Validatierapport RSID Saliva Field Kit

Transcriptie

1 Validatierapport RSID Saliva Field Kit Rapportage van onderzoek ter validatie van methoden, protocollen en apparatuur Algemeen Datum: September 2009 Titel: Validatie Field Kit for Rapid Stain Identification of Human Saliva Aandachtsgebieden: Presumptieve tests Afdeling: NFI, project IFO i.s.m. Forensische Opsporing IJsselland Projectleider: Walter Makkinga Opdrachtgever: Walter Makkinga Onderzoekers: Hilde Drenth-de Boer, Susan van Esch, Robert Otte, Matthijs Zuidberg Auteurs: Matthijs Zuidberg, Hilde Drenth-de Boer, Susan van Esch Handtekening opdrachtgever Datum voor instemming: handtekening Projectbeschrijving De Forensische Opsporing (FO) heeft de behoefte aan opsporingsgericht forensisch onderzoek. De karakterisatie van humaan speeksel kan hieraan een belangrijke bijdrage leveren. Omwille van de snelheid en de mogelijkheid tot selectie van sporen heeft het de voorkeur dit opsporingsgerichte onderzoek naar de karakterisatie van humaan speeksel al op een plaats delict (PD) te kunnen uitvoeren. Een PD wordt door forensisch onderzoekers met het blote oog of met behulp van forensische lichtbronnen onderzocht. Er wordt, zeker tijdens een eerste onderzoek, geen gebruik gemaakt van bijvoorbeeld een microscoop. Een presumptieve test t.b.v. opsporingsgericht forensisch onderzoek zal op een PD dan ook in de regel toegepast worden op sporen die met het blote oog of met gebruikmaking van de forensische lichtbron waarneembaar zijn. De huidige methoden die een aanwijzing geven voor de aanwezigheid van speeksel zijn gebaseerd op het aantonen van de enzymatische activiteit van α-amylase. Een voorbeeld hiervan is de Phadebas amylase test. De twee α-amylasebronnen die de mens bezit zijn speekselklieren en de pancreas. Daarom zijn er twee soorten lichaamsafscheiding met een hoge concentratie α-amylase: speeksel en feces. De huidige enzymatische assays zijn echter niet humaan specifiek. α-amylase komt ook voor in dieren, planten, bacteriën en schimmels. Met name deze micro-organismen kunnen aanwezig zijn in forensische bemonsteringen ten gevolge van omgevingsfactoren of bacteriepopulaties in bepaalde lichaamsvloeistoffen. Dit kan leiden tot fout positieve resultaten. Een ander probleem is dat de enzymatische assays om praktische redenen niet geschikt zijn voor gebruik op de PD. RSID Saliva kit Recent is een testmethode van Galantos Genetics GmbH op de markt gebracht, de RSID Saliva Kit, waarbij humaan speekselvloeistof kan worden aangetoond d.m.v. monoklonale antilichamen specifiek voor humaan α-amylase. Een dergelijke methode heeft hiermee de potentie zeer specifiek te zijn. Omdat zowel speeksel- als pancreas-α-amylase worden herkend door deze antilichamen, is de test echter ongeschikt om onderscheid te maken tussen speeksel en feces en speeksel en urine. De RSID Saliva Kit is een immunografisch flow-assay. Extracten kunnen worden getest op de aanwezigheid van α-amylase (zie figuur 1). Hiertoe wordt het extract opgebracht (plaats S). De daar aanwezige, met colloïdaal goud gelabelde, antilichamen lossen op en worden met het extract geabsorbeerd door het membraan. Indien het eiwit α-amylase aanwezig is, bindt dit aan de antilichamen en ontstaat er een complex. Verderop in 1

2 de membraan bindt dit complex zich aan een geïmmobiliseerd anti-α-amylase antilichaam (plaats T). Hierop verkleurt de membraan rood. De rest van het extract trekt verder de membraan in. De overige antilichamen die geen α-amylase hebben gebonden, binden uiteindelijk aan een geïmmobiliseerd anti-muis-antilichaam (plaats C). Ook hier ontstaat een rode verkleuring op de membraan. Plaats T (=test) geeft in principe dus alleen een verkleuring wanneer het α-amylase-antilichaamcomplex aanwezig is. Plaats C (=controle) geeft altijd een verkleuring en fungeert als interne positieve controle. A B Figuur 1: Mechanisme RSID Saliva kit A) Negatief resultaat. et colloïde goud gelabelde anti-α-amylase antilichamen hebben geen bindingsmogelijkheid op plaats T. Een rode verkleuring is niet zichtbaar. B) Positief resultaat. Met colloïde goud gelabelde anti-α-amylase antilichamen hebben, door binding met het aanwezige α-amylase, wel een bindingsmogelijk op plaats T. Een rode verkleuring is zichtbaar. A B Figuur 2: Foto s resultaat RSID Saliva kit A) Negatief resultaat. Rode verkleuring alleen zichtbaar op plaats C. B) Positief resultaat. Rode verkleuring zichtbaar op plaats C en T. RSID Saliva field kit Een aanvulling op de RSID Saliva kit van Galantos Genetics GmbH is de introductie van een RSID Saliva Field Kit. Een dergelijke test lijkt aan de behoefte van de FO tegemoet te komen en de mogelijkheid te bieden de karakterisatie van speeksel op of in de nabijheid van een PD uit te voeren. Binnen de forensische vakgebieden is de RSID Saliva Field Kit echter nog niet onderworpen aan een validatiestudie. Van de standaard RSID Saliva Kit hebben de fabrikant [1,2] en B.C.M. Pang et al. [3] een validatierapport gepubliceerd. Persoonlijke communicatie met zowel het Nederlands Forensisch Instituut (NFI) als het Forensisch DNA laboratorium van het Universitair Ziekenhuis Antwerpen heeft daarnaast uitgewezen dat de standaard RSID Saliva Kit intern is gevalideerd en wordt gebruikt t.b.v. het biologisch vooronderzoek. Het mechanisme van de RSID Saliva Field Kit is gelijkend aan dat van de standaard RSID Saliva Kit, maar er zijn een tweetal verschillen: - In de RSID Saliva Field Kit zijn de extractie en de running reeds bij elkaar gevoegd. - In het protocol van de RSID Saliva Field Kit wordt de centrifugestap achterwege gelaten. Deze stap wordt in de standaard RSID Saliva Kit toegepast om de vervuiling in de oplossing neer te laten slaan. 2

