Automatische analyse van dicentrische chromosoomaberraties voor het bepalen van de opgelopen dosis tijdens een stralingsaccident.

Transcriptie

1 Automatische analyse van dicentrische chromosoomaberraties voor het bepalen van de opgelopen dosis tijdens een stralingsaccident. Eline CASTELEIN Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Anne VRAL Vakgroep: Medische basiswetenschappen Academiejaar

2

3 Automatische analyse van dicentrische chromosoomaberraties voor het bepalen van de opgelopen dosis tijdens een stralingsaccident. Eline CASTELEIN Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Anne VRAL Vakgroep: Medische basiswetenschappen Academiejaar

4 VOORWOORD Zonder de steun van velen zou deze thesis niet tot stand gekomen zijn. Daarom zou ik graag willen beginnen met een woord van dank. Een eerste welgemeende dank-je-wel gaat uit naar prof. Dr. Vral. Tijdens mijn 1 e masterjaar heeft haar majorvak mij de nodige kennis bijgebracht om met voldoende inzicht aan deze masterproef te kunnen beginnen. Ook daarna was zij steeds bereid om haar kennis en expertise te delen. Ik wil haar ook bedanken voor het nalezen van mijn werk en het geven van feedback. Daarnaast verdient uiteraard ook mijn begeleidster Julie Depuydt een woord van dank. Ondanks dat zij het dit jaar heel druk had met het afwerken van haar doctoraat kon ik steeds bij haar terecht met mijn vele vragen, voor het maken van grafieken en zoveel meer. Ik ben erg dankbaar voor de nuttige feedback die ik steeds van haar gekregen heb. Ook wil ik graag Leen bedanken. Ze was steeds bereid mijn vragen over de praktische uitvoering van zaken in het labo te beantwoorden. Annelot, bedankt voor al je hulp met het inscannen met de Metafer. Ook al ging het niet altijd even vlot en staken frustraties de kop op, ik kon steeds rekenen op jouw geduld en vastberadenheid. Ik wil ook mijn medestudenten op het labo bedanken voor de aangename pauzes en babbels! Uiteraard verdienen mijn ouders een bijzonder woord van dank, hun onvoorwaardelijke steun tijdens mijn studie was essentieel voor mijn slagen. Bedankt om mij tijdens de moeilijke momenten te steunen en mij altijd de moed gegeven te hebben door te zetten. Tot slot wil ik mijn vriend Colin bedanken om mij gedurende mijn studiejaren te steunen. Dankzij delen van je ervaring, jouw vele tips en je hulp bij de opmaak is mijn masterproef geworden tot wat hij nu is.

5 INHOUD Voorwoord... i Inhoud... ii Samenvatting... 1 Abstract Inleiding Stralingsaccidenten Ioniserende straling Wat en welke types DNA-schade Gezondheidseffecten en klinische symptomen Dosisbepaling: dosimetrie Klinische symptomen Fysische dosimetrie Biologische dosimetrie Partiële lichaamsbestraling Automatische detective Fluorescente in-situ hybridisatie Doelstelling Materialen en methoden De dicentrische test Principe Methodologie Analyse Verwerking resultaten FISH met centromeer en telomeer probes... 23

6 Principes Methodologie Analyse Verwerking resultaten Resultaten Dosis-respons curves Dosis-respons curves Giemsa Dosis-respons curve Fish Vergelijking dosis-respons curves fish- en giemsa-gekleurde preparaten partiële lichaamsbestraling Scoring dicentrische chromosomen en mn Vergelijking correctheid van de voorspelling op basis van scoring van dicentrische chromosomen vs MN Bespreking Celdeling Dosis respons curves Partiële lichaamsbestraling Algemeen besluit Referentielijst... 47

7 SAMENVATTING Wanneer zich een stralingsaccident voordoet is het van belang de slachtoffers in een korte tijdspanne te kunnen triëren volgens de ernst van blootstelling zodat men de blootgestelde slachtoffers snel de aangepaste medische hulp kan bieden. De ontvangen dosis kan het best bepaald worden op basis van biologische dosimetrie gezien hierbij rekening gehouden wordt met de individuele stralingsgevoeligheid van personen. Dicentrische chromosomen zijn de gouden standaard voor biologische dosimetrie bij volledige lichaamsbestraling omdat ze nauwelijks voorkomen in onbestraalde cellen en er weinig individuele verschillen zijn. Tijdens accidentele bestraling vindt er echter vaker een partiële lichaamsbestraling plaats. Tot op heden wordt de scoring van dicentrische chromosomen beschouwd als de methode voor het bepalen van de dosis opgelopen tijdens zo n partiële lichaamsbestraling. In dit onderzoek wordt een vergelijking gemaakt van verschillende methodes voor scoring van dicentische aberraties in kader van stralingsaccidenten (automatisch, semi-automatisch en manueel). Daarna wordt in het kader van partiële lichaamsbestraling een vergelijking gemaakt tussen scoring van dicentrische chromosomen en de scoring van MN, deze laatste laten op zich al een snellere en meer eenvoudige scoring toe. Naast onderzoek naar partiële lichaamsbestraling wordt in deze masterproef ook nagegaan of FISH-TC-gekleurde preparaten eenvoudiger te scoren zijn dan Giemsa-gekleurde slides. Resultaten uit dit onderzoek bevestigen de bevinding resulterend uit eerder onderzoek, namelijk dat een automatische scoring van Giemsa-gekleurde preparaten slechts 50% van de manueel gescoorde dicentrische chromosomen oplevert. Op basis van een vergelijking tussen de curves voor Giemsa- en FISH-TC-gekleurde slides komt een vermoedelijke mis-scoring bij Giemsagekleurde preparaten naar voor. De scoring van FISH-TC-gekleurde slides blijkt uit onze preliminaire resultaten sneller en met meer accuraatheid een predictie te kunnen geven van de opgelopen dosis. Uit de resultaten voor partiële lichaamsbestraling kon geen duidelijk bewijs gevonden worden van de superioriteit van dosisbepaling op basis van scoring van micronucleï of scoring van dicentrische chromosomen. Verdere optimalisatie van detectie van partiële lichaamsbestraling dient te gebeuren. Een combinatie met FISH-TC-kleuring zou hiervoor een interessante mogelijkheid kunnen zijn aangezien uit dit onderzoek blijkt dat scoring van FISH- TC-gekleurde slides eenvoudiger verloopt. 1

