Consensusprotocol voor cytologisch en immunofenotyperingsonderzoek op BAL materiaal In het kader van interstitiële longziekten Juni 2008

Transcriptie

1 Consensusprotocol voor cytologisch en immunofenotyperingsonderzoek op BAL materiaal In het kader van interstitiële longziekten Juni 2008 Opgesteld in naam van de BAL-werkgroep Nederland, door Anke Claessen, Ingrid van Hoogstraten en Ellen van Lochem. Inleiding 1.1 Doel Dit protocol beschrijft een methode voor isolatie en analyse (morfologisch en flowcytometrisch immunofenotyperingsonderzoek) van cellen uit de Broncho-Aveolaire Lavage (BAL) vloeistof. Onderzoek van BAL vloeistof kan een bijdrage leveren aan de differentiatie van de verschillende ziektebeelden binnen de groep van interstitiële longziekten. De drie meest voorkomende interstitiële longziekten zijn sarcoïdose, idiopathische pulmonale fibrose (IPF) en extrinsieke allergische alveolitis (EAA). Voor de diagnostiek wordt de BAL vloeistof onderzocht op celaantal, celdifferentiatie, relatieve omvang van de lymfocytenpopulatie en lymfocyten subpopulatie verdeling. Voor een goede interpretatie van de resultaten is het van belang dat bij onderzoek naar lymfocyten subpopulaties in BAL gelijktijdig bloed onderzocht wordt. 1.2 Principe BAL-vloeistof wordt verkregen door de bronchoalveolaire ruimte meerdere malen te laveren met fysiologische zoutoplossing. De cellen die daarmee worden opgezogen bevinden zich in een eiwitarm medium en kunnen lyseren en/of adhereren aan de wand van de opvangfles. Om adherentie aan de wand van de buis tegen te gaan wordt gesiliconiseerd glaswerk of polypropyleenflesjes gebruikt en wordt het materiaal direct - op ijs - naar het lab vervoerd. In de BAL van gezonde personen worden o.h.a. weinig leukocyten aangetoond. Isolatie van cellen uit de BAL-vloeistof vindt plaats voor morfologische differentiatie en flowcytometrisch immunofenotyperingsonderzoek. Karakterisering van de verschillende leukocyten is gebaseerd op morfologie en cytologische kleuringen en analyse van de lymfocyten subpopulatie is gebaseerd op het aantonen van specifieke eiwitten of glycoproteïnen (antigenen/markers) die op de celmembraan tot expressie worden gebracht of intracellulair voorkomen. Voor de morfologische differentiatie worden cytospinpreparaten gemaakt van de celsuspensies. Deze worden na een May Grünwald Giemsa (MGG) kleuring, beoordeeld. Voor de detectie van leukocyten antigenen/markers wordt gebruikt gemaakt van direct geconjugeerde monoklonale antistoffen. Door gebruik te maken van antistoffen met verschillende fluorochromen is gelijktijdige detectie van meerdere subpopulaties in een suspensie of van meerdere antigenen op een cel mogelijk. 2. Monstername 2.1 Afname van de BAL-vloeistof De bronchoalveolaire lavage wordt verricht na premedicatie volgens lokaal protocol. Er wordt gelaveerd met minimaal 100 ml (vaak 2-4 x 50ml) steriele fysiologische zoutoplossing of PBS. De lavage wordt opgevangen in gesiliconiseerde glazen flessen of flessen van polypropyleen. De eerste fractie dient apart te worden gehouden aangezien deze niet representief is voor de diepere luchtwegen.