3 Om het effect van bovenstaande twee verschillen op de werking van de RSID field kit te onderzoeken, is er een validatiestudie uitgevoerd. 2. Validatieonderzoek Het validatieonderzoek is opgedeeld in twee onderdelen: 1. RSID field testen uitgevoerd onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden Dit omvat onderzoeken naar: a. Gevoeligheid De bijbehorende prestatie-eisen hierbij zijn: i. Positief resultaat bij 0,1µl speeksel ii. Positief resultaat bij 700µl speeksel b. Robuustheid in andere lichaamsvloeistoffen De bijbehorende prestatie-eis hierbij is: i. De RSID Saliva field kit mag niet leiden tot fout negatieve resultaten door de aanwezigheid van overige lichaamsvloeistoffen. c. Herhalend uitvoeren van testen bij dezelfde omstandigheden (reproduceerbaarheid) De bijbehorende prestatie-eis hierbij is: i. Het karakteriseren van één speekselextract met behulp van de RSID Saliva field kit moet op verschillende dagen en door verschillende uitvoerenden steeds leiden tot hetzelfde resultaat. 2. RSID field testen uitgevoerd onder PD omstandigheden Dit omvat onderzoeken naar selectiviteit en robuustheid: a. bij ondergronden en kleurstoffen De bijbehorende prestatie-eis hierbij is: i. Bij de aanwezigheid van diverse veelvoorkomende ondergronden dienen fout negatieve of fout positieve resultaten tot een minimum beperkt te blijven. De eventuele foutieve resultaten dienen kenbaar gemaakt te worden. b. bij verouderd speeksel De bijbehorende prestatie-eis hierbij is: i. De RSID Saliva field kit moet in staat zijn verouderd speeksel op diverse ondergronden te karakteriseren. Het aantal fout negatieve resultaten moet tot een minimum beperkt blijven. c. bij extremen in temperatuur De bijbehorende prestatie-eis hierbij is: i. Bij blootstelling van extreme temperaturen (hier: -18 ºC en 80ºC) aan zowel de RSID field kit zelf als het speeksel, moet de RSID Saliva field kit betrouwbare resultaten geven. Fout negatieve resultaten moeten tot een minimum beperkt blijven. Alleen als de resultaten van de uitgevoerde testen onder gecontroleerde omstandigheden conform de wenselijke prestatie-eisen zijn, wordt het onderzoek vervolgd met het uitvoeren van testen onder PD omstandigheden. Alle experimenten in deze validatiestudie zijn uitgevoerd met een RSID TM Saliva field kit, welke bestaat uit: 500µl RSID (extractie- en running-, voorgemengd), RSID immunografische cassette, druppelpipet, schaar en handschoenen. Opmerking: Voor dit onderzoek is gebruik gemaakt van een uitgeklede versie; geen schaar, handschoenen en druppelpipet. 3

4 Alle onderzoeken/testen zijn uitgevoerd conform het bijgevoegde protocol: Biologisch materiaal toevoegen aan RSID (bij biologisch materiaal op een ondergrond stelt het protocol dat er 0,4cm 2 dient te worden uitgeknipt en aan de RSID wordt toegevoegd) Goed schudden 50min incuberen bij kamertemperatuur 100µl (staat gelijk aan 3 druppels met bijbehorende druppelpipet) van RSID (met mogelijk biologisch materiaal) op cassette brengen 10min laten lopen (de cassette dient hierbij op een vlakke ondergrond te worden geplaatst) Aflezen: Alleen C Alleen T C & T Rood bandje op membraan Negatief Ongeldig Positief Andere kleur bandje op membraan Ongeldig Ongeldig Ongeldig Tabel 1: Interpreteren resultaten RSID Saliva field kit Fotograferen Opmerking: Resultaat aflezen na een langere periode geeft onbetrouwbare resultaten. Het wordt daarom sterk aangeraden na 10min de cassette te fotograferen. Alle testen zijn uitgevoerd in duplo. De resultaten van de experimenten worden onderverdeeld in 3 verschillende categorieën: negatief, zwak positief en positief. Op basis van onderstaande intensiteitskaart (figuur 3) zijn de categorieën ingeschaald: 1= negatief, 2-7 = zwak positief, 8-10 = positief. De waarnemingen zijn bij ieder experiment door minimaal 2 personen afzonderlijk uitgevoerd. Figuur 3: Intensiteitskaart RSID kit - Rode verkleuring aan de bovenzijde van de strip is de Controle band (plaats C) - Rode verkleuring aan de onderzijde van de strip is de Test band (plaats T) In onderstaande paragrafen zijn de experimenten beschreven die respectievelijk in het kader van de laboratoriumomstandigheden en de PD-omstandigheden zijn uitgevoerd. De volgende prestatiekenmerken zijn daarbij aan bod gekomen: gevoeligheid, selectiviteit, robuustheid, reproduceerbaarheid. Elke paragraaf start met het weergeven van de gestelde/gewenste prestatie-eisen en de prestaties van de huidige standaard RSID kit. Daarnaast wordt beknopt uitgelegd waarom het desbetreffende prestatiekenmerk van de RSID field kit (gelet op de twee verschillen) mogelijk minder goed is. Elke paragraaf eindigt met een conclusie of de gestelde prestatie-eisen zijn behaald. 4