8 ABSTRACT Background: The dicentric chromosome aberration is the all-round accepted gold-standard method for biodosimetry. Automatic scoring in cases of mass-casualty events is needed. In this study, we established dose-response curves for different types of scoring for Giemsa (automatic, semi-automatic and manual) and FISH-centromere-telomere (FISH-TC) staining (manual). We also compared the dicentric and micronucleus (MN) assay for detection of partial-body irradiation. (PBI) Methods: For establishment of the curves, blood of 2 healthy donors was irradiated with 60 Co γ-rays, doses between 0 and 4,5 Gy. The slides were stained with Giemsa or FISH-TC-staining), and dicentrics were scored. For PBI, blood of 2 healthy donors was irradiated with 60 Co γ-rays, doses between 0 and 4 Gy, and mixed with unirradiated blood in different proportions to simulate PBI. Slides were stained with Giemsa and scored for dicentrics. Also micronucleus slides, stained with DAPI, were analysed. Results: Our results confirm what has been described in earlier research: automatic scoring of dicentrics only detects 50% of the manually scored dicentrics. Preliminary results derived from comparison between Giemsa- and FISH-TC-stained slides suggest a mis-detection of dicentrics in Giemsa-stained slides. Comparison between micronuclei and dicentrics for detection of PBI did not result in a preference for one of both methods. Conclusions: We could not conclude a significant difference between scoring of micronuclei and dicentrics for detection of PBI. A further optimization for determining PBI is necessary. In this research, it has been confirmed that FISH-TC-staining results in a more efficient scoring. A combination of FISH-TC-staining and PBI should be further investigated in the future. 2

9 1. INLEIDING 1.1. STRALINGSACCIDENTEN Een stralingsaccident wordt door het International Atomic Energy Agency (IAEA) gedefinieerd als zijnde een gebeurtenis (straling) die geleid heeft tot significante gevolgen voor mens, milieu of faciliteiten. Dit behelst dodelijke effecten voor het individu, vrijkomen van grote hoeveelheid radioactiviteit in de omgeving en het smelten van een reactorkern. Een voorbeeld van één van de grootste stralingsaccidenten is de kernramp van Chernobyl in [1] Wereldwijd zijn al 99 geregistreerde accidenten gebeurd met nucleaire energiecentrales, 57 daarvan hebben plaatsgevonden sinds de ramp in Tsjernobyl. [2] Een ander voorbeeld van een stralingsaccident is het Goiânia-incident. In 1985 veranderde een privaat instituut voor radiotherapie van locatie. Een verouderd toestel met cesiumchloride-bron (cesium-137) werd op de oude locatie achtergelaten. De bron kwam in handen van daklozen die het gebouw binnengedrongen hadden, waarna nog een groot aantal mensen in contact kwamen met de bron. Het duurde twee weken alvorens men de schadelijkheid ervan ontdekte en de overheid kon ingrijpen. Uiteindelijk zijn vier mensen overleden ten gevolge van contact met de bron, 20 personen hadden medische behandeling nodig en 249 personen bleken een verhoogde hoeveelheid straling te hebben ontvangen. [3] Alhoewel de kans op zo n grootschalig stralingsaccident klein is, is het toch van belang een algemene aanpak klaar te hebben voor wanneer een grootschalig stralingsaccident zou plaatsvinden. Onderdeel daarvan is het snel kunnen bepalen van de opgelopen dosis van een grote groep individuen zodat de slachtoffers de nodige medische hulp geboden kan worden. De focus ligt in zo n geval dus in eerste instantie op snelle triage, niet op het nauwkeurig bepalen van de opgelopen dosis. Echter, naast grootschalige accidenten gebeuren ook accidenten waarbij slechts één of enkele personen betrokken zijn. Zo werd in Fleurus op 11 maart 2006 een operator blootgesteld aan 4,4-4,8 Gy tijdens een interventie in een bestralingscel. De persoon in kwestie was zich hier echter niet van bewust. Enige tijd later kreeg de operator last van misselijkheid en braakneigingen maar er werd geen verband gelegd met zijn interventie in de bestralingscel. Zijn huisarts was van oordeel dat hij spijsverteringsproblemen had. Ongeveer drie weken later klaagde hij bij de arbeidsgeneesheer over haarverlies, waardoor het vermoeden rees dat hij aan 3

10 straling was blootgesteld. Het bloedonderzoek dat toen onmiddellijk werd uitgevoerd, liet veronderstellen dat hij aan een stralingsdosis tot 4 Gy werd blootgesteld. Op 31 maart werd de operator naar een ziekenhuis in Frankrijk overgebracht dat gespecialiseerd is in de behandeling van bestraalde personen. Daarbij werd bevestigd dat hij over het volledige lichaam bestraald is geweest en dat de dosis waaraan hij werd blootgesteld lag tussen 4,4 Gy en 4,8 Gy. [4] Ook anno 2015 vinden individuele stralingsaccidenten plaats. Zo werd het FANC door een dienst radiotherapie op de hoogte gebracht van een bestralingsfout bij een patiënte met borstkanker. Bij een retrospectieve studie werd ontdekt dat de patiënte een dosis van 30 Gy had gekregen in de regio van de borst, in plaats van de voorgeschreven 7,95 Gy. [5] Gezien de frequentie van voorkomen van individuele of kleinschalige accidenten hoger is dan deze voor grootschalige accidenten is het van belang ook in deze gevallen een passend protocol te hebben. De focus ligt hierbij echter wel op nauwkeurige dosisbepaling, bovendien betreft het eerder partiële lichaamsbestraling met kleinere dosissen. Het feit dat de kans op nucleaire catastrofes tegenwoordig minder tot een mogelijkheid aanzien wordt, steunt op het wereldwijde beleid waarin concepten zoals geen losse kernwapens en geen nieuwe nucleaire staat centraal staan. Dit beleid heeft het risico op ontploffing van een kernwapen waarbij een grote populatie een volledige lichaamsbestraling ondergaat schijnbaar geminimaliseerd. Toch blijft de kans op een nucleaire of radiologische blootstelling bestaan: accidenten met kernreactoren of energiecentrales, potentieel terrorisme waarbij kernwapens gebruikt worden etc. De verschuiving naar deze types van blootstelling verhogen de kans op een gedeeltelijke lichaamsbestraling. Dit illustreert de nood aan de verdere ontwikkeling van aangepaste beoordelingsmethodes voor gedeeltelijke lichaamsbestraling. [6] 1.2. IONISERENDE STRALING WAT EN WELKE TYPES Ioniserende straling zijn deeltjes of elektromagnetische golven die voldoende energie bezitten om excitaties en ionisaties te veroorzaken in het medium waar ze doortrekken. Deze ionisaties en excitaties gebeuren door fysische interactieprocessen zoals elektrische aantrekking of afstoting, botsingsprocessen,.. 4

