SAMENVATTING EN CONCLUSIES SAMENVATTING EN CONCLUSIES

Transcriptie

1 SAMENVATTING EN CONCLUSIES SAMENVATTING EN CONCLUSIES 137

2 Binnen één spier kunnen de contractiele elementen, de spiervezels, uiteenlopende biochemische en fysiologische eigenschappen hebben. Verschillende soorten spiervezels zijn optimaal uitgerust voor het vervullen van verschillende motorische taken. Vezels met langzame contracties en een hoog uithoudingsvermogen zijn geschikt voor het gebruik in langdurige contracties die nodig zijn voor het behoud van lichaamshouding. Snelle vezels met een hoog mechanisch vermogen zijn daarentegen optimaal voor krachtige spierverkortingen bij het maken van bewegingen. De individuele spieren van de ledematen bevatten meestal een mengsel van de beide hoofdsoorten van vezels, zij het in verschillende proporties binnen verschillende spieren. De langzame en snelle vezels kunnen worden geïdentificeerd in histologische coupes die gekleurd zijn voor het aantonen van myofibrillaire ATPase (matpase). In histochemisch verband komen langzame vezels overeen met type I en snelle vezels met type II (voor algemene achtergrondskennis, zie Hoofdstuk 1). Dit proefschrift betreft hoofdzakelijk de spatiële verdeling van de langzame type I vezels binnen spieren van de achterpoot. Het is sinds lang bekend dat binnen sommige spieren de distributie van type I en II vezels zeer onevenredig kan zijn. Dit fenomeen van spiervezel-type regionalisatie werd tot nu toe echter niet goed begrepen en ook niet grondig kwantitatief onderzocht. In dit proefschrift worden nieuwe methoden en procedures geïntroduceerd voor de kwantificatie van spiervezel-type regionalisatie in histochemische coupes. De methoden werden toegepast bij metingen in coupes van normale spieren uit de onderpoot van drie veel gebruikte soorten proefdier (muis, rat, konijn). De normale patronen van regionalisatie werden verder vergeleken met de patronen die ontstonden na onderbreking van de zenuw (denervatie) en een daarop volgende reïnnervatie. Hieronder worden verdere details beschreven van verschillende aspecten uit deze onderzoekingen. Nieuwe methoden voor de kwantificatie van diverse aspecten van spiervezel-type regionalisatie worden beschreven in Hoofdstuk 2. Ten eerste werd een massa-vector methode beschreven waarmee de positie van een populatie van vezels binnen een dwarscoupe kan worden vastgelegd. Volgens deze procedure wordt de locatie van het midden van de spierdwarsdoorsnede berekend als het zwaartepunt van een uniforme plaat van dezelfde vorm en grootte. Verder wordt de locatie van het midden van de populatie van spiervezels berekend als het zwaartepunt van overeenkomstig geplaatste puntvormige indicatoren, elk met dezelfde massa. De doel-vezel vector (b.v. type I vezel vector ) is de lijn die het midden van de spierdwarsdoorsnede verbindt met het midden van de doel-vezelpopulatie. De hoek van deze vector geeft de richting aan van de excentriciteit van de betrokken vezelpopulatie en de relatieve lengte van de vector weerspiegelt de mate van excentriciteit. Ten tweede werden methoden vergeleken voor de omschrijving en kwantitatieve bepaling van het gebied waarbinnen de doel-vezels zich bevinden (b.v. type I vezels). Eén van deze methoden, de sector methode, werd 138