5 2.1. Laboratoriumomstandigheden Gevoeligheid Naar aanleiding van het gestelde in de inleiding, is de verwachting is dat de RSID Saliva field kit veelal zal worden toegepast op sporen die visueel waarneembaar zijn, en dus niet op de minimale sporen. Een uitgangspunt binnen het validatieonderzoek is daarom dat het volume van de (onverdunde) speekselvlek minimaal 0,1µl dient te zijn; de onderste gevoeligheidsgrens. Punt van aandacht is hier het High Dose Hook Effect (HDHE). Bij hoge concentraties kunnen immunochromatografische teststrips onderhevig zijn aan fout negatieve resultaten. De immunografische cassette wordt dan overladen; het ongebonden α-amylase is dan in overmaat aanwezig en bezet de bindingsplaatsen met de geïmmobiliseerde antilichamen (plaats T). Hierdoor is het α-amylase antilichaamcomplex niet meer in staat te binden en blijft een verkleuring op plaats T uit (zie figuur 2). Dergelijke fout negatieve resultaten zijn niet gewenst. Figuur 4: High Dose Hook Effect (HDHE) A) Negatief resultaat. Door de grote hoeveelheid α- amylase bereikt dit ongebonden plaats T. Een verkleuring door de colloïde goud deeltjes blijft uit. Bijbehorende gestelde prestatie-eisen voor de gevoeligheid van de RSID Saliva field kit zijn daarom: 1. Positief resultaat bij 0,1µl speeksel 2. Positief resultaat bij 700µl speeksel De standaard RSID Saliva kit voldoet aan de eerste prestatie-eis, de onderste gevoeligheidsgrens. Het detectielimiet is namelijk 10nl speeksel [3]. De tweede prestatie-eis, de bovenste gevoeligheidsgrens, is echter maar getest tot 20µl speeksel in de RSID. Bij dit volume bleef een fout negatief resultaat door een eventueel HDHE uit. Zoals eerder aangegeven, is een centrifugestap niet opgenomen in het protocol van de RSID Saliva field kit. Dit zou kunnen leiden tot vervuiling op het testmembraan en, bij zowel kleine als grote hoeveelheden speeksel, tot een fout negatief resultaat. Tevens kan het vooraf mengen van de extractie- en de running- leiden tot fout negatieve resultaten. De concentratie running- neemt namelijk af, waardoor de analyse mogelijk minder efficiënt verloopt. Om dergelijke fout negatieve resultaten uit te kunnen sluiten en te kijken of de RSID Saliva field kit dus voldoet aan de gestelde prestatie-eisen, is de volgende serie experimenten uitgevoerd: Gevoeligheid Hoeveelheid Speeksel in RSID Donor Resultaat 0,1µl * Vrouw 45 jaar Positief 30µl Vrouw 45 jaar Positief 60µl Vrouw 45 jaar Positief 700µl Vrouw 45 jaar Positief * Omdat deze hoeveelheid niet nauwkeurig kan worden gepipetteerd, is er eerst een oplossing gemaakt van 1µl speeksel + 9µl PBS. Van deze oplossing is vervolgens 1µl in de RSID gepipetteerd. Tabel 2: Gevoeligheid RSID Saliva field kit 5

6 C onclusie: De prestatie-eisen betreffende de gevoeligheid van de RSID Saliva field kit zijn behaald. Zowel de onderste (0,1µl) als bovenste gevoeligheidsgrens (700µl) geven een positief resultaat (rode verkleuring bij zowel plaats C als T). Voor de RSID Saliva field kit wordt een HDHE niet waargenomen. Zelfs als de buis met RSID volledig is aangevuld met speeksel, wordt een positief resultaat verkregen Robuustheid Andere lichaamsvloeistoffen Op de PD treft men in veel gevallen biologisch materiaal aan dat een mengsel is van lichaamsvloeistoffen, zoals sperma en bloed. In deze gevallen is het wenselijk dat een RSID Saliva field kit een betrouwbaar resultaat geeft en niet wordt verstoord door de aanwezigheid van ander materiaal. De prestatie-eis is hier: De RSID Saliva field kit mag niet leiden tot fout negatieve resultaten door de aanwezigheid van overige lichaamsvloeistoffen. De standaard RSID kit voldoet aan deze prestatie-eis tot een ratio speeksel:overige lichaamsvloeistof van maximaal 1:1000. De RSID Saliva field kit presteert mogelijk slechter door het ontbreken van de centrifugestap. Storende factoren van de andere lichaamsvloeistoffen worden niet verwijderd en zouden dus op de testmembraan kunnen worden gebracht. Om de prestatie-eis te toetsen en fout negatieve resultaten door storende factoren afkomstig van andere lichaamsvloeistoffen te onderzoeken, is de volgende serie experimenten uitgevoerd: Aan de buis met RSID is 0,1µl speeksel toegevoegd. Vervolgens is aan deze buis 0,1µl (1:1) of 100µl andere lichaamsvloeistof (1:1000) toegevoegd. Robuustheid (sensitiviteit in andere lichaamsvloeistoffen) Hoeveelheid Speeksel Andere Ratio Resultaat in RSID lichaamsvloeistof speeksel:lichaamsvloeistof 0,1µl * Bloed 1:1 Positief 0,1µl * Bloed 1:1000 Positief 0,1µl * Urine 1:1 Positief** 0,1µl * Urine 1:1000 Positief** 0,1µl * Urine 1:1 Positief** 0,1µl * Urine 1:1000 Positief** 0,1µl * Sperma 1:1 Positief 0,1µl * Sperma 1:1000 Positief 0,1µl * Feces 1:1 Positief** 0,1µl * Feces 1:1000 Zwak positief** 0,1µl * Vaginaal epitheel 1:1 Positief 0,1µl * Vaginaal epitheel 1:1000 Positief * Omdat deze hoeveelheid niet nauwkeurig kan worden gepipetteerd, is er eerst een oplossing gemaakt van 1µl speeksel + 9µl PBS. Van deze oplossing is vervolgens 1µl in de RSID gepipetteerd. Tabel 3: Robuustheid RSID Saliva field kit (sensitiviteit in andere lichaamvloeistoffen) * De gewenste resultaten zijn hier (zwak) positief. Indien dit afwijkt, is dit met rood weergegeven in de tabel. ** De antilichamen in de RSID Saliva Fields kit reageren op α-amylase. Derhalve was de verwachting dat urine en feces zou resulteren in een positieve reactie. 6