11 Een eerste type van ioniserende straling zijn hoog energetisch geladen deeltjes zoals α- en β- straling die vrijkomen bij radioactief verval. Het zijn direct ioniserende stralingen omdat het de primaire deeltjes op zich zijn die de ionisaties veroorzaken zonder dat er zijn secundaire deeltjes nodig om dit te bewerkstelligen. [7] α-deeltjes worden uitgezonden tijdens α-verval. Ze zijn samengesteld uit 2 protonen en 2 neutronen en mogen gelijkgesteld worden aan een 4 He kern. + β-deeltjes worden uitgestuurd tijdens β - verval en β + verval. Ze zijn afkomstig uit de kern van het vervallende element en hebben de massa van een elektron. Ze kunnen positief (β + -deeltjes of positronen) of negatief (β - -deeltjes of negatronen) geladen zijn. : + + : + + Een tweede type zijn de niet-geladen deeltjes zoals neutronen en elektromagnetische golven zoals X- en gamma-stralen. Doordat ze ongeladen zijn kunnen deze niet zelf voor de ionisaties zorgen. Ionisaties gebeuren door de secundaire geladen deeltjes die vrijgemaakt zijn door de elektrisch neutrale primaire straling. Deze secundaire geladen deeltjes zijn elektronen en positronen. Hierdoor wordt dit tweede type ook indirect ioniserende straling genoemd. [7] De afstand die straling door een medium kan afleggen, de range, hangt af van verschillende factoren zoals de energie van het ioniserend deeltje, de lading van het partikel, de massa van het ioniserende deeltje en het atoomnummer (Z) of massagetal (A) van het medium waar de straling door gaat. α-deeltjes zijn zware, geladen deeltjes (He-kernen) en verliezen op heel korte afstand hun energie in de vorm van ionisaties, de zogeheten ionisatiedichtheid is dus groot. (Fig. 1) Een β-deeltje met eenzelfde energie-inhoud als een α-deeltje zal een veel grotere snelheid hebben dan het α-deeltje aangezien zijn veel massa kleiner is. De ionisatiedichtheid is dus veel kleiner dan bij α-deeltjes. Er is minder beschikbare tijd voor interactie door de hoge snelheid van het β-deeltje. 5

12 Gevolg van dit verschil in ionisatiedichtheid tussen beide direct ioniserende stralingen is dat de DNA-schade veroorzaakt door α-straling complexer zal zijn dan bij β-straling. [8] Fig. 1: Vergelijking ionisatiedichtheid voor α- en β-straling. [9] Voor de kwantitatieve beschrijving van de ruimtelijke verdeling van de energieafgifte werd de grootheid LET (Linear Energy Transfer) ingevoerd. Dit is de hoeveelheid energie afgegeven per eenheid van afgelegde weg van het ioniserend deeltje, uitgedrukt in KeV/micron. (Fig. 2) Bij lage LET-straling, zoals β-deeltjes en X- en gamma-stralen, wordt de energie vooral afgezet onder de vorm van verspreide of geïsoleerde ionisaties en excitaties. Bij hoge LET-straling zoals snelle neutronen en α-deeltjes wordt de energie afgezet onder de vorm van grote ionisatieclusters. Het feit dat de ionisaties al dan niet dicht op elkaar volgen in tijd en ruimte vormt de verklaring voor het verschil in biologisch effect tussen hoge en lage LET-straling. Hoe dichter de ionisaties zijn in tijd en ruimte, hoe meer DNA-schade wordt veroorzaakt. [10] Om de biologische effectiviteit van straling uit te drukken werd in de radiobiologie de relatieve biologische effectiviteit ingevoerd, kortweg RBE. Dit is de verhouding van de dosis röntgenstraling of gammastraling voor een bepaald biologisch effect, met de dosis van de soort ioniserende straling in kwestie die nodig is om hetzelfde effect te verkrijgen. Zo is de RBE dus afhankelijk van de LET. Daarnaast zal de RBE ook afhankelijk zijn van de stralingsdosis, het dosistempo en het eindpunt. [10] [11] Fig. 2: Vergelijking tussen energiedepositie in de cel voor lage en hoge LET. [12] 6

13 DNA-SCHADE Ioniserende straling veroorzaakt zoals eerder vermeld schade aan het DNA in de celkern. De voornaamste vormen van schade zijn baseschade, dubbelstrengige- en enkelstrengige breuken in het DNA. [13] Vooral DNA dubbelstrengbreuken worden biologisch als belangrijk beschouwd omdat hun herstel intrinsiek moeilijker is dan voor andere soorten DNA-schade. Foutief of geen herstel van dubbelstrengbreuken leidt tot chromosoomaberraties zoals dicentrische chromosomen en acentrische fragmenten, deleties, inversies, (Fig. 3) Een voorbeeld van een dicentrisch chromosoom staat afgebeeld in Fig. 4. Dicentrische chromosomen zijn het resultaat van foutief herstel tussen twee dubbelstrengbreuken gelegen op twee verschillende chromosomen die dicht bij elkaar gelegen zijn, zowel in tijd als in ruimte. Wanneer een dicentrisch chromosoom gevormd wordt, ontstaat ook een acentrisch fragment. Dit is een fragment zonder centromeer [10]. Fig. 3: Diagramvoorstelling van de vorming van chromosoomaberraties gevormd door ioniserende straling. De omcirkelde zaken zijn fragmenten die aanleiding kunnen geven tot micronucleï. [10] 7

14 Fig. 4: Dicentrisch chromosoom (D) (bron: eigen experiment) Naast vorming van dicentrische chromosomen kunnen ook micronucleï (MN) gevormd worden ten gevolge van schade aan het DNA. (Fig. 5). MN worden gevormd tijdens de metafaseanafase transitie van de mitose. Ze bevatten volledige chromosomen of chromosoomfragmenten zonder centromeer (acentrische fragmenten). In beide gevallen zijn deze er niet in geslaagd om in de dochtercellen te worden geïncorporeerd. MN kunnen spontaan gevormd worden maar de hoeveelheid kan ook toenemen door bepaalde endogene en exogene factoren. In Fig. 3 staan alle acentrische fragmenten omcirkeld die aanleiding kunnen geven tot MN. [14] [15] Fig. 5: Binucleaire cel zonder en met micronucleus (bron: eigen materiaal) 8

15 GEZONDHEIDSEFFECTEN EN KLINISCHE SYMPTOMEN Gezondheidsschade ten gevolge van ioniserende straling is afhankelijk van het feit of het een hoge of een lage dosis van opgelopen straling betreft. Een hoge dosis geeft aanleiding tot deterministische effecten. Bij deze hangt de ernst van een effect samen met de opgelopen dosis. Een deterministisch effect heeft een drempelwaarde waaronder het effect niet voorkomt. De drempelwaarde kan variëren van persoon tot persoon. Echter, eenmaal de drempelwaarde overschreden treedt het effect zeker op en neemt de ernst van het effect ook toe met de dosis. Deterministische effecten worden ook acute effecten genoemd omdat ze binnen uren tot enkele maanden na bestraling optreden. [10] Tot de deterministische effecten behoort het acute radiation syndrome (ARS). Het wordt gedefinieerd als de symptomen die verschijnen nadat een significant deel van het lichaam (minimum 60%) blootgesteld werd aan >1 Gy totale dosis ioniserende straling, opgelopen aan een relatief hoog dosistempo. [16] De symptomen verschijnen uren tot weken na de blootstelling. In Fig. 6 wordt het benaderd tijdsverloop van de klinische manifestaties weergegeven. Het optreden van de klinische symptomen gebeurt in drie verschillende maar overlappende fasen: de prodromale fase, de latente fase en de fase van manifeste ziekte. In de prodromale fase (periode vooraf aan de ziekte) fase treden klinische symptomen gewoonlijk op binnen de eerste 48 uur na blootstelling. Deze klinische symptomen zijn hematopoietische veranderingen, gastro-intestinale symptomen en neurologische symptomen. De latente fase persisteert gedurende 2-20 dagen en wordt gekenmerkt door een verbetering van de symptomen. Dit geeft de valse impressie dat herstel is ingezet, alhoewel typisch cytopenie persisteert. De duur van de latente fase is invers gecorreleerd met de geabsorbeerde dosis (zie Fig. 6). De fase van manifeste ziekte duurt 2-60 dagen waarin symptomen optreden omwille van beschadiging van één of meer organen. Bij personen die werden blootgesteld aan een dosis hoger dan Gy ligt de mortaliteit op bijna 100%. Alhoewel deze klinische symptomen niet stralingsspecifiek zijn, zouden de symptomen in combinatie met een mogelijke blootstelling herkenbaar moeten zijn voor instanties die de eerste hulp leveren aan slachtoffers. De bepalende factor voor bruikbaarheid van de symptomen is de tijd tussen bestraling en manifesteren van het symptoom. [17] 9

