à la kanamycine et/ou à l'ampicilline ne présente en conséquence qu'un risque théorique et en tout état de cause négligeable pour la santé humaine et animale au regard de la présence de ces gènes de résistance aux antibiotiques dans les bactéries de l environnement. Si les constructions avec l'ampicilline comme marqueur de sélection du vecteur transformant sont désormais débarrassées de ce genre de marqueur, les méthodes substitutives qui permettraient de s'affranchir de marqueur de sélection végétale (type kanamycine) sont encore en développement et nécessitent d'être validées. Pour les constructions à venir, comme le prévoit la directive 2001/18/CE, il convient de recommander d'éviter, la présence, dans des plantes génétiquement modifiées destinées à la consommation humaine et animale, de gènes de résistance à un antibiotique susceptible d'avoir des effets préjudiciables sur la santé humaine et animale. 18 Cette question a déjà été examinée par un collège d'experts dans le cadre d'un séminaire conjoint des commissions du génie génétique et du génie biomoléculaire en janvier 1999 et conduit à la signature en janvier 2000 d'un avis conjoint de ces deux instances scientifiques. 31

54 Cas des microorganismes génétiquement modifiés Bien qu aucun microorganisme génétiquement modifié destiné à la consommation humaine ou animale n'ait encore reçu d'autorisation de mise sur le marché dans l'union européenne, l utilisation de gènes de résistance à un antibiotique comme marqueurs de sélection pourrait présenter un risque non négligeable de transfert de ces gènes à des bactéries de la flore intestinale, les barrières génétiques (telles que promoteurs eucaryote/procaryote, présence de système de restriction) n existant plus ou n étant plus aussi efficaces. Il convient donc d'être beaucoup plus restrictif sur l'utilisation de gènes de résistance à un antibiotique comme marqueur de sélection, chez des microorganismes 19 destinés à la consommation humaine ou animale. 19 Certains microorganismes utilisés en production alimentaire possèdent des résistances intrinsèques à des antibiotiques. Il n'y a pas de raison d'exclure de tels microorganismes comme organisme receveur pour autant qu'il aura été vérifié que ces gènes de résistance ne sont pas portés par des éléments génétiques mobiles (plasmides, transposons et intégrons) du microorganisme. 32

55 Bijlage 8 Safety aspects of genetically modified foods from plant origin. June Report of a Joint FAO/WHO expert consultation on foods derived from biotechnology. pp Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: helpsbb@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ Bijlagen

56 6. Specific Food Safety Issues 6.1 Introduction This section deals with specific issues that are frequently raised with regard to the safety of genetically modified foods. These issues include the potential for gene transfer from genetically modified plants to gut microflora and mammalian cells, the safety of antibiotic resistance genes as markers for the selection of genetically modified plants, and the assessment of the potential allergenicity of genetically modified foods that may be caused by the presence in these foods of novel gene products. The discussion which follows provides an evaluation of existing knowledge about these topics and elaborates scientific approaches that may be used to assess possible health risks. 6.2 Gene Transfer from Genetically Modified Plants: Mechanisms and Consequences for Food Safety As background to the discussion that follows, it should be noted that all foods contain DNA, which is ingested in significant quantities. In humans, dietary intakes of RNA and DNA vary widely but are typically in the range from 0.1 to 1.0 g per day (Doerfler and Schubbert, 1997). Any concerns over the presence of novel DNA in a genetically modified food consumed in the human diet must take into consideration that this DNA would represent less than 1/250,000 of the total amount of DNA consumed. In view of this and the digestibility of dietary DNA, the probability of transfer of genes from genetically modified plants to mammalian cells is extremely low. It is nevertheless necessary to examine this possibility and the consequences of such transfer if it were to occur. The transfer of plant DNA into microbial or mammalian cells under normal circumstances of dietary exposure would require all of the following events to occur: the relevant gene(s) in the plant DNA would have to be released, probably as linear fragments; the gene(s) would have to survive nucleases in the plant and in the gastrointestinal tract; the gene(s) would have to compete for uptake with dietary DNA; the recipient bacteria or mammalian cells would have to be competent for transformation and the gene(s) would have to survive their restriction enzymes; and the gene(s) would have to be inserted into the host DNA by rare repair or recombination events. There have been numerous experiments aimed at evaluating the possibility of transfer of plant DNA to microbes and mammalian cells. To date, there are no reports that marker genes in plant DNA transfer to these cells. Results of model experiments in which mice were orally administered high doses of bacterially derived DNA indicated apparent incorporation of the test DNA fragments into bacterial and mouse cells (Schubbert et al., 1998). The report contrasts with other reports where no transfer or only a low frequency of transfer was observed. The significance of the observations of Schubbert et al. have been seriously questioned (Beever and Kemp, 2000). It was concluded that the data do not demonstrate that plant DNA can be 11

57 transferred to and stably maintained in mammalian cells. There is additionally no evidence that intact genes from plants can be transferred to and be expressed in mammalian cells. It should be noted that the vast majority of known bacteria are not naturally transformable and there is as yet no evidence of transfer to and expression of plant genes in bacteria under natural conditions. Transfer has been observed under laboratory conditions, but only if homologous recombination is possible (Nielsen et al., 1998). It should be noted that inserted gene sequences in genetically modified plants show in many cases homology with prokaryotic genes. The Consultation is aware of the study being undertaken whereby chickens and sheep are being fed genetically modified maize, and bacteria in the normal flora of the gastrointestinal tract are being tested for DNA uptake. Should horizontal gene transfer from a genetically modified plant to bacteria occur, the gene (e.g. an antibiotic resistance gene) may alter the fitness of the recipient cell. A reduction in fitness may not provide sufficient selective pressure to eliminate the gene or gene fragment from the gene pool. The presence of this DNA in the cell population could then serve as a genetic reserve for the evolution of the recipient species. The available knowledge on bacteria is derived from bacteria that can be cultured and readily analyzed. Bacteria that are susceptible neither to culture nor identification represent a significant proportion of existing microflora. Therefore, without available knowledge of these bacteria, it is not possible to assess the possibility, probability or consequences of their acquisition of genes or gene fragments. The consequences of uptake of plant DNA by mammalian cells are different from those of uptake by bacteria because existing data indicate that such DNA is not transmitted via the germline. The extent to which cells containing exogenous DNA are phagocytosed is not yet clear. Neither is it clear that the incorporated DNA is stably maintained and replicated in somatic cells. Mammalian cells would be similarly affected by uptake of exogenously derived DNA regardless of its source. The most important consideration with respect to horizontal gene transfer is the consequence of a gene being transferred from a genetically modified plant and expressed in recipient cells. Therefore data on the possible extent of such transfer will be needed as part of the safety assessment when the nature of the transferred gene(s) is such that, if transfer were to occur, it would give rise to health concerns. The Consultation noted that the antibiotic resistance markers currently used in genetically modified plants have been previously reviewed for safety (WHO, 1993). There is no evidence that the markers currently in use pose a health risk to humans or domestic animals. Nevertheless, with the variable gene transfer frequencies noted in current literature, the transfer and expression of a functional antibiotic resistance gene to recipient cells, while remote, cannot be ignored. If the recipient cell is subjected to selection from therapeutic use of the antibiotic, proliferation of a drug resistant cell population could compromise the effectiveness of the drug. This directs attention to the more important considerations: whether there are already prevailing high levels of culturable bacteria resistant to that antibiotic, whether that antibiotic is, or could be, clinically important, and whether there are alternative effective therapies. For certain antibiotic resistance genes currently in use in genetically modified plants, the available data suggest that the consequences of horizontal gene transfer will be unlikely to pose a significant threat to the current therapeutic use of the respective drugs. With other genes that confer resistance to drugs that are important in specific medical use, or to drugs that have limited alternative therapies, the possibility of transfer and expression of these genes is a risk that 12

58 warrants their avoidance in the genomes of widely disseminated genetically modified organisms and foods and food ingredients. A number of methods are available to genetically modify plants without incorporation of an antibiotic resistance gene in the commercial product. These methods include removing the gene after successful gene transfer, or using alternative marker genes for genetic transformation. If alternative marker genes are used, they also would need to be evaluated for safety. In addition, it is recognized that further technical development of these or additional methods may be necessary for practical transformation of certain plant species. In future developments, the Consultation encourages the use of alternative transformation technologies, if available and demonstrated to be safe, that do not result in antibiotic resistance genes in genetically modified foods. If further development of alternative technologies is required, additional research should be strongly encouraged. 6.3 Allergenicity Introduction Food allergies are adverse reactions to an otherwise harmless food or food component that involves an abnormal response of the body s immune system to specific protein(s) in foods. True food allergies may involve several types of immunological responses (Sampson and Burks, 1996). The most common type of food allergies are mediated by allergen-specific immunoglobulin E (IgE) antibodies 3. IgE-mediated reactions are known as immediate hypersensitivity reactions because symptoms occur within minutes to a few hours after ingestion of the offending food. IgE-mediated reactions can occur to pollens, mould spores, animal danders, insect venoms and other environmental stimuli as well as foods. IgE-mediated reactions affect perhaps 10-25% of the population in developed countries (Mekori, 1996), although food allergies represent a small fraction of all allergic diseases. IgE-mediated food allergies affect less than 2.5% of the population in developed countries (Anderson, 1996). Infants and young children are more commonly affected by IgE-mediated food allergies than adults; the prevalence among infants under the age of 3 may be as high as 5-8% (Bock, 1987; Sampson, 1990). True food allergies also include cell-mediated reactions which involve sensitized tissue-bound lymphocytes rather than antibodies (Sampson, 1990). In cell-mediated reactions, the onset of symptoms occurs more than 8 hours after ingestion of the offending food. The role of foods in cell-mediated reactions remains uncertain (Burks and Sampson, 1993) but, celiac disease, also known as glutensensitive enteropathy, affects 1 in every 300 to 3000 individuals in the population depending upon the specific geographic region. The Codex Alimentarius Commission has adopted a list of the most common allergenic foods associated with IgE-mediated reactions on a world-wide basis that includes peanuts, soybeans, milk, eggs, fish, crustacea, wheat, and tree nuts. These commonly allergenic foods account for over 90% of all moderate to severe allergic reactions to foods, although an extensive literature search has revealed more that 160 foods associated with sporadic allergic reactions (Hefle, 1996). Allergic reactions to fresh fruits and vegetables, the so-called oral allergy syndrome, are also rather common (Parker, 1990), but these foods are not included on the Codex Alimentarius Commission list because the symptoms are typically mild and confined to the 3 IgE, or immunoglobulin E, is a protein antibody that recognizes an allergen. It circulates in the blood, and becomes fixed on the surface of specific cells (basophils and mast cells). When IgE on the cell surface binds to allergen, this triggers the release of chemical mediators that provoke the symptoms associated with allergic reactions. 13

59 Bijlage 9 OECD. Task force for the safety of novel foods and feeds C(2000)86ADD1. Pp Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: helpsbb@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ Bijlagen