7 C onclusie De RSID Saliva field kit voldoet aan bovenstaand gestelde prestatie-eis. Zelfs bij een minimale hoeveelheid speeksel en een overmaat ander lichaamsmateriaal (1:1000), is er geen sprake van fout negatieve resultaten Selectiviteit In de diverse validatiestudies van de standaard RSID Saliva kit zijn aanwijzingen gevonden voor fout positieve reacties. Eierstoktumoren, borstmelk, feces en urine [3] kunnen leiden tot fout positieve resultaten. Omdat het onderliggende mechanisme van de RSID Saliva Field Kit niet verschilt van de standaard RSID Saliva Kit, is aan te nemen dat deze resultaten ook worden verkregen met de RSID Saliva field kit. Dergelijke experimenten met betrekking tot het prestatiekenmerk selectiviteit zijn dus ook niet uitgevoerd. Hetzelfde geldt voor RSID experimenten met speeksel van verschillende diersoorten (waaronder geit, schaap, varken, stier, hond, paard, muis, rat, kat). Alleen bij speeksel van de rat werd een positief resultaat verkregen [3]. Verdere fout positieve resultaten bleven uit; de RSID kit is dus selectief voor humaan speeksel. Wederom is aangenomen dat dit ook geldt voor de RSID Saliva field kit. Desalniettemin, is toch besloten de fout positieve resultaten van de relatief veelvoorkomende overige lichaamsvloeistoffen (hier: feces en urine) te verifiëren. Hiertoe is de volgende serie experimenten uitgevoerd: Hoeveelheid Speeksel in RSID Selectiviteit (evt. fout positieven) Andere lichaamsvloeistof Hoeveelheid lichaamsvloeistof in RSID Resultaat 0µl Feces 0,3µl* Negatief 0µl Feces 30µl Positief 0µl Urine 0,3µl* Negatief 0µl Urine 30µl Negatief 0µl Urine 0,3µl* Negatief 0µl Urine 30µl Zwak positief * Omdat deze hoeveelheid niet nauwkeurig kan worden gepipetteerd, is er eerst een oplossing gemaakt van 3µl speeksel + 7µl PBS (bij urine demiwater i.p.v. PBS). Van deze oplossing is vervolgens 1µl in de RSID gepipetteerd. Tabel 4: Selectiviteit Saliva field kit De gewenste resultaten zijn hier negatief. Indien het verkregen resultaat afwijkt, is dit met rood weergegeven in de tabel. C onclusie De RSID Saliva field kit heeft net als de standaard RSID kit kans op fout positieve resultaten bij de aanwezig van feces of urine. Al bij een hoeveelheid van 30µl feces of urine zijn dergelijke fout positieve resultaten waarneembaar Reproduceerbaarheid De verwachting is dat een RSID Saliva field kit door verschillende forensisch onderzoekers in Nederland gebruikt gaat worden. Wanneer eenzelfde monster zou worden gekarakteriseerd met behulp van de kit, dan mag dit, bij variatie in tijd en personen, niet leiden tot onderlinge verschillen. Bijbehorende prestatie-eis is hier: Het karakteriseren van één speekselextract met behulp van de RSID Saliva field kit moet op verschillende dagen en door verschillende uitvoerenden steeds leiden tot hetzelfde resultaat. De standaard RSID Saliva kit voldoet aan deze prestatie-eis. Om dit uit te sluiten en te onderzoeken of de RSID Saliva field kit voldoet aan de eis betreffende de reproduceerbaarheid, is de volgende serie experimenten uitgevoerd: 7