16 Fig. 6: Benaderd tijdsverloop van klinische manifestaties. [17] Een blootstelling aan lage stralingsdosis veroorzaakt stochastische effecten. Deze hebben in tegenstelling tot deterministische effecten een toevalskarakter. Er is geen drempelwaarde waarbij men met zekerheid kan stellen dat het effect zal voorkomen. Bij stochastische effecten stijgt de kans van voorkomen met toenemende dosis. Echter, de ernst van de effecten stijgt hierbij niet. Tot de stochastische effecten behoren kankerinductie (mutaties in somatische cellen) of overerfbare genetische effecten (mutaties in geslachtscellen) als gevolg van blootstelling aan straling. Men krijgt kanker of men krijgt het niet, maar men kan niet met zekerheid stellen dat kanker zal geïnduceerd worden vanaf een bepaalde dosis. [18][10] Onmiddellijke stralingsgeïnduceerde genetische schade kan bijdragen tot veranderingen in weefsel- en tumorresponsen. Bij 50% van alle kankers is er bijvoorbeeld een mutatie vastgesteld in de tumor suppressor p53. Een aantal fundamentele cellulaire functies die normaliter tumor suppressief zijn onder controle van wildtype p53 ontsporen onder invloed van het mutante p53. Het mutante p53 zorgt voor een verstoring van de normaal streng gecontroleerde fundamentele processen inclusief controle over de celcyclus waardoor ongecontroleerde celdeling mogelijk is leidend tot tumoren. [19] Het risico op een stralingsgeïnduceerde kanker is afhankelijk van de leeftijd waarop men bestraald wordt, de ontvangen dosis, het bestraalde volume normaal weefsel alsook de familiegeschiedenis van de patiënt op vlak van kanker (genetica). Aangezien het risico levenslang blijft gelden en cumulatief is, is het risico op stralingsgeïnduceerde kanker het grootst voor kinderen en jongvolwassenen die kankertherapie overleefd hebben. [20] 10

17 1.3. DOSISBEPALING: DOSIMETRIE KLINISCHE SYMPTOMEN Wanneer één individu tijdens een werkongeval een overbestraling heeft opgelopen, is het van belang de exacte dosis te kunnen bepalen waaraan de persoon werd blootgesteld. Klinische symptomen zijn hiervoor niet altijd voldoende, bijvoorbeeld bij lage dosis bloostelling. Na een grootschalig stralingsaccident is het van cruciaal belang de slachtoffers in een zo korte mogelijke tijdspanne te kunnen triëren volgens de ernst van blootstelling. Triage moet gebeuren volgens drie categorieën zijnde <1 Gy, 1-2 Gy en >2 Gy, zodat men de blootgestelde slachtoffers snel de aangepaste medische hulp kan bieden. [21] Daarvoor dient de ontvangen dosis snel bepaald te kunnen worden. Klinische symptomen kunnen na accidentele bestraling gebruikt worden voor triage, deze zijn echter niet altijd stralingsspecifiek, zoals misselijkheid, overgeven... Mensen die weten dat ze misschien bestraald werden zullen zich al snel onwel voelen uit angst. Dit wordt in de literatuur genoemd als worried well. Gebruik van klinische symptomen kan dus al snel leiden tot een foute diagnose. [22] Vaststellen van de dosis gebeurt daarom beter via fysische of biologische dosimetrie omdat deze in wezen veel objectiever zijn FYSISCHE DOSIMETRIE Bij fysische dosimetrie wordt gebruik gemaakt van een persoonlijke dosimeter (bv. Filmbadge). Deze meet de blootstelling aan ioniserende straling door fysische verandering in een bepaald materiaal. Een persoon die werkt in een risico-omgeving waarbij bestraling mogelijk is draagt normaliter een dosimeter. Hetzelfde geldt echter niet voor een accidenteel bestraald persoon uit de algemene populatie (bv. grootschalig stralingsaccident). Daarom werden alternatieve methodes zoals de mobiele telefoon als dosimeter reeds nader onderzocht, gezien tegenwoordig heel wat mensen deze altijd bij zich hebben. Een eerste voorbeeld van het gebruik van de mobiele telefoon als dosimeter is Electron Paramagnetic Resonance, kortweg EPR. Dit is een spectroscopische techniek die steunt op het feit dat ioniserende straling radicalen induceert in biologische of artificiële materalen. Zo zal ioniserende straling ook radicalen induceren in het glazen scherm van de mobiele telefoon. Het voordeel van EPR is de hoge specificiteit en goede sensitiviteit bij blootstelling aan hoge dosissen (>1 Gy) en het feit dat de geïnduceerde radicalen maanden na bestraling nog bruikbaar zijn voor dosisbepaling. Nadeel is dan weer de lage sensitiviteit voor dosissen lager dan 1 Gy. Echter, dosissen van die grootteorde zijn bij 11