3 SAMENVATTING EN CONCLUSIES nieuw ontwikkeld in verband met ons project. Resultaten verkregen met de sector methode werden vergeleken met de uitkomsten van de bekende rekenprocedure van de convex hull. De buitengrenzen van de vezelpopulatie werden wat meer gedetailleerd gevolgd met de sector methode terwijl de hull methode als voordeel had dat de berekeningen meer automatisch zijn en minder afhankelijk van voorafgaande parameterinstellingen. In Hoofdstuk 3 werden de nieuwe kwantitatieve procedures gebruikt voor onderzoek naar de vezel-type regionalisatie binnen alle met de voet verbonden spieren van de onderpoot van de rat. Dwarscoupes uit het midden tussen de proximale en distale uiteinden (uit de spier-buik ) werden onderzocht voor de volgende 12 spieren: ED, extensor digitorum longus; EH, extensor hallucis longus; FD, flexor digitorum & hallucis longus; GL, gastrocnemius lateralis; GM, gastrocnemius medialis; PB, peroneus brevis; PD, peroneus digiti 4 & 5; PE, peroneus longus; PL, plantaris; SO, soleus; TA, tibialis anterior; TP, tibialis posterior. Met uitzondering van de langzame soleus zijn al deze spieren gedomineerd door snelle vezels ( snelle spieren). Een onderscheid werd gemaakt tussen twee potentiëel onafhankelijke aspecten van de spatiële vezeldistributie: areaal-regionalisatie en vectorregionalisatie. De mate van areaalregionalisatie geeft aan in hoeverre de distributie van de doel-vezelpopulatie zich beperkt tot een deel van de gehele dwarsdoorsnede van de spier. Hierbij werd zowel de sector- als de hull-methode gebruikt voor de berekeningen (FRs, FRh) en het areaal van het doel-vezelgebied werd gegeven als percentage van de gehele spier-dwarsdoorsnede. De mate en richting van vector-regionalisatie werd gegeven als de relatieve lengte en richting van de doel-vezel vector (lengte in percentage van de diameter van de spierdwarsdoorsnede). De mate en richting van vector-regionalisatie komt dus overeen met de mate en richting van excentriciteit in de ligging van de doelvezels binnen de spier-dwarsdoorsnede. Alle onderzochte spieren waren vector-geregionaliseerd en van de snelle spieren waren de meesten ook areaalgeregionaliseerd (uitzonderingen: PB, PD). Verder bleken de twee aspecten van regionalisatie sterk met elkaar te zijn gecorreleerd. Zowel de richting als de mate van vector-regionalisatie waren significant gerelateerd aan de positie van de spieren binnen de poot: binnen een spierdwarsdoorsnede waren de type I vezels meestal (maar niet altijd) vooral aanwezig aan de kant tegen het centrum van de poot en deze excentriciteit van de type I vezel posities was doorgaans meer uitgesproken voor spieren ver van het centrum van de poot dan voor spieren met een meer centrale ligging. In Hoofdstuk 4 werden deze onderzoekingen uitgebreid tot een analyse van de samenstelling van spieren langs hun lengte. Dit werd gedaan voor vijf snelle spieren uit de onderpoot van de rat (ED, FD, GM, PE en TA), en de samenstelling werd bepaald binnen 7 proximo-distaal verschillende niveau s van dwarsdoorsneden. De vijf onderzochte spieren hadden duidelijk verschillende motorische taken en functionele specialisaties (b.v. verschillen in relatieve hoeveelheden type I vezels). Echter, de proximo-distale verdeling van 139

4 type I vezels was verbazingwekkend gelijk: in alle vijf de spieren werd nagenoeg dezelfde relatieve afname van de dichtheid van type I vezels gevonden van proximaal naar distaal. Parallel hiermee toonden alle onderzochte spieren ook een toename, van proximaal naar distaal, van de mate van zowel areaal- als vector-regionalisatie van de type I vezels. Als achtergrond voor de interpretatie van deze gegevens werden ook hoofdtrekken van de architectonische opbouw van de spieren in de kaart gebracht. De lengte werd gemeten van individueel vrij geprepareerde spiervezels uit verschillende locaties binnen elke spier (weefsel van tevoren verzacht door chemische behandeling). De pinnatie-hoeken van de vezels werden globaal bepaald in onbehandelde spieren. De vijf spieren hadden allemaal een geveerde structuur en de lengte van individuele spiervezels was gemiddeld tussen 21 en 55 % van de spierlengte. De variatie van de dichtheid van type I vezels tussen proximo-distaal verschillende dwarsdoorsneden zou dus inderdaad verklaard kunnen worden als een gevolg van geleidelijke veranderingen in de proporties tussen de type I en II vezel populaties van proximaal naar distaal; het was niet nodig te veronderstellen dat er ook veranderingen in histochemische eigenschappen plaats zouden vinden langs individuele spiervezels. In Hoofdstuk 5 werden de bevindingen uit spieren van de rat vergeleken met overeenkomstige metingen bij twee andere soorten van vaak bestudeerde proefdieren: konijnen en muizen. Veel algemene overeenkomsten werden gevonden met betrekking tot de type I vezel regionalisatie bij de drie soorten dieren: alle onderzochte spieren toonden een vector-regionalisatie en in de meeste spieren was er ook sprake van een significante areaal-regionalisatie. De mate waarin de beide soorten regionalisatie voorkwamen binnen overeenkomstige snelle spieren was echter duidelijk en consistent verschillend tussen de drie soorten dieren. Voor de relatieve grootte van het type I vezel areaal waren spieren gerangschikt in de orde konijn > rat > muis en voor de mate van type I vezel excentriciteit (relatieve lengte van de type I vezel vector) was de ordening konijn < rat < muis. Deze soort-verbonden verschillen vonden plaats onafhankelijk van de variaties in totale type I vezeldichtheid binnen de diverse spieren. In de lengterichting van de spieren waren de veranderingen van type I vezel dichtheid weinig opvallend in het konijn, maar relatief gelijk tussen rat en muis. De bevinding dat de mate van type I vezel regionalisatie consistent verschillend is tussen de drie onderzochte diersoorten is in overeenstemming met de gedachte dat dit fenomeen waarschijnlijk niet slechts een soort overblijfsel is van embryonale ontwikkelingsprocessen, maar dat de regionalisatie waarschijnlijk ook van functionele betekenis is in het volwassen dier. Het is echter nog onduidelijk welke de functionele voordelen van de type I vezel regionalisatie dan zouden zijn. Verschillende mogelijkheden werden besproken in de hoofdstukken 3-5. Al vroeg tijdens de embryonale ontwikkeling van skeletspieren komen de processen in werking die leiden tot de karakteristieke patronen van type I vezel regionalisatie. Deze processen lijken o.a. mechanismen te bevatten voor het 140

5 SAMENVATTING EN CONCLUSIES begeleiden van de zenuwvezels (axonen) van langzame motoneuronen naar de gebieden van langzame spiervezels. In Hoofdstuk 6 hebben wij onderzocht of zulke mechanismen voor de regionale begeleiding van langzame zenuwvezels nog steeds beschikbaar zijn in het volwassen dier (rat). Onder algemene verdoving werd in één van de achterpoten de ischiadicus-zenuw doorgesneden op een niveau tussen heup en knie; daarna werden de uiteinden meteen weer met elkaar verbonden. Het is bekend dat na een dergelijke operatie een degeneratie optreedt van de distale (meer perifere) gedeeltes van de zenuwvezels waardoor de daarmee verbonden spiervezels raken gedener-veerd. De zenuwvezels die er nog zijn aan de centrale kant van de zenuw-doorsnijding groeien vervolgens weer uit en kunnen functionele verbindingen maken met gedenerveerde spiervezels ( reïnnervatie ). Uit eerdere publicaties is echter bekend dat, in volwassen dieren, deze weer uitgroeiende zenuwvezels niet in staat zijn om de weg te vinden naar hun eigen oorspronkelijke spier. Na de operatie van de zenuwdoorsnijding werden de ratten met rust gelaten gedurende 21 weken. Daarna werden uit beide achterpoten vijf verschillende spieren uitgeprepareerd voor nader onderzoek naar hun patronen van type I vezel regionalisatie (ED, FD, GM, PE, TA; dezelfde methoden als in Hoofdstuk 2-3). Alhoewel de variabiliteit groter was dan normaal, werd in dwarsdoorsneden van de gereïnnerveerde spieren gemiddeld een richting van type I vezel regionalisatie gevonden die nagenoeg identiek was aan die van de overeenkomstige contralaterale controle-spieren. De gemiddelde afname van type I vezel dichtheid van proximaal naar distaal was ook grotendeels gelijk in de experimentele en controle spieren. Er was echter ook één belangrijk verschil tussen de twee groepen spieren: de type I vezels lagen veel vaker dicht op elkaar in de gereïnnerveerde spieren dan in de controle spieren. Deze vezel-type klontering ( fibre type grouping ), een vaak voorkomend fenomeen bij spierreïnnervatie, betekent dat de ingroeiende langzame zenuwvezels in veel gevallen voormalige snelle spiervezels hadden gereïnnerveerd en dat vervolgens de eigenschappen van deze spiervezels daardoor werden veranderd van snel naar langzaam (type II naar type I). Na de reïnnervatie was dus in deze gevallen de gemiddelde ligging van de type I spiervezels ook een maat van waar nu de langzame zenuwvezels terecht waren gekomen; de gelijkheid van type I vezel regionalisatie in experimentele en controle spieren kon niet simpelweg worden verklaard als het aanblijven van oude spiervezel-eigenschappen ongeacht wat er was gebeurd met de innervatie. De resultaten van deze proeven gaven sterke aanwijzingen dat, binnen individuele spieren van volwassen dieren, mechanismen nog aanwezig zijn voor de regionaal correcte (moleculaire) begeleiding van uitgroeiende langzame axonen. In Hoofdstuk 7 werd onderzocht in hoeverre het herstel van normale regionalisatie-patronen na reïnnervatie afhankelijk was van de omstandigheden waaronder de reïnnervatie plaats vond. Deze proeven werden allemaal verricht met betrekking tot de spier gastrocnemius medialis (GM), een normaliter zeer duidelijk geregionaliseerde spier met een 141