8 Reproduceerbaarheid Hoeveelheid Donor Datum Uitvoerende Resultaat Speeksel in RSID 0,1µl Vrouw 45 jaar Jan 2009 HIBOE Positief 0,1µl Vrouw 45 jaar Jan 2009 ROOTT Positief 0,1µl Vrouw 45 jaar Jan 2009 MAZUI Positief 0,1µl Vrouw 45 jaar Jan 2009 SUESC Positief 0,1µl Vrouw 45 jaar Feb 2009 PAHAS Positief 0,1µl Vrouw 45 jaar Feb 2009 RABAL Positief 0,1µl Vrouw 45 jaar Feb 2009 HIBOE Positief 0,1µl Vrouw 45 jaar Feb 2009 SUESC Positief 0,1µl Vrouw 45 jaar Maart 2009 HIBOE Positief 0,1µl Vrouw 45 jaar Maart 2009 MAZUI Positief 0,1µl Vrouw 45 jaar Maart 2009 RABAL Positief 0,1µl Vrouw 45 jaar April 2009 MAZUI Positief 0,1µl Vrouw 45 jaar Mei 2009 ROOTT Positief 0,1µl Vrouw 45 jaar Mei 2009 MAZUI Positief 0,1µl Vrouw 45 jaar Mei 2009 SUESC Positief 0,1µl Vrouw 45 jaar Mei 2009 HIBOE Positief 0,1µl Vrouw 45 jaar Juli 2009 MAZUI Positief Tabel 5: Reproduceerbaarheid RSID Saliva field kit De gewenste resultaten zijn hier positief. Indien het verkregen resultaat afwijkt, is dit met rood weergegeven in de tabel. Voor deze experimenten zijn mogelijk testen uit verschillende batches gebruikt. Er is aangenomen dat er geen significante verschillen zijn tussen verschillende batches. Het biologisch materiaal is opgeslagen bij 4 C. C onclusie De RSID Saliva field kit voldoet aan bovenstaand genoemde prestatie-eis betreffende de reproduceerbaarheid. Diverse RSID field testen uitgevoerd op hetzelfde speeksel, op verschillende dagen en door verschillende personen, leiden tot dezelfde resultaten Conclusies In de experimenten uitgevoerd onder gecontroleerde omstandigheden, voldoet de RSID Saliva field kit aan alle gestelde prestatie-eisen. De kit is humaan specifiek en voldoende selectief (aanname). Urine, feces, speeksel van een rat en borstmelk kunnen leiden tot fout positieve resultaten. De kit is zeer gevoelig; minimale speekselsporen leiden tot een interpreteerbaar positief resultaat. Geen HDHE waarneembaar; bij hoge concentraties speeksel zijn geen fout negatieve resultaten verkregen. De kit is robuust met betrekking tot de aanwezigheid van andere lichaamsvloeistoffen. De reproduceerbaarheid is goed. Bovenstaande resultaten zijn voldoende aanleiding het validatieonderzoek voort te zetten en de RSID Saliva field kit te onderwerpen aan gesimuleerde PD-omstandigheden. 8

9 2.2. PD-omstandigheden Selectiviteit en robuustheid a. Verschillende ondergronden Op een PD kan speeksel worden aangetroffen op een verschillende ondergronden. Het is van belang dat het merendeel van deze ondergronden niet leidt tot fout positieve resultaten (selectiviteit). Ook moet het aantal fout negatieve resultaten tot een minimum beperkt blijven (robuustheid). Treden dergelijke foute resultaten toch op, dan moet bekend zijn welke ondergronden dit betreft. Bijbehorende prestatie-eis is daarom: Bij de aanwezigheid van diverse veelvoorkomende ondergronden dienen fout negatieve of fout positieve resultaten tot een minimum beperkt te blijven. De eventuele foutieve resultaten dienen kenbaar gemaakt te worden. Voor de standaard RSID kit is de invloed van diverse ondergronden niet uitvoerig getest. Alleen de invloed van kleurstoffen op het resultaat van de RSID test is onderzocht. Uit deze experimenten blijkt dat kleurstoffen kunnen binden aan het geïmmobiliseerde antilichaam op plaats T (=test) en een bijbehorende verkleuring kunnen geven. Dit leidt over het algemeen tot ongeldige resultaten. In het geval van een roodachtige kleurstof kan dit echter leiden tot een fout positief resultaat (let wel: rode verkleuring op plaats T) en is oplettendheid vereist. Deze bevindingen zijn tevens bevestigd door de fabrikant. Doordat de centrifugestap in het protocol van de RSID Saliva field kit ontbreekt, zijn eventuele storende factoren van ondergronden en kleurstoffen in hogere concentraties aanwezig, waardoor fout positieve en fout negatieve resultaten kunnen optreden. Om dergelijke foutieve resultaten te onderzoeken en de haalbaarheid van bovenstaande prestatieeis met betrekking tot de diverse ondergronden te onderzoeken, is de volgende serie experimenten uitgevoerd: In overleg met FO IJsselland zijn de meest voorkomende ondergronden met de bijbehorende manier van bemonsteren bepaald. Bij meerdere mogelijkheden van bemonsteren is gekozen voor degene die het meest efficiënt is. Eventuele fout positieve resultaten zijn onderzocht door de desbetreffende ondergronden zonder toevoeging van speeksel te testen (selectiviteit). Eventuele fout negatieve resultaten zijn onderzocht door op de desbetreffende ondergronden eerst 0,1µl speeksel (minimale donor: vrouw 45 jaar) aan te brengen en daarna pas de RSID Saliva field kit uit te voeren (robuustheid). De experimenten zijn uitgevoerd conform protocol. 9

10 Selectiviteit (verschillende ondergronden evt. fout positieven) Hoeveelheid Ondergrond Bemonstering Resultaat Speeksel in RSID 0µl Synthetisch textiel (wit) Knippen* Negatief 0µl Wol (wit) Knippen* Negatief 0µl Katoen (wit) Knippen* Negatief 0µl Geel katoen Knippen* Negatief 0µl Rood katoen Knippen* Negatief 0µl Blauw katoen Knippen* Negatief 0µl Zwart katoen Knippen* Negatief 0µl Papieren zakdoek (wit) Knippen* Negatief 0µl Condoom (met Knippen* Negatief glijmiddel) 0µl Maandverband Knippen* Negatief 0µl Behang (rood) Knippen* Negatief 0µl Bekleding autostoel Knippen* Negatief (zwart) 0µl Leer (wit) Afpoetsen** Negatief 0µl Beton Gruis in RSID Negatief 0µl Dennennaald Rechtstreeks in RSID Ongeldig (gele verkleuring) 0µl Metaal (ijzer) Afpoetsen** Negatief 0µl Hout Afpoetsen** Negatief 0µl Eikenblad Rechtstreeks in RSID Negatief 0µl Gras Rechtstreeks in RSID Negatief 0µl Humusachtige grond Rechtstreeks in RSID Ongeldig (gele verkleuring) 0µl Klei Rechtstreeks in RSID Ongeldig (gele verkleuring) 0µl Asfalt Gruis in Zwak positief * Conform RSID Saliva field kit protocol; 0,4cm 2 ** Afpoetsen is gedaan met een bevochtigd wattenstaafje, waarvan de kop vervolgens volledig in RSID is gebracht. Tabel 6: Selectiviteit RSID Saliva field kit (verschillende ondergronden) De gewenste resultaten zijn hier negatief. Indien het verkregen resultaat afwijkt, is dit met rood weergegeven in de tabel. 10

11 Robuustheid (sensitiviteit op verschillende ondergronden evt. fout negatieven) Hoeveelheid Ondergrond Bemonstering Resultaat Speeksel in RSID 0,1µl Synthetische textiel (wit) Knippen* Positief 0,1µl Wol (wit) Knippen* Positief 0,1µl Katoen (wit)** Knippen* Positief 0,1µl Papieren zakdoek (wit) Knippen* Positief 0,1µl Condoom (met Knippen* Positief glijmiddel) 0,1µl Maandverband Knippen* Positief 0,1µl Behang (rood) Knippen* Positief 0,1µl Bekleding autostoel Knippen* Zwak positief (zwart) 0,1µl Leer (wit) Afpoetsen Positief 0,1µl Beton Gruis in RSID Zwak positief 0,1µl Dennennaald Rechtstreeks in RSID Zwak positief 0,1µl Metaal (ijzer) Afpoetsen Positief 0,1µl Hout Afpoetsen Positief 0,1µl Eikenblad Rechtstreeks in RSID Positief 0,1µl Gras Rechtstreeks in RSID Positief 0,1µl Humusachtige grond Rechtstreeks in RSID Zwak positief 0,1µl Klei Rechtstreeks in RSID Ongeldig (gele verkleuring) 0,1µl Asfalt Gruis in Positief * Conform RSID Saliva field kit protocol; 0,4cm 2 ** De diverse kleuren katoen zijn getest in het kader van de selectiviteit (evt. fout positieve resultaten). Voor het prestatiekenmerk robuustheid is echter alleen wit katoen getest. Het gaat hier namelijk om de ondergrond zelf. Tabel 7: Robuustheid RSID Saliva field kit (sensitiviteit op verschillende ondergronden) De gewenste resultaten zijn hier (zwak) positief. Indien het verkregen resultaat afwijkt, is dit met rood weergegeven in de tabel. C onclusie Uit bovenstaande tabellen is te zien dat de RSID Saliva field kit voldoet aan de gestelde prestatieeis. Het merendeel van de ondergronden leidt niet tot fout positieve en/of negatieve resultaten. Met betrekking tot de selectiviteit: Alleen de ondergrond asfalt geeft een fout positief resultaat. Verder leiden de ondergronden dennennaald, humusachtige grond en klei tot ongeldige resultaten, omdat een gele verkleuring zichtbaar is. Een mogelijke verklaring voor het verkregen ongeldige resultaat op deze ondergronden is dat er waarschijnlijk gele kleurstoffen in relatief hoge concentraties aanwezig zijn. Deze kleurstoffen zijn in staat te binden aan het geïmmobiliseerde antilichaam op de immunografische cassette, waardoor er een gele verkleuring ontstaat. Opvallend is hier dat kleurstoffen geen fout positieve en/of ongeldige resultaten geven. Bij de standaard RSID Saliva kit is dit wel het geval. Met betrekking tot de robuustheid in aanwezigheid van de diverse ondergronden: Alleen voor de ondergrond klei blijft het resultaat ongeldig. De aanwezigheid van de overige ondergronden hebben allen geen aantoonbaar effect op het positieve resultaat. Voor asfalt moet echter wel duidelijk zijn, dat dit positieve resultaat niet per definitie een aanwijzing voor speeksel is. Immers, asfalt zelf leidt ook tot een (fout) positief resultaat. 11

12 b. Verouderd speeksel Forensisch onderzoekers zullen niet altijd meteen na het delict op een PD aanwezig zijn. Het tijdstip van het misdrijf kan sterk verschillen van het tijdstip van het sporenonderzoek en dus is het waarschijnlijk dat de aangetroffen speekselsporen al enige tijd zijn blootgesteld aan omgevingsfactoren. Bijbehorende prestatie-eis is daarom: 1. De RSID Saliva field kit moet in staat zijn verouderd speeksel op diverse ondergronden te karakteriseren. Het aantal fout negatieve resultaten moet tot een minimum beperkt blijven. Voor de standaard RSID Saliva kit is dit alleen onderzocht door de fabrikant zelf, welke de conclusie heeft getrokken dat de kit goed in staat is verouderde speekselsporen te karakteriseren. Hierbij moet worden aangetekend dat de invloed van diverse ondergronden niet is meegenomen. Om de invloed van tijd op de karakterisatie van speekselsporen door de RSID Saliva field kit te onderzoeken, is de volgende serie experimenten uitgevoerd: 0,1µl speeksel is op de diverse ondergronden gebracht. Deze zijn vervolgens 7 dagen weggezet bij 20-25ºC, waarna het RSID protocol weer is opgepakt. Voor 7 dagen is gekozen omdat de verwachting is dat in de meeste gevallen de forensisch onderzoekers binnen deze termijn ter plaatse zijn en de speekselsporen hebben kunnen veiligstellen. Hoeveelheid Speeksel in RSID 0,1µl Robuustheid (sensitiviteit bij verouderd speeksel evt. fout negatieven) Ondergrond Bemonstering Resultaat t = 0 dagen Resultaat t = 7 dagen Synthetisch textiel Knippen* Positief Positief (wit) 0,1µl Wol (wit) Knippen* Positief Positief 0,1µl Katoen (wit)** Knippen* Positief Positief 0,1µl Papieren zakdoek (wit) Knippen* Positief Positief 0,1µl Condoom (met Knippen* Positief Positief glijmiddel) 0,1µl Maandverband Knippen* Positief Positief 0,1µl Behang (rood) Knippen* Positief Positief 0,1µl Bekleding autostoel Knippen* Zwak positief Positief (zwart) 0,1µl Leer (wit) Afpoetsen Positief Positief 0,1µl Beton Gruis in RSID Zwak positief Negatief 0,1µl Dennennaald Rechtstreeks in RSID Zwak positief Positief 0,1µl Metaal (ijzer) Afpoetsen Positief Positief 0,1µl Hout Afpoetsen Positief Negatief 0,1µl Eikenblad Rechtstreeks in RSID Positief Positief 0,1µl Gras Rechtstreeks in RSID Positief Positief 0,1µl Humusachtige grond Rechtstreeks in RSID Zwak positief Positief 0,1µl Klei Rechtstreeks in RSID Ongeldig (gele verkleuring) Ongeldig (gele verkleuring) 0,1µl Asfalt Gruis in Positief Positief * Conform RSID Saliva field kit protocol; 0,4cm 2 ** De diverse kleuren katoen zijn getest in het kader van de selectiviteit (evt. fout positieve resultaten). Voor het prestatiekenmerk robuustheid is echter alleen wit katoen getest. Het gaat hier namelijk om de ondergrond zelf. Tabel 8: Robuustheid RSID Saliva field kit (sensitiviteit bij verouderd speeksel, t = 7dagen) De gewenste resultaten zijn hier (zwak) positief. Indien dit afwijkt, is dit met rood weergegeven in de tabel. 12