18 triage niet van belang, enkel slachtoffers blootgesteld aan meer dan 1 Gy hebben dringende medische verzorging nodig. EPR heeft naast de mobiele telefoon ook nog andere toepassingen. De radicalen geproduceerd in materiaal door ioniserende straling hebben een heel korte levensduur (nanoseconden) in waterige omgeving zoals de meeste biologische weefsels. Echter, in niet waterige media zoals tanden, bot, vingernagels en haar kunnen de radicalen wel extreem stabiel zijn. Tegenwoordig zijn er drie toepassingen met een potentiële waarde in het schatten van de geabsorbeerde dosis bij noodgevallen: in vivo meting bij tanden, in vitro meting bij kleine stukjes tand en in vitro meting van stukjes vinger- of teennagels. Elk van deze EPRgebaseerde technieken zijn niet invasief of minimaal invasief en bieden een direct resultaat op gelijk welk tijdstip na blootstelling, zelfs wanneer het uitvoerend personeel minimaal getraind is. Metingen van stralingsgeïnduceerde veranderingen in tanden kunnen gebeuren tot honderden zelfs duizenden jaren na blootstelling. Metingen in vingernagels kunnen tot 30 dagen na blootstelling gebeuren. Als de vingernagels binnen enkele uren na blootstelling gecollecteerd worden en bewaard worden bij lage temperatuur kunnen later ook nog metingen uitgevoerd worden. [17] Naast EPR kan ook Optically Stimulated Luminescence ofwel OSL gebruikt worden in combinatie met de mobiele telefoon. Hierbij wordt de dosis aan ioniserende straling bepaald door meten van licht uitgezonden door bestraalde objecten. OSL heeft dan wel een heel hoge specificiteit en sensitiviteit (mgy tot Gy), het te meten effect verdwijnt veel sneller dan bij ERP. 50% van het signaal verdwijnt in de eerste 10 dagen na bestraling. [22] BIOLOGISCHE DOSIMETRIE ALGEMENE WERKWIJZE Voor biologische dosimetrie geldt telkens dezelfde werkwijze. Door bloedstalen te bestralen met verschillende dosissen en bij deze dosissen telkens de respons te meten, kan een in-vivo dosis-respons curve opgesteld worden. Deze dient dan als calibratiecurve om in vivo dosisblootstelling bij een accident te onderzoeken. Hierdoor kan de geobserveerde schade gelinkt worden aan de dosis. [17] Voor chromosoomaberraties volgt de curve volgende vergelijking: Y = C + αd + βd² voor lage LET-straling en Y = C + αd voor hoge LET straling. (Fig. 7) In de lineaire component (αd), is α de fractie van de aberraties gevormd door één enkele elektronenbaan. Deze is dus onafhankelijk van het dosistempo. In de kwadratische component βd² stelt β de fractie van aberraties voor die gevormd worden door twee verschillende elektronenbanen. Hierbij speelt 12

19 dosistempo dus wel een rol aangezien de twee elektronenbanen niet alleen in ruimte maar ook in tijd voldoende dicht bij elkaar gelegen moeten zijn. Wanneer er te veel tijd zit tussen beide gebeurtenissen, zal er meer tijd zijn voor herstel van DNA-schade door DNAherstelmechanismen. [14] Voor de dosimetrie is het van belang om zowel LET als dosistempo van de straling waaraan men blootgesteld werd te kennen zodat de juiste dosis-respons curve gebruikt kan worden bij bepaling van de dosis. Fig. 7: Algemene dosis-respons curves voor chromosoomaberraties geïnduceerd door verschillende types van ioniserende straling. (a) Hoge LET (b) Lage LET en hoog dosistempo (c) Lage LET en laag dosistempo. [14] VERSCHILLENDE BIOLOGISCHE TESTSYSTEMEN Onder biologische dosimetrie verstaat men het evalueren van de opgelopen stralingsdosis door middel van biologische testsystemen waarbij stralingsgeïnduceerde veranderingen in het menselijk lichaam worden bepaald. [10] Op die manier wordt dus rekening gehouden met de individuele gevoeligheid van personen, dit in tegenstelling tot fysische dosimetrie. Zoals eerder aangehaald onder DNA-schade zijn dicentrische chromosoomaberraties en micronucleï voorbeelden van zo n stralingsgeïnduceerde veranderingen die waargenomen kunnen worden in respectievelijk cellen in metafase en in interfase cellen. De micronucleï (MN) kunnen waargenomen worden in cellen die één keer gedeeld hebben. [14] Deze micronucleï worden gebruikt in de MN test voor biologische dosimetrie. (Fig. 8) Bij de cytokinesis-block micronucleus assay (CBMN) worden lymfocyten in cultuur gebracht en gestimuleerd met phytohemagglutinine (PHA). Cytochalasine-B wordt toegevoegd zodat 13

20 celdeling geïnhibeerd wordt terwijl kerndeling wel plaatsgevonden heeft. Dit resulteert in binucleaire cellen waarin men de eventuele micronucleï kan scoren. Dankzij de eenvoudige en snelle scoring is deze MN-test goede optie voor triage, de test is echter niet zo gevoelig in het lage dosisgebied (<0,2 Gy) door de variabele en hoge spontane frequentie van MN. [14] Fig. 8: Celdeling in CBMN assay. [23] Dicentrische chromosomen zijn echter de gouden standaard voor biologische dosimetrie omdat ze normaal nauwelijks voorkomen in onbestraalde cellen (1-2 dic/1000 metafasen) en er weinig individuele verschillen zijn. Dicentrische chromosomen kunnen waargenomen worden in metafase cellen. In de dicentrische test worden bloedculturen opgestart en de lymfocyten worden tot deling gebracht door middel van fytohemagglutinine (PHA). De lymfocyten worden geblokkeerd in de metafase door toevoegen van colcemid. De dicentrische chromosomen kunnen gescoord worden in de metafase lymfocyten na kleuring met Giemsa. (Fig. 9) Door bloedstalen met verschillende dosissen te bestralen kan een dosis-respons curve opgesteld worden. Deze dient als calibratiecurve om in vivo dosisblootstelling bij een accident te onderzoeken. Hierdoor kan geobserveerde schade, namelijk het aantal dicentrische aberraties per cel, gelinkt worden aan de dosis. [17] Fig. 9: Verloop dicentrisch assay (bron: eigen afbeelding) Bij stralingsaccidenten is het van belang zo snel mogelijk een beeld te hebben van de ontvangen dosis per slachtoffer. Alhoewel het dicentrisch assay aanzien wordt als de meest specifieke en 14

21 gevoelige methode om dosisbepalingen te doen van recente blootstellingen aan ioniserende straling, is het niet de snelste methode. Om dit nadeel te omzeilen kan men ervoor kiezen om slechts 50 metafasecellen te scoren in plaats van 500. [17] RENEB (Realising the European Network of Biodosimetry), een Europees project met als doel het realiseren van een duurzaam netwerk voor biodosimetrie in Europa, voerde in 2015 een onderzoek uit naar hoeveel metafasecellen gescoord moeten worden om een schatting te kunnen maken van de dosis zodat deze zich binnen de betrouwbaarheidsinterval bevindt voor de betreffende dosis. Hieruit bleek dat de correctheid van de dosisbepalingen steeg naarmate het aantal gescoorde metafasecellen toenam van 20 naar 30. Bij scoring van 50 metafasecellen werd echter geen verbetering vastgesteld in de resultaten ten opzichte van de 30 gescoorde metafasecellen. [24] Het scoren laten plaatsvinden in bepaalde centrale laboratoria door getrainde personen kan de capaciteit van de analyse verhogen. Als laatste kan ook software gebruikt worden om metafasen en dicentrische chromosomen op te sporen. (zie verder bij 1.5. Automatische detectie ) [17] Naast MN en dicentrische chromosomen bestaan ook andere cytogenetische testen als biologische dosimeters. Eén daarvan is schade in een cel nagaan door middel van premature chromosoom condensatie (PCC). Deze techniek laat toe om chromosoomaberraties in interfase cellen te visualiseren. In de klassieke PCC-test worden mitotische Chinese hamster ovary (CHO) cellen gefuseerd met perifere bloed lymfocyten (PBL) in aanwezigheid van polyethyleen glycol (PEG). (Fig. 10) Hierdoor verdwijnt de kernmembraan en kunnen de mitose promoting factors (MPF s) afkomstig van de mitotische cellen zorgen voor een premature condensatie van de testcellen (PBL). De 46 chromatiden worden zichtbaar en in combinatie met FISH kunnen breuken, dicentrische aberraties etc. gedetecteerd worden. De snelle uitvoering van de test en het feit dat geen celdeling nodig is zijn voordelen van deze test. Nadelig aan de PCC-test is de noodzakelijkheid van expertise. [25][10] Fig. 10: Fusie van lymfocyten met mitotische CHO cellen in suspensie zoals zichtbaar onder de microscoop. (a) 10 min na fusie, (b) 60 min na fusie. Mitotische CHO-cellen zijn groter dan lymfocyten. Gefuseerde cellen hebben een ander uitzicht dan zowel de lymfocyten als de mitotische CHO-cellen. [26] 15