6 makkelijk te bereiken zenuw. In al deze proeven werd, in een eerste operatie onder algehele verdoving, de GM zenuw van één poot doorgesneden dicht bij de spier en dan weer met de spier verbonden. Daarna volgde (zoals in Hoofdstuk 6) een reïnnervatie-periode van 21 weken waarna de GM spier werd uitgeprepareerd van beide achterpoten en onderzocht met onze standaard methodes. Vijf groepen dieren werden met elkaar vergeleken: (1-2) doorsneden GM zenuw verbonden met originele intree-plaats op de spier (groep ox) of met andere, meer mediale plaats (groep dx); (3-4) zoals groepen ox en dx, maar na een rotatie van de GM spier om zijn lengteas (groepen Tox en Tdx); (5) rotatie van de spier zoals bij groepen Tox en Tdx, maar zonder doorsnijding van de zenuw (Tc). In alle gereïnnerveerde spieren (ox, dx, Tox, Tdx), maar niet in slechts geroteerde spieren (Tc), werd een sterke toename van type I vezelklontering gevonden; veel type II vezels waren dus na de reïnnervatie veranderd tot type I vezels. De gemiddelde richting van de type I vezel regionalisatie was gelijk in groepen ox en dx en in de contralaterale controles. De begeleiding van ingroeiende langzame axonen in de richting naar de langzame spiergebieden was dus even effectief ongeacht of de axonen mochten ingroeien langs de oude zenuw of langs een nieuw intramusculair traject. In de groepen met spier-rotatie plus reïnnervatie (Tox, Tdx) was de richting van de regionalisatie veranderd op een wijze die niet geheel kon worden verklaard als een resultaat van de rotatie met behoud van een vast patroon van intra-musculaire regionalisatie. Deze resultaten gaven aan dat de regionalisatiegerichte begeleiding van de ingroeiende zenuw afhankelijk was van zowel de topografische verhoudingen binnen de spier als ook binnen de achterpoot als geheel. Vergeleken met de reïnnervatie langs een vreemd intramusculair traject (groepen dx, Tdx), gaf een ingroei langs de oude zenuwstomp (groepen ox, Tox) minder spier-atrofie, meer normale hoeveelheden type I vezels en minder extreme (maar toch zeer sterk verhoogde) patronen van type I vezel-klontering. Vergeleken met groep ox hadden de gereïnnerveerde spieren van groep dx significant kleinere aantallen type I vezels. Het is nog onbekend of dit een teken was van een vermindering van het aantal overlevende langzame motoneuronen en/of een verkleining van de omvang van de gereïnnerveerde langzame motorische eenheden. Samenvattend gaven onze resultaten aan dat, binnen achterpootspieren van zoogdieren, de vezel-type regionalisatie een zeer algemeen verschijnsel is met op duidelijke wijze georganiseerde eigenschappen. Deze bevindingen kunnen dienen als een basis voor verder onderzoek over de functionele betekenis van deze intrigerende aspecten van spierorganisatie. Bovendien blijkt de spiervezel-regionalisatie ook interessante mogelijkheden te bieden voor verder experimenteel onderzoek naar mechanismen van het begeleiden en doelvinden van uitgroeiende axonen in volwassen dieren. Tenslotte geven onze metingen een praktisch bruikbare plattegrond van hoe de snelle en langzame vezels zijn verdeeld binnen spieren die vaak worden gebruikt ook in ander biomedisch onderzoek (o.a. belangrijk bij electromyografisch onderzoek, spierbiopten, etc.). 142