13 C onclusie De RSID Saliva field kit voldoet aan de gestelde prestatie-eis, met uitzondering van klei, beton en hout. Naarmate de tijd vordert zal het speeksel namelijk verder in dergelijke poreuze materialen getrokken zijn, waardoor de extractie-efficiëntie afneemt en fout negatieve resultaten op kunnen treden. Ook afpoetsen is in deze gevallen niet meer mogelijk. Opvallend is dat de poreuze ondergrond, humusachtige grond, niet leidt tot een fout negatief resultaat na 7 dagen. Klei leidt wederom tot een ongeldig resultaat. c. Extremen in temperatuur Speekselvlekken op een PD en RSID Saliva field kits die zijn opgeslagen in een voertuig van de Forensische Opsporing kunnen worden blootgesteld aan zowel hoge als lage temperaturen. Een temperatuur van 80 ºC kan bijvoorbeeld voorkomen in auto s die s zomers langdurig in de zon zijn geplaatst. Daarentegen kan de temperatuur in extreme winters tot -20 ºC dalen. De sensitiviteit van de RSID Saliva field kit kan hierdoor worden beïnvloed. Toch is het ook bij deze extreme temperaturen wenselijk dat betrouwbare resultaten worden verkregen. Derhalve is bijbehorende prestatie-eis: Bij blootstelling van extreme temperaturen (hier: -18 ºC en 80ºC) aan zowel de RSID field kit zelf als het speeksel, moet de RSID Saliva field kit betrouwbare resultaten geven. Fout negatieve resultaten moeten tot een minimum beperkt blijven. Voor de standaard RSID kit zijn dergelijke extreme temperaturen tot dusver niet getest. De fabrikant heeft alleen de langdurige invloed van blootstelling aan 37ºC onderzocht. Dit leidt niet tot foutieve resultaten. Om te onderzoeken of de resultaten van de RSID Saliva field kit niet beïnvloed worden door extremen in temperatuur, is de volgende serie experimenten uitgevoerd: Zowel de RSID Saliva field kit ( & immunografische cassette) als het speeksel zijn overnacht blootgesteld aan: -18ºC, 4ºC en 80ºC. Hiertoe zijn respectievelijk een vriezer, koelkast en oven gebruikt. Vervolgens is het speeksel in de RSID gebracht en is de RSID Saliva field kit volgens protocol uitgevoerd. Robuustheid (sensitiviteit bij extreme temperaturen) Hoeveelheid Temperatuur Blootgestelde Resultaat Speeksel in RSID 0,1µl -18ºC RSID Saliva field kit Positief 0,1µl 4ºC RSID Saliva field kit Positief 0,1µl 80ºC RSID Saliva field kit Negatief* Robuustheid (sensitiviteit bij extreme temperaturen) Hoeveelheid Temperatuur Blootgestelde Resultaat Speeksel in RSID 0,1µl -18ºC Speeksel Positief 0,1µl 4ºC Speeksel Positief 0,1µl 80ºC Speeksel Negatief Tabel 9: Robuustheid RSID Saliva field kit (sensitiviteit bij extreme temperaturen) De gewenste resultaten zijn hier (zwak) positief. Indien het verkregen resultaat afwijkt, is dit met rood weergegeven in de tabel. * De RSID- is visceus en wit uitgeslagen. 13