22 Ook detectie van DNA-dubbelstrengschade kan gebruikt worden om de ontvangen dosis voor een bestraald individu vast te stellen. Een voorbeeld hiervan is de γ-h2ax foci test. H2AX is één van de drie types geconserveerde H2A histoneiwitten. Het verschilt van de andere twee types door een absoluut geconserveerd serine-glutamine (SQ) motief in de C-terminale regio van het eiwit. Wanneer een cel blootgesteld wordt aan ioniserende straling worden H2AX histoneiwitten in de buurt van een dubbelstrengbreuk snel gefosforyleerd ter hoogte van het γ- serine (serine 139) in het SQ-motief. Deze worden de γ-h2ax foci genoemd. Deze fosforylatie van het H2AX eiwit trekt andere eiwitten van de DNA-schade-respons pathway aan. Het aantal geïnduceerde foci is proportioneel (1:1) voor het aantal geïnduceerde dubbelstrengbreuken. Door gebruik te maken van een fluorescent antilichaam specifiek voor γ-h2ax worden de foci gevisualiseerd, het aantal dubbelstrengbreuken kan via fluorescentie microscopie bekeken worden.[27][28][10] Het voordeel van de γ-h2ax test is onder andere de mogelijkheid deze te gebruiken om stralingsgeïnduceerde schade te kwantificeren bij lage dosis blootstellingen. [29] Daarnaast bewijst deze test in geval van grootschalig stralingsaccident zijn nut door heel snel leveren van resultaten (uren) en high throughput in vergelijking met chromosoom dosimetrie assays. Op die manier kunnen personen blootgesteld aan kritische dosissen heel snel onderscheiden worden van worried well. Nadeel is wel het snel verdwijnen van de foci na vorming naarmate herstel van dubbelstrengbreuken plaatsvindt PARTIËLE LICHAAMSBESTRALING Bij de meeste stralingsaccidenten wordt een gedeeltelijke lichaamsbestraling opgelopen in plaats van een volledige. Analyse van dicentrische chromosoomaberraties blijkt ook hier het meest geschikt voor identificatie van gedeeltelijke lichaamsbestraling, in tegenstelling tot de micronucleus test. [30] Bij volledige lichaamsbestraling volgt de verdeling van het aantal dicentrische aberraties per cel een Poissondistributie. Dit is een discrete kansverdeling dat de kans uitdrukt dat een gegeven aantal gebeurtenissen voorkomt in een bepaalde tijd of ruimte. (Fig. 11) Echter, bij gedeeltelijke lichaamsbestraling is er een overdispersie van de frequentie distributie t.o.v. de Poissondistributie. Bij een grote dosis op een heel klein gedeelte van het lichaam werden de meeste cellen niet bestraald waardoor heel veel cellen geobserveerd worden zonder dicentrische chromosomen, terwijl een klein deel van de cellen wel veel dicentrische kunnen bevatten. 16

23 Fig. 11: Poisson-distributie (licht grijs) en overdispersie op de Poisson-distributie (zwart) Een gedeeltelijke lichaamsbestraling kan opgespoord worden met de Dolphin methode. Eerste stap in deze methode is het bepalen van de ratio van variatie op het gemiddelde, de dispersieindex genaamd (σ2/y), en de waarde van de µ-test. Er wordt bepaald of de ratio significant afwijkt. Een µ-waarde groter dan 1,96 wijst op een overdispersie. Wanneer geconcludeerd wordt dat de data niet-poisson verdeeld is, kan verder gewerkt worden met de Dolphin methode om de partiële lichaamsdosis in te schatten. Deze methode beschouwt de overdispersie van de distributie van dicentrische chromosomen onder alle gescoorde cellen. De geobserveerde distributie wordt beschouwd als de som van (a) de Poissondistributie die de bestraalde fractie van het lichaam voorstelt en (b) de overige onbestraalde fractie. Cellen die aberraties bevatten behoren tot het bestraalde deel van het lichaam, onbeschadigde cellen bestaan uit twee subpopulaties: diegene die niet blootgesteld werden en diegene die bestraald werden maar geen schade opgelopen hebben. [31] In een recente studie van Valente et al. (2015) werd onderzocht of een volledige lichaamsbestraling (Total-body irradiation of TBI) en gedeeltelijke lichaamsbestraling (Partial-body irratiation of PBI) van elkaar onderscheiden kunnen worden door gebruik van bepaalde biomerkers waaronder het dicentrisch chromosoom. In deze studie onderging de ene groep bavianen een totale lichaamsbestraling, de andere groep werd slechts gedeeltelijk blootgesteld. De verschillende biomerkers konden dan bij deze dieren vergeleken worden. Alhoewel de studie niet werd uitgevoerd op de mens, wordt de baviaan als waardig alternatief aanvaard wegens het feit dat hij dicht bij de mens staat qua genetica en fysiologie. Een baviaan blootgesteld aan 2 Gy TBI ontwikkelt ook een klassieke ARS (Acute Radiation Syndrome) zoals de mens. Uit deze studie bleek dat een PBI het best onderscheiden kan worden op basis van het dicentrisch assay 1 dag na blootstelling. Later, tussen dag 28 en dag 200 in deze studie, kon 17

24 PBI ook nog onderscheiden worden maar nam het aantal van vals positieven wel toe ten opzichte van dag 1. Dit komt doordat het moeilijker werd om PBI te onderscheiden van TBI. [32] 1.5. AUTOMATISCHE DETECTIVE Dicentrische chromosomen kunnen na kleuring (Giemsa) geanalyseerd worden met een eenvoudige lichtmicroscoop. Hierbij dient echter opgemerkt te worden dat zo n manuele telling heel erg tijdrovend is en dat dit bovendien de nodige expertise vergt. Omwille van die tijdrovendheid is automatische detectie van dicentrische chromosomen gewenst. In verschillende biologische dosimetrie labo s wordt automatische detectie momenteel op punt gesteld. De meeste groepen maken hierbij gebruik van het microscopie Metafer scanningplatform van Metasystems. Met behulp van de Metafer worden de metafase preparaten ingescand (10x vergroting), de MSearch module detecteert de metafasen en met behulp van de Autocapt module wordt daarna een opname gemaakt op grote vergroting (63x) van de geselecteerde metafasen. Automatische detectie van dicentrische chromosomen kan gebeuren met behulp van de DCScore module. Een studie uitgevoerd door Vaurijoux et al. toonde aan dat automatische detectie van dicentrische chromosomen driemaal sneller gaat dan manuele detectie. [21] Echter, tevens blijkt dat de huidige software (DCScore) slechts 50% van de manueel gescoorde dicentrische chromosomen detecteert. [33] Er is dus een verdere optimalisatie nodig van het automatisch systeem FLUORESCENTE IN-SITU HYBRIDISATIE Dicentrische chromosomen kunnen ook gevisualiseerd worden door gebruik te maken van fluorescente in-situ hybridisatie (FISH), dit zou kunnen resulteren in een meer accurate detectie van dicentrische chromosomen aangezien herkenning van een dicentrisch chromosoom veel eenvoudiger is dan bij gebruik van een Giemsa-kleuring. Bij deze methode worden fluorescent gelabelde DNA-probes gebruikt. De gebruikte fluorescente probes zijn specifiek voor sequenties ter hoogte van centromeer (pan-centromeerprobe) en telomeer (pan-telomeerprobe). (Fig. 12) Gecombineerd gebruik van telomeer- en centromeer DNA probes werd eerder reeds bekeken als mogelijkheid ter detectie van alle asymmetrische chromosomale aberraties en dit met hoge accuraatheid. [34] 18

25 Fig. 12: Voorbeeld van gebruik van PNA probes voor opsporen van dicentrische chromosomen. (TRITC=telomeerprobe (rood), FITC=centromeerprobe (groen)) (bron: eigen foto) In de studie van M kachter et al [33] rond gebruik van telomeer- en centromeerprobes werd aangetoond dat deze kleuring een grote verbetering oplevert qua gevoeligheid voor biologische dosimetrie. Wanneer met deze probes een in-situ hybridisatie wordt uitgevoerd op metafasepreparaten wordt m.b.v. een fluorescentiemicroscoop zichtbaar waar de dicentrische chromosomen zich bevinden. Zo worden overlappende chromosomen veel beter herkend, ook centromeren die dicht bij elkaar of tegen telomeren liggen worden veel beter gedetecteerd. Detectie gebeurde in deze studie met eigen ontwikkelde software (TCScore), deze bleek 95% van de manueel gescoorde dicentrische chromosomen te detecteren tegenover de eerder vermelde 50% bij gebruik van DCScore sofware. Nadeel van het uitvoeren van een FISH voor detectie van dicentrische chromosomen is de tijdsduur van het protocol, het neemt een ganse dag in beslag naast de twee dagen die nodig zijn voor uitvoeren van het eigenlijke protocol voor opsporen van dicentrische chromosomen. Voor het vaststellen van de schade bij een beperkt aantal patiëntstalen of voor wetenschappelijk onderzoek is dit geen punt, echter, bij een grootschalig stralingsaccident ligt het belang bij een snelle en grove triage eerder dan een nauwkeurige bepaling van de dosis. Onderzoek naar gebruik van FISH voor opsporen van dicentrische chromosomen en hieraan gekoppeld de ontvangen dosis staat dus voorlopig los van het gebruik ervan bij grootschalig stralingsaccident DOELSTELLING Het doel van dit onderzoek is eerst het opstellen van een dosis-respons curve voor dicentrische chromosoomaberraties via verschillende scoringsmethoden. Daarna wordt de bruikbaarheid van de scoring van dicentrische chromosomen versus MN vergeleken voor partiële lichaamsbestraling. Finaal wordt ook nog nagegaan of FISH-TC-gekleurde preparaten eenvoudiger te scoren zijn dan Giemsa-gekleurde slides. 19

26 2. MATERIALEN EN METHODEN 2.1. DE DICENTRISCHE TEST PRINCIPE Wanneer door straling DNA-dubbelstrengbreuken ontstaan, kunnen deze aanleiding geven tot dicentrische chromosoomaberraties. Met de dicentrische test worden deze aberraties opgespoord en gekwantificeerd. Door bloedstalen in-vitro te bestralen met verschillende dosissen kan een dosis-respons curve worden opgesteld. Deze kan dan gebruikt worden als calibratiecurve om in vivo dosisblootstelling bij een accident te onderzoeken. Na het in-vitro bestralen van de bloedstalen worden de lymfocyten gestimuleerd worden tot deling door middel van PHA. De delende lymfocyten worden m.b.v. colcemid stilgelegd in metafase. De verzamelde metafasen worden gekleurd via de Romanowsky-Giesma kleuring en in beeld gebracht via een Zeiss lichtmicroscoop met het Metafer scanningplatform en beeldanalyse systeem METHODOLOGIE BESTRALING Bloedstalen afkomstig van vrijwillige donoren worden bestraald bij 37 C (warmwaterbad) met verschillende dosissen gaande van 0-4,5 Gy gammastralen ( 60 Co bron), dosistempo 1 Gy per 7 minuten. Voor het onderzoek van partiële lichaamsbestraling wordt bestraald bloed (met verschillende dosissen) gemengd worden met onbestraald bloed in verschillende verhoudingen BLOEDCULTUREN Per dosispunt worden twee cultuurflessen (25cm 2 ) bereid met daarin 4 ml crpmi (500 ml RPMI-1640 (Gibco) + 5 ml L-glutamine (Gibco)+ 2,5 ml peniciline/streptomycine(gibco)) 0,5ml FCS (Gico), 0,5 ml bloed en 100µl PHA (Gibco). De cultuurflessen worden in een incubator (5% CO2) geplaatst (37 C). Na 24uur wordt 50µl colcemid (10µg/ml) (Serva) toegevoegd. (0,5µg in 5ml cultuur) Na 48uur worden de culturen geoogst. 20