2 Voor morfologisch en flowcytometrisch imuunofenotyperingsonderzoek kunnen de 2e en volgende fracties gepoold worden. Zet de BAL-vloeistof direct na afname op ijs en verwerk deze binnen max. 4 uur na afname. Immunofenotyperingsonderzoek van lymfocyten subpopulaties in BAL-vloeistof gaat gepaard met dezelfde typering in perifeer bloed. Dit verhoogt de sensitiviteit bij de vraagstellingen sarcoïdose, EAA [Heron et al., 2008]. 2.2 Afname van het bloed Er wordt vóór het toedienen van de premedicatie, dus vóór de lavage 1 buis (4-7ml) Li-heparine bloed afgenomen (K3-EDTA kan ook). Het bloed dient binnen 24 uur na afname bewerkt te worden. 3. Uitvoering 3.1 Bewerking BAL Houd de BAL en de PBS/BSA minimaal 0,1% steeds op smeltend ijs (0 C). Bepaal het volume van de BAL-vloeistof (ml) en noteer het aspect: Kleur Homogeniciteit Slijm Filtreer de BAL-vloeistof om slijm te verwijderen. Gebruik hiervoor een zacht filter (minimale poriegrootte µm). Centrifugeer 10 min 490 ±100 xg (4 o C). Zuig supernatant af en beoordeel het aspect van het celpellet (kleur). Lyseer eventueel aanwezige erytrocyten volgens een lokaal gangbare methode (NH 4 CL of een commerciële lyseervloeistof). Pool de celpellets in één buis. Was de cellen 2x met PBS/minimaal 0,1% BSA. Centrifugeer 5 min, 491xg (4 o C). Zuig de wasvloeistof na de laatste wasstap secuur af. Neem het celpellet op in een bekend volume PBS/minimaal 0,1% BSA, (b.v. 1-4 ml). Bepaal de totale celopbrengst en het percentage lymfocyten m.b.v. een celteller of microscoop (m.b.v Türk-oplossing, telkamer). Breng voor het maken van cytocentrifuge preparaten de celsuspensie op een concentratie van 0,5-1x10 6 /ml. Indien er >10% lymfocyten of een verhoogd aantal leukocyten (> ^6/L) aanwezig zijn, zet het immunofenotyperingsonderzoek van de uit de BAL verkregen celsuspensie en het bloed in. Breng hiervoor cellen op concentratie van 5 x 10 6 cellen/ml in PBS/BSA 0,5%. Bij <10% lymfocyten en een niet verhoogd aantal leukocyten is er geen sprake van een lymfocytose en is lymfocytensubset analyse niet zinvol. 3.2 Morfologische analyse (Cytocentrifuge preparaten) Bereiding cytospincentrifuge preparaten Maak 5-6 cytospin preparaten van een suspensie met een concentratie van 0,5-1 x 10 6 ml in PBS/BSA 0,1-0,5%. Voorzie objectiefglaasjes van naam, datum en materiaalcode. Plaats de glaasjes in de cytospincentrifuge (matrand boven, beschreven kant naar de opening van het cupje). Plaats cytospin-filtreerpapier tussen objectglaasje en cupje. Draai de glaasjes voor met 50 µl PBS/ 0,1-0,5%BSA. Pipetteer in de cupjes 50 µl celsuspensie (celconcentratie 0.5*10 6 ).

3 Centrifugeer 3 min rpm. Haal de cytospinpreparaten direct na het centrifugeren uit het apparaat. Laat de preparaten aan de lucht drogen. Beoordeel de kwaliteit van de gemaakte preparaten m.b.v. de lichtmicroscoop Beoordeling cytocentrifuge preparaten De glaasje worden gekleurd m.b.v. een MayGrünwald Giemsa kleuring waarna er minimaal 300 cellen worden geteld. Hieruit wordt het % neutrofiele granulocyten, eosinofiele granulocyten, mestcellen, plasmacellen, lymfocyten en macrofagen bepaald. Deze getallen worden later vergeleken met de uitslagen van het immunofenotyperingsonderzoek. Beoordeel in ieder geval de volgende aspecten: fagocytose afwijkingen in het algemeen specifieke afwijkingen zoals aanwezigheid van: epitheel (plaveisel- en/of trilhaarepitheel) (veel) bacteriën asbestlichaampjes schuimmacrofagen rozetvorming van lymfocyten rondom macrofagen maligne cellen (of cellen die verdacht zijn) 3.3 Immunofenotyperingsonderzoek Minimaal inzet panel immunofenotyperingsonderzoek Voor immunofenotypering van de leukocyten in de BAL-vloeistof, worden 0,5 x10 6 cellen (100 µl van een suspensie met een concentratie van ca. 5x10 6 /ml) met monoklonale antistoffen geïncubeerd volgens het geldende immunofenotyperings protocol voor lymfocytensubset analyse in de BAL. Voor een 4-kleuren analyse zal een minimaal protocol er als volgt uitzien: CD4/CD8/CD45/CD3 ter bepaling van T-cellen en CD4/ CD8 ratio binnen de T- cellen CD19/CD56/CD45/CD3 ter bepaling lymfocyten subpopulaties: B-cellen, NK-cellen, T- cellen Eventueel aan te vullen met: CD103/CD4/CD45/CD3 ter bepaling van de CD103/CD4 ratio (binnen de CD4+ T- cellen. Een ratio < 0,2 verhoogt de sensitiviteit voor sarcoïdose. CD19/HLA-DR/CD45/CD3 ter bepaling van B-cellen en (geactiveerde) T-cellen CD11c/CD16/CD45/CD13.33 ter bepaling van (eosinofiele) granulocyten Meten van de celsuspensies op de flowcytometer Na de kleuring met monoklonale antistoffen worden de celsuspensies op de flowcytometer gemeten. Gebruik hierbij de voor de instellingen zoals gedefinieerd voor de betreffende flowcytometer. Voor een betrouwbare analyse van de lymfocyten(sub)populaties in de BAL-vloeistof dienen tenminste 2000 events binnen een lymfocytengate (gesteld op zijwaartse lichtverstrooiing - SSC en CD45 expressie) gemeten te worden Beoordeling immunofenotypering Analyseer de relatieve omvang van de subpopulaties in BAL en bloed binnen de lymfocytenpopulatie. Gebuik de FSC /SSC en CD45/SSC dot plots voor de identificatie van de lymfocytenpopulaties. Maak hierbij gebruik van de volgende eigenschappen: sterke CD45 expressie, lage SSC, lage FSC.