14 C onclusie: De RSID Saliva field kit voldoet niet aan de prestatie-eis. Als het speeksel en/of de RSID Saliva field kit wordt blootgesteld aan een temperatuur van 80ºC, zijn fout negatieve resultaten waarneembaar. Waarschijnlijk denatureert/degradeert het eiwit α-amylase bij dergelijk hoge temperaturen. De kit zelf kan de hoge temperaturen niet aan, omdat het water uit de RSID verdampt en deze te visceus wordt om op de immunografische membraan te worden gebracht. Het is dus van belang hoge temperaturen ten alle tijden te vermijden Conclusies In de experimenten uitgevoerd onder gesimuleerde PD-omstandigheden voldoet de RSID Saliva field kit aan de volgende gestelde prestatie-eisen met betrekking tot de robuustheid: Selectiviteit en robuustheid bij diverse veelvoorkomende ondergronden. Uitzonderingen bij de selectiviteit zijn dennennaald, humusachtige grond, klei en asfalt. De eerste drie leiden tot ongeldige resultaten. Asfalt geeft een fout positief resultaat. Uitzonderingen bij de robuustheid zijn klei en asfalt. Klei geeft wederom een ongeldig resultaat. Asfalt geeft een positief resultaat, maar hier is dus niet bekend of dit toe te schrijven is aan de aanwezigheid van α-amylase of het asfalt zelf. Robuustheid bij verouderd speeksel. Uitzonderingen hier zijn klei, beton en hout. Klei geeft een ongeldig resultaat, terwijl beton en hout tot fout negatieve resultaten leiden. De enige prestatie-eis die niet is behaald is: Robuustheid bij extremen in temperatuur. Dit is een punt van aandacht. Zowel de RSID Saliva field kit als het speeksel dienen niet te worden blootgesteld aan temperaturen van ±80ºC. Fout negatieve resultaten treden dan namelijk op. Al met al leiden de voorgemengde extractie-/running- en de ontbrekende centrifugestap niet tot uitzonderlijke foutieve resultaten. Alleen asfalt, urine en feces leiden tot fout positieve resultaten en zijn een punt van aandacht. Verder kunnen poreuze materialen en extremen in temperatuur tot problemen leiden Conclusies en Aanbevelingen Het inzetten van de RSID Saliva field kit is een stap in de goede richting met betrekking tot het vervullen van de behoefte van de Forensische Opsporing aan opsporingsgericht forensisch onderzoek. Voordelen van de methode zijn: Te gebruiken nabij of zelfs op een PD Resultaten binnen 1 uur Humaan specifiek Selectief Zeer gevoelig (weinig speeksel benodigd) Geen High Dose Hook Effect waarneembaar Robuust (tot dusver hebben alleen klei, asfalt, een aantal poreuze materialen en hoge temperaturen tot problemen geleid) Reproduceerbaar Het ontbreken van de centrifugestap en het voormengen van de extractie- en running- leiden dus niet tot extra foutieve resultaten. Ten opzichte van de huidige methode, de Phadebas amylase test, is het grote voordeel van de RSID Saliva field kit dat deze zeer selectief en sensitief is. Dit minimaliseert het aantal foute resultaten. 14

15 Bovenstaande conclusie betreffende het HDHE dient genuanceerd te worden, omdat er immers maar 1 donor is getest. Per individu kan het α-amylase gehalte verschillen. Echter uit tabel 10 blijkt dat de intensiteiten per donor niet dusdanig verschillen. Hoeveelheid Speeksel in Donor Resultaat RSID 30µl Man 24 jaar Positief 30µl Man 53 jaar Positief 30µl Vrouw 24 jaar Positief 30µl Vrouw 45 jaar Positief Tabel 10: Verschillende donoren Toch zijn er ook een aantal nadelen te benoemen. Dit zijn: Fout positieve resultaten verkregen voor asfalt, urine en feces. Deze lichaamsvloeistoffen kunnen in zedendelciten in mengvorm voorkomen met speeksel. Bijgevoegd protocol dient nauwgezet te worden gevolgd: o Een extractie korter dan 50min kan leiden tot fout negatieve resultaten. De extractie-efficiëntie neemt dan sterk af, waardoor er onvoldoende materiaal op de immunografische cassette wordt geladen. o Een analysetijd langer dan 10min kan leiden tot fout positieve resultaten. De ongebonden colloïdaal goud gelabelde antilichamen kunnen na verloop van tijd terugvloeien op de immunografische cassette en uiteindelijk binden op plaats T. Dit leidt tot een rode verkleuring en dus een fout positief resultaat. Gedurende de experimenten is dit meerdere malen waargenomen. Het is dus van belang het resultaat van de RSID Saliva field kit na 10min af te lezen en direct een foto te maken, zodat het resultaat is vastgelegd. De strip kan vervolgens worden weggegooid. Methode is zeer afhankelijk van de wijze van bemonsteren (en dus de hoeveelheid speeksel). Onjuist bemonsteren kan leiden tot fout negatieve resultaten. Dit is zeker het geval bij poreuze materialen. Uitgangspunt dient te zijn dat er altijd wordt gekozen voor de methode met de beste bemonsteringsefficiëntie (vb. knippen in plaats van afpoetsen). Fout negatieve resultaten verkregen voor beton en hout. De methode is destructief, omdat het geëxtraheerde materiaal niet kan worden gebruikt voor een DNA typering. Op een PD kan immers meestal niet DNA vrij worden gewerkt. Daarnaast zijn de bijgeleverde materialen in de RSID Saliva field kit, zoals een schaar, niet steriel. Besluit EGFO-V De resultaten van deze validatiestudie zullen worden voorgelegd aan de Expert Groep Forensische Opsporing Vakinhoud (EGFO-V). Deze zullen vervolgens moeten bepalen of de RSID Saliva field kit wordt gezien als een goede aanvulling op de uitrusting van de forensisch onderzoeker. 15

16 3. Literatuur [1] Independent Forensics. Developmental Validation Study of Rapid Stain Identification Test for Saliva (RSID-Saliva), [2] Old, J.B., Schweers, B.A., Boonlayangoor, P.W., Reich, K.A. Developmental Validation of RSID TM -Saliva: A lateral Flow Immunochromatographic Strip Test for the Forensic Detection of Saliva. Journal of Forensic Science, Vol. 54, No. 4, Pag , 2009 [3] Pang, B.C.M., Cheung, B.K.K. Applicability of Two Commercially Available Kits for Forensic Identification of Saliva Stains. Journal of Forensic Science, Vol. 53, No. 5, Pag ,