60 C(2000)86/ADD1 levels known to have toxic or pharmacological effects. During the long history of plants used as food, varieties have been developed that are treated and accepted as safe because they do not have obvious acute toxicity. Plant breeders may monitor substances in new varieties (e.g. solanine in potato, erucic acid and glucosinolates in canola) to ensure that concentrations in new varieties have not increased beyond acceptable levels. In other cases, processing procedures or consumption limits are needed to ensure that substances known to have toxic effects (e.g. cassava, legumes, bitter almond) are present at concentrations safe for consumption. 64. All plant breeding methods, traditional and modern, have the potential to lead to unexpected or unintended changes in concentrations of various substances in the plants. It is important that all new varieties be evaluated, in order to reduce the likelihood that unexpected changes will produce adverse health effects. In most cases of plant modification, DNA insertion takes place at random, unpredictable loci. Such random insertion may lead to unintentional changes in gene expression: first, the foreign DNA might be inserted into the coding region of a gene of the host organism, leading to a truncated or hybrid gene product whose function is altered, impaired or lost; second, it might be inserted into the regulatory region of a gene and therefore alter the gene s expression pattern; third, the foreign DNA might affect the gene of a regulatory protein thereby affecting other genes. Another issue is that plant metabolism, might be altered as an adaptation to expression of the foreign gene. None of these effects are unique to GM plants Each could also be caused by naturally jumping genes and natural or induced mutations, e.g. chromosomal rearrangements. All these events may lead to more or less pronounced changes in plant metabolism. Alterations in concentrations of known plant metabolites in the new variety can be monitored using existing analytical methods. 65. The concept of substantial equivalence has been used as a tool in risk assessment. This concept involves comparing the GM organism-derived plant and its conventional counterpart with respect to their phenotypic and agronomic characteristics and their food composition, taking into particular account key nutrients, antinutrients and toxicants typical of the particular plant. Agronomic and phenotypic characteristics provide an objective assessment of the plant s health, often indicating unacceptable alterations. Analyses of key substances provide increased assurance that substances important from a nutritional or health perspective are present in acceptable concentrations. B.5. Gene transfer: potential impacts on human health (e.g. antibiotic resistance markers) 66. Horizontal gene transfer is the non-sexual or parasexual transfer of genetic material between organisms belonging to the same or different species. Though actual evidence of its occurrence or feasibility (except among bacteria and fungi) is rare, the issue is taken seriously in the safety assessment of GMOs. This issue concerns the potential transfer of genetic material from micro-organisms and plants to other organisms. There is no scientifically valid reason to treat possible gene transfer events involving genetically modified organisms differently from those involving naturally occurring organisms (Salyers, 1997). In any case, it is the gene and the trait it confers, and whether or not it brings a reproduction or selection advantage to the recipient organism that are crucial concerns when possible impacts of potential gene transfer are being considered. 67. Since selection in favour or against a gene is important in its maintenance or proliferation, genes that confer a selective advantage deserve particular attention. However, depending on the trait, selective advantage as such does not automatically imply any harmful effects. Foreign DNA is normally linked to marker genes, in order to be able to identify cells into whose genome the DNA construct has been inserted. Two categories of selection markers commonly used are genes conferring resistance to various herbicides and certain antibiotic resistance genes of bacterial origin. The marker gene commonly used in biotechnology, kanamycin resistance, does not confer resistance to antibiotics that are in (oral) therapeutic 17

61 C(2000)86/ADD1 use. Furthermore, bacterial strains resistant to the antibiotics in question (e.g. kanamycin or ampicillin) are common in the environment and in the human intestines, and large numbers of naturally resistant bacteria are acquired when ingesting fresh food (Salyers, 1997a; Smalla et al, 1997; Sci Am, March 1998). 68. In the case of antibiotic resistance genes, there is good reason to think that genetically modified strains pose much less of a threat than naturally occurring resistant bacterial strains, because the former represent old, narrow-spectrum and less mobilizable resistance genes not involved in the present problems in hospitals (Salyers, 1997b). Marker genes conferring resistance to antibiotics for therapeutic use should be avoided in viable GM micro-organisms in food. If the GM micro-organism includes marker genes, information should be provided to show that these genes do not provide a selective advantage in the gut or influence the existing microflora under either typical and extreme conditions (e.g. consumers taking medication). If the marker does provide a selective advantage in the gut, the consequences for the consumer must be defined. Genetic exchange between living bacteria by conjugation is known to occur very broadly, even across genus or family limits. Certain bacteria can also take up bare DNA from their surrounding fluid and even sometimes integrate it in their genome - a phenomenon called natural transformation. However, that occurs relatively rarely and only with DNA from the same or closely related bacterium species (Salyers, 1997a). 69. In vivo gene transfer of DNA from GM plants to bacteria, while hypothetically possible, is a remote possibility. This is because a number of unlikely events must occur sequentially. These events include the availability of the right kind of DNA, the type of bacteria, the ability of these bacteria to take up DNA and be transformed by that DNA and the competitiveness of the transformed bacteria. At present there is no evidence that these events occur in the bacteria normally found in human or animal digestive tracts, and the probability of transfer of antibiotic resistance traits does not present a concern. However, in evaluation, the following should be taken into account: a) Fate of the antibiotic resistance gene DNA DNA, including the genetic material encoding for the antibiotic resistance trait, is not normally exposed to the environment outside of the plant s tissue. However, once the plant cell wall and membranes have been disrupted, DNA released from the plant tissue is primarily degraded by the plant s own nucleases. In addition, DNAses and enzymes found in the digestive environment of the gastrointestinal (GI) tract degrade any remaining intact DNA into small pieces. These pieces encode little of the original information for antibiotic resistance. b) Uptake by bacteria Under idealised laboratory conditions, DNA from GM plants has been shown to transform bacteria commonly found in soil at low frequencies (de Vries, 1998). However, as noted a) above, the genetic material encoding antibiotic selection markers are normally contained in the plant cells and are not exposed to the outside environment. In fact, soil has been shown to inhibit transformation efficiencies, and the occurrence of gene transfer from plants to soil micro-organisms is considered to be so low as to be irrelevant (Nielsen, 1997; Schluter, 1995). It is known that opportunistic pathogenic micro-organisms of soil origin with various resistances to antibiotics can emerge, even in the absence of exposure to plant tissue. However, the medical implications, both human and animal, of gene transfer of antibiotic resistance genes in soil has not been documented. In vivo gene transfer to populations of bacteria normally found in the gut is also extremely low. Neither the small pieces of DNA produced by gastrointestinal digestion of plant tissue, nor any small amounts of larger-sized DNA that may have escaped digestion, have been shown to become incorporated into, or transform, the normal flora found in the gut (Syvanen, 1999). 18

62 C(2000)86/ADD1 c) Establishment of stable foreign DNA fragments in a bacterial cell Stable integration of foreign DNA into the host genetic material occurs by means of recombination. The frequency of these events occurring in either soil or gastrointestinal environments (paragraph b) is exceptionally low. The stable establishment of foreign DNA fragments within a bacterial population is dependent upon a number of events, including the relative competitiveness of any transformed bacteria with naturally occurring bacteria. It is unlikely that any transferred trait would be stably maintained, or expressed, without selective pressure (e.g. the presence of antibiotic). d) Successful expression of the transferred antibiotic resistance gene For this to occur, the regulatory segments required for gene expression must be present in an appropriate arrangement and be recognised in the new host cell. 70. The sequential occurrence of these individually rare events needed to establish in vivo gene transfer is highly improbable (Droege et al., 1998). Nevertheless, in principle, introduced genes should be restricted to those genes required to confer the desired trait, while avoiding use of marker genes that may confer resistance to therapeutically relevant antibiotics (German Central Advisory Committee for Biological Safety, 1999). 19

63 Bijlage 10 OECD. Report of the working group on harmonisation of regulatory oversight in biotechnology. C(2000)86/ADD2. pp Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: helpsbb@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ Bijlagen

64 C(2000)86/ADD2 D.2. Weediness 104. Weeds are plants that grow where humans do not want them to grow. This includes volunteer plants, crop plants remaining from the previous year's growing season, either through over wintering or by seed set. Volunteers of transgenic crops can present an agronomic problem when not properly controlled. Growers need to be especially careful to avoid the inadvertent gene stacking that can arise either by planting the same crop bearing different traits in subsequent years, or by planting crops bearing different traits close enough together that pollen flow can occur. As an example, planting canola with glyphosate herbicide tolerance in year one, followed by canola with imidazolonone herbicide tolerance in year two, can result in the appearance of canola volunteer plants bearing both herbicide tolerance traits, if gene flow is allowed to occur between the current years crop and the previous years volunteers. The presence of multiple herbicide tolerant volunteer plants may reduce the agronomic control strategies that growers can use for this type of weed. Growers need to be encouraged to apply sound agronomic practices including weed control and crop rotation. For some transgenic plants, it is important to consider whether a wild relative of a transgenic plant could acquire the GM trait through cross-pollination. The question is whether the wild relative could become a weed if the acquired GM trait endowed it with an ability to escape an environmental constraint, such as herbivore damage. In making this evaluation, it should be noted that weediness is a constellation of biological traits. It depends on the existence of a selection pressure, and would not necessarily result from a wild relative acquiring a single trait from a transgenic plant In considering potential for transfer of a trait to wild relatives, possible management procedures are taken into account. These include pollen barriers, separation distances and removal of flowers. There is also the potential for developing transgenic crops where cross-pollination is unlikely to occur by, for example, using male sterility traits or chloroplast transformation. D.3. New viruses or new viral diseases of plants 106. Like other organisms, plant species are susceptible to infection by viruses. Modern biotechnology applied to viral disease control has been developed in which a component of the virus, normally a gene for viral coat proteins (VCP), is engineered into a crop plant to prevent the virus from infecting the plant. The risk considerations are: a) whether the VCP from the modified crop plant could be acquired by wild relatives and lead to their increased viral resistance and weediness; b) whether new viral strains may emerge through process such as recombination, transcapsidation and synergy; and c) whether changes in host range may evolve by recombination Should a potential for weediness be identified, it can be managed through methods described above. Several studies, including a Consensus Document prepared by the Working Group entitled, Consensus Document on General Information Concerning the Biosafety of Crop Plants Made Virus Resistant through Coat Protein Gene-Mediated Protection (OECD, 1996a), have concluded that the potential for new viral diseases to arise through use of this technology is extremely low. D.4. Use of antibiotic resistance traits as selection markers in GM plants 108. The development of pathogen resistance to antibiotics has become a growing problem world-wide and has major implications for human health. Environmental reservoirs of pathogens resistant to antibiotics are created mainly through the misuse of antibiotics in animal feed, in 29

65 C(2000)86/ADD2 veterinary science or human healthcare. To effectively deal with the development of antibiotic resistance in pathogen populations, those items must be addressed Certain antibiotics have been used as screening agents to create and select genetically engineered organisms, such as transgenic plant varieties. Although there is no evidence that the use of antibiotic resistance traits in transgenic plants contributes to the development of resistant pathogen populations, their use has been criticised as potentially adding to the problem where alternative solutions could be devised. The use of antibiotic resistant marker genes within transgenic plants is one of the important points which are discussed, in some countries, in connection with risk assessment and precaution. It is difficult to distinguish the relative risks associated with these various practices and this may not always be appropriately reflected in public discussion. Issues associated with the use of antibiotic resistance markers have been detailed in a US FDA guidance document (1997), in an opinion by the Scientific Steering Committee on Antimicrobial Resistance (European Commission, 1999), and on the Belgian Biosafety Server ( To address these concerns and as a matter of precaution, alternatives to antibiotic resistance traits are currently assessed as to their feasibility to reduce experimental dependence on their use as selective markers, for example, the use of secondary selection markers (e.g. green fluorescent protein). The alternatives also need to be subject to a risk assessment and compared with the risks of antibiotic resistance markers. Other technologies may allow for the elimination of antibiotic resistant markers from the transgenic plant. For plants, other resistance traits, such as resistance to herbicides, may be used instead of resistance to antibiotics. E. MONITORING ENVIRONMENTAL EFFECTS OF GENETICALLY MODIFIED (GM) PRODUCTS 111. Monitoring is a specific risk management measure which has been an important aspect of small field releases (OECD, 1992). Some Member countries have undertaken extended programmes to assess the long-term risk from releases of GM crops into the environment. However, it is a topic where there is a need for a greater understanding of the different priorities and practices of Member countries. The paragraphs below exemplify the range of factors which may be taken into account by Member countries in monitoring programmes, though the actual requirements will vary from case to case The monitoring of genetically engineered organisms in the environment may be undertaken following an experimental release or commercial use to identify either a) a predicted effect, or b) unforeseen effects, following an experimental release or commercial use. Specific monitoring is designed to detect effects predicted in the risk/safety assessment. General monitoring attempts to detect unpredicted effects If undertaken in a statistically valid way, monitoring broadens the knowledge base for future risk/safety assessment. However, the usefulness of the programme must be weighed against the costs and size of the programme, the importance of the crop as well as the potential risks to the environment. Monitoring can be a feasible safety measure when experience with a genetically engineered organism is lacking or the possibility of unknown adverse effects exists. Some countries also believe that it is an important precautionary measure. In addition to testing the conclusions of a risk assessment, specific monitoring can serve as an early warning system to alert risk/safety assessors that counter-measures against adverse effects should be implemented. Three essential 30