4 Analyseer de lymfocytensubpopulatie binnen een gate die op bovengenoemde eigenschappen is vastgesteld. 3.4 Bewerking bloed Analoog aan de analyse van de BAL-vloeistof wordt bloed geanalyseerd ter vergelijking van de T- cel CD4/CD8 ratio. Het immunofenotyperingsonderzoek wordt ingezet op vol onbewerkt bloed waarna lysis van de erytrocyten plaatsvindt met NH4CL of een commerciële lyseervloeistof. Voor het immunofenotyperingsonderzoek naar samenstelling en relatieve omvang van lymfocytensubpopulaties kan gebruik gemaakt worden van de volgende MoAb combinaties: Minimaal in te zetten panel: CD4/CD8/CD45/CD3 CD19/CD56/CD45/CD3 4. Technische beoordeling 4.1 BAL vloeistof: Om de resultaten van BAL-vloeistofanalyse goed te kunnen interpreteren dienen aspect van de BALvloeistof, het rendement, de celconcentratie en celsamenstelling in ogenschouw te worden genomen: Aspect: Het aspect is te omschrijven a.h.v. kleur (kleurloos/ rood/ wit/ bruin) en homogeniciteit (helder/ troebel/vlokkerig) en slijmerigheid (weinig/veel slijm). Een normale BAL is helder tot licht troebel. Indien de BAL melkachtig wit is, kan dit passen bij alveolaire proteïnose. Een rode kleur duidt op erytrocyten en dus bloedbijmenging. Een bruine kleur past bij roken. Rendement: Dit is de relatieve hoeveelheid van het gebruikte lavage-volume dat is teruggezogen. Dit zegt wat over representativiteit van de BAL is. Is er slechts een klein deel teruggezogen, dan zal er nog relatief veel fysiologisch zout in de broncheoli zijn achtergebleven. Het rendement hangt niet alleen af van de vaardigheid van de bronchoscopist en van het lavage-volume, maar correleert bijv. met de leefijd en met de mate van longfibrose [Helmers et al., 1989; Lofdahl et al., 2005]. Kwalitatieve beoordeling van rendement: 60 %: goed rendement 30% en < 60%: matig rendement < 30%: slecht rendement Celconcentratie: Het aantal cellen (leukocyten) in de BAL-vloeistof van rokende personen is doorgaans groter dan van gezonde, niet rokende personen (zie referentie waarden). Derhalve is informatie over roker danwel niet-roker van belang. Een verhoogd aantal leukocyten in een BAL-vloeistof kan een aanwijzing zijn voor inflammatoire processen. Er kan sprake zijn van een lymfocytair dan wel een granulocytair infiltraat of een infiltraat met zowel lymfocyten als granulocyten.