27 OOGSTEN VAN DE CULTUREN EN FIXEREN VAN DE CELLEN De bloedculturen worden overgebracht in proefbuizen en gecentrifugeerd (8min, 1000 rpm). Het supernatant wordt verwijderd en 5ml KCl (75 mm, 37 C) (Sigma) wordt langzaam toegevoegd al vortexend. Dit wordt gedurende 15min geïncubeerd bij 37 C. Daarna wordt de celsuspensie gecentrifugeerd (8min, 1000 rpm), het supernatant wordt weer verwijderd. 5ml methanol/azijnzuur (3/1, 4 C) oplossing wordt traag toegevoegd al vortexend. Na opnieuw 8 min te centrifugeren bij 1000 rpm wordt het supernatant verwijderd. De fixatiestappen worden tot 3 keer herhaald, tot het fixatief boven de cellen helder is. Voor het maken van de preparaten wordt gebruik gemaakt van glaasjes die bewaard worden in een gekoelde methanoloplossing (1% methanol in aq. dest., 4 C). Op een nog nat draagglas wordt 40 µl celsuspensie gedruppeld. Eenzelfde volume fixatief (methanol/ijsazijn, 3:1) wordt vervolgens op de slides aangebracht voor een betere spreiding van de metafasen ROMANOWSKY-GIEMSA KLEURING Bereiden van de oplossing: De Romanowsky-Giesma oplossing bestaat uit 80 ml Azuur B en 20 ml Eosine Y. (Merck) De Hepesbuffer-werkoplossing wordt gemaakt door 300ml Hepesbuffer-stockoplossing samen te voegen met 700 ml gedestilleerd water (0,03 M, ph 6,5) (Serva-Heidelberg). Voor de hepesbuffer-stockoplossing wordt 900 ml oplossing A samengebracht met 100 ml oplossing B (0.1 M, ph 6.5). Oplossing A (Hepes-zuur) bestaat uit 23,83 g in 200 ml gedestilleerd water aangelengd tot 1 liter. Oplossing B (Hepes-zout) bestaat uit 26 g opgelost in 200 ml gedestilleerd water aangelengd tot 1 liter. Hepesbuffer-stockoplossing kan verschillende maanden bewaard worden op 4 C. Een kleuringscuvet wordt gevuld met 3ml R-G kleuring + 75ml Hepes bufferoplossing (1/25). Deze oplossing wordt gemaakt net voor gebruik, ze blijft stabiel gedurende 1u en wordt slechts éénmaal gebruikt. De slides worden gekleurd door 3 min in de kleuringscuvet te laten, gedurende deze tijd dient alles afgeschermd te worden van licht door gebruik van een pot met daarrond aluminiumfolie aangebracht. Na 3 min worden de slides gespoeld in 2 baden van gedestilleerd water. Daarna dienen de slides aan de lucht gedroogd te worden, afgeschermd van stof. Na enkele uren drogen kan afgedekt worden door middel van DPX (3 druppels). Dit dient tenslotte 1 dag in een oven van 50 C gedroogd te worden. 21

28 ANALYSE Voor analyse worden de met Giemsa gekleurde metafase preparaten ingescand met de Metafer op een 10X vergroting. De MSearch module detecteert automatisch de metafasen op het ingescande preparaat. De gedetecteerde metafasen worden met de Autocapt module vervolgens op grote vergroting (63X) gescand. Voor een automatische scoring van dicentrische chromosomen wordt na het inscannen van de preparaten gebruik gemaakt van de DCScore module. Deze detecteert op een volledig automatische manier de dicentrische chromosomen in de ingescande metafasen. Een semi-automatische scoring is ook mogelijk door de metafasen waarin de DCscore module één of meerdere dicentrische chromosomen detecteerde te overlopen en te corrigeren voor vals positieve of niet-gedetecteerde dicentrische chromosomen. Tenslotte kan er ook manueel gescoord worden door alle ingescande metafasen manueel te analyseren voor dicentrische chromosomen VERWERKING RESULTATEN DOSIS-RESPONS CURVES VOLLEDIGE LICHAAMSBESTRALING Giemsa-gekleurde preparaten voor 12 dosispunten afkomstig van 2 gezonde donoren worden gescoord op de 3 mogelijke scoringswijzen. Voor elke donor worden twee slides per dosispunt gescoord. Op basis van de scoringsresultaten wordt een dosis-respons curve opgesteld. De dosis-respons curves voor de drie verschillende scoringsmethodes worden opgesteld. Het bepalen van de exacte vergelijking gebeurt met behulp de software DoseEstimate die specifiek ontwikkeld is voor biologische dosimetrie-doeleinden. In de optie Yield curve fitting wordt op basis van ingevoerde scoringsresultaten (Dosis, aantal gescoorde metafasen en aantal gescoorde aberraties) de vergelijking van de hiermee overeenkomstige curve bepaald. Voor het bepalen van de statistische significantie tussen de curves wordt de Wilcoxon signedrank test gebruikt. Voor deze test hoeven de populaties enkel dezelfde soort verdeling te hebben, een normale verdeling is niet vereist in tegenstelling tot de t-test PARTIËLE LICHAAMSBESTRALING Op basis van bloedculturen afkomstig van 2 gezonde donoren zijn preparaten beschikbaar die 20 situaties van partiële lichaamsbestraling nabootsen. De preparaten zijn beschikbaar voor zowel dicentrische chromosomen als micronucleï en dit voor identieke situaties van partiële 22

29 lichaamsbestraling. Voor elke donor is een A- en B-slide beschikbaar voor 20 verschillende situaties van partiële lichaamsbestraling. Er worden dus voor alle 20 situaties 2 slides per donor gescoord en dit op een manuele manier. Voor de verdere verwerking van de scoringsresultaten wordt gebruik gemaakt van de sofware CABAS. [35] Per slide wordt het scoringsresultaat ingevoerd waarna de software een schatting maken van de Whole body dose (WBD), Partial body dose (PBD) en %Exposed. De PBD is de dosis waaraan het bestraalde lichaamsvolume blootgesteld werd, %Exposed is het volume van het lichaam dat bestraald werd en de WBD is een fictieve dosis dat waaraan het volledige lichaam blootgesteld zou zijn als het geen partiële maar volledige lichaamsbestraling zou betreffen. Bedoeling van het bepalen van deze waarden is om op basis van de scoringsresultaten te bekijken of een partiële lichaamsbestraling gedetecteerd kan worden aan de hand van de verdeling van het aantal gescoorde dicentrische chromosomen. (Poisson-verdeling of niet) 2.2. FISH MET CENTROMEER EN TELOMEER PROBES PRINCIPES Naast de Romanowsky-Giesma kleuring, die de vorm van het dicentrisch chromosoom duidelijk weergeeft, kunnen fluorescente DNA probes gebruikt worden om bepaalde delen van de chromosomen aan te kleuren. Pan-centromeer en pan-telomeer probes zullen via in-situ hybridisatie respectievelijk met alle centromeren en telomeren hybridiseren. De pancentromeer probe is gelabeld met FITC (Fluorescein isothiocyanate), de pan-telomeer probe is gelabeld met TRITC (Tetramethylrhodamine). DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindool) DNAkleuring wordt gebruikt om de chromosomen aan te kleuren. De combinatie van de fluorescente probes met DAPI geeft met behulp van fluorescentie-microscopie een duidelijk beeld van uitwisselingen tussen chromosomen METHODOLOGIE De metafase preparaten verkregen na het fixeren van de cellen (zonder Giesma kleuring) worden gewassen in PBS (1x 5min, kamertemperatuur). Daarna worden ze gefixeerd met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Na nog 3 wasbeurten in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur kan 100µl pepsine (0,1mg/ml) aangebracht 23