66 Bijlage 11 Codex Alimentarius Draft guideline for the conduct of food safety assessment of foods derived from recombinant-dna plants. Section Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: helpsbb@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ Bijlagen

67 ALINORM 03/34 Page 55 same effect. Although the recombinant-dna plant components may be individually assessed as safe, the impact of the change on the overall nutrient profile should be determined. 51. When the modification results in a food product, such as vegetable oil, with a composition that is significantly different from its conventional counterpart, it may be appropriate to use additional conventional foods or food components (i.e. foods or food components whose nutritional composition is closer to that of the food derived from recombinant-dna plant) as appropriate comparators to assess the nutritional impact of the food. 52. Because of geographical and cultural variation in food consumption patterns, nutritional changes to a specific food may have a greater impact in some geographical areas or in some cultural population than in others. Some food plants serve as the major source of a particular nutrient in some populations. The nutrient and the populations affected should be identified. 53. Some foods may require additional testing. For example, animal feeding studies may be warranted for foods derived from recombinant-dna plants if changes in the bioavailability of nutrients are expected or if the composition is not comparable to conventional foods. Also, foods designed for health benefits may require specific nutritional, toxicological or other appropriate studies. If the characterization of the food indicates that the available data are insufficient for a thorough safety assessment, properly designed animal studies could be requested on the whole foods. SECTION 5 OTHER CONSIDERATIONS POTENTIAL ACCUMULATION OF SUBSTANCES SIGNIFICANT TO HUMAN HEALTH 54. Some recombinant-dna plants may exhibit traits (e.g., herbicide tolerance) which may indirectly result in the potential for accumulation of pesticide residues, altered metabolites of such residues, toxic metabolites, contaminants, or other substances which may be relevant to human health. The safety assessment should take this potential for accumulation into account. Conventional procedures for establishing the safety of such compounds (e.g., procedures for assessing the human safety of chemicals) should be applied. USE OF ANTIBIOTIC RESISTANCE MARKER GENES 55. Alternative transformation technologies that do not result in antibiotic resistance marker genes in foods should be used in the future development of recombinant-dna plants, where such technologies are available and demonstrated to be safe. 56. Gene transfer from plants and their food products to gut microorganisms or human cells is considered a rare possibility because of the many complex and unlikely events that would need to occur consecutively. Nevertheless, the possibility of such events cannot be completely discounted In assessing safety of foods containing antibiotic resistance marker genes, the following factors should be considered: A) the clinical and veterinary use and importance of the antibiotic in question; (Certain antibiotics are the only drug available to treat some clinical conditions (e.g. vancomycin for use in treating certain staphylococcal infections). Marker genes encoding resistance to such antibiotics should not be used in recombinant-dna plants.) B) whether the presence in food of the enzyme or protein encoded by the antibiotic resistance marker gene would compromise the therapeutic efficacy of the orally administered antibiotic; and (This assessment should provide an estimate of the amount of orally ingested antibiotic that could be degraded by the presence of the enzyme in food, taking into account factors such as dosage of the antibiotic, amount of enzyme likely to remain in food following exposure to digestive conditions, 6 In cases where there are high levels of naturally occurring bacteria which are resistant to the antibiotic, the likelihood of such bacteria transferring this resistance to other bacteria will be orders of magnitude higher than the likelihood of transfer between ingested foods and bacteria.

68 Page 56 ALINORM 03/34 including neutral or alkaline stomach conditions and the need for enzyme cofactors (e.g. ATP) for enzymatic activity and estimated concentration of such factors in food.) C) safety of the gene product, as would be the case for any other expressed gene product. 58. If evaluation of the data and information suggests that the presence of the antibiotic resistance marker gene or gene product presents risks to human health, the marker gene or gene product should not be present in the food. Antibiotic resistance genes used in food production that encode resistance to clinically used antibiotics should not be present in foods. REVIEW OF SAFETY ASSESSMENTS 59. The goal of the safety assessment is a conclusion as to whether the new food is as safe as the conventional counterpart taking into account dietary impact of any changes in nutritional content or value. Nevertheless, the safety assessment should be reviewed in the light of new scientific information that calls into question the conclusions of the original safety assessment.

69 Bijlage 12 The biosafety of antibiotic resistance markers in plant transformation and the dissemination of genes through horizontal gene flow. Gay In 'Safety of genectically engineered crops'. VIB report. Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: helpsbb@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ Bijlagen

70 The Biosafety of Antibiotic Resistance Markers in Plant Transformation and the Dissemination of Genes through horizontal Gene Flow Authors: Philippe Gay GMOs consultants 119 bis rue de Colombes F Asnières, France 1. Introduction Microbes as part of human life Antibiotic resistance marker genes The antibiotic resistance marker genes used in plant genetic engineering The need for marker genes in plant genetic engineering The antibiotic resistance marker genes used in plant genetic engineering Conclusion The use of antibiotics versus natural antibiotic resistance The use of antibiotics and the occurrence of resistance Reservoirs Conclusion Transgenic plants as a potential contributor to the spread of antibiotic resistance genes Requirements for horizontal gene transfer from plants to bacteria Fate of the DNA released in the environment Bacterial transformation Approaches for the evaluation of DNA mediated transformation frequencies Conclusion Horizontal transfer of DNA ingested by mammals General Discussion Cases References Horizontal Gene Flow 135

71 1. Introduction 1.1. Microbes as part of human life Microbes and especially bacteria are an integral part of human life, though most people only become aware of their existence when they cause a health problem. Bacteria are key partners of our digestive track. One gram of faeces of an adult human contains approximately 100 billion bacteria belonging to more than 50 genera. The most well known of them: Escherichia coli, is among the less represented in this habitat, approx. 100 millions per gram. The mouth, the upper respiratory track, the skin and the vagina are colonized by several tenths of commensal bacterial species (Stanier et al, 1987). Bacteria are present in our food, either as contaminants or commensals of raw food ingredients, especially milk and vegetables, as contaminants of stored food or as basic constituents of fermented food. Bacteria are everywhere in our environment. The number of bacteria in soils ranges from millions to billions per gram (Foster 1988). Millions of bacteria currently colonize each cm 2 of vegetable leave (Nguyen-the and Carlin 1994). Figure 1 depicts the dissemination of bacteria and bacterial genes in our environment. Though various species have highly specialized or at least preferred habitats, human and animal activities result in an intermingling of bacterial species. These exchanges between various biotopes/reservoirs are however quite strongly counterselected, meaning that exchanges result only in some cases to presence of bacteria in another niche, something that is not represented in the figure. What is true for bacteria is also true for the DNA which they release either as the result of physiological secretion mechanisms or as the result of their death and decay. It is noteworthy that the food industry destroys the bacteria present in the raw matters as well as most of the DNA present. The exception of course are raw fermented products. Some bacteria cause infectious diseases which, until the appearance of antibacterial drugs, were by far the major cause of human and animal mortality. Courvalin and Acar, (1998) have called the last decades of the 20th century "the golden age of antibiotics", when nearly all bacterial diseases could be controlled by these drugs, of which the penicillins are the most well known. Like the penicillins, most antibiotics are substances that are produced by different micro-organisms naturally. This golden age may come to an end as a result of the generalized spread of antibiotic resistance among most bacteria and the lack of discovery of new antibiotics based on novel working mechanisms. Antibiotic resistance is currently considered one of the biggest threats to public health (American Society for Microbiology report 1995; Kumin C.M ) Antibiotic resistance is caused by the expression of antibiotic resistance genes resulting in different physiological mechanisms such as detoxification of the antibiotic, mutation of the target of the antibiotic resulting in insensitivity, or pumping the antibiotic out of the cell. These antibiotic resistance genes are widely found in nature. They are required for the self-protection of microbes that produce antibiotic substances themselves (Davies 1994). Their existence is also assumed to be the result of the co-evolution of soil micro- 136 Safety of Genetically Engineered Crops

72 organisms that required protection against other microbes that produce antibiotics in the same habitats. The spread of antibiotic resistance genes is the result of the combination of both the selection of resistant clones in the presence of antibiotics and of an active inter-generic transmission of the resistance genes, also called horizontal gene transfer (Mazodier and Davies, 1991; Lorenz and Wackernagel, 1994). It is generally recognized (see that the widespread use of antibiotics in human and animal therapy as well as in animal farming (feed additives) over the last decades has predominantly contributed to an important increase of the frequency of resistance genes in bacteria. It has been proven that modifying antibiotic prescription practice can result in significant decrease of the frequencies of resistant pathogens (see Figure 1: The dissemination of bacteria and bacterial genes in the environment Antibiotics Animals Processed Foods Humans Faeces, wastes Plants Faeces, wastes Soil, Water Circles represent various biotopes. Blue arrows indicate a flux of bacteria and/or bacterial genes between the different biotopes. Boxes represent intermediate reservoirs that play a role in the flux of bacteria and/or bacterial genes between different biotopes. Brown arrows indicate a selection by the use of antibiotics in human and animal therapy and in the animal industry which influences the presence and flow of antibiotic resistance genes into different biotopes. Industrial food processing results in a strong diminution of the bacterial and of the DNA content originally present in raw matters. Processed food can be however contaminated by accident, and more frequently during domestic storage and use Antibiotic resistance marker genes Some of the antibiotic resistance genes are key tools in genetic engineering where genes are transferred (added) to cells of organisms. When the genes are transferred, one somehow has to identify the cells that have taken up the additional genetic material. For this one uses marker genes. These are genes that are responsible for a trait that can be easily identified/selected. It is physically attached to the fragment of DNA under study, so if the marker gene is present, the fragment of DNA under study will also be present. The cells that have actually taken up the DNA can be identified either through: Horizontal Gene Flow 137

73 1. Selection: cells are being grown in such circumstances that only cells that have taken up the DNA can survive. For this one often uses antibiotic resistance genes. 2. Screening: cells that have taken up the marker gene are easily identified (for instance visually) and can be picked out. Selection is the most used method, because it requires less effort. The ampr, kanr, tetr genes, respectively responsible for resistance to the antibiotics ampicillin, kanamycin and tetracycline, are used daily as selective markers by tens of thousands of scientists. Since the beginning of the eighties marker genes, and mostly antibiotic resistance genes, have been used by biotechnologists to help to create genetically engineered plants. Most of the genetically engineered plants that have been grown on millions of hectares in North and South America since 1996 include antibiotic resistance marker genes. Whether the presence of antibiotic resistance marker genes in transgenic crops could contribute to the spread of resistance and thus be a threat to public health by diminishing the possibilities to treat infectious diseases has become the subject of intense public debate in Europe over the last years. It is this question that will be addressed in this paper. The issue is already covered by an abundant scientific literature including the opinions of the EU scientific committees, ( the Advisory Committee for Novel Food and Processes (ACNFP) in the UK ( recent reviews by Nielsen et al (1998) and Bertolla and Simonet (1999), and opinions of other well known experts such as Salyers ( and a number of scientific reports to which we will refer below. It might however be of interest to revisit the issue in the light of the latest developments of the scientific knowledge and of the argumentation opposed to the dissemination of crops bearing antibiotic resistance marker genes (ACNFP reports, Courvalin 1998). In this paper this latest scientific knowledge is presented together with as many facts and figures as possible. 138 Safety of Genetically Engineered Crops

74 2.The Antibiotic Resistance Marker Genes Used in Plant Genetic Engineering 2.1. The need for marker genes in plant genetic engineering The engineering of plants is a process that includes two major steps: a. The transforming DNA (bacterial selective markers) For the preparation of DNA to transform a plant, small circular genetic elements plasmids are used. Plasmids occur naturally in bacteria. Plasmids can be easily purified from bacterial cultures, engineered in vitro, and re-introduced in bacteria where they multiply. The genes to be transferred in plants are pasted in vitro into these bacterial plasmids. The resulting engineered plasmids, or transgene vectors, are re-introduced in bacteria which can either serve directly as gene donors to plants (Agrobacterium mediated transformation), or which are used to generate large numbers of copies of the engineered plasmids in order to obtain enough DNA to carry out direct transformation of plant cells by using for instance the Biolistic method (the gene gun ) or electroporation. Bacterial plasmids used in genetic engineering can hardly be maintained in bacteria unless forced. For this purpose an antibiotic resistance gene is included in the plasmid and the relevant antibiotic is added to the culture medium so that only the bacteria bearing the engineered plasmid can survive. By far, the marker gene most frequently used for maintaining plasmids in the bacterium Escherichia coli is the amp r gene also termed bla TEM1, that allows bacteria to resist to ampicillin, an antibiotic of the β-lactam family. A consequence of this process is that when a whole plasmid is transferred to the plant, the resulting transgenic plant will include a bacterial antibiotic resistance marker gene. This is the case in the Novartis 176 maize. This bacterial antibiotic resistance marker gene cannot be expressed in the plant, because it is preceded by a bacterial promotor. When submitted to the regulation of a bacterial promoter the genes are not expressed in plants, and vice versa. b. The plant transformation step (plant selective markers) The transformation of plant cells by either Agrobacterium mediated conjugation, or direct gene transfer, is a rather rare event. In order to select the few transformed cells that will allow the regeneration of a transformed plant, a marker is required that is expressed in the plant. Therefore another marker gene is added to the vector which is put under the control of a plant promotor. This will allow the transformed cells to be selected or identified. Such markers include herbicide resistance genes or genes allowing the resistance to antibiotics that are toxic for plants cells such as kanamycin or hygromycin. Remarks The bacterial selective marker used in step a. is not required in principle in the plant transformation when using direct gene transfer techniques such as Biolistics. However in the early nineties, the state of the art Horizontal Gene Flow 139

75 plant transformation techniques used entire plasmids as donor DNA, resulting frequently in the integration in the plant of the bla TEM1 gene, or part of it. This is the case for the following plants that were approved for growing and processing in the EU: Ciba/Novartis maize (EU application number C/F/94/11-03) and AgrEvo maize (EU application number C/F/95/12-07). A plant selective marker is presently still an absolute requirement to ensure successful DNA-transfer to plant cells. AgrEvo Oilseed rape (EU application number C/UK/95/M5/1), includes two selective markers, the herbicide resistance gene pat and nptii antibiotic resistance marker. For more details see The antibiotic resistance marker genes used in plant genetic engineering The antibiotic resistance genes used in plant genetic engineering are listed in table 1. They all originate from bacterial transposons (small naturally jumping genetic elements). Table 1: Main antibiotic resistance genes used in plant biotechnology 1 Antibiotic Bacterial phenotype* Plant phenotype ** Main use resistancegene amp r Ampicillin and amoxicillin None Bacterial selective bla TEM1 resistance marker aad Streptomycin and None Bacterial selective marker or spectinomycin resistance ant (3 )-Ia3 aph(3 )-II Kanamycin,neomycin Kanamycin resistance Plant selective marker or resistance nptii aph(3 )-III Kanamycin, neomycin, Kanamycin resistance Plant selective marker or amikacin resistance npt III hgh Hygromycin resistance Hygromycin resistance Plant and fungi or selective marker hpt cm r Chloramphenicol resistance Expression of Reporter gene or chloramphenicol cat acetyl transferase * only when the gene is expressed under the regulation of a bacterial promoter ** only when the gene is expressed under the regulation of a plant promoter The relative importance of these markers can be evaluated according to their presence either in plants approved for cultivation both in the EU and US, or plants for which the marketing dossiers are currently reviewed in the EU and plants tested in the fields in the US, as shown in table 2 and 3. 1 Abbreviations: bla = Beta-lactamase aad = aminoglycoside adenyltransferase ant = aminoglycoside nucleotidetransferase aph = aminoglycoside phosphotransferase npt = neomycine phosphotransferase hpt = hygromycine phosphotransferase cat = chloramphenicol acetyltransferase 140 Safety of Genetically Engineered Crops

76 Table 2: Antibiotic resistance genes in approved transgenic crops (see sources below) Gene EU * USA** bla TEM1 Corn Corn nptii Corn Corn nptii Oilseed rape Oilseed rape nptii Chicory Chicory nptii, aad, cat Tomato nptii Cotton nptii Potato nptii Squash nptii Flax nptii Papaya * for more details see URL ** for more details see APHIS at URL Table 3: Antibiotic resistance genes in plants tested in the fields in the US (total number of records 5769, source APHIS, 1 Marker gene Number of trials applications Number of trials applications total since Jan 1998 Cat 4 0 Hpt nptii Ant 1 0 Bla Statistics not available* Most likely 0 *** npt III Statistics not available** Statistics not available** * the bla gene is not considered a plant marker gene in the statistics, ** marker not listed, either covered by confidential business information, or more likely not used. *** see explanations below From the above given tables it can be deduced that the nptii kanamycin resistance gene still is the most important selective marker in plant genetic engineering. About 90% of the plants in R&D contain this marker gene. Although not given in the tables above, herbicide tolerance is more important than hpt and comes in second. Many plants on the market or in R&D phases are genetically modified to be herbicide tolerant and in a number of cases the herbicide tolerance is combined with another trait, for instance insect resistance or male sterility. There seems to be a trend towards an increased use of the hygromycin resistance gene hpt though it is not yet present in a registered transgenic crop. In contrast to many other antibiotics, hygromycin is in practice not used as an anti-microbial drug. Another trend is to develop new selective markers to replace the antibiotic resistance markers (Kunkel et al.1999; Stein and Hansen 1999). It will however take time to have a full assessment of the usefulness and the harmlessness of such new markers. Recent examples are the cytokin 1 For field tests in the EU comparable statistics are not available Horizontal Gene Flow 141

77 based system by Chua et al. (1999) and the mannose based selective marker developed by Novartis (Privalle, et al, 2000). An increased efficacy of the techniques of gene transfer to plants might lead in the near future to a situation where selective markers are no longer necessary. Though nptiii does not appear in the statistics to which we had access, it is noteworthy that it is present in potatoes for which a marketing application had been filed in the EU by Avebe (application C/NL/96/10). This nptiii gene was present in the plasmid used in the Agrobacterium-mediated transformation. In this particular case the whole plasmid was transferred to the plant including the nptiii gene. This is a kind of textbook case since the issue of horizontal gene transfer has been raised in connection with the fact that the gene causes resistance to amikacin which is an antibiotic of value to fight nosocomial infections ( Avebe has withdrawn its application, when it was clear that the presence of this npt-iii gene led to serious objections to the request to put the potatoes on the market. Two remaining remarks are first that the bla gene is by far the most frequently used marker in the laboratory for gene cloning purpose in bacteria. It is however not to be expected that this gene will be present in plants that will be marketed in the future. And secondly that a streptomycin resistance gene was integrated in a cotton line from Monsanto company Conclusion In the immediate and mid-term future, the issue of the presence of antibiotic resistance marker genes in genetically engineered plants will be restricted to the following genes: a) The bla TEM1 gene. This gene is present in Novartis 176 maize commercialized in the US and Canada, and registered in EU (Commission Decision 97/98/EC). A partial copy is present in the AgrEvo T25 maize which is also registered for growing and processing in the EU (Commission Decision 98/293/EC). It will not be present in plants to be marketed in the near future. b) The nptii gene present in several plants registered in the US, and especially in AgrEvo Topaz 19/2 oilseed rape authorized in the EU ( Commission Decision98/293/EC). These crops are grown on millions of hectares. The npt-ii gene is also present in plants in very large amounts (thousands) of field trials. Many transgenic crops that will be marketed in the near future will therefore contain this marker gene. c) The hpt gene that is not yet present in a registered transgenic crop, but this may be different in the future, because there is a trend toward an increased use of hygromycine. About 10% of the plants in field trials contain this marker gene. In the following we will particularly focus on risks that could be associated with the antibiotic resistance genes present in commercialized transgenic crops. 142 Safety of Genetically Engineered Crops

78 3. The Use of Antibiotics Versus Natural Antibiotic Resistance 3.1. The use of antibiotics and the occurrence of resistance Publicly available statistics on the use of antibiotics are scarce. The search of scientific literature and the web, and the interviewing of a number of specialists in infectious diseases, including practitioners, microbiologists, epidemiologists, managers in the public health insurance system, did not result in precise figures on the evolution of the use of specific antibiotics. However some trends are unanimously acknowledged. 1. Kanamycin, neomycin Kanamycin and neomycin are rather toxic antibiotics of the aminoglycoside-group. They are of no clinical importance. Resistance to kanamycin and neomycin is not considered to be a threat for public health. Their use has been nearly abandoned in the treatment of infectious diseases, because of their toxicity In clinical practice today their use is limited to some applications of external use. Kanamycin appears only in one ointment formula in the French Vidal dictionary of pharmaceutical specialities and neomycin only appears in OTC topical formulations for the treatment of dermatitis, and superficial burns and wounds. Borne by the Tn5 transposon detected in Escherichia coli, the nptii gene, rendering resistance to kanamycin and neomycin is abundant in nature (Leff et al. 1993; Smalla, 1993, De Vries and Wackernagel 1998). 2. Ampicillin, amoxicillin Ampicillin and amoxicillin are antibiotics of the β-lactam group that are widely used in human and animal chemotherapy. In human therapy they are used against numerous bacterial diseases such as ear infections, infections of the respiratory tract, of the urinary and digestive tracts, etc.. Though this does not appear in literature, the specialists interviewed indicated that the use of ampicillin is significantly declining. However this decline does not extend to the use of amoxicillin. There are alternatives to cure the diseases that were previously treated by both ampicillin and amoxicillin. Resistance to ampicillin and amoxicillin is ubiquitous, likely due to the massive use of ampicillin over the last 25 years. Resistance to ampicillin also results in resistance to amoxicillin. Figures vary from country to country but it is clear that resistance is found in a large spectrum of bacteria infecting humans (Calva, 1996), farm animals (DANMAP Report. 1997), and is present in soils and ground waters (McKeon, D. 1995). In hospitals, about 50% of the Enterobacteriaceae are resistant to ampicillin, and more than 80% of these resistances are caused by the bla TEM1 gene (Livermore 1995). The bla TEM 1 gene codes for a β-lactamase that cuts the ampicillin molecule thereby inactivating the antibiotic. Since the bla TEM1 gene was first identified in the early 1960s, a number of β-lactam antibiotic resistance genes - to-date more than sixty - have been identified. They encode β-lactamases that provide resistance to most β- lactam antibiotics, including the third generation cephalosporins (Medeiros, A. A. 1997). Resistance has build up to such an extend that a safe use of ampicillin or amoxicillin is to complement them with a β-lactamase inhibitor, clavulanic acid, though resistance also has build up against this mixture (Nordmann P et al. 1994). Horizontal Gene Flow 143

79 3. Hygromycin The antibiotic hygromycin is not used in human medicine because of its very high toxicity. Only in farm animals it is used as an anti-helmintic (= anti-worm). ( The hpt gene produces the hygromycin phosphotransferase protein that inactivates the hygromycin molecule by phosphorylation. It is widely present in bacteria in soil and Enterobacteriaceae (ZKBS, 1999). 4. Streptomycin The use of streptomycin has been nearly abandoned in human medicine except for the treatment of some cases of gonorrhea. Its use might be revived for the treatment of severe endocarditis. (Courvalin 1998). No streptomycin resistance gene is present in a crop reaching the human food chain. The frequency of occurrence of the above mentioned resistance genes in the reservoirs is so far not limited by the availability of the genes and of horizontal gene transfer mechanisms but rather by the selection exerted by the use of antibiotics in human and animal therapy and likely by the use of antibiotics as additives in animal feed Reservoirs It is generally agreed that antibiotic resistance genes have appeared over millions of years of bacterial evolution as a result of a) the need for antibiotic producing bacteria to protect themselves against their own poisons (Davies, 1994), b) the co-evolution of soil bacteria and various antibiotic producer microbes. The resistance genes present in resistant bacteria in a relevant biotope form resistance reservoirs. These reservoirs consist of pre-existing genes. Soil has likely been the initial reservoir of antibiotic resistance genes. From there, resistant bacteria migrated into new biotopes, including animals, where resistance genes have invaded numerous species, including humans, thanks to natural horizontal gene transfer mechanisms (HGT). HGT is the transfer of genetic material from one individual organism to the other without the involvement of mechanisms of reproduction. The transfer of genetic material from a parent to a daughter organism involving mechanisms of reproduction is called vertical gene transfer. Humans, especially their intestinal tracts, also present a resistance reservoir. Contributions to this reservoir occur among other things through direct contamination, for instance, thanks to: a) bacteria present in the food chain such as the bacteria on raw vegetables (Corbet D. 1988), raw fermented products, and stored food, and b) direct contact with other humans and their effluents (this is particularly the source of nosocomial infections), with animals and their effluents and with soil. The spread of bla and npt-ii in the natural environment through horizontal gene transfer Both the bla TEM1 and nptii genes have been initially identified in bacteria on transposons (Tn3 and Tn5 respectively). Transposons are small genetic elements that can be transposed or "jump" from place to place in chromosomes or plasmids. Plasmids are mini-chromosomes that can be infectious. This means that they can be naturally transmitted from one bacterium to the other. These bacteria do not have to belong to the same 144 Safety of Genetically Engineered Crops

80 species (Courvalin, 1994). This natural mechanism of HGT is called conjugation. Tn3 and Tn5 can be found on several plasmids widely disseminated across bacterial species by conjugation (bacterial mating) (Mazodier and Davies 1991, Amabile-Cuevas and Chicurell 1992, Nielsen et al 1998). The spread of the bla TEM1 gene in human pathogens resulted from the transfer by conjugation of plasmids that invaded several pathogenic species, starting initially with enterobacteriaceae in the mid sixties, then Pseudomonas aeruginosa in 1970, followed by Haemophilus influenzae in 1974, Neisseria gonorrhoeae in 1976, Acinetobacter in 1978, Vibrio cholerae in 1979, then Neisseria meningitidis in 1983, (Arlet and Philippon, 1997). This evolution clearly correlates with the explosion of the use of ampicillin in human and veterinary medicine. The extensive use of ampicillin has been responsible for a strong selection pressure favouring the bacteria with antibiotic resistance. This illustrates that the evolution of the ampicillin resistance reservoir depends on selection in as much as genes and horizontal transfer mechanisms exist. This key role of the selection depending on the heavy use of antibiotics is emphasized in several reports (Betts et al. 1984; Pear et al. 1994; Seppala et al. 1997; Austin et al. 1999). It is actually the case that humans, their direct environment and livestock have now become the main reservoirs of resistance, in their turn feeding the soil and plant biotopes with resistant bacteria. In addition to the mechanisms of HGT, spontaneous mutations play a role in the formation of resistance reservoirs. Like any other gene, antibiotic resistance genes are subject to spontaneous mutations. It is generally agreed that the spontaneous mutation rate of a given gene is approximately 10-6 per generation. This means that the gene in one in 1 million bacteria is hit by one mutation. In microbes such rates can have consequences in a short time frame, given the size of microbial populations and their multiplication rates. It is estimated that a healthy human being disseminates daily between 500 millions and 5 billions bacteria carrying an ampicillin resistance gene of the bla TEM family through his faeces. This means that even without selection pressure, such a bacterial population already includes a significant number of mutants, and some of them will carry a mutation in the ampicillin resistance gene, perhaps even resulting in an extended spectrum of resistance to β-lactams. This means that the mutation rate is of such an order that it is not a limiting factor for the evolutions of resistance reservoirs. The amount of selection pressure will determine the evolution in the resistance reservoirs of extended resistances. Ampicillin was given here as an example of how also mutations can effect changes in antibiotic resistances. But this is also true for kanamycin resistance. Even more so, in the case of the npt-ii gene objections were raised against the use of nptii in plants (Courvalin 1998) arguing that a single mutation would transform nptii in a nptiii like gene causing amikacin resistance (Kocabiyik, 1992). Resistance to amikacin is a serious issue since this compound is a reserve antibiotic used to fight nosocomial infections (Opinion of the EU Scientific Committee for plants, 2 October 1998). However it should be noted that amikacin resistance, is caused by different genes, including aac (6 )-I (Miller et al. 1995) and aph(3 )-III (Trieu Cuot and Courvalin 1983) that are already rather abundant in nature. As a résumé it can be stated that resistance reservoirs are determined by the following: The availability of resistance genes. The dissemination of the resistant bacteria and of their resistance genes within a biotope and across biotopes. The variations and mutations that affect these genes. The selection pressure that regulates the frequency of the genes within the bacterial community in a biotope. Horizontal Gene Flow 145

81 3.3. Conclusion The antibiotics kanamycin and hygromycin are of no clinical importance. Ampicillin and amoxicillin are still abundantly used in human medicine though the use is of ampicillin is considerably declining. Resistance to all of these antibiotics is abundant in nature and the resistance genes are readily available in resistance reservoirs. One way to get round resistance in order to further benefit from these antibiotics is to add the β-lactamase inhibitor clavulanic acid to amoxicillin. However, resistance to this mixture is already rather high. 146 Safety of Genetically Engineered Crops

82 4. Transgenic Plants as a Potential Contributor to the Spread of Antibiotic Resistance Genes Can transgenic plants bearing bacterial ampicillin, hygromycin or kanamycin resistance genes be a new factor influencing the frequency of these genes in resistance reservoirs? Can these genes when they are present in foodstuffs, be transferred to the bacteria in the gut of individuals and pose an unacceptable risk? These are the two main issues raised by the presence of antibiotic resistance marker genes in crops, already grown on millions of hectares. To our knowledge, as well as in literature, there has so far not been a report of a direct observation of any transfer of genes from plants to bacteria in the natural environment. In order to investigate whether and how such a horizontal gene transfer would be possible, the likelihood of each of the requirements to be fulfilled should be considered and if necessary subjected to an experimental approach Requirements for horizontal gene transfer from plants to bacteria There is no known dedicated mechanism for horizontal gene transfer from plants to other organisms. Therefore horizontal gene flow requires the direct transfer of plant DNA to bacterial cells, i.e. DNA mediated transformation. This requires the following: a) Plants cells, i.e. decaying or ingested plant parts should release in the environment DNA fragments of at least the average size of a (resistance) gene (fragments should be in the kilobase range and more). b) After release, DNA should persist in an (aggressive) environment for a longer period of time (to allow it to be taken up by bacteria). c) Bacteria should be able to take up the released DNA. d) DNA taken up should be stably established in the recipient cells. e) This establishment should at least be neutral so that the transformed cells are not counter-selected Fate of the DNA released in the environment Some orders of magnitude Novartis 176 maize, includes one functional copy of the bla TEM1 gene together with the origin of replication of the puc 18 plasmid. The number of cells of fresh maize is in the range of 10 7 to 10 8 per gram. In mid-summer, the number of maize cells per ha is thus in the range of meaning as many copies of the maize bla TEM1 gene. In the upper layer (ploughed) of agricultural land, each gram of soil includes on average 10 7 bacterial colony forming units (cfu) including approx.10 5 ampicillin resistant bacteria bearing the bla TEM1 (Simonet, personal communication). These 10 7 cfu refer to the organisms that can be cultivated in the laboratory from soil. It is estimated that the species that can be cultivated from soil represent only 1% of the actually present species in soil. Therefore these cfu represent only a small proportion of the actual soil bacterial population. Horizontal Gene Flow 147

83 This majority of bacteria that cannot be cultivated in the laboratory might also include amp r (bla) bacteria. The top 10 cm of a hectare of agricultural land can currently include about cfu, among which cfu each bearing 10 copies of bla TEM1 2. This means that it includes at least copies of the bla TEM1 gene, borne by highly transmissible plasmids. For the npt-ii and hpt antibiotic resistance genes similar calculations can be made, because these genes, like the bla TEM1 gene are widely present in soil- and Enterobacteria (ZKBS, 1999). The fate of linear plant DNA fragments released in soil For most crops at least parts of the crop remain on the field after harvest. This remaining plant material is often ploughed into the soil where the plant material decays and the plant cells break down thereby releasing the cell content including the DNA. The plant cell content itself is a threat for DNA. The destruction of the cell infrastructure releases nucleases that attack the DNA when released from the nucleus. In all plant DNA extraction protocols in the laboratory chelators are added to the extraction medium before grinding the cells otherwise no DNA can be recovered. In addition to the degradation by the plant cell content itself, DNA molecules released in the environment are sensitive to mechanical shearing and to the nucleases released in the environment by other organisms, especially bacteria (Blum et al., 1997), both resulting in the breakdown into smaller fragments. However, in soil, a) DNA fragments of a size of few kilobases - that is of the size of some bacterial antibiotic resistance genes - are remarkably resistant to mechanical shearing. b) DNA molecules can be protected against nuclease action in aquatic environments (Paul et al. 1989) and in soil (Lorenz and Wackernagel, 1992; Romanowski et al., 1993; Paget et al., 1992), so they could persist long enough in this apparently hostile environment to allow a possible uptake by acceptor cells. The fate of linear plant DNA fragments in the intestinal tract of mammals Schubbert et al, (1994, 1997) have shown that DNA ingested by mice is not totally degraded in the intestinal tract and that fragments of the size of an antibiotic resistance gene could resist degradation and become available for horizontal transfer. Such large fragments represent less than 4% of the ingested plant DNA, but this still is a significant amount. To our knowledge, the fate of DNA released in the intestinal tract of ruminants, like cows and sheep has not been documented. Ruminants have three stomachs in their intestinal tract. The DNA is released in the first stomach, the rumen, which is a fermentation vessel of more than 100 liters, that includes approximately 10 to 100 billions bacteria per ml. It is assumed to be an extremely hostile environment for free DNA given the abundance of nucleases secreted by the bacteria and protozoa that degrade the ingested plant material. However, most of the feed present in rumen is under a solid phase, i.e. involves microenvironments where DNA might be protected like in soil and further made available for horizontal gene transfer. The content of the rumen is however digested downstream in the abomasum, the second stomach of ruminants (in an acidic medium similar to the stomach of monogastric animals). 2 Resistant bacteria contain multiple copies of the bla TEM1 gene. The average is about 10 copies per bacterium. 148 Safety of Genetically Engineered Crops

84 The fate of plant DNA: possibilities for reconstitution of plasmids Plant DNA is released as linear fragments. In some transgenic plants however, like for instance the Novartis 176 maize, the bacterial cole1 origin of replication is present, which means that fragments that are released from these plants can include both the bla TEM1 gene and the cole1 origin of replication i.e. the material required to reconstitute a functional plasmid. Both linear fragments and plasmids can be taken up by bacteria, but functional plasmids are more likely to be attained by bacteria than linear fragments of DNA. If the locus contains internal duplications, then the chance that functional plasmids are formed is enlarged, because loops can be formed (duplications are sticky) that can be spontaneously excised from the chromosome thereby releasing a circular plasmid. Such a case had never been encountered at Novartis, where, in the early nineties, the DNA of more than 5000 plants was analyzed (Gay P. unpublished data). Moreover, in an attempt to rescue such plasmids from Novartis maize DNA, A.Kahn (1996) showed that transgenic maize DNA treated with a restriction enzyme and further circularised by ligase treatment (deliberately making circular genetic element which could contain the cole1 origin), allows the rescue of a functional plasmid by electroporation of E.coli cells at a frequency of 10-9, while untreated DNA did not. These experiments did neither allow any rescue by exposure of competent E.coli to maize DNA. So even though the formation of plasmids in this case was identified as a possibility which would increase the chances of successful transfer of genes from the transgenic plant to bacteria, these data show that the chances of this happening in practice are extremely low. Conclusions on the fate of DNA in the environment Whether released in water, soil, in animal or human intestine, the proportion of plant DNA escaping degradation after release is small but most likely not insignificant. DNA degradation results in a decrease of the absolute amount of fragments bearing intact antibiotic resistance genes to an extent that the instant concentration of this DNA might become limiting to allow successful contact with transformable bacteria, in soil or in the digestive tract of animals and humans. It should be noted that the same environments include micro-organisms that are sources of the same antibiotic resistance genes present on circular plasmids that are by far better candidates for horizontal gene transfer than transgenic plant DNA. This means that if the use of antibiotics leads to the selection of resistant bacteria, the antibiotic resistance genes will be more likely to be acquired from these plasmid sources and not from horizontal gene transfer from the plant material to the bacteria. Transgenic plants carrying bacterial ampicillin or kanamycin resistance genes are therefore, based on the data given above, not a factor that significantly influences the frequency of these genes in resistance reservoirs Bacterial transformation For bacteria to become antibiotic resistant two requirements have to be fulfilled: (1) antibiotic resistance genes should be available, and (2) bacteria should be able to absorb these genes and express them. In the paragraphs above it is already shown that the npt-ii, bla TEM1, and hpt genes present in transgenic crops present only a minor contribution to the frequency of these genes in resistance reservoirs. In the following the second requirement is being discussed to determine the chances that the antibiotic resistance genes from transgenic plants are actually being taken up and expressed by bacteria in soil or in other biotopes. Horizontal Gene Flow 149

85 Bacterial transformation is crucial for the uptake and expression of DNA from the environment. Not all bacteria are known to be transformable. Lorenz and Wackernagel (1994) have listed more than 40 naturally transformable bacterial species. New species e.g. Escherichia coli and Ralstonia solanacearum (Bertolla et al., 1997), have since been added to this list and more will be added in the future. Transformation of bacteria involves the following steps. a) Competence: Competence is a state that allows bacteria to bind DNA with which they make contact and initiate the transfer of the DNA molecule into the cell. Competence is generally a developmentally regulated state. In the laboratory, the development of competence in several organisms is shown to be inducible under specific conditions, composition of the medium, population size, growth conditions etc. which seem to be hardly achievable under natural conditions. However laboratory experiments cannot pretend to mimic the broad variety of environments in which bacteria can develop, especially growth on solid supports, such as soil, plants or food particles. For example the founding paper of Griffith, F. (1928) shows that competence of Streptococcus pneumoniae can occur in the blood stream of a mouse. Also Ralstonia solanacearum can reach spontaneously a competent stage in the infected plants. Some bacterial species do not develop the competent state in nature though they can be transformed following some laboratory treatments that allow extra-cellular DNA to penetrate the cellmembranes. This is for instance the case for E.coli. b) DNA uptake: DNA binding by competent bacteria is followed by its uptake. In some cases, such as Haemophilus influenzae and Neisseria sp., DNA uptake involves the recognition of specific sequences. In other cases, including Bacillus subtilis or Streptococcus pneumoniae DNA of any origin can be taken up. DNA is taken up as single stranded DNA (Steward and Carlson 1986). The uptake of a given DNA sequence or gene will depend on the relative concentration of this gene or sequence among the DNA molecules surrounding the bacteria. In other terms DNA entry is subject to a competition between the molecules available in the environment of the cell. Antibiotic resistance marker genes are expected to be borne by fragments of a size of few kilobase pairs representing approximately a millionth of the plant genome and a smaller proportion of the overall DNA potentially available in the relevant environments. The dilution of the antibiotic resistance marker genes is thus likely to be a hurdle for their horizontal transfer. c) Stabilization of transforming DNA. Maintaining the incoming genes in the cell genome is likely to be the most critical step in bacterial DNA mediated transformation. It requires either the integration of the incoming single stranded DNA in the chromosome, in a resident plasmid or the reconstitution of an autonomous replicon. The integration of the incoming DNA in chromosomes or resident plasmids requires the existence of sequence homologies between the donor and the recipient cell DNA (de Vries and Wackernagel, 1998, Gebhard and Smalla 1998). The reconstitution of an autonomous replicon, e.g. a plasmid, in a recipient cell has more requirements. Firstly a strand complementary to the incoming single strand DNA-molecule should be synthesized. This requires a priming by a partial duplex. Therefore more than one DNA fragment originating from the transgenes has to be taken up. When this is achieved, this duplex sequence should be further replicated. This requires the inclusion 150 Safety of Genetically Engineered Crops

86 of an origin of replication that is recognized as such by the recipient bacterium. In the case of Novartis 176 Maize, the cole1 origin of replication would limit the replication of a reconstituted plasmid to Enterobacteriaceae, i.e. genera in which attempts to transfer plant antibiotic resistance marker genes by exposure of the cells to DNA actually failed (A. Kahn, 1996); Novartis application C/F/94/11-03; Schlüter et al., 1995). The uptake and expression of DNA by bacteria therefore involves a multiple step process in which each step can be a limiting factor in the actual success of the bacterium obtaining an antibiotic resistance. In the following an estimation will be given of the frequencies with which such transformation can succeed Approaches for the evaluation of DNA mediated transformation frequencies Smalla and coworkers quoted by Nielsen et al (1998) as well as Bertolla and Simonet (1997), have failed to detect any transfer of antibiotic resistance markers in soil bacteria, following the cultivation of either transgenic sugar beets or transgenic tobacco, while the genes could be isolated from soil. Plant DNA can be available for transformation in two different ways: as fragments of linear DNA, but perhaps in some exceptional cases also as plasmids. In the case of the Novartis 176 maize for instance the cole1 origin of replication is present, which means that a functional plasmid can be formed if the linear DNA containing the origin would circularize and close. Plasmids have far higher chance of transforming bacteria than linear DNA. This is why Novartis researchers have attempted to rescue a puc like functional plasmid from 176 maize DNA in competent Escherichiacoli cells. The attempt has failed. The results indicated that the probability of rescuing such a plasmid was at least times lower than rescuing a plasmid extracted from a bacterial culture. The experiments were reproduced by Kahn (1996) with the same result. Kahn also digested maize DNA with the restriction enzyme Xho1 that makes no cut in the 176 maize transgene and re-ligated the DNA. The mixture was electroporated in E.coli and one amp r transformant colony was obtained which, as shown by the analysis of the plasmid, undoubtedly derived from the maize DNA. Electroporation of native or sheared maize DNA, did not allow any rescue of an amp r plasmid. This means that in reality the formation of a closed plasmid in this case is the limiting factor. Schlüter et al (1995) attempted unsuccessfully to transfer an ampr gene (bla TEM1) present in transgenic potato in the enterobacterium Erwinia chrysanthemii. From an extrapolation of their data, they considered that the probability of such a transfer in nature is below 2x De Vries and Wackernagel (1998) as well as Gebhard and Smalla (1998) have designed constructs in Acinetobacter BD413 that allow the rescue of the nptii gene whether present in the DNA of transgenic crops, or in soil. The system is optimized in that sense that a) the strains include a large homology sequence with the nptii donor DNA, b) high levels of competence are achieved in vitro. Both publications report a rescue of the nptii gene present in transgenic plant DNA with transformation rates in the range of However, neither author could obtain any horizontal transfer of plant nptii genes in the original strain of Acinetobacter BD413. Interestingly De Vries and Wackernagel (1998) show that their technique allows a titration of any selectable gene in a natural extract, with an efficiency of approximately one transformant per 10 4 copies of the gene to be detected, that is an efficiency only a thousand fold lower than PCR, while less prone to artifacts. More Horizontal Gene Flow 151

87 recently, Wackernagel and De Vries (2000) showed that if the Acinetobacter acceptor culture does not include any homology with the donor DNA, no transformation can be detected meaning that the transformation frequency is less than despite the high level of competence of the culture. The case of silage Silage is an important way to store fresh maize and other forage crops. The whole plants are harvested prior to maturity, crushed and stored under anaerobic conditions. The ensiled material is subject to a fermentation mainly mediated by lactic bacteria resulting in few days in a drop of the ph that prevents the development of other bacteria and allows the conservation of the forage for the whole season. Novartis has shown that in ensiled maize DNA is heavily degraded likely due to the low ph. Preliminary studies by J. Heritage (personal communication) indicate that during the early stage of the fermentation process no stable transfer of the bla gene of Novartis maize could be detected in the streptococci that are responsible for the lactic fermentation of silage. Again if the bla gene is transferred, the frequency of the phenomenon is below the detection limits. Transformation rates Thanks to systems artificially designed to detect a transfer of plant antibiotic resistance genes in bacteria, the experiments of De Vries and Wackernagel (1998) and Gebhard and Smalla (1998) have shown that such a transfer is not impossible. The systems employed are however designed in such a way that the chances of transfer are several orders of magnitudes higher and do not represent the natural situations. The search for horizontal transfer of antibiotic resistance marker gene in soil bacteria under natural conditions has failed so far. It could not be found either in laboratory simulations of natural conditions, although in the laboratory, each of the steps required for DNA mediated transformation has been successfully achieved. The probability of the event to happen in nature is thus below the detection limits, that is below at least to per bacterium exposed to transforming DNA Conclusion Horizontal gene transfer of plant DNA to bacteria is very unlikely and has not been observed in nature. To be able to transform bacteria, the plant DNA first has to become available after decay of the plant material. It is proven that fragments of plant DNA can persist in the soil over longer periods of time and that fragments can be large enough to contain intact resistance genes. The antibiotic resistance genes that are released from the transgenic plants and persist in the soil only just add up to the enormous number of these genes that are already present in the resistance reservoir. For npt-ii, bla TEM1, and hpt these resistance reservoirs are quite large. An important difference between the resistance genes in the reservoir and the ones from the transgenic plants is that the genes in the reservoir are carried by easily transmissible plasmids, while the plant resistance genes are present on broken linear fragments. Plasmids can far more easily transform bacteria than the linear plant DNA. Estimates on the successful transformation of bacteria with linear plant DNA, which requires three different steps to be taken successfully are below It can be concluded that it is many factors more likely that a bacterium acquires an npt-ii, bla TEM1, or hpt gene from a plasmid present in the different resistance reservoirs than the chances of acquiring such a gene from a transgenic plant. 152 Safety of Genetically Engineered Crops

88 5. Horizontal Transfer of DNA Ingested by Mammals Based on the observations in the former chapter one cannot exclude that horizontal transfer of either amp r or kan r genes could occur in the rumen microflora. Large enough DNA fragments may be present and the steps necessary to achieve bacterial transformation are not impossible. The rumen environment is so complex that it can hardly be simulated in the laboratory, and even less subjected to direct investigations. It should be noted that in order to produce a number of amp r bacteria as high as the number already present in faeces, transformation rates in the overall population should be in the range of one in a hundred, a figure that cannot be seriously envisaged, because this would mean a factor of 10 6 better than the best transformation rates that can be achieved under optimized laboratory conditions. But nonetheless one has tried to determine the fate of DNA in the intestinal tract, among other things to see whether this DNA would transform the bacteria that are present in the intestinal tract. Schubbert, Doerfler and coworkers (1994, 1997, 1998) have fed mice with large amounts of double stranded DNA of the bacteriophage M13. Despite the fact that bacteriophage infection is an outstandingly powerful amplification system that could probably signal any single transformation event that would occur in Enterobacteriaceae, no M13 phages could be found in the faeces of the treated animals. This indicates that no potential M13 host present in the mice microflora had been transformed. From this we can infer that the ingestion of Novartis 176 maize is extremely unlikely to result in the transformation of gut commensal bacteria in man. This is even more so because, unlike in Schubbert et al. experiments, the maize derived ingredients in food have been subjected to various industrial processes that are expected to destroy most of the DNA. Nevertheless, transgenic crops like fruits or vegetables can also be eaten unprocessed and raw. Schubbert s and coworkers experiments however gave rather unexpected results. The authors found that M13 phage DNA fragments (most fragmenst between 200 and 400 basepairs) could be recovered in the mice faeces, in the blood stream and even integrated in some mice cells including cells of the foetuses borne by the pregnant female mice. Such fragments of course are too small to constitute functional genes like for instance antibiotic resistance genes. But, this finding opens a new and fascinating field of investigations regarding the potential mutagenic role of ingested DNA, and especially its potential carcinogenic role. Therefore the issue raised by the discoveries of Schubbert, Doerfler and collaborators is more relevant to determine the consequences of a random integration of the DNA fragments originating from the gut contents rather than the nature of the genes themselves. Horizontal Gene Flow 153

89 6. General Discussion The npt-ii and bla TEM1 genes, corresponding to resistance to the antibiotics kanamycin/neomycin and ampicillin/amoxicillin respectively, are the most important antibiotic resistance markers used in plant genetic engineering. The antibiotics kanamycin and neomycin are of no clinical importance. Ampicillin and amoxicillin are still used but the trend is downwards. Both resistance genes are present in very large amounts in natural resistance gene pools. The use of these genes in plant genetic engineering does not significantly contribute to these reservoirs of resistance genes. The horizontal gene transfer from plants to bacteria has never been observed under natural conditions. Also in the laboratory, providing better circumstances for the observation, no horizontal gene transfer has been observed. Only when the conditions of the experiment were manipulated with the goal to provoke transfer, horizontal gene transfer from plants to bacteria has been observed. Gebhard et Smalla, (1998) and De Vries et Wackernagel, (1998) have shown that plant DNA can actually transform cells of bacteria (in this case Acinetobactebacter sp.) provided the recipient strain has been engineered so it can rescue the nptii gene present in plant DNA. In the experimental system there was sequence homology between the plant DNA and bacterial DNA and there was selection pressure to favour uptake of the antibiotic resistance gene. When such homology and selection pressure is not present the chances of transfer are so low that they have not been observed. The data show especially that DNA of prokaryotic origin can transform bacteria irrespective of the fact that it is inserted in plant DNA. The arguments often heard in the debate referring to a specific status of plant DNA are therefore not valid and this also makes obsolete all considerations relating to the scarcity of horizontal gene transfer from plants to bacteria in the evolution. The transfer of plant (antibiotic resistance marker) genes to bacteria in the soil, in silage or in the digestive track of herbivores (including mankind) has to overcome a series of hurdles. Experimental approaches have demonstrated that each of the steps required by horizontal gene transfer can be achieved in nature. It is quite clear that the realization of each of them is the exception rather than the rule, so that their combination/succession can be regarded as a very highly improbable event. Unless a true case of spontaneous transfer of antibiotic markers genes from a plant to a bacterium was identified, the evaluation of the probability of such an event should rely on the orders of magnitudes indicated by negative data. Evaluations of the probability of the transfer of the plant resistance genes vary according to the authors. Avoiding extrapolations, we can safely state that the transformation frequencies in the absence of DNA homologies are below the experimental detection levels, i.e. below 10-11, per bacterium exposed to transforming DNA. If the transfer of the maize bla TEM1 gene of Novartis maize would occur with this frequency in soil, it would account for one billionth of the resistant bacteria already living in this environment, meaning that it would have strictly no impact on this important reservoir of ampicillin resistance. 154 Safety of Genetically Engineered Crops

90 Though the information about natural transformation of bacteria in the digestive track of mammals are scarce, (Schubbert et al. 1994, 1997, 1998; Mercer et al. 1999a, 1999b), based on the data described above, one can assume that the frequencies of exchange are in the same range as in soil, that is incommensurate with the importance of the already existing reservoirs of resistance. That the number of resistant bacteria that could be produced by horizontal transfer in the human gut could match the number of ampicillin and kanamycin resistant bacteria ingested with raw vegetables such as single salad (Corpet, 1988) is unthinkable. We have seen that the build-up of reservoirs requires horizontal transfer systems. While horizontal transfer by DNA mediated transformation is at least unlikely, bacteria are unfortunately well equipped to transfer plasmid borne resistance genes very efficiently by conjugation (Courvalin 1994). Unlike transformation, natural conjugation was found wherever it was looked for. No doubt that this is the origin of the dissemination of the bla TEM based ampicillin resistance in numerous pathogens as shown above. However we have also emphasized that the dissemination was made possible because of the existence of a strong selection by the use of the antibiotic. As stated above the horizontal transfer of antibiotic resistance genes present in transgenic crops is an issue that so far can be restricted to two cases, nptii and bla TEM1. Although the risks of the use of these antibiotic resistance markers in plant genetic engineering is extremely low, the discussions in the public arena, where often no distinction was made between the differences in risk levels of different antibiotic resistance markers, has led to development of alternative marker genes. It is likely that the use of antibiotic resistance markers in transgenic plants meant for commercial growth will be phased out. For laboratory purposes antibiotic resistance markers will probably stay important for a longer period. Alternatives to antibiotic resistance markers are the inducible isopentenyl transferase system developed by Chua (1999) and the mannose based system developed by Novartis. The latter is already in plants that are grown in field trials. Also systems are discussed in which it is possible to remove the marker after the successful transformation of the plant, for instance by using the cre-lox system (Koenig, 2000). But like for antibiotic resistance markers it is important that the safety of these alternatives is properly investigated. What could for instance the effects of cre-lox be when it outcrosses to the wild flora? The chances that these alternative markers or in fact any plant gene - are transferred to bacteria or to herbivores (including humans) are just as high as for antibiotic resistance markers. Many different steps have to be taken and the chances are extremely low. The difference between antibiotic resistance markers and other marker might however be that antibiotic resistance markers are more likely to be attained, as a result of selection pressure caused by the use of the antibiotic. Horizontal Gene Flow 155

91 7. Cases A. Case of the nptii gene The nptii gene is present in registered varieties of oil seed rape. It is likely to be present in further transgenic crops. This gene is responsible for the resistance to kanamycin and neomycin which are neither antibiotics of any clinical importance. As pointed out by Courvalin (1998) mutations could occur in the nptii gene borne by canola that would transform it in a nptiii like gene i.e. an amikacin resistance gene. The probability of a natural transfer of the plant genes to bacteria is so low that it cannot be measured. Therefore the impact of the mutations occurring in the plant nptii gene on the reservoir of amikacin resistance genes will be insignificant compared to the impact of the mutations of the nptii genes already present in bacteria which themselves have a lesser impact than nptiii genes. Therefore it is considered that horizontal transfer of the nptii gene from transgenic plants to bacteria does not cause any harm to mankind. The presence of this antibiotic resistance gene in transgenic crops has never been invoked by any expert group against the release of transgenic crops. B. Case of the bla TEM1 gene The bla TEM1 gene raises more passion since unlike aminoglycosides, ampicillin and β-lactams in general are most popular and symbolize the victory of modern medicine against diseases (see prior remarks). We have confirmed the analysis of the EU experts as well as other experts (see Antibiotic resistance via the food chain: Fiction or reality? (J. Shuman, ed.) Foundation for Nutritional Advancement, Boston MA) showing that the probability of horizontal transfer of the bla TEM1 gene present in maize cannot influence the frequency of the gene in existing reservoirs in a measurable proportion. Again the issue of the mutation of the maize bla marker gene giving rise to alleles that would cause resistance to the last generation of β-lactams is irrelevant, since those mutations are already abundant in the existing reservoirs, and since the possible contribution of maize to this evolution is limited to the horizontal transfer rate, meaning it is a billion times lower than the actual contribution of the already existing ampicillin resistant microflora. 156 Safety of Genetically Engineered Crops

92 8. References Amabile-Cuevas, C. F., and Chicurel M. E Bacterial plasmids and gene flux. Cell 70: American Society for Microbiology report of the ASM Task force on antibiotic resistance: Antimicrob. Agent Chemother (suppl.) 1-23 Arlet, G., and Philippon A., Les ß-lactamases : une évolution sous la contrainte. Médecine Thérapeutique HS1: Austin D. J., Kristinsson K. G., Anderson R. (1999) The relationship between the volume of antimicrobial consumption in human communities and the frequency of resistance PNAS; 96: Berche P. Les plantes transgéniques et la résistance aux antibiotiques. Médecine Thérapeutique 4 (9) : Bertolla and Simonet (1997) Potentialities for DNA transfer from plants to soil microorganisms. Nordic Seminar on antibiotic resistance marker genes and transgenic plants. June 12-13, Bertolla, F., Van Gijsegem, F., Nesme, X. and Simonet, P Conditions for natural transformation of Ralstonia solanacearum. Appl. Environ. Microbiol. 63(12) : Bertolla F, Simonet P Horizontal gene transfers in the environment: natural transformation as a putative process for gene transfers between transgenic plants and microorganisms. Res Microbiol 150(6): Betts R.F., Valenti W.M., Chapman S.W., Chonmaitree T., Mowrer G., Pincus P., et al. (1984). Five-year surveillance of aminoglycoside usage in a university hospital. Annals of Internal Medicine; 100: Calva, J. J., Sifuentes-Osornio, J. and Ceron. C Antimicrobial resistance in fecal flora: Longitudinal community-based surveillance of children from urban Mexico. Antimicrob. Agents Chemother. 40: Chua, et al., 1999, Inducible isopentenyl transferase as a high-efficiency marker for plant transformation, Nature Biotechnology, 17, sept 1999 : 916 Corpet D.E Antibiotic resistance from food. N Engl J Med 5;318(18): Courvalin P Transfer of antibiotic resistance genes between Gram-positive and Gram-negative bacteria. Antimicrob Agents Chemother 38: Courvalin P Plantes transgéniques et antibiotiques. La Recherche 309 : Courvalin P. and Acar J. (1998) : La fin de l âge d or des antibiotiques, La Recherche, 1998, 314:50-52) DANMAP Report Consumption of antimicrobial agents and occurrence of antimicrobial resistance in bacteria from food animals, food and humans in Denmark. Danish Zoonosis Centre, Bulowsvej 27, DK-1790, Copenhagen V, Denmark. Davies J 1994 Inactivation of antibiotics and the dissemination of resistance genes, Science 264 (5157): De Vries, J. and Wackernagel, W Detection of npt II (kanamycin resistance) gene in genomes of transgenic plants by marker-rescue transformation. Mol. Gen. genet. 257 : Foster, R.C Microenvironments of soil microorganisms. Biology and fertility of soils. 6: Gebhard, F.and Smalla, K Transformation of Acinetobacter sp. BD413 by transgenic sugar beet DNA. Appl. Env. Microbiol. 64(4) : Griffith, F The significance of pneumococcal types. J. Hyg. 27 : Kahn A (data presented at the joint SCAN/SCF meeting, Brussels, December 6, 1996) Kocabiyik, S., and. Perlin M. H Altered substrate specificity by substitutions at Tyr218 in bacterial aminoglycoside 3' - phosphotransferase-ii. FEMS Microbiol. Lett. 93: Koenig, A, 2000, Development and biosafety aspects of transgene excision methods, In: Proceedings of the 6th International Symposium on The Biosafety of Genetically Modified Organisms, July 2000, Saskatoon, Canada. Kumin C.M Resistance to anti-microbial drugs. A worldwide calamity. Annals Intl Med 118: ) Kunkel T., Niu QW, Chan YS and Chua NH Inducible isopentenyl transferase as a high-efficiency marker for plant transformation. Nature Biotechnology 17: Horizontal Gene Flow 157

93 Leff, L. G., J. R. Dana, J. V. McArthur, and L. J. Shimkets Detection of Tn5-like sequences in kanamycin-resistant stream bacteria and environmental DNA. Appl. Environ. Microbiol. 59: Livermore DM, 1995 _ lactamase in laboratory and clinical resistance, Clin. Microbiol. Rev., ). Lorenz, M. G. and Wackernagel, W DNA binding to various clay minerals and retarded enzymatic degradation of DANN in sand/clay microcosm, p , in M.J. Gauthier (ed.) Gene transfers and environment. Springer Verlag KG. Berlin. Lorenz, M. G. and Wackernagel, W Bacterial gene transfer by genetic transformation in the environment. Microbiol. Rev. 58 : Mazodier P, Davies J Gene transfer between distantly related bacteria. Annu Rev Genet;25: McKeon, D. M., J.P.Calabrese, and G. K. Bissonnette Antibiotic resistant gram-negative bacteria in rural groundwater supplies. Water Res. 29: ). Medeiros, A. A Evolution and dissemination of ß-lactamases accelerated by generations of ß-lactam antibiotics. Clin. Infect. Dis. 24: S Mercer DK, Scott KP, Bruce-Johnson WA, Glover LA, Flint HJ, 1999a. Fate of free DNA and transformation of the oral bacterium Streptococcus gordonii DL1 by plasmid DNA in human saliva Appl Environ Microbiol ;65(1):6-10 Mercer DK, Melville CM, Scott KP, Flint HJ, 1999b. Natural genetic transformation in the rumen bacterium Streptococcus bovis JB1. FEMS Microbiol Lett 15;179(2): Miller GH, Sabatelli FJ, Hare RS, Glupczynski Y, Mackey P, Shlaes D, Shimizu K, Shaw KJ The most frequent aminoglycoside resistance mechanisms--changes with time and geographic area: a reflection of aminoglycoside usage patterns? Aminoglycoside Resistance Study Groups Clin Infect Dis ;24 Suppl 1:S46-62 Nguyen-the C;, Carlin F The microbiology of minimally processed fresh fruits and vegetables. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 34: Nielsen KM, Bones AM, Smalla K, van Elsas JD Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event? FEMS Microbiol Rev 22(2): Nordmann P, Naas T, Labia R., New trends in enterobacterial ß-lactamases. APUA Newslett.; 12: 1-4 Paget, E., Jocteur Monrozier, L. and Simonet, P Adsorption of DNA on clay minerals : protection against DNase I and influence on gene transfer. FEMS Microbiol. Lett. 97 : Paul, W.J., Jeffrey, W. H., David, A. W., De Flaun, M. F. and Cazares, L. H Turnover of extracellular DNA in eutrophic and oligotrophic freshwater environments of Southwest Florida. Appl. Environ. Microbiol. 55 : Pear S.M., Williamson T.H., Bettin K.M., Gerding D.N, Galgiani J.N. (1994).Decrease in nosocomial Clostridium difficile-associated diarrhea by restricting clindamycin use. Annals of Internal Medicine ; 120: Privalle L.S, et al, (2000), Phosphomannose isomerase a novel system for plant selection, in: the proceedings of the 6th symposium on the biosafety of genetically modified organisms, July 2000, Saskatoon, Canada. Romanovski, G., Lorenz, M.G. and Wackernagel, W Plasmid DNA in a groundwater aquifer microcosm-adsorption, DNase resistant and natural genetic of Bacillus subtilis. Mol. Biol. Ecol. 2 : Schlüter, K., Fütterer, J. and Potrycus, I Horizontal gene transfer from transgenic potatoe line to a bacterial pathogen (Erwinia chrysanthemi) occurs-if at all- at an extremely low frequency. Biotechnology. 13 : Schubbert R., Lettmann C. and Doerfler W. (1994). Ingested foreign (phage M13) DNA survives transiently in the gastrointestinal tract and enters the bloodstream of mice. Mol. Gen. Genet. 242, Schubbert R., Renz D., Schmitz B. and Doerfler W. (1997). Foreign (M13) DNA ingested by mice reaches peripheral leukocytes, spleen, and liver via the intestinal wall mucosa and can be covalently linked to mouse DNA. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 94, Schubbert R, Hohlweg U, Renz D, Doerfler W On the fate of orally ingested foreign DNA in mice: chromosomal association and placental transmission to the foetus. Mol Gen Genet 259(6): Seppala H., Klaukka T., Vuopio-Vakila J., Muotiala A., Helenius H., Lage K., Huovinen P. (1997). The effects of changes in the consumption of macrolide antibiotics on erythromycin resistance in group A streptococci in Finland. New England Journal of Medicine; 337: Smalla, K., L. S. van Overbeek, R. Pukall, and J. D. van Elsas. (1993). Prevalence of nptii and Tn5 in kanamycin resistant bacteria from different environments. FEMS Microbiol. Ecol. 13: Stein JC and Hansen G (1999) Mannose induces an endonuclease responsible for DNA ladering in plant. Plant physiol, 121: Stewart G.J. and Carlson C.A. (1986) The biology of natural transformation. Ann. Rev. Microbiol. 40: Stanier RY, Ingraham JL, Wheelis ML, Painter PR, 1987, General Microbiology, MacMillan Education LTD). 158 Safety of Genetically Engineered Crops

94 Syvanen M, In search of horizontal gene transfer Nature Biotechnology 17:833 Trieu-Cuot P, Courvalin P 1983 Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III. Gene;23(3): ZKBS, Stellungnahme der ZKBS zur Biologischen Sicherheit von Antibiotika-Resistenzgenen im Genom gentechnisch veränderten Pflanzen, Juli Horizontal Gene Flow 159

95 Annex1: Referees We hereby show our gratitude to the following persons who during the conception of this report have made valuable comments to parts of this report. Detlef Bartsch, RWTH Aachen, Aachen, Germany Carsten Bindslev-Jensen, Odense University Hospital, Odense, Denmark Willem Brandenburg, Plant Research International, Wageningen, The Netherlands Andrew Chesson, Rowett Research Institute, Aberdeen, Scotland Harry Kuiper, RIKILT-DLO, Wageningen, The Netherlands Susan MacIntosh, Aventis Crop Science, Des Moines, USA Mike Syvanen, Medical Microbiology and Immunology, University of California, Davis, USA Steve Taylor, University of Nebraska, Dept. of Food Science & Technology, Lincoln, Nebraska, USA Wilfried Wackernagel, Oldenburg University, Oldenburg, Germany 160 Safety of Genetically Engineered Crops

96 Bijlage 13 Antibiotic resistance markers in GM crops. Briefing paper of the European Federation of Biotechnology Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Juliette Wytsmanstraat, 14 - B 1050 Brussel - BELGIE Tel: Fax: helpsbb@sbb.ihe.be Web server: WIV/1520/SR/ Bijlagen

97 Antibiotic Resistance Markers in Genetically Modified (GM) Crops EUROPEAN FEDERATION of BIOTECHNOLOGY TASK GROUP ON PUBLIC PERCEPTIONS OF BIOTECHNOLOGY What are they and why are they used? The regulatory framework for the safety assessment of GM crops Risk assessment of antibiotic resistance genes in GM crops Are there alternatives and can they be removed? The use of marker genes for resistance to certain antibiotics in the development of genetically modified (GM) crops has given rise to considerable public concern. This briefing paper reviews what they are and why they are used, how the safety of GM crops is regulated and the possible alternatives to their use. The overall aim is to provide balanced information and advance public debate. This paper results from the combined contributions of scientists, industrialists, and governmental and public interest organisations across Europe. It is intended to provide information and does not represent the views or policy of the European Federation of Biotechnology or any other body. Introduction The combination of antibiotic resistance genes and antibiotic is an important tool in genetic engineering in general and in plant biotechnology in particular. A key task in genetic engineering is the identification and selection of cells into which a new gene has been introduced. Antibiotic resistance genes have the ability to selectively inactivate certain antibiotics and consequently protect cells against these antibiotics. An antibiotic resistance gene can thus be used to tag a gene carrying a trait or characteristic of interest. In practice the antibiotic gene is linked to a gene carrying the trait of interest prior to its introduction into the recipient cells, whether of bacterial, yeast, plant or animal origin. These cells are then incubated in the presence of the antibiotic. The only cells which multiply under these conditions are the ones that have incorporated the antibiotic resistance gene together with the trait of interest. The identification of the transgenic cells would be extremely tedious, and even impossible, without this selection procedure since only a very small fraction of the cell population incorporates the introduced genes (one out of several thousands of cells). A selection procedure is a necessity in genetic engineering, and this is the reason why antibiotic resistance genes have been so widely use in many different areas of biotechnology for a number of years. Recent approvals for the commercialisation of GM crops containing antibiotic resistance markers have raised concern in Europe about the risk of spreading antibiotic resistance genes to previously unsusceptible microbes and hence making them resistant to the antibiotics used. Public concern about this topic is widespread and the issue is repeatedly raised in the media. As a consequence governments in the European Union have recommended phasing out GM crops containing antibiotic resistance markers contrary to the recommendations of several national and European scientific committees. What are they and why are they used? Antibiotics and antibiotic resistance in nature Bacteria are microbes that are present everywhere in the environment and in plants and animals. We are permanently exposed to them, for example, ingesting them with our food. Microbes occupying the same habitat compete for nutrients and for their own survival some have evolved naturally to produce antibiotics to eliminate their competitors. Antibiotics inhibit a cell s growth by blocking some of its essential metabolic processes. Bacterial strains producing a given antibiotic therefore have to carry resistance to inactivate the corresponding antibiotic and thus prevent its own self-destruction. In the evolutionary race between microbes the production of new antibiotics is usually countered through the development of resistance mechanisms both by producing- and target-organism. There is in nature a wide range of antibiotic and corresponding antibiotic genes. However, rather than developing their own resistance mechanisms, targeted bacteria will in general acquire antibiotic resistance genes which are already present in the bacterial pool surrounding them. This is facilitated due to the fact that bacteria are generally quite promiscuous about exchanging genetic material between each other. The presence of an antibiotic confers an advantage to a resistant bacterium and so under these conditions resistance development and spread increases. The discovery of antibiotic action against disease-causing agents at beginning of the 20th INFORMATION For further information concerning Briefing Papers and other publications and activities of the European Federation of Biotechnology, Task Group on Public Perceptions of Biotechnology, contact: Prof Dr Richard Braun (chairman) Bio-Link Enggisteinstraße 19 CH-3076 Worb Tel & fax: rdbraun@bluewin.ch Dr David J Bennett (secretary) Secretariat, EFB TGPPB Oude Delft 60 NL-2611 CD Delft Tel: Fax: efb.cbc@tnw.tudelft.nl Copyright EFB Task Group on Public Perceptions of Biotechnology, This Briefing Paper is intended for information and does not represent the views of the European Federation of Biotechnology or any other body. This publication may be reproduced for the purposes of research or study only, with due acknowledgement of the copyright owner and a notice in terms of this notice. No part may otherwise be reproduced without the permission of the copyright owner. The Task Group gratefully acknowledges the continuing support and funding of the European Commission, Research Directorate-General, for this and other issues. Briefing paper 10 September 2001