5 5. Referentiewaarden BALCGSC1990 Drent1993 BAL parameters gem sem 5-95 percentiel gem sem Niet rokers n = 76 n = 28 Cel opbrengst x10e3/ml 129 2, % macrofagen binnen BAL-cellen 85 1,6 54,6-97, % neutrofielen binnen BAL-cellen 1,6 0,7 0-3,1 1,3 0,2 % eosinofielen binnen BAL-cellen 0,19 0,06 0-0,2 <1 % basofielen/mestcellen binnen BAL-cellen <1 % plasmacellen binnen BAL-cellen <1 % lymfocyten binnen BAL-cellen 11, ,9-34,3 8,4 7 n = 30 n = 28 % B cellen binnen de lymfocyten ,1 3,2) % T cellen binnen de lymfocyten 70 3,6 25,6-94, % CD4+ van CD3 binnen de lymfocyten 44 3,7 7,6-83,5 52 3,4 % CD8+ van CD3 binnen de lymfocyten 21 2,2 6,6-49,4 19 0,9 CD4+/CD8+ ratio 2,6 0,29 0,5-6,4 2,7 0,2 Rokers n = 64 n = 32 Cel opbrengst x10e3/ml 418 4, % macrofagen binnen BAL-cellen 93 1,0 79,5-99, % neutrofielen binnen BAL-cellen 1,6 0,2 0,0-7,0 1,2 0,2 % eosinofielen binnen BAL-cellen 0,56 0,13 0,0-3,0 <1 % basofielen/mestcellen binnen BAL-cellen <1 % plasmacellen binnen BAL-cellen <1 % lymfocyten binnen BAL-cellen 5,2 0,9 1,0-18,6 3,8 5 n = 29 n = 32 % B cellen binnen de lymfocyten 6,6 1,5 0-28,1 6,5) % T cellen binnen de lymfocyten 69 4,5 15,0-95, % CD4+ van CD3 binnen de lymfocyten 32 2,7 9, ,5 % CD8+ van CD3 binnen de lymfocyten 29 3,0 5, ,0 CD4+/CD8+ ratio 1,6 0,29 0,30-6,1 1,6 0,0 Ex-rokers n = 50 Cel opbrengst x10e3/ml 139 1, % macrofagen binnen BAL-cellen 85 1,6 66,6-97,0 % neutrofielen binnen BAL-cellen 2,1 0,5 0-8,4 % eosinofielen binnen BAL-cellen 0,08 0,04 0-0,05 % basofielen/mestcellen binnen BAL-cellen % plasmacellen binnen BAL-cellen % lymfocyten binnen BAL-cellen ,0-29,3 n = 26 % B cellen binnen de lymfocyten 3 1,0 0-17,5 % T cellen binnen de lymfocyten 74 4,3 15,8-96,7 % CD4+ van CD3 binnen de lymfocyten 47 3,7 11,2-77,7 % CD8+ van CD3 binnen de lymfocyten 21 2,1 5,7-44,7 CD4+/CD8+ ratio 2,8 0,32 0,7-6,0 bronnen: BAL Cooperative Group Steering Committee. 1990; Drent M Thesis 1993 appendix; Drent et al., Chest 1994

6 6. Literatuur BAL Cooperative Group Steering Committee. Bronchoalveolar lavage constituent in healthy individuals, idiomatisch pulmonary fibrosis, and selected comparison groups. Am. Rev. Respir. Dis. 1990, 141: S169. Baughman RP. Technical aspects of bronchoalveolar lavage. Recommendations for a stadard procedure. Sem. Resp. Crit. Care Med. 2007, 28: Drent M, Wagenaar SS, Mulder PH, van Velzen-Blad H, Diamant M, van den Bosch JM. Bronchoalveolar lavage fluid profiles in sarcoidosis, tuberculosis, and non-hodgkin's and Hodgkin's disease. An evaluation of differences. Chest 1994,105: Drent M. Diagnostic value of bronchoalveolar lavage in interstitial lung diseases. Thesis Helmers RA, Dayton, CS, Floerchinger C, Hunninghake GW. Bronchoalveolar lavage in interstitial lung disease: effect of volume of fluid infused. J. Appl. Physiol. 1989, 67: Heron, M Slieker WA, Zanen P, van Lochem EG, Hooijkaas H, van den Bosch JM, van Velzen- Blad H. Evaluation of CD103 as a cellular marker for the diagnosis of pulmonary sarcoidosis. Clin. Immunol. 2008, 126: Hoogsteden HC, van Hal PTW, van Dongen JJM. Immunologische markers van cellen in bronchoalveolaire lavage (BAL) en perifeer bloed (PB) bij insterstitiële longziekten. Bull. Fijnvlekkige Longafw. 1988, 16: Jansen HM, Kauffman HF. Standaardisatie van het protocol voor bronchoalveolaire lavage in Nederland. Pulmoscript 1994, sept.: King TE. Basis principles and technique of bronchoalveolar lavage. Up to Date Online Lofdahl JM, Cederlund K, Nathell L, Eklund A, Skold CM. Bronchoalveolar lavage in COPD: fluid recovery correlates with the degree of emphysema. Eur. Respir. J. 2005, 25: Robinson BW, James A, Rose AH, Sterrett GF, Musk AW. Bronchoalveolar lavage sampling of airway and alveolar cells. Br. J. Dis. Chest. 1988, 82: