Colofon. Datu a Mole ula Solutio s BV. Postadres la oratoriu : t.a.. Datu a NCB. Ge estigd te:

Transcriptie

1 e DNA o de zoek aa ate spits uis e oo dse oel uis I opd a ht a Wate p oef

2 Colofon Titel Tekst, foto's e sa e stelli g I opd a ht a Naa opd a htge e Rappo t u e Datu ople e i g appo t Aa tal pagi a's Wijze a ite e La o ato iu a alist e DNA o de zoek aa ate spits uis e oo dse oel uis K. a Bo ho e Wate p oef T. G oe e ege okto e a Bo ho e K.. e DNA o de zoek aa ate spits uis e oo dse oel uis. Rappo t RA, Datu a, Wage i ge J. Rook Datu a Mole ula Solutio s BV Ge estigd te: Joha Buziaust aat NR Wage i ge Nede la d Postadres la oratoriu : t.a.. Datu a NCB S l ius eg BE, Leide Nede la d.datu a. l kees a o ho e@datu a. l

3 Inhoudsopgave. Doelstelli g.... Methode.... Sa pli g.... La o ato iu a al se.... K aliteits aa o gi g..... Hoe als positie e aa e i ge oo ko e o de..... Hoe als egatie e aa e i ge oo ko e o de.... Resultate...

4 1. Doelstelling Vaststelle a de aa - of af ezigheid a edna a ate spits uis Neo ys fodie s i ate sa ples e oo dse oel uis Mi rotus oe o o us uit keutels i opd a ht a Wate p oef. 2. Methode 2.1 Sampling De e o ste i g is uitge oe d doo Wate p oef i sa e e ki g et Datu a. 2.2 Laboratorium analyse De ode sa ples zij gea al see d op de aa ezigheid a edna a ate spits uis, de keutels zij gea al see d op de aa ezigheid a DNA a oo dse oel uis. Het a al se e a ee DNA sa ples i dt plaats i d ie stappe. Ee st o dt het edna a ee ode sa ple ge o e t ee d i ee pellet daa a olgt ee e t a tie et ee Qiage Blood & Tissue kit. Bij ee keutel o dt het DNA gezui e d e ge o e t ee d et ehulp a de Qiage Stool kit. Ve olge s o dt ee o t ole a al se uitge oe d o te teste of e DNA dete tie i ee sa ple e e tueel geï hi ee d o dt doo sto e de stoffe. Te slotte o dt het edna gedete tee d et ehulp a ee eal-ti e ua titati e PCR. 1. Het edna uit de ode sa ples is geë t ahee d et ehulp a de Qiage Blood & Tissue kit. Het DNA uit de keutels is is geë t ahee d et ehulp a de Qiage Stool kit. Sto e de stoffe als hu uszu e ku e dete tie a het edna i hi e e at ka leide tot als egatief esultaat. Gedu e de de e t a tie zij deze i hi e e de stoffe zo eel ogelijk e ijde d. 2. E is ee o t ole uitge oe d o a te gaa of edna dete tie i ee sa ple geï hi ee d o dt. Dit is gedaa doo ee eke de hoe eelheid a ee f ag e t a tifi ieel DNA toe te oege. Ve olge s is de o e t atie a dit f ag e t a tifi ieel DNA ge ete. Dit is zo el gedaa i ee ea tie aa ee hoe eelheid sa ple aa toege oegd is, als i ee ea tie aa gee sa ple aa toege oegd is. Als DNA dete tie i ee sa ple geï hi ee d o dt, da is de ge ete o e t atie a tifi ieel DNA i de ea tie aa i sa ple toege oegd o dt lage te opzi hte a de ea tie aa aa gee sa ple toege oegd is. Voo a elijk i zuu ate, aa i eel o ga is he deeltjes aa ezig zij ka i hi itie opt ede. I ee de gelijk ge al o dt ee e t a zui e i gsstap uitge oe d of o dt het sa ple e du d. Ve olge s o dt op ieu gekeke of de i hi e e de stoffe oldoe de e ijde d zij. 3. Dete tie a edna i dt plaats doo iddel a ee eal-ti e k a titatie e PCR PCR. Het p i ipe a hte deze te h iek is dat ee spe ifiek deel a het DNA zee aak e e ig uldigd gea plifi ee d o dt. Datu a aakt ge uik a soo t-spe ifieke p i e s die uitsluite d DNA a de doelsoo t e e ig uldige. Bo e die o dt ee soo t-spe ifieke p o e ge uikt ee soo t p i e die uitsluite d i dt aa edna a de doelsoo t. Bi di g a de p o e aa het e e ig uldigde edna a de doelsoo t e oo zaakt ee fluo es e t sig aal. Dit sig aal o dt gedete tee d et ehulp a ee PCR platfo CFX Tou h TM a Bio-Rad. De PCR dete tie o dt uitge oe d et epli a's. Het aa tal positie e epli a's is ee i di atie oo de o e t atie edna. Het is e hte oo als og iet ogelijk o op asis a de o e t atie a edna de populatiedi htheid te epale. De PCR dete tie o dt uitge oe d et de Ta Ma E i o e tal Maste i. Life Te h ologies. Naast het edna sa ple o de PCR ea ties uitge oe d aa aa gee sa ple is toege oegd. Deze oete egatief zij. )odoe de ka e estigd o de dat de a al se s hoo is uitge oe d e e gee o ta i atie opt eedt. Te slotte o de ook e kele ea ties gea al see d aa aa ee eke de o e t atie DNA is toege oegd. Deze ea ties oete positief zij. Dit e estigt dat de a al se juist is uitge oe d.

5 2.3 Kwaliteitswaarborging Hoe vals positieve waarnemingen voorkomen worden Het opt ede a zo el als positie e als als egatie e aa e i ge o dt tot het i i u epe kt. Vals positie e aa e i ge ku e op d ie a ie e o tstaa : De ge uikte p i e s e de p o e zij iet spe ifiek; E i dt o ta i atie plaats i het la o ato iu ; E i dt o ta i atie plaats i het eld. Hie o de o dt aa gege e hoe als positie e aa e i ge oo ko e o de. O dat de ka s op als positie e aa e i ge zee klei is, ku e e iet e a t k a tifi e e hoe g oot de ka s daad e kelijk is. Datu a ka daa o iet % zeke ga a de e dat als positie e aa e i ge ooit opt ede. I de p aktijk iddels alidatie studies e e e e hte gee als positie e aa e i ge aa. Het is daa o aa e elijk dat als positie e aa e i ge iet opt ede. Hoe het optrede als positie e aar e i ge oorko e ordt door degelijk o t erp e alidatie a spe ifieke pri ers e pro es: 1. E o dt ge uik ge aakt a ee -staps PCR p oto ol, hetgee de ka s op aspe ifieke dete tie e klei t; 2. Ge uik a zee spe ifieke p i e s aa ee uitsluite d edna a de doelsoo t gedete tee d ka o de. De p i e s zij o t ikkeld et ehulp a spe ialistis he soft a e; 3. Ee PCR dete tie o dt uitge oe d et ehulp a ee zee spe ifieke p o e. Deze p o e he ht uitsluite d aa DNA a de doelsoo t, hetgee esultee t i ee fluo es e t sig aal; 4. De p i e s e de p o e zij i het la o ato iu getest. Ee st is getest of de PCR dete tie i de daad egatief esultaat geeft a het toe oege a DNA a e a te soo te ; Ve olge s is de ethode ge alidee d doo het teste a eldsa ples. E zij edna sa ples e za eld op lo aties aa de doelsoo t iet oo ko t. E e d gee edna gedete tee d i deze sa ples. )odoe de ko aa getoo d o de dat de ethode iet esultee t i positie e dete tie als de doelsoo t iet aa ezig is. O als positie e aar e i ge te oorko e erkt Datura i ee spe ifiek oor e DNA i geri ht la oratoriu o ge i g e orde strikte pro edures ge olgd: 1. Ve s hille de o de dele a de a al se o kflo o de uitge oe d i f siek ges heide la o ato iu ui tes. Het sa e stelle a de edna sa ple kits e het oo e eide a de PCR eage tia i dt plaats i ee DNA lea oo. Dit is ee ui te aa i gee DNA sa ples aa ezig zij. )odoe de ku e e ga a de e dat e gee DNA aa ezig is i de edna sa ple kits e de eage tia zoals de p i e s e p o es die late ge uikt o de i de edna a al ses. Het e t ahe e a de edna sa ples ge eu t i ee p e-pcr la o ato iu. Dit is ee ui te aa i uitsluite d lage o e t aties DNA aa ezig zij. Ve olge s o de hie de edna sa ples sa e et de PCR eage tia i ee - ell plaat gepipettee d. Deze plaat o dt lu htdi ht afgeslote. Te slotte o dt de PCR uitge oe d i ee post-pcr la o ato iu. I dit la o ato iu o dt het edna e ee de d e hie zij dus hoge o e t aties DNA aa ezig.

6 O als positie e aar e i ge te oorko e erkt Datura i ee spe ifiek oor edna i geri ht la oratoriu o ge i g e orde strikte pro edures ge olgd: 2. E o dt ee u idi e tio ele o kflo geha tee d o o ta i atie a de DNA lea oo e het p e-pcr la o ato iu te oo ko e. Dit houdt i dat ate iale die ee aal i het post-pcr la o ato iu ge eest zij iet ee te ug oge aa de DNA lea oo e het p e-pcr la o ato iu. Ook oge ede e ke s a Datu a iet dezelfde dag a ee post-pcr la o ato iu te ug aa de DNA lea oo e het p e-pcr la o ato iu. 3. I iede e a al se o de o t ole a al ses uitge oe d. )o o de e sa ples geë t ahee d aa aa gee sloot ate o dt toege oegd zoge aa de e t a tie o t oles. I de PCR o de aast de e t a tie o t oles ook egatie e PCR o t oles eege o e. )odoe de ka heel au keu ig ge o ito d o de of e i de daad gee o ta i atie opt eed. O o ta i atie i het eld te oorko e orde de olge de aatregele ge o e : 1. Het sa pli g p oto ol a Datu a o dt ge olgd. Dit p oto ol s h ijft ee spe ifieke e k ijze oo. I de p aktijk is ge leke dat e gee o ta i atie plaats i dt als dit p oto ol ge olgd o dt; 2. E die t eke i g gehoude te o de et ate e plaatsi ge. De sa pli g o dt daa o uitge oe d op ee o e t dat e ei ig st o i g is. )o o de edna sa ples iet e za eld di e t a he ige ege al. Ook o dt e eke i g gehoude et ku st atig opge ekte st o i g, ij oo eeld ij isseli g a zo e - aa i te peil Hoe vals negatieve waarnemingen voorkomen worden Naast als positie e aa e i ge ku e ook als egatie e aa e i ge opt ede. Daa aast is uit di e se alidatie studies ge leke dat het edna i so ige ge alle iet gedete tee d o dt, ook al is de doelsoo t el aa ezig. Maat egele die ge o e o de o als egatie e aa e i ge te oo ko e : 1. Voo ee ode sa ple o de i i aal su sa ples e za eld. Hie ee o dt de ka s e g oot dat edna i het sa ple te e ht ko t. 2. Ee zee ge oelige PCR dete tie o dt uitge oe d et ehulp a epli a s. Wa ee i de epli a's uitge oe d o de ka e i de ge oelig gedete tee d o de. Mee da PCR epli a's leidt e hte iet tot ge oelige e dete tie; 3. Ge uik a ee zee ko te e ke a a i aal asepaa ; 4. Va iede sa ple o dt astgesteld of de PCR dete tie geï hi ee d o dt doo sto e de stoffe. I die dit het ge al is o dt e ee e t a zui e i gstap uitge oe d. Ve olge s o dt og aals getest of e i de daad gee i hi itie ee opt eedt zie ethode oo ee uitge eide e es h ij i g ; 5. E o dt altijd ee positie e o t ole ea tie a doelsoo t DNA eege o e i de PCR dete tie. Deze o t ole ea tie oet altijd esulte e i positie e dete tie. Ook als alle sa ples egatief zij, ka zodoe de astgesteld o de dat de dete tie juist is uitge oe d.

7 3. Resultaten I éé a de op ate spits uis geteste ate sa ples is edna a ate spits uis aa getoo d, oo dse oel uis e d i t ee sa ples aa getoo d ta el. E is gee a plifi atie aa ge o e i de egatie e o t ole ea ties aa gee sa ple aa toege oegd is. De positie e o t ole ea ties aa DNA uit eefsel a de doelsoo t aa toege oegd is e d aa e a hti g el gea plifi ee d. Dit geeft aa dat de a al se juist is uitge oe d. Hu uszu e ku e ee PCR ea tie i hi e e at ka leide tot als egatief esultaat. Daa o o dt altijd ee i te e o t ole ee gea al see d o ast te stelle of e sp ake is a i hi itie. E e d gee sig ifi a te af ijki g ge o de i de C - aa de a de i te e o t oles aa ee sa ple aa toege oegd is te opzi hte a de ea ties aa gee sa ple aa toege oegd is. E as i dit ge al da ook gee sp ake a i hi itie. Sa e atte d, de edna a al ses zij et su es uitge oe d. I éé ate sa ple is edna a ate spits uis aa getoo d e i t ee keutelsa ples DNA a oo dse oel uis. Ta el 1. Resultate a edna a alyse. Sa ple u e Aa tal positie e ea ties ate spits uis Aa tal positie e ea ties oo dse oel uis / NVT / NVT NVT / NVT / NVT /