DE ROL VAN APOLIPOPROTEINE AI (APO AI) EN DE ATP BINDENDE CASSETTE TRANSPORTER A1 (ABCA1) BIJ HET CHOLESTEROL METABOLISME.

Transcriptie

1 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen Vakgroep Biochemie Labo Lipoproteïne Chemie DE ROL VAN APOLIPOPROTEINE AI (APO AI) EN DE ATP BINDENDE CASSETTE TRANSPORTER A1 (ABCA1) BIJ HET CHOLESTEROL METABOLISME. Stein Roosbeek Promotor : Prof. Dr. J. Vandekerckhove Co-Promotor : Prof. Dr. M. Rosseneu Proefschrift voorgelegd tot het verkrijgen van de graad van doctor in de wetenschappen-biotechnologie

2 I. Inleiding...6 II. De lipoproteïnen Algemeen Indeling van de lipoproteïnen De apolipoproteïnen De apolipoproteïnen B Apolipoproteïne B De uitwisselbare apolipoproteïnen III. Apolipoproteïne B bevattende lipoproteïnen en het voorwaarts cholesterol transport Transport van exogeen cholesterol door de chylomicronen Transport van endogeen cholesterol door VLDL, IDL en LDL Het atherogeen effect van de apo B bevattende lipoproteïnen...17 IV. HDL en het omgekeerd cholesteroltransport Efflux van cholesterol uit de cel Hermodellering van HDL Transport van HDL cholesterolesters naar de lever De beschermende rol van HDL...23 V. Apolipoproteïne AI Algemeen De strucuur van humaan apo AI Conformatie van apo AI in HDL partikels Eigenschappen van het apo AI Lipide binding Activatie van LCAT Apo AI als ligand voor de ATP binding cassette A1 (ABCA1) transporter Natuurlijke mutanten van humaan apo AI VI. Het lecithine : cholesterol acyltransferase (LCAT) Algemeen De enzymatische werking van het LCAT enzym Het katalytisch mechanisme van LCAT Structuur van het LCAT enzym Substraten van LCAT Natuurlijke mutanten van LCAT...41 VII. De ATP-bindende cassette A1 (ABCA1) transporter ABC transporters : algemeen De structuur van een ABC transporter Interactie tussen verschillende domeinen tijdens transport van het substraat Evolutie van de ABC transporters De rol van humane ABC transporters bij het lipide metabolisme De ABCA subfamilie De ABCA1 transporter Algemeen

3 7.2. Functies van de ABCA1 transporter De rol van ABCA1 bij het cholesterol transport De ziekte van Tangier Lokalisatie van de ABCA1 transporter in de cel Het mechanisme van de lipide-efflux door ABCA a) De interactie van ABCA1 met apo AI...60 b) Fosfolipiden en cholesterol Regulatie van de ABCA1 transporter ABCAI flippase activiteit, fosfolipiden en apoptose VIII. Doelstelling...70 IX. Drie arginine residu s in apolipoproteïne A-I zijn belangrijk voor de activatie van lecithine:cholesterol acyltransferase X. Expressie en activiteit van de Nucleotide Bindende Domeinen van de humane ABC-A1 transporter XI. Karakterisering van de ABCA transporter subfamilie: identificatie van prokaryote en eukaryote leden en topologie...82 XII. Fosforylatie door proteïne kinase CK2 moduleert de activiteit van de ATPbindende cassette A1 (ABCA1) transporter XIII. Samenvatting en besluiten XIV. English summary XV. Referentielijst

4 Gebruikte afkortingen. ABC ATP-bindende cassette ACAT acyl : coenzymea acyltransferase ALDR adrenoleukodystrophy-related gene Apo apolipoproteïne ATP adenosine trifosfaat CAMP cyclisch adenosine monofosfaat CE cholesterolester CETP cholesterolester transfer proteïne CFTR cystic fibrosis transmembrane regulator CK2 caseine kinase 2 CM chylomicronen DAG diacylglycerol DMPC dimyristoyl fosfatidylcholine DNA desoxyribonucleïnezuur DPPC dipalmitoyl fosfatidylcholine FED Fish Eye Disease FHD Familiale HDL Deficiëntie FL fosfolipide FLD Familiale LCAT Deficiëntie GFP green fluorescent protein HBP HDL bindend proteïne HDL hoge densiteits lipoproteïnen HisP histidine permease HL hepatisch lipase HTGL hepatisch triglyceride lipase IDL intermediaire densiteits lipoproteïnen IFN-γ interferon-gamma LCAT lecithine cholesterol acyltransferase LDL lage densiteits lipoproteïnen LPL lipoproteïne lipase LRP LDL receptor related proteïne LXR lever X receptor MDR multidrug resistentie mrna messenger ribonucleïnezuur MSD membraan overspannend domein NBD nucleotide bindend domein NMR nucleaire magnetische resonantie PA fosfatidylzuur PAF platelet activating factor PC fosfatidylcholine PE fosfatidylethanolamine PEST peptide sequentie zeer rijk aan proline (P), glutaminezuur (E), serine (S) en threonine (T) residu s PI fosfatidylinositol PIP fosfatidylinositol 4-fosfaat PIP 2 fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat 3

5 PKA PKC PLTP POPC PS R-domein RHDL RXR SCD SDS-PAGE SM SR-BI TG VC VLDL WT proteïne kinase A proteïne kinase C fosfolipide transfer proteïne palmitoyloleoyl fosfatidylcholine fosfatidylserine regulerend domein gereconstrueerde HDL partikels retinoid X receptor stearyol CoA desaturase natrium dodecyl sulfaat polyacrylamide gelelektroforese sfingomyeline scavenger receptor BI triglyceride vrij cholesterol zeer lage densiteits lipoproteïnen wild type 4

6 Inleiding 5

7 I. Inleiding. Cardiovasculaire aandoeningen als gevolg van atherosclerose zijn nog steeds de belangrijkste doodsoorzaak in de geïndustrialiseerde landen. Een teveel aan plasma cholesterol zorgt voor de accumulatie van cholesterol aan de binnenwand van de bloedvaten hetgeen resulteert in de vorming van atherosclerotische letsels die voornamelijk bestaan uit cholesterol, cholesterol esters, macrofagen en later collageen. De belangrijkste risicofactoren voor de ontwikkeling van atherosclerose zijn een verhoogd cholesterolgehalte in de lage densiteits lipoproteïnen (LDL), hyperlipidemie, roken en overgewicht. Het cholesterolgehalte in de hoge densiteits lipoproteïnen (HDL) vertoont echter een inverse correlatie met het risico op hartziekten. Dit kan toegeschreven worden aan de beschermende rol van de HDL in het omgekeerd cholesterol transport waarbij een teveel aan cholesterol in de perifere weefsels voor afbraak naar de lever getransporteerd wordt (Gordon et al., 1977; Miller, 1980). Efflux van cholesterol uit de perifere cellen is de eerste stap in het omgekeerd cholesterol transport. Deze cellulaire efflux kan enerzijds gebeuren door een niet selectieve diffusie van membraancholesterol gevolgd door incorporatie in HDL partikels (Phillips et al., 1987; Johnson et al., 1991). Anderzijds kan de efflux gebeuren door actief transport van intracellulair cholesterol op een selectieve apolipoproteïne-gemedieerde manier. Fosfolipiden en cholesterol worden door de ATP-bindende cassette A1 (ABCA1) transporter naar het celoppervlak getransporteerd en door apolipoproteïne AI (apo AI) gebonden. Dit resulteert in de vorming van nieuwe HDL precursoren (Hara et al., 1991; Hara et al., 1992). In deze HDL precursoren wordt vervolgens vrij cholesterol veresterd door het plasma enzyme lecithine cholesterol acyltransferase (LCAT) waardoor matuur HDL gevormd wordt. LCAT speelt dus, samen met zijn belangrijkste activator, het apo AI (Fielding et al., 1972), een belangrijke rol in het metabolisme van de HDL en in het omgekeerd cholesterol transport. 6

8 In dit werk hebben wij de gecombineerde rol van apo AI als cholesterol acceptor en LCAT activator, samen met de rol van de ABCA1 transporter bestudeerd, in het bijzonder in het kader van het omgekeerd cholesterol transport en van de beschermende rol van HDL bij atherosclerose. 7

9 II. De lipoproteïnen. 1. Algemeen. Lipiden spelen een belangrijke rol in het lichaam. Fosfolipiden en cholesterol zijn essentiële bouwstenen van de celmembraan. Cholesterol is eveneens een precursor voor steroïdhormonen, galzouten en vitamine D. Triglyceriden zijn noodzakelijk als bron van energie. In het plasma worden deze hydrofobe lipiden getransporteerd door wateroplosbare lipoproteïnen. Lipoproteïnen zijn sferische partikels opgebouwd uit lipiden en apolipoproteïnen. De buitenste laag van deze complexen bestaat uit amfifiele fosfolipiden, vrij cholesterol en apolipoproteïnen, en omringt een hydrofobe kern bestaande uit neutrale lipiden (cholesterolesters en triglyceriden). De hydrofobe zijde van de amfifiele componenten is gericht naar de hydrofobe kern van het partikel, terwijl de hydrofiele zijde naar de waterige fase gericht is (Figuur 1). Onder invloed van lipolytische enzymen en lipide transporteiwitten treedt een continue uitwisseling van de lipide- en eiwitcomponenten op tussen de verschillende lipoproteïne-klassen. Figuur 1 : Schematische voorstelling van een lipoproteïne partikel. 8

10 2. Indeling van de lipoproteïnen. Lipoproteïnen worden meestal ingedeeld op basis van hun densiteitsverschillen, waarop hun scheiding via ultracentrifugatie gebaseerd is (Havel et al., 1955). De densiteit wordt bepaald door de lipide/proteïne verhouding en varieert tussen <0.95 en 1.21 g/ml. In Tabel 1 worden de fysicochemische eigenschappen, de samenstelling en de functie van de verschillende lipoproteïnen samengevat. Chylomicronen worden gesynthetiseerd in de darm en transporteren de exogene lipiden naar de lever en de perifere weefsels. Ze bestaan uit meer dan 95% lipiden (vnl. triglyceriden) en worden zeer snel gekataboliseerd. VLDL (zeer lage densiteits lipoproteïnen) worden gevormd in de lever en bestaan voor 90% uit lipiden (vnl. triglyceriden). Ze zorgen voor het transport van endogene triglyceriden vanuit de lever naar de perifere weefsels. IDL (intermediaire densiteits lipoproteïnen) worden gevormd uit de VLDL door hydrolyse van hun triglyceriden door het lipoproteïne lipase (LPL) en het hepatisch lipase (HL). LDL (lage densiteits lipoproteïnen) worden door verdere hydrolyse gevormd uit IDL en bestaan voor 75% uit lipiden (vnl. cholesterolesters). HDL (hoge densiteits lipoproteïnen) zijn de kleinste lipoproteïne-partikels en bevatten 50% lipiden en 50% proteïnen. Ze transporteren lipiden (vnl. cholesterol) vanuit de perifere weefsels naar de lever. HDL zijn een heterogene verzameling van lipoproteïne partikels waarbij nascente HDL schijfvormig zijn, terwijl mature HDL sferische partikels zijn. Lipoproteïnen kunnen eveneens ingedeeld worden op basis van hun electroforetische mobiliteit (α, β, pre-β of γ) of op basis van hun apolipoproteïne samenstelling. 9

11 VLDL IDL LDL HDL2 HDL3 Densiteit (g/ml) < Elektroforetische - pre-β tussen β en pre-β β α α mobiliteit Molecuulmassa (Da) x x x x x x 10 5 Diameter (nm) % Lipide triglyceriden vrij cholesterol cholesterolesters fosfolipiden % Apolipoproteïnen apo AI apo AII apo B apo C apo E spoor spoor Synthese in de darm in de lever uit VLDL uit IDL in de darm en lever Afbraak Functie lipolyse van de triglyceriden transport van exogene triglyceriden in plasma, o.i.v. lipoproteïne lipase tot IDL transport van vnl. endogene triglyceriden tot LDL precursor van LDL lysosomale hydrolyse van de componenten transport van cholesterol in bloed spoor spoor opname door de lever opname van cellulair cholesterol en transport naar de lever Tabel 1 : Algemene eigenschappen van de verschillende soorten lipoproteïnen. 10

12 3. De apolipoproteïnen. Apolipoproteïnen zijn eiwitten die in het plasma met lipiden kunnen associëren tot een lipoproteïne partikel. Naast hun functie als structureel element spelen ze een belangrijke rol bij het transport en de herverdeling van de lipiden. Ze worden door cellulaire receptoren herkend en kunnen ook activatoren of inhibitoren zijn van enzymen en van lipide-transferproteïnen. De eigenschappen en functies van de verschillende apolipoproteïnen zijn samengevat in Tabel 2. Apolipoproteïnen worden onderverdeeld in twee grote groepen. De apolipoproteïnen AI, AII, AIV, CI, CII, CIII en E zijn wateroplosbare eiwitten die kunnen uitwisselen tussen de verschillende lipoproteïne partikels. De apolipoproteïnen van de apo B familie daarentegen zijn niet wateroplosbaar en blijven in plasma steeds geassocieerd met hetzelfde lipoproteïne partikel De apolipoproteïnen B. Apo B komt voor in twee vormen; apo B-100 en apo B-48. Het is het meest hydrofobe apolipoproteïne en bestaat uit twee types repetitieve segmenten : de amfipatische helicoidale segmenten zoals deze in de uitwisselbare apolipoproteïnen enerzijds en proline-rijke domeinen anderzijds (De Loof et al., 1987). Deze prolinerijke domeinen zijn specifiek voor apo B en kunnen bijdragen tot de lipide bindende eigenschappen van het proteïne Apolipoproteïne B-100. Apo B-100 wordt gesynthetiseerd in de lever en is opgebouwd uit 4536 aminozuren en heeft een moleculair gewicht van 549 kda (Chen et al., 1986). Het is de enige proteïnecomponent van LDL en komt ook voor in VLDL en IDL. Apo B-100 bezit, net zoals apo E, heparine-bindende domeinen die instaan voor de binding van triglyceriderijke lipoproteïnen op de endotheelcellen, waar hydrolyse van de triglyceriden plaatsvindt. 11

13 Apo Moleculair gewicht (kda) Concentratie in plasma (g/l) Lipoproteïnedistributie Syntheseplaats Functie AI CM,HDL lever structurele rol in HDL, cholesterol efflux, activeert LCAT, is ligand voor de ABCA1 transporter AII HDL lever structurele rol in HDL, moduleert HTGL AIV HDL dunne darm,lever structurele rol in HDL, cholesterol efflux, activeert LCAT B variabel CM dunne darm biosynthese, secretie en structurele integriteit van chylomicronen B VLDL,IDL,LDL lever biosynthese en secretie van VLDL, structurele rol in LDL en VLDL, ligand apo B/E receptor CI CM,VLDL,HDL lever activeert LCAT, LPL inhibitor CII CM,VLDL,HDL lever,darm belangrijkste LPL activator CIII CM,VLDL,HDL lever inhibeert LPL en HTGL E CM,VLDL,IDL, HDL lever, hersenen, macrofagen ligand voor apo B/E receptor, LRP-receptor en VLDL-receptor Tabel 2 : Eigenschappen en functies van de belangrijkste apolipoproteïnen 12

14 3.2. De uitwisselbare apolipoproteïnen. De wateroplosbare apolipoproteïnen behoren tot dezelfde multigenfamilie (Li et al., 1988). Evolutionair gezien zijn de uitwisselbare apolipoproteïnen allen afkomstig van het apo CI. Duplicaties van 11 codons en van volledige genen leidde tot het ontstaan van de andere wateroplosbare apolipoproteïnen. Een schematisch overzicht van de evolutie van deze apolipoproteïne genen wordt weergegeven in Figuur 2 (Luo et al., 1986). Figuur 2: schematische voorstelling van de evolutie van de genen van wateroplosbare apolipoproteïnen. : gen duplicatie; : duplicatie van 11 of 22 codons; x: deletie van 11 codons. Het gen dat codeert voor apo AII bevindt zich op chromosoom 1, de apo AI, CIII en AIV genen zijn gelocaliseerd op chromosoom 11, terwijl de apo E, CI en CII genen een cluster vormen op chromosoom 19 (Li et al., 1988). De genstructuur van deze genen bestaat uit vier exons, met uitzondering van het apo AIV gen dat slechts drie exons bevat. Het eerste intron bevindt zich steeds in het 5 deel van het gen, het deel dat niet voor proteïne codeert. Het tweede intron is 13

15 gesitueerd bij de signaal-peptide splitsingsplaats, en het zijn exon 3 en 4 die coderen voor het matuur apolipoproteïne (Figuur 3) (Li et al., 1988). Het laatste exon is voornamelijk opgebouwd uit repetitieve segmenten van 33 baseparen die coderen voor 11 aminozuren lange repeats. Twee dergelijke repeats vormen een basissegment dat instaat voor de vorming van amfipatische helices opgebouwd uit 22 residu s (Li et al., 1988). Figuur 3: Overzicht van de gen structuur van de uitwisselbare apolipoproteïnen. De zwarte balken stellen de exons voor met vermelding van het aantal nucleotiden waaruit ze zijn opgebouwd. Amfipatische alfa helices of amfipatische beta vouwbladen (enkel in apo B) vormen het lipide-bindend motief van de apolipoproteïnen (Figuur 4) (Segrest et al., 1974). Hierbij bindt de hydrofobe zijde van deze structuurelementen aan de lipiden, terwijl de hydrofiele zijde naar de waterige fase gericht is. 14

16 Figuur 4 : Voorbeeld van een amfipatische helix in apolipoproteïne AI (residu ). A: de helix is loodrecht geprojecteerd ten opzichte van de lengteas; zwart : hydrofobe residu s, groen : neutraal hydrofiel, blauw : positief geladen hydrofiel, rood : negatief geladen hydrofiel. In sferische HDL partikels bevinden deze amfipatische helices zich tussen de polaire hoofdgroepen van de fosfolipiden. Hierbij is de hydrofobe zijde van de helix naar de hydrofobe kern van het partikel gericht (Atkinson et al., 1974). In schijfvormige HDL vormen de helices een ring rond de dubbellaag van fosfolipiden en cholesterol (Wlodawer et al., 1979). Er werden twee modellen voorgesteld voor de conformatie van het apolipoproteïne AI in de schijfvormige HDL partikels : het picket-fence model en het riem model (zie Hoofdstuk V.: Apolipoproteïne AI). 15

17 III. Apolipoproteïne B bevattende lipoproteïnen en het voorwaarts cholesterol transport. 1. Transport van exogeen cholesterol door de chylomicronen. Tijdens de spijsvertering worden de exogene lipiden gehydrolyseerd tot monoacylglycerolen, lysofosfolipiden, cholesterol en vetzuren. Na absorptie in de darm worden deze componenten gebruikt voor de synthese van triglyceriden, cholesterolesters en fosfolipiden die samen met het apo B-48 en met apo AI, AII en AIV de chylomicronen vormen. Deze triglyceriderijke chylomicronen worden door de lymfevaten van de darm gesecreteerd en komen vervolgens in de bloedstroom terecht. In het bloed wisselen ze dan hun apo A apolipoproteïnen uit met apo E en apo C afkomstig van HDL partikels (Green en Glickman, 1981; Eisenberg, 1990). Ter hoogte van de spieren en vetweefsel worden de triglyceriden snel gehydrolyseerd door het lipoproteïne lipase (LPL). Hierdoor ontstaat er aan het oppervlak van de chylomicronen een overschot aan fosfolipiden en apo C, die getransfereerd worden naar HDL partikels. De met apo E en cholesterolesters aangerijkte chylomicron restpartikels worden vervolgens in de lever opgenomen door het LDL receptor related proteïne (LRP) en door de LDL receptor (Beisiegel et al., 1989). 2. Transport van endogeen cholesterol door VLDL, IDL en LDL. Endogene triglyceriden en cholesterol worden door de lever gesynthetiseerd en in het plasma gesecreteerd als VLDL partikels. Door hydrolyse van de triglyceriden door het lipoproteïne lipase worden apo C en fosfolipiden getransfereerd naar HDL en worden de VLDL omgezet in kleinere VLDL remnants en IDL partikels, die door de apo B/E en LRP receptoren van de lever worden heropgenomen (Dolphin, 1992). 10 tot 20% van de IDL worden echter door inwerking van het hepatisch triglyceride lipase verder omgezet in kleinere LDL partikels (Havel, 1984). Door inwerking van het cholesterolester transfer proteïne (CETP) wisselen de VLDL en LDL partikels hun triglyceriden uit met cholesterolesters in de HDL partikels. De cholesterolester-rijke LDL partikels worden uiteindelijk in de lever en in de perifere cellen opgenomen door de apo B/E receptoren (Figuur 5). 16

18 Figuur 5: Het metabolisme van de VLDL partikels. LPL: lipoproteïne lipase ; HTGL: hepatisch triglyceride lipase ; CETP: cholesterolester transfer proteïne ; CE: cholesterolester ; VZ: vetzuur ; TG: triglyceride ; PL: fosfolipide. 3. Het atherogeen effect van de apo B bevattende lipoproteïnen. Een verhoogde LDL concentratie in het plasma leidt tot een accumulatie van LDL partikels in de subendotheliale intima van de arteriën en tot de ontwikkeling van initiële atherosclerotische letsels. Onder invloed van vrije radicalen worden vetzuurketens in LDL omgezet in lipide hydroperoxiden, die verder omgezet worden tot aldehyden. Deze aldehyden kunnen de lysine residu s op apo B modificeren. Deze geoxideerde LDL partikels worden via scavenger receptoren en via ox-ldl receptoren opgenomen door monocyten. In tegenstelling tot opname via de apo B/E receptor vertoont deze opname van geoxideerd LDL geen down-regulatie. Dit leidt tot een accumulatie van cholesterol en cholesterolesters in de cel, waardoor de macrofagen omgevormd worden tot 17

19 schuimcellen (Brown en Goldstein, 1983). Schuimcellen en endotheelcellen secreteren chemotactische elementen en groeifactoren waardoor gladde spiercellen uit de media in de intima migreren, waarna ze prolifereren. Door de accumulatie van lipiden en de vorming van bindweefsel vormen de initiële letsels zich dan om tot atherosclerotische letsels (Stary et al., 1995). IV. HDL en het omgekeerd cholesteroltransport. Cholesterol is een essentiële bouwsteen van cellulaire membranen en is een belangrijke precursor voor galzouten en voor steroid hormonen. Alle lichaamscellen kunnen dan ook cholesterol zelf aanmaken, en deze biosynthese is de belangrijkste bron voor cholesterol in het menselijk lichaam (Dietschy et al., 1993). Enkel de levercellen en de steroid hormoon producerende cellen in de gonaden en de bijnier zijn echter in staat om cholesterol af te breken. Om cholesterolaccumulatie in extrahepatische cellen tegen te gaan wordt het cholesterol opgenomen door de hoge densiteits lipoproteïnen (HDL) en getransporteerd naar de lever. In de lever wordt een deel van het vrije cholesterol gebruikt voor de synthese van VLDL, en een deel wordt geëxcreteerd in de gal. De opname van cholesterol uit de perifere cellen en het transport ervan door HDL naar de lever wordt het omgekeerd cholesterol transport genoemd, en speelt een belangrijke rol bij cellulaire cholesterol homeostase. Er zijn drie belangrijke stappen te onderscheiden (Figuur 6): - de efflux van vrij cholesterol uit de perifere cellen en de opname door precursor HDL partikels - de verestering van vrij cholesterol door het LCAT enzyme met hermodellering van de HDL - de opname van LDL en HDL cholesterol door de lever 18

20 Figuur 6: Schematische voorstelling van het omgekeerd cholesterol transport : 1) de efflux door ABCA1 van vrij cholesterol uit de cel naar apo AI, met vorming van prebeta HDL 2) de verestering van vrij cholesterol in HDL door het LCAT enzyme, 3) transfer van de bekomen cholesterolesters naar apo B-bevattende lipoproteïnen door CETP, 4) opname van de cholesterolesters door de lever. 1. Efflux van cholesterol uit de cel. De efflux van cholesterol uit de cel naar extracellulaire acceptoren is de eerste stap van het omgekeerd cholesterol transport, en gebeurt via twee verschillende mechanismen: passieve diffusie en apolipoproteïne gemedieerde efflux. Het aandeel van beide mechanismen in de totale efflux van cholesterol is afhankelijk van de toestand van de cel; passieve diffusie speelt vooral een rol in groeiende cellen terwijl apolipoproteïne gemedieerde efflux belangrijker is in cholesterolrijke en nietgroeiende cellen (Oram en Yokoyama, 1996). 19

21 De apolipoproteïne-gemedieerde cholesterol efflux (Oram en Yokoyama, 1996) wordt hoofdzakelijk gemedieerd door de belangrijkste proteïnecomponent van HDL, apo AI. In serum komen een klein deel van apo AI en apo AIV voor als vrije apolipoproteïnen die niet met lipoproteïne partikels geassocieerd zijn (Lefevre et al., 1988). Deze lipide-vrije apolipoproteïnen mediëren de cellulaire cholesterol efflux en de hiermee nauw geassocieerde fosfolipide efflux door interactie met cellulaire receptoren of door binding met specifieke componenten in de celmembraan. Dit leidt niet enkel tot de efflux van cholesterol uit de celmembraan, maar stimuleert bovendien de mobilisatie van intracellulair cholesterol dat door inwerking van het acylcoa : acyltransferase (ACAT) enzyme in de cel opgeslagen werd als cholesterolesters. In tegenstelling tot de passieve diffusie is deze apolipoproteïne gemedieerde cholesterol efflux een actief proces dat ATP afhankelijk is, waarbij proteïne kinase C (PKC) geaktiveerd wordt en dat geïnhibeerd wordt door inhibitoren van het Golgi transport (Mendez et al., 1991; Mendez en Uint, 1996; Mendez, 1997). Verschillende membraangebonden proteïnen werden geïdentificeerd als mogelijke apolipoproteïne receptoren: - HDL bindend proteïne (HBP): het overladen van cellen met cholesterol leidt tot overexpressie van HBP en tot een verhoogde HDL binding (McKnight et al., 1992). - ATP-binding cassette A1 (ABCA1): in 1999 werd aangetoond dat mutaties in het ABCA1 gen verantwoordelijk zijn voor de ziekte van Tangier (Brooks-Wilson et al., 1999; Bodzioch et al., 1999; Rust et al., 1999). Deze ziekte wordt gekarakteriseerd door verlaagde concentraties plasma HDL-cholesterol en apo AI. Fibroblasten met niet functionele ABCA1 hebben een defectieve apolipoproteïne gemedieerde cholesterol efflux, terwijl de niet-specifieke diffusie van cholesterol uit de cel behouden blijft (Francis et al., 1995). Door middel van immunoprecipitatie en fluorescentie energie transfer metingen werd een directe interactie tussen ABCA1 en apo AI gesuggereerd (Wang et al., 2000; Chambenoit et al., 2001). 20

22 De belangrijkste initiële acceptoren van cellulair cholesterol zijn de apo AI bevattende pre-β1 HDL partikels (Castro en Fielding, 1988). Efflux van cholesterol via deze partikels maakt 60% uit van de totale cholesterol efflux en gebeurt via het apolipoproteïne gemedieerde proces, en niet via diffusie van cholesterol (Kawano et al., 1993). Na de passieve diffusie van cholesterol vanuit de plasmamembraan naar de waterige fase rondom de cellen kan het cholesterol vervolgens binden aan extracellulaire acceptoren zoals de HDL partikels (Phillips et al., 1987). Deze niet-selectieve cholesterol diffusie vereist geen directe interactie tussen de acceptor partikels en de celmembraan en vertoont een brede acceptorspecificiteit: vrijwel elk partikel dat cholesterol kan binden kan op deze manier cellulair cholesterol opnemen (Kilsdonk et al., 1995). Bovendien gebeurt de diffusie van cholesterol zowel van de cel naar de acceptor als omgekeerd, de richting waarin netto efflux gebeurt is afhankelijk van de hoeveelheid vrij cholesterol in de celmembraan en in het acceptor partikel. 2. Hermodellering van HDL. Door opname van fosfolipiden en cholesterol uit de cel worden de pre-β1 HDL partikels snel omgezet in pre-β2 partikels en vervolgens in pre-β3 partikels (Francone et al., 1989). Deze pre-β3 partikels vormen een goed substraat voor de verestering van cholesterol door het LCAT enzyme (Wong et al., 1992). LCAT zet amfifiele cholesterolmoleculen om in apolaire cholesterolesters die migreren naar de hydrofobe kern van het partikel. Dit draagt bij tot de omzetting van de schijfvormige pre-β partikels in sferische α-hdl3 (Glomset, 1968). Cholesterolverestering door LCAT en incorporatie van cholesterol en fosfolipiden, die vrijgesteld worden uit triglyceriderijke lipoproteïnen door inwerking van lipoproteïne lipase, zorgen ervoor dat de HDL3 partikels omgezet worden in grotere HDL2 partikels (Patsch et al., 1978). Deze omzetting wordt bevorderd door het fosfolipide 21

23 transfer proteïne (PLTP) dat fusie van HDL3 partikels induceert waarbij HDL2 en pre-β1 HDL partikels gevormd worden (Tu et al., 1993). CETP transfereert vervolgens cholesterolesters van HDL2 naar LDL en VLDL in ruil voor triglyceride moleculen (Tall, 1993). Deze triglyceriderijke HDL2 vormen een goed substraat voor het hepatisch triglyceride lipase (HTGL) dat de triglyceriden in de kern van deze HDL2 partikels hydrolyseert. Hierdoor worden ze opnieuw omgezet in kleinere HDL3, in pre-β1 HDL en in vrij apo AI (Barrans et al., 1994) (Figuur 7). Figuur 7: Hermodellering van HDL. LCAT : lecithine:cholesterol acyltransferase; CETP : cholesterolester transfer proteïne; LPL : lipoproteïne lipase; PLTP : fosfolipide transfer proteïne; HTGL : hepatisch triglyceride lipase; FL : fosfolipide; VC : vrij cholesterol; TG : triglyceride; CE : cholesterolester. 22

24 3. Transport van HDL cholesterolesters naar de lever. Opname van cholesterolesters in de lever kan gebeuren door verschillende mechanismen: - selectieve opname van HDL cholesterol gebeurt waarschijnlijk na binding van het HDL partikel op de SR-BI receptor in de lever (Acton et al., 1996). Deze opname zonder endocytose gebeurt zonder degradatie van de HDL apolipoproteïnen zodat deze kunnen gerecycleerd worden. - door inwerking van CETP wordt een belangrijk deel van de HDL cholesterolesters getransfereerd naar de apob bevattende lipoproteïnen LDL en VLDL, die via de apo B/E receptor door de lever opgenomen worden (Tall, 1993). - apoe bevattende HDL partikels kunnen via de specifieke apoe receptor opgenomen worden in de lever (Koo et al., 1985). 4. De beschermende rol van HDL. Klinische studies hebben aangetoond dat er een omgekeerd verband bestaat tussen de plasma HDL cholesterol concentratie en het voorkomen van coronaire aandoeningen (Gordon et al., 1977). Dit beschermend effect van HDL wordt vooral toegeschreven aan hun rol in het omgekeerd cholesterol transport. Toch hebben HDL mogelijks ook een beschermend effect op het endothelium van de vaatwand, waardoor het endothelium intact blijft en de adhesie van leukocyten en bloedplaatjes en de groei van gladde spiercellen wordt tegengegaan (Zeiher et al., 1994). De HDL kunnen eveneens ook de LDL beschermen tegen oxidatieve beschadiging (Bowry et al., 1992). Bovendien kunnen de met HDL geassocieerde enzymes paraoxonase, platelet activating factor (PAF) acetylhydrolase en LCAT, de schadelijke fosfolipidehydroperoxiden hydrolyseren (Klimov et al., 1989). 23

25 V. Apolipoproteïne AI. 1. Algemeen. Matuur humaan apo AI is een niet geglycosileerd eiwit opgebouwd uit 243 aminozuren en met een moleculair gewicht van 28 kda (Brewer et al., 1978). De sequentie van apo AI werd voor het eerst bepaald door Brewer in 1978 door directe proteïne sequenering en werd later bevestigd door cdna sequenering (Cheung en Chan, 1983). Apo AI wordt in de lever en de dunne darm gesynthetiseerd. In de dunne darm wordt het samen met de chylomicronen (CM) gesecreteerd. Na lipolyse van de CM wordt het snel getransfereerd naar de HDL (Green en Glickman, 1981). Bij synthese in de lever wordt apo AI samen met fosfolipiden gesecreteerd onder de vorm van discoïdale nascente HDL partikels (Tall en Small, 1978; Nichols et al., 1980). Het primaire translatieprodukt, het prepro apo AI is 267 aminozuren lang (Gordon et al., 1983; Law et al., 1983). Het signaalpeptide van 18 aminozuren wordt tijdens de translatie afgeknipt en het propeptide (6 aminozuren) wordt gehydrolyseerd tijdens de secretie van apo AI. In plasma kunnen eveneens modificaties zoals fosforylatie en myristoylatie (Chan en Li, 1991) voorkomen. 2. De strucuur van humaan apo AI. Het apo AI gen is opgebouwd uit 4 exons. Exon 3 en 4, die coderen voor het matuur apolipoproteïne, zijn voornamelijk opgebouwd uit repetitieve segmenten van 33 baseparen die coderen voor 11 aminozuren lange repeats. Twee dergelijke repeats vormen in de primaire structuur van apo AI een basissegment (Figuur 8). Deze opeenvolgende herhalingen van 22 aminozuren lang beginnen meestal met een proline (Boguski et al., 1986), en staan in voor de vorming van amfipatische helices (Li et al., 1988). 24

26 helix 1 helix 2 helix 3 helix 4 helix 5 helix 6 helix 7 helix 8 D E P P Q S P W D R..Q L N 1 43 L K L L D N W D S V T S T F S K L R E Q L G P V T Q E F W D N L E K E T E G L R Q E M S K D L E E V K A K V Q P Y L D D F Q K K W Q E E M E L Y R Q K V E P L R A E L Q E G A R Q K L H E L Q E K L S P L G E E M R D R A R A H V D A L R T H L A P Y S D E L R Q R L A A R L E A L K E N G G A R L A E Y H A K A T E H L S T L S E K A K P A L E D L R Q G L L P V L E S F K V S F L S A L E E Y T K K L N T Q 243 Figuur 8: De primaire structuur van apo AI, opgebouwd uit 22 aminozuren lange herhalingen die meestal beginnen met een proline. De secundaire structuur van apo AI bestaat dus uit een opeenvolging van α-helices, gescheiden door 4 à 5 residu s die een antiparallelle oriëntatie van de α-helices mogelijk maken (Boguski et al., 1986; Li et al., 1988). Door het amfipatisch karakter van de α-helices bindt apo AI zeer sterk aan fosfolipiden (zie eigenschappen van apo AI). Een vergelijking van de primaire en secundaire structuur van apo AI in verschillende species toont een sterke conservatie aan van de 22 aminozuren lange herhalingen en van hun amfipatisch en helicoïdaal karakter (Figuur 9). 25

27 Figuur 9: Edmundson wheel voorstelling van de 8 helices van apo AI, met een vergelijking van de aminozuursequentie tussen verschillende species (van binnen naar buiten: mens, aap, varken, koe, hond, konijn, spitsmuis, muis, rat, hamster, egel, kip, kwartel en eend). Rood: negatief geladen hydrofiele residu s; donkerblauw: positief geladen hydrofiele residu s; lichtblauw: neutrale hydrofiele residu s; groen: hydrofobe residu s. 26

28 In 1997 werd door Borhani en medewerkers de kristalstructuur van apo (1-43)AI bepaald (Borhani et al., 1997). Apo (1-43)AI bestaat uit residu s 44 tot 243 van apo AI en bevat alle tien klasse A amfipatische α-helices van het intacte apo AI. Deze verkorte vorm van het proteïne bindt lipiden, net zoals intact apo AI, en werd gekristalliseerd in afwezigheid van lipiden en bij een hoge zout concentratie. In deze kristalstructuur vormen de eerste 9 helices van monomeer apo (1-43)AI een pseudocontinue amfipatische α-helix die telkens een buiging vertoont ter hoogte van de proline residu s aan het begin van elke repeat. Hierdoor krijgt de molecule een hoefijzervormige structuur waarbij de N- en C-terminus slechts 23 Å van elkaar verwijderd zijn (Figuur 10A). Figuur 10A: Monomere kristalstructuur van apo (1-43)AI (figuur werd overgenomen uit Borhani et al., 1997). 27

29 Twee monomeren interageren in een antiparallelle manier waarbij een ellipsvormig dimeer ontstaat (Figuur 10B). In het dimeer zijn de amfipatische helices met hun hydrofobe zijde naar het centrum van de ellips gericht. Figuur 10B: Dimere kristalstructuur van apo (1-43)AI (figuur werd overgenomen uit Borhani et al., 1997). 28

30 3. Conformatie van apo AI in HDL partikels. Er werden twee modellen voorgesteld voor de conformatie van het apo AI in de schijfvormige HDL partikels : het picket-fence model en het riem model. Figuur 11 : Twee mogelijke modellen voor de conformatie van de amfipatische helices van apolipoproteïnen in schijfvormige HDL; A: picket-fence; B: riem model. A. Het picket-fence model. In het picket-fence model vormen de apolipoproteïnen een ring van antiparallelle amfipatische helices die verbonden zijn via korte beta-strengen. (Brasseur et al., 1990; Brasseur et al., 1992; Ji et al., 1997) (Figuur 11A). Deze antiparallelle oriëntatie van de amfipatische helices ten opzichte van elkaar werd gesuggereerd door epitoopmapping studies met monoclonale anti-apoai antilichamen (Marcel et al., 1991), door kristallisatie van twee insect apolipoforines met X-straal diffractie en NMR spectroscopie (Breiter et al., 1991; Wang et al., 1997a) en door kristallisatie van het N-terminaal receptorbindingsdomein van apoe in afwezigheid van fosfolipiden met behulp van X-straal diffractie (Wilson et al., 1991). In dit picket-fence model zijn de helices parallel georiënteerd ten opzichte van de acylketens van de fosfolipiden. Een dergelijke parallelle oriëntatie van de helices van apolipoproteïne AI en de vetzuurketens van de fosfolipiden in een schijfvormig complex wordt gesuggereerd door Polarized Attenuated Total Reflection infrarood spectroscopie (Wald et al., 1990; Vanloo et al., 1991). 29

31 B. Het riem model. In het riem model vormen de apolipoproteïnen een doorlopende riem van gebogen α- helices rond de schijf. Hierbij zijn de helices loodrecht georiënteerd ten opzichte van de acylketens van de fosfolipiden (Figuur 11B). Deze conformatie werd voor het apolipoforine bevestigd door Attenuated Total Reflection infrarood spectroscopie (Raussens et al., 1995). De kristalstructuur van apo AI suggereert eveneens een riem model voor de structuur van apo AI in HDL partikels (Borhani et al., 1997). 4. Eigenschappen van het apo AI. Apo AI is de belangrijkste proteïne component van de hoge densiteit lipoproteïnen en is bepalend voor de structuur en functie van deze lipoproteïne klasse. De antiatherogene eigenschappen van HDL zijn voornamelijk toe te schrijven aan hun rol bij het omgekeerd cholesterol metabolisme. Verschillende stappen bij dit proces zijn afhankelijk van de eigenschappen van apo AI : apo AI bindt aan cellulaire receptoren (Xu et al., 1997) en transporters (Wang et al., 2000), het activeert eveneens het lecithine cholesterol acyltransferase (LCAT) wat resulteert in de verestering van cholesterol op de HDL (Jonas, 1991), apo AI medieert naast de transfer van lipiden tussen verschillende lipoproteïnen ook de hermoddelering van HDL door activatie van LCAT en PLTP (Rye et al., 1992), en tenslotte is het betrokken bij de opname van cholesterol esters door de steroïdogene weefsels en de lever (Fidge, 1999). Om de eigenschappen en de functie van apo AI te bestuderen wordt gebruik gemaakt van discoïdale gereconstrueerde HDL partikels (r-hdl). Deze disks hebben een dikte die gelijk is aan deze van een fosfolipide dubbellaag en hun diameter wordt bepaald door het aantal helices rondom het discoïdaal partikel, door de fosfolipide/apolipoproteïne samenstelling, alsook door het moleculair gewicht van het apolipoproteïne en zijn conformatie (Jonas et al., 1990). De eenvoudigste en best gekarakteriseerde r-hdl partikels bevatten 2 apo AI moleculen en zijn opgebouwd uit één type fosfolipide. De fosfolipiden met verzadigde acylketens (DMPC, DPPC) vormen grotere en meer homogene partikels, de fosfolipiden met zowel verzadigde als onverzadigde vetzuren (POPC) vormen meer heterogene partikels, terwijl de 30

32 fosfolipiden met lange poly-onverzadigde ketens (diarachidonyl-pc) de kleinste partikels vormen. De verhouding van het fosfolipide ten opzichte van apo AI in het oorspronkelijke incubatiemengsel beïnvloedt eveneens de grootte van het partikel : een stijgende molaire verhouding fosfolipide/apo AI doet de gemiddelde grootte van het partikel toenemen (Zorich et al., 1987; Jonas et al., 1990). Indien eveneens cholesterol in de r- HDL disk wordt geïncorporeerd leidt dit tot de vorming van kleinere partikels dan de r-hdl, die enkel uit fosfolipide en apo AI bestaan (Jonas et al., 1983) Lipide binding. De diverse functies van apo AI zijn een gevolg van z n unieke structurele eigenschappen, vooral in een lipid gebonden toestand. Door het amfipatisch karakter van de α-helices bindt apo AI zeer sterk aan fosfolipiden waarbij het percentage helix toeneemt. De rol van de amfipatische helix als een fundamenteel lipidbindend motief van de apolipoproteïnen werd bevestigd door enerzijds de synthese van amfipatische peptiden die gemakkelijk lipide binden (Sparrow et al., 1981), en anderzijds de directe observatie van α-helices in de kristallijne structuur van apo AI (Borhani et al., 1991) en het N-terminaal domein van humaan apo E (Wilson et al., 1991). Alle amfipatische helices van het apo AI (ongeveer 80% van de sequentie) kunnen potentieel binden aan lipiden, maar het zijn vooral de laatste 3 helices (helix 8-10) die een essentiële rol spelen bij de lipide binding (Minnich et al., 1992; Holvoet et al., 1995; Davidson et al., 1996) Activatie van LCAT. Het LCAT enzym is verantwoordelijk voor de vorming van het grootste deel van de cholesterolesters in ons lichaam (zie Hoofdstuk VI). Apo AI is de belangrijkste activator van LCAT (Fielding et al., 1972), maar ook andere wateroplosbare apolipoproteïnen kunnen in mindere mate LCAT activeren (Tabel 3). Synthetische peptiden, bestaande uit een potentiële amfipatische α-helix, kunnen eveneens het LCAT enzym activeren (Chung et al., 1985; Anantharamaiah et al., 1990). 31

33 Apolipoproteïne Relatieve LCAT activiteit (%) Apo AI 100 Apo AVI Apo E Apo CI 12 Apo CIII 4-5 Apo CII 3 Apo AII 1.5 Tabel 3 : LCAT activering door verschillende apolipoproteïnen in schijfvormige lipide/apolipoproteïne complexen (Jonas et al., 1984; Chen et al., 1985; Steinmetz et al., 1985; Zorich et al., 1985; Jonas, 1987). Om het LCAT activerend gebied in apo AI te bepalen werden in meerdere labo s deletiemutanten van apo AI gemaakt. Hierbij werden één of meerdere amfipatische helices in de apo AI sequentie volledig of gedeeltelijk verwijderd (Figuur 12; overgenomen uit Jonas et al., 1998). Figuur 12: LCAT activering door deletiemutanten van apo AI. Deze figuur is een samenvatting van de resultaten van verschillende studies (Minnich et al., 1992; Sorci-Thomas et al., 1993; Holvoet et al., 1995; Ji et al., 1995; Rogers et al., 1997). Op de x-as wordt de lineaire sequentie van apo AI voorgesteld met aanduiding van de amfipatische helices. De verschillende staven in het diagram duiden de positie en lengte van de deleties aan. 32

34 De resultaten van deze studies tonen aan dat deleties in het C-of N-terminaal gedeelte van apo AI slechts een beperkt effect hebben op de LCAT activering, en dat het voornaamste LCAT activerend gebied gelegen is tussen residu s 143 en 186 (Figuur 12; overgenomen uit Jonas et al., 1998). Dit gebied omvat twee amfipatische helices, tussen residu s en tussen residu s Deze resultaten stemmen overeen met het gedeeltelijk verlies van LCAT activering door apo AI Seattle, een natuurlijk voorkomende apo AI mutant die een deletie tussen residu s 146 en 160 vertoont (Lindholm et al., 1998) Apo AI als ligand voor de ATP binding cassette A1 (ABCA1) transporter. ABCA1 speelt een belangrijke rol bij de apolipoproteïne gemedieerde cholesterolefflux (zie hoofdstuk VII). Het exact mechanisme voor de efflux van cellulair cholesterol en fosfolipiden naar apolipoproteïne AI is echter nog niet gekend. Het feit dat korte synthetische peptiden, die de secundaire structuur van apo AI nabootsen, ook cellulaire cholesterol efflux kunnen bevorderen (Davidson et al., 1994; Mendez et al., 1994) suggereert een niet specifiek mechanisme waarbij vooral de affiniteit van apo AI voor lipiden van belang zou zijn. Omdat de initiële binding van apo AI aan lipiden gebeurt via de C-terminale helices, wordt vermoed dat deze helices eveneens een belangrijke rol spelen bij het efflux proces. Door middel van immunoprecipitatie en fluorescentie energie transfer metingen werd echter wel een directe interactie tussen ABCA1 en apo AI gesuggereerd (Wang et al, 2000; Chambenoit et al., 2001). 5. Natuurlijke mutanten van humaan apo AI. Er werden reeds meer dan 40 natuurlijke mutaties beschreven in humaan apo AI, meestal zijn het puntmutaties die zelden voorkomen. In apo AI Milano is de arginine op positie 173 gemuteerd naar een cysteïne. Een analoge mutatie wordt teruggevonden bij apo AI Paris, op residu 151. Door de aanwezigheid van een cysteïne residu kunnen beide apo AI mutanten zowel 33

35 homodimeren als heterodimeren met apo AII vormen. Hoewel patiënten met één van deze mutaties duidelijk verlaagde plasma HDL-concentraties hebben, wordt er bij deze personen geen toename van atherosclerotische letsels aangetroffen. Patiënten met de apo AI Giessen mutatie (P143R) vertonen een sterk gereduceerde LCAT-activering, maar een normale HDL-cholesterol concentratie. Ook bij deze personen wordt geen toename van atherosclerotische letsels geobserveerd. Ook apo AI Seattle, waar het gebied tussen residu s Glu146 en Arg160 gedeleteerd is, leidt niet tot vroegtijdige atherosclerose, alhoewel een duidelijke HDL-deficiëntie en een sterk verlaagde LCAT-activering waargenomen worden. Waarom dergelijke mutaties, die ondanks hun abnormale concentraties aan HDL en apo AI, geen indicatie vertonen van vroegtijdige atherosclerose is nog onbekend. Een overzicht van de meest relevante natuurlijke apo AI mutanten, met aanduiding van de mutatie en de geassocieerde clinische gevolgen, wordt gegeven in Tabel 4. 34

36 Specifieke Mutatie HDL Verhoogd LCAT Referentie benaming concentratie risico op activatie (% t.o.v. atherosclerose (% t.o.v. normaal apo AI HDL) WT) AI Milano R173C 10 Neen 100 Weisgraber et al., 1983 AI Paris R151C 50 Neen 100 Bruckert et al., 1997 AI Pisa L141R 50 Ja 100 Miccoli et al., 1996 AI Giessen P143R 100 Neen 45% Utermann et al., 1982 AI Oita V156E 60 Ja 100 Huang et al., 1998 AI Zavalla L159P Ja 100 Miller et al., 1998 AI Fin L159R Neen 100 Miettinen et al., 1997 AI Oslo R160L 40 Neen 50% Leren et al., 1997 AI Seattle E146 R Neen 35% Deeb et al., 1991 AI Marburg K Neen 60% Rall et al., 1984 Tabel 4 : Overzicht van de meest relevante natuurlijke apo AI mutaties. 35

37 VI. Het lecithine : cholesterol acyltransferase (LCAT). 1. Algemeen. Het LCAT enzym speelt een centrale rol in het extracellulair metabolisme van plasma lipoproteïnen. Het humaan LCAT gen is gelocaliseerd op chromosoom 16 (16q22) (Azoulay et al., 1987) en komt voornamelijk tot expressie in de lever, waarna het enzyme in de bloedstroom gesecreteerd wordt. In plasma is LCAT grotendeels gebonden op de HDL, terwijl een kleine hoeveelheid (1%) geassocieerd is met LDL (Chen et al., 1982). In zijn mature, gesecreteerde vorm bestaat het enzym uit 416 aminozuren en heeft het een berekend moleculair gewicht van Dalton. In het LCAT preproteïne wordt deze sequentie voorafgegaan door een hydrofoob signaalpeptide van 24 aminozuren dat afgesplitst wordt (McLean et al., 1986). Na synthese wordt het enzym gemodificeerd door N-glycosilatie op positie Asn 20, Asn 84, Asn 272 en Asn 384, en door O-glycosilatie op positie Thr 407 en Ser 409 (Schindler et al., 1995). Deze glycosilaties verhogen het schijnbaar moleculair gewicht van LCAT in SDS-PAGE tot Dalton (Yang et al., 1987). Heterogeniteit in de glycosilaties leidt tot minstens zes isovormen van het LCAT enzym (Doi et al., 1983). De sequentie van het LCAT enzym is zeer sterk geconserveerd tussen verschillende species, zo is er 85% similariteit tussen mens en muis LCAT en 75% similariteit tussen mens en kip LCAT. 2. De enzymatische werking van het LCAT enzym. Ongeveer 70% van het cholesterol in de plasma lipoproteïnen komt voor als cholesterolesters. Het grootste deel van deze cholesterolesters wordt gevormd door de werking van het LCAT enzym. LCAT bevindt zich aan het oppervlak van de plasma lipoproteïnen waar het een vetzuurketen afsplitst van een fosfatidylcholine, fosfatidylserine of fosfatidylethanolamine, en deze transfereert naar de 3- hydroxylgroep van cholesterol (Figuur 13). Het overgebleven lysofosfolipide wordt door albumine opgenomen. 36

38 Figuur 13: Schematische voorstelling van de LCAT reactie waarbij een vetzuurketen van fosfatidylcholine wordt afgesplitst en getransfereerd naar cholesterol, met de vorming van een cholesterolester als gevolg. Hoewel het LCAT enzym een voorkeur heeft voor de transacylatie van het vetzuur op de sn-2 positie van fosfatidylcholine, fosfatidylserine of fosfatidylethanolamine, kunnen ook vetzuren op de sn-1 positie als substraat dienen (Jonas et al., 1987). Bij zoogdieren en mensen heeft LCAT de voorkeur voor lange onverzadigde vetzuren zoals linoleïne zuur (18:2) (Jonas et al., 1987). Door zijn hoge concentratie in de HDL (74% van de fosfolipiden) is fosfatidylcholine (PC) de belangrijkste natuurlijke donor van de acylketen voor de LCAT reactie. Fosfatidylethanolamine (PE) is echter een beter substraat dan PC, maar PE maakt slechts 7% uit van de HDL fosfolipiden en treedt dus in mindere mate op als donor (Pownall et al., 1985). Amide of ether gebonden vetzuren kunnen niet afgesplitst worden door LCAT (Pownall et al., 1985; Jonas et al., 1987) omdat een esterbinding tussen de acylketen en de fosfoglyceride backbone vereist is. Het moleculair mechanisme van de LCAT reactie is nog niet volledig opgehelderd, maar het staat wel vast dat er voor de activiteit op het HDL substraat een activator vereist is. Dit is niet het geval voor monomerische substraten of voor LDL. De belangrijkste activator van LCAT is het apolipoproteïne AI (Fielding et al., 1972). 37

39 3. Het katalytisch mechanisme van LCAT. Het LCAT enzym vertoont functionele gelijkenissen met lipasen. Bij de lipasen vormt een serine samen met een histidine en een asparagine- of glutaminezuur de katalytische triade (Warshel et al., 1989), zoals voorgesteld in Figuur 14. Figuur 14: Schematische voorstelling van het katalytisch mechanisme van lipasen. In LCAT werd serine 181, gelegen in een Gly-X-Ser-X-Gly motief zoals bij lipasen, geïdentificeerd als catalytisch residu (Farooqui et al., 1988). Naast Ser 181 werden Asp 345 en His 377 als actieve site residu s geïdentificeerd, samen met Phe 103 en Leu 182 die deel uitmaken van de oxyanion holte (Peelman et al., 1998). In verdere analogie met lipasen werd een domein geïdentificeerd dat mogelijk betrokken is bij de binding van het enzym aan zijn substraat. In analogie met de lidstructuur van de lipasen is ook dit gebied gesloten door een disulfidebrug, tussen cysteïne 50 en 74 (Peelman et al., 1998). Net zoals lipasen en fosfolipasen is LCAT een wateroplosbaar enzym dat actief is aan het oppervlak van geaggregeerde lipide substraten. De LCAT reactie op een 38

40 lipoproteïne substraat verloopt via verschillende stappen die schematisch voorgesteld worden in Figuur 15: - Binding van LCAT aan het lipidenoppervlak (1), met activatie van het enzym door een apolipoproteïne cofactor (2). - Binding van één enkele fosfolipidemolecule in het actief centrum van LCAT (3). - Afsplitsing van een vetzuurketen van het fosfolipide, met vorming van een LCAT Ser 181 O-acylintermediair en van een lyso-fosfolipide (4). - Binding van een cholesterolmolecule in het actief centrum van LCAT (5). - Transfer van de vetzuurketen naar de 3-β hydroxylgroep van cholesterol met vorming van een cholesterolester (6). - Migratie van het gevormde cholesterolester naar de hydrofobe kern van het lipoproteïnepartikel (7). Figuur 15: De verschillende stappen in het reactiemechanisme van LCAT (overgenomen uit Jonas, 1998). E : vrij LCAT; E* : substraat gebonden en geactiveerd LCAT; PL : fosfolipide; E*-PL : fosfolipide gebonden in LCAT; E*-Acyl : Ser 181 O-acylintermediair; C : vrij cholesterol; CE : cholesterolester. 39