VASCULARISATIE VAN HET EQUINE CORPUS LUTEUM

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar VASCULARISATIE VAN HET EQUINE CORPUS LUTEUM door Kitty DE CLERCQ Promotor: Dr. Jan Govaere Co-promotor: Prof. Dr. Gunther Van Loon Onderzoek uitgevoerd in het kader van de masterproef 2015 Kitty De Clercq

2 VRIJWARINGSCLAUSULE Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

3 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar VASCULARISATIE VAN HET EQUINE CORPUS LUTEUM door Kitty DE CLERCQ Promotor: Dr. Jan Govaere Co-promotor: Prof. Dr. Gunther Van Loon Onderzoek uitgevoerd in het kader van de masterproef 2015 Kitty De Clercq

4 VOORWOORD Graag wil ik van dit voorwoord gebruik maken om enkele mensen te bedanken. Allereerst mijn promotor, Dr. Jan Govaere, die mij de kans heeft gegeven dit onderzoek te voeren en me hierbij heeft begeleid. Ook mijn co-promotor, Prof. Dr. Gunther Van Loon, wil ik graag bedanken voor de hulp bij de instellingen van het echotoestel en zijn feedback. Verder bedank ik Jeroen Hoekstra om me wegwijs te maken met het programma ImageJ. Daarnaast wil ik zeker ook Margot Van de Velde bedanken voor de hulp tijdens mijn proeven. Vervolgens bedank ik mijn ouders voor de kans die ze me gegeven hebben om diergeneeskunde te studeren, hun geduld en steun tijdens deze studie en het nalezen van mijn masterproef. En tenslotte wil ik graag mijn vriend en mijn vrienden bedanken voor de motivatie en de nodige ontspanning tijdens dit onderzoek.

5 INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING... 1 INLEIDING... 2 LITERATUURSTUDIE... 3 I. CYCLUS VAN DE MERRIE Folliculaire fase of oestrus Ovulatie Luteale fase of dioestrus Definities Vorming van het corpus luteum Functie en regeling van het corpus luteum Het verloop van progesteron tijdens de cyclus Beeldvorming van het corpus luteum II. VASCULARISATIE VAN HET CORPUS LUTEUM TIJDENS DE CYCLUS Doorbloeding van de ovaria Vascularisatie van het corpus luteum Beeldvorming en verloop van de vascularisatie Doppler echografie Verloop van de vascularisatie in het corpus luteum III. INVLOED VAN PROSTAGLANDINE Invloed op de progesteron concentratie Invloed op de vascularisatie ONDERZOEKSSTUDIE I. DOELSTELLINGEN EN ONDERZOEKSONTWERP Doelstellingen Onderzoeksontwerp II. MATERIAAL EN METHODEN Studiepopulatie en interventie... 23

6 2. Beeldvorming en metingen De dwarsdoorsnede van het corpus luteum De bloedstroming in het corpus luteum Progesteronbepaling III. RESULTATEN Deel I geen interventie De progesteronconcentratie De dwarsdoorsnede van het corpus luteum De doorbloeding van het corpus luteum Deel II met interventie De progesteronconcentratie De dwarsdoorsnede van het corpus luteum De doorbloeding van het corpus luteum Overzicht vóór de toediening van prostaglandine BESPREKING CONCLUSIE REFERENTIELIJST... 39

7 SAMENVATTING In de echografische opvolging van de cycliciteit van de merrie kan men tijdens de luteale fase, benevens indirect door middel van progesteron metingen, moeilijk de exacte leeftijd en metabole activiteit van het corpus luteum meten. Dit beperkt de mogelijkheden van de dierenarts om tijdig een therapie in te zetten en om accuraat te voorspellen wanneer de merrie opnieuw dient te worden onderzocht. De vascularisatie, die essentieel is voor de functie van het corpus luteum, door de aanvoer van steroïde precursoren naar het ovarium en de vrijlating van progesteron in de systemische circulatie, verandert gedurende de levenscyclus van het corpus luteum. Het meten van die vascularisatie van het corpus luteum, zou ons in staat stellen om accurater een therapie in te zetten, om de viabiliteit en activiteit van het corpus luteum in te schatten. Doppler echografie, gebaseerd op het Doppler-effect, is een opkomende technologie die frequent wordt toegepast in de transrectale studie van het genitaal stelsel. Power Doppler, een meer gevoelige en hoekonafhankelijke Doppler techniek, wordt aangewend in dit onderzoek. Enerzijds ter bevestiging van de literatuur omtrent de relatie tussen de doorbloeding van het corpus luteum en de progesteron concentratie in het plasma en anderzijds bij de studie naar een meer eenvoudiger manier om een geïnduceerde luteolyse aan te tonen. Acht merries worden opgevolgd in het vroege voortplantingsseizoen aan de hand van drie studieparameters: de dwarsdoorsnede van het corpus luteum, de doorbloeding van het corpus luteum en de plasma progesteron concentratie. In een eerste deel worden twee merries opgevolgd zonder interventie, in een tweede deel krijgen zes merries een prostaglandine injectie bij een zeven of acht dagen oud corpus luteum. Een dag na de toediening van prostaglandine is er over het algemeen een daling te zien van de drie parameters. De metingen voor de bepaling van het verloop van de vascularisatie in de luteale fase zijn té onregelmatig om een besluit te kunnen vormen. Mogelijks levert verder onderzoek aan de hand van 3D Doppler echografie, een grotere studiepopulatie met meer metingen en het type ovulatie als bijkomende parameter betere resultaten op. Sleutelwoorden: corpus luteum - power Doppler - progesteron - prostaglandine - vascularisatie 1

8 INLEIDING Het corpus luteum is een tijdelijke endocriene klier die ontwikkelt na ovulatie en een belangrijke rol speelt in het onderhoud van de dracht door de productie van progesteron. De vorming en de groei van dit corpus luteum bestaat uit herhalende patronen van cellulaire ontwikkeling en differentiatie. De nieuwe vasculaire groei uit bestaande bloedvaten, of de angiogenese, is een belangrijke component in de folliculaire ontwikkeling en de luteale functie (Tamanini en De Ambrogi, 2004). Na ovulatie dringen de bloedvaten doorheen de basaalmembraan en invaderen de granulosacellaag. Deze neovascularisatie is essentieel voor de toevoer van nutriënten en hormonen om de functie van het corpus luteum te ondersteunen (Ferreira-Dias et al., 2006). Op het einde van de luteale fase wordt het corpus luteum afgebroken door het hormoon prostaglandine. Bij deze luteale regressie zullen zowel vasculaire als steroidogene cellen degenereren en de vascularisatie van het corpus luteum zal bijgevolg verdwijnen. De angiogenese en de angioregressie worden geregeld door systemische en lokale factoren. De controle van de angiogene ontwikkeling in het ovarium is nuttig voor de verbetering van de reproductie (Tamanini en De Ambrogi, 2004). De cyclische veranderingen van het corpus luteum bij de merrie werden gedurende lange tijd enkel door monitoring via B-mode echografie en de bepaling van het plasma progesteron level opgevolgd (Townson en Ginther, 1989; Bergfelt en Ginther, 1996). Bij andere diersoorten werd het verband tussen de plasma progesteron concentratie en de veranderingen in de luteale bloedvloei onderzocht door middel van invasieve methoden zoals de implantatie van elektromagnetische probes bij ooien (Brown et al., 1980). De laatste decennia brengen hoge resolutie echografische toestellen met B- mode en verscheidene Doppler-modes een enorme dimensie aan de evaluatie van het corpus luteum. Het doel van dit onderzoek is enerzijds een bevestiging geven van de literatuur in verband met de relatie bij de merrie tussen de vascularisatie van het corpus luteum, de dwarsdoorsnede van het corpus luteum en de progesteronconcentratie in het plasma. Anderzijds wordt er nagegaan in welke mate de daling van de functie van het corpus luteum na de toediening van prostaglandine kan worden waargenomen aan de hand van Doppler echografie en in welke mate het haalbaar is in de praktijk de progesteronbepaling hierdoor te vervangen. 2

9 LITERATUURSTUDIE I. CYCLUS VAN DE MERRIE De merrie is een poly-oestrisch en seizoensgebonden dier, met een voortplantingsseizoen in de lente en zomer (Brinsko et al., 2011). Een belangrijke factor in de regeling van de cyclus bij de merrie is de fotoperiode of dag- en nachtlengte. Melatonine, een hormoon dat wordt geproduceerd door de epifyse of pijnappelklier, regelt de secretie van GnRH (Gonadotropine Releasing hormoon) door zijn invloed op de hypothalamus. Melatonine wordt voornamelijk s nachts geproduceerd. De hoge concentraties tijdens de lange nachten in de herfst en de winter zorgen voor onderdrukking van de GnRH aanmaak en afgifte. Gedurende de korte nachten in het voortplantingsseizoen neemt de lage concentratie melatonine de remming van GnRH weg (Brinsko et al., 2011). Een merrie is voor de voortplanting dus afhankelijk van haar geografische locatie, maar ook andere factoren zoals voeding, genetica en de omgeving spelen een rol (Raz en Aharonson-Raz, 2012). Ook opioïden zouden een rol spelen in de seizoensgebonden voortplanting, door suppressie van de gonadotropines voornamelijk in de winter. Dit wordt echter nog verder onderzocht (Brinsko et al., 2011). De oestrus cyclus loopt van een ovulatie tot de volgende ovulatie en bedraagt ongeveer 21 tot 22 dagen. Deze cyclus wordt onderverdeeld in twee fasen. Tijdens de folliculaire fase of oestrus 4 tot 7 dagen, met een grote variatie in lengte mogelijk van 2 tot 12 dagen vertoont de merrie bepaalde gedragssignalen, laat de merrie de hengst toe en bereidt het voortplantingsstelsel zich voor op de ontvangst en het transport van sperma. Gedurende de luteale fase of dioestrus 14 tot 15 dagen is de merrie niet ontvankelijk voor de hengst en maakt het voortplantingsstelsel zich klaar voor een mogelijke dracht (Brinsko et al., 2011; Raz en Aharonson-Raz, 2012). 1. Folliculaire fase of oestrus Tijdens de folliculaire fase groeien de follikels en produceert voornamelijk de dominante follikel oestrogenen, waardoor oestrusgedrag of hengstigheid ontstaat (Brinsko et al., 2011). Het terugkerend patroon van de cyclus wordt geregeld door hormonen (figuur 1). Bij de start van het voortplantingsseizoen is er een daling van melatonine vanwege de korte nachten, waardoor de remming van GnRH (gonadotropine releasing hormoon) wegvalt. GnRH zorgt op zijn beurt voor de synthese en vrijlating van FSH (follikel stimulerend hormoon) en LH (luteïniserend hormoon) uit de hypofysevoorkwab. Ter hoogte van de ovaria staat FSH in voor de folliculaire ontwikkeling terwijl LH zorgt voor folliculaire rijping, productie van oestrogeen, ovulatie en luteïnisatie (Brinsko et al., 2011). Groeiende follikels produceren oestrogeen en inhibine, deze hebben respectievelijk een positieve feedback op LH afgifte en een negatieve feedback op FSH afgifte (Brinsko et al., 2011). 3

10 Figuur 1: Het verloop van hormonen en de tijdelijke relatie met folliculaire en luteale ontwikkeling tijdens de oestrus cyclus bij de merrie. (Uit: Ginther, 1999; Bron: Bergfelt, 2009) De groei van follikels verloopt in golfpatronen (figuur 1), waarbij de meeste merries één of twee folliculaire golven hebben per cyclus (Raz en Aharonson-Raz, 2012). Een folliculaire golf slaat op een groep follikels die synchroon groeien, tot één of eventueel twee follikels sterker beginnen te groeien in vergelijking met de andere follikels en vervolgens dominant worden (Brinsko et al., 2011). De verandering in groei tussen de dominante en ondergeschikte follikels noemt men de folliculaire deviatie (Bergfelt en Adams, 2007). Door de toename van intra-folliculaire factoren enkel in de grootste follikel, voornamelijk IGF (insuline-like groeifactor), zal deze dominante follikel verder uitgroeien en ovuleren (Beg en Ginther, 2006). Aangezien niet alle golven aanleiding geven tot ovulatie wordt er een onderscheid gemaakt tussen ovulatoire en anovulatoire golven. Bovendien wordt er een onderscheid gemaakt tussen major waves, met een duidelijk verschil tussen een dominante follikel en verschillende ondergeschikte follikels, en minor waves, waarbij geen enkele follikel voldoende groot is om dominant te worden (Raz en Aharonson-Raz, 2012). Doorgaans heeft een merrie een major ovulatoire golf in het midden van de cyclus met 1 dominante follikel die zal ovuleren en verschillende ondergeschikte follikels die zullen regresseren (Raz en Aharonson-Raz, 2012). 4

11 2. Ovulatie De productie van oestrogeen en inhibine door de preovulatoire follikel, samen met de afwezigheid van progesteron, zorgt voor een golf van LH uit de hypofyse. Deze hoge concentraties van LH zijn nodig voor de verdere groei van de dominante follikel en de voorbereiding op ovulatie. Tijdens ovulatie scheurt de follikelwand ter hoogte van de ovulatiegroeve waardoor de follikelvloeistof samen met een deel granulosacellen en het cumulus-eicel-complex wegvloeit (Bergfelt en Adams, 2007). De ovulatie vindt meestal rond 24 tot 48 uur voor het einde van de oestrus plaats (Sendel, 2010). Figuur 2: Echografisch beeld (B-mode) van een preovulatoire follikel één dag voor de ovulatie. A= het antrum G= de granulosacellaag T= de thecacellaag (Uit: Gastal et al., 2006a) Bij het naderen van de ovulatie kunnen echografisch meerdere veranderingen waargenomen worden in de wand van de dominante follikel. De granulosacellaag, dit is de echogene rand rondom het antrum (figuur 2), zal verdikken en een stijgende echogeniciteit vertonen (Pierson en Ginther, 1985b). Enkele uren voor de ovulatie wordt de aflijning van deze cellaag onregelmatig en getand, ook wel de karteling van de granulosa genoemd (figuur 3). Deze karteling wordt voornamelijk 12 uur tot 1 uur vóór de ovulatie waargenomen en speelt een belangrijke rol in de voorspelling van het tijdstip van de eisprong (Gastal et al., 2006b). Ook de thecacellaag, te zien als anechogene band op de B-mode (figuur 2), zal enkele dagen voor de ovulatie toenemen. Aan de hand van kleuren Doppler kan de dagelijkse toename van de doorbloeding in deze anechogene band worden aangetoond. Vier uur vóór de ovulatie verkleint deze thecacellaag en zal de doorbloeding afnemen. Beide parameters zijn van belang voor de voorspelling van het tijdstip van ovulatie (Gastal et al., 2006a). Figuur 3: De preovulatoire follikel 1 uur voor de ovulatie, met karteling van de granulosa (A= B-mode; B= kleuren mode; sg= karteling van de granulosa) (Uit: Ginther et al., 2007c). 5

12 De preovulatoire follikel kan op twee manieren ovuleren: de normale follikel evacuatie en de gesepteerde follikel evacuatie. Bij de normale evacuatie vloeit 90% van de antrale vloeistof weg binnen het uur. Er wordt een apex gevormd, dit is het dunwandig en avasculair deel van de preovulatoire follikelwand, waar de ruptuur tijdens de ovulatie zal plaatsvinden (Ginther et al., 2007c). Bij de helft van deze normale evacuaties is de vrijlating van het meeste follikelvocht een abrupt proces met een duur van 5 tot 90 seconden. Ongeveer 15% van de vloeistof blijft na dit kort proces achter in het antrum. Bij de andere helft verloopt dit proces traag en gradueel gedurende 6 tot 7 minuten en blijft er ongeveer 10% follikelvocht achter. Het duurt minuten tot uren vooraleer het follikelvocht volledig verdwenen is (Townson en Ginther, 1989; Bergfelt en Adams, 2007). Tijdens de gesepteerde evacuatie verdwijnt 75% van het follikelvocht in meer dan 3 uur, met de groei van onregelmatige, echogene septa. De gevormde compartimenten bevatten folliculaire vloeistof en het voorkomen van dit type evacuatie is gerelateerd aan de lokalisatie van de bloedvaten in de periferie van de follikel (Carnevale et al., 1994). Eveneens kan door een bloeduitstorting de preovulatoire follikel omgevormd worden tot een haemorrhagische anovulatoire follikel. In de plaats van de ovulatie wordt er een hematoom gevormd in het antrum (Ginther en Pierson, 1989). Ten slotte kan de preovulatoire follikel ook in atresie gaan. Dit komt af en toe voor in het overgangsseizoen van de merries en is vermoedelijk hormonaal gestuurd (Gastal en Gastal, 2011). De diameter van de dominante follikel bedraagt meestal 40 tot 45 mm. Maar zowel kleinere als grotere follikels kunnen ovuleren, afhankelijk van onder andere het ras (bij kleinere rassen kunnen kleinere follikels ovuleren), het tijdstip in het voortplantingsseizoen (vroeg in het seizoen zullen grotere follikels ovuleren) en het voorkomen van multiple ovulaties (follikels zullen kleiner ovuleren bij dubbele ovulaties) (Bergfelt en Adams, 2007; Brinsko et al., 2011). 3. Luteale fase of dioestrus Na ovulatie wordt een tijdelijke luteale klier gevormd op de plaats van de eisprong. Deze tijdelijke klier doorloopt verschillende stadia: het corpus hemorrhagicum, het corpus luteum en het corpus albicans. (Ginther, 1979) Definities Een deel van de corpora lutea ontwikkelt zonder de vorming van een intraluteale holte, daartegenover zal een groot deel van de corpora lutea wel een intraluteale holte vormen (Bergfelt en Adams, 2007). Na collaps van de follikelwand vult deze holte zich met bloed, dit stadium wordt corpus hemorrhagicum genoemd (Ginther, 1979). De vorming van een corpus hemorrhagicum komt dus niet bij iedere cyclus voor. Het zou een willekeurige gebeurtenis zijn en de vorming blijkt functioneel niet 6

13 belangrijk te zijn aangezien het slechts in de helft van de luteale klieren voorkomt (Pierson en Ginther, 1985a; Bergfelt en Adams, 2007). Een primair corpus luteum ontstaat na ovulatie van een dominante follikel van een primaire golf tijdens de oestrus. Een secundair corpus luteum komt voort uit de ovulatie van een dominante follikel van een secundaire golf tijdens dioestrus of vroege dracht. Accessoire corpora lutea ontstaan door luteïnisatie van anovulatoire follikels tijdens vroege dracht (Bergfelt en Adams, 2007). Corpus albicans verwijst naar een corpus luteum dat is geregresseerd door verminderde vascularisatie en verhoogde organisatie van bindweefsel (Ginther, 1979; Bergfelt en Adams, 2007) Vorming van het corpus luteum Voor de ovulatie bestaat de wand van de preovulatoire follikel uit verschillende lagen (figuur 4). Het antrum is een met vocht gevulde holte omgeven door een laag granulosacellen. Samen met de eicel wordt deze granolosacellaag door een basaalmembraan gescheiden van de theca interna en externa. Deze basaalmembraan werkt als een barrière waardoor er enkel capillairen aanwezig zijn in de theca interna en externa. De cellen van de granulosacellaag en de theca interna produceren steroïde hormonen, de cellen van de theca externa niet. Volgend op de ovulatie zullen de granulosacellen luteïniseren, waarbij biochemische en morfologische veranderingen plaatsvinden. Samen met de groei van nieuwe bloedvaten zullen er progesteronsecreterende luteale cellen ontwikkelen uit de oestrogeenproducerende granulosacellen (Bergfelt en Adams, 2007). Figuur 4: De ontwikkeling van een corpus luteum uit een follikel. 1= ovulatie 2= ontwikkeling van corpus luteum uit follikelwand A= antrum GL= granulosacellaag BM= basaal membraan TI= theca interna TE= theca externa C= capillairen LLC= grote luteale cel SLC= kleine luteale cel (Uit: Niswender et al., 2000) 7

14 De ontwikkeling van een corpus luteum uit een follikel bestaat uit meerdere stappen (figuur 4). Vóór de ovulatie prolifereren en groeien de fibroblasten van de theca interna en bevinden de theca cellen zich in verschillende stadia van degeneratie. Granulosa cellen stoppen met delen en gaan daarna over van een compacte massa naar een laagje ster- of spoelvormige cellen. Kort na de ovulatie zal de wand van de opengebarsten follikel plooien vormen met gezwollen bloedvaten en zijn de granulosa cellen gegroeid met een grote, donkere kern. 24 uur na de ovulatie zijn de granulosa cellen nog vergroot en bevatten ze vacuolen die wijzen op secretorische activiteit en luteïnisatie. De centrale holte van de geovuleerde follikel vult zich met bloed en in de plooien van het stromale weefsel vindt er proliferatie van de capillairen plaats. De thecacellen zullen op dit moment bijna compleet gedegenereerd zijn en vervangen worden door hypertrofische fibroblasten. Op dag 3 zijn alle granulosa cellen geluteïniseerd en op dag 9 vertonen ze maximale hypertrofie. Vanaf dag 12 beginnen de luteale cellen te verkleinen en verdwijnen de bloedvaten geleidelijk aan. In tegenstelling tot andere diersoorten zijn er bij de merrie geen luteale cellen afkomstig van de theca cellen aangezien deze cellen regressie ondergaan na ovulatie (Ginther, 1979) Functie en regeling van het corpus luteum Het corpus luteum produceert progesteron dat zorgt voor het onderhoud van de dracht door een omgeving te creëren voor de ontwikkeling van de foetus (Sendel, 2010). De merrie vertoont geen oestrusgedrag meer vanaf plasma progesteron concentraties hoger dan 1 of 2 ng/ml en het geproduceerde progesteron leidt tot een negatieve feedback op de afgifte van LH (Brinsko et al., 2011). Aan het begin en het einde van de luteale fase wordt een drempelwaarde voor het negatieve effect van progesteron op LH waargenomen van 2 ng/ml progesteron in het plasma. Tijdens de dioestrus wordt LH onderdrukt door de aanmaak van progesteron. Gedurende de oestrus is er geen progesteronproductie door het corpus luteum meer waardoor het negatieve effect op LH wordt opgeheven (Ginther et al., 2006). Na bevruchting zal er door migratie van het embryo in de baarmoeder maternale herkenning van de dracht plaatsvinden waardoor de prostaglandine afgifte door de baarmoeder wordt geremd (Sendel, 2010). Indien er geen embryo aanwezig is, zal er tussen dag 13 en 16 na ovulatie prostaglandine F2α (PGF) worden vrijgesteld uit het endometrium. Dit hormoon bereikt de ovaria via de systemische circulatie en zorgt voor de aanvang van de regressie van het corpus luteum. Door deze luteolyse daalt de progesteronconcentratie waardoor de blokkering van LH wordt opgeheven (Brinsko et al., 2011). De duur van de luteale functie kan zowel verkort worden, onder andere door endometritis waarbij PGF te vroeg wordt vrijgegeven door de baarmoeder, of verlengd worden, door bijvoorbeeld pyometra die aanleiding geeft tot verzwakte PGF vrijstelling (Bergfelt en Adams, 2007). Na de luteale fase begint de volgende folliculaire fase met de groei van nieuwe follikels en oestrus symptomen bij de merrie (Brinsko et al., 2011). 8

15 4. Het verloop van progesteron tijdens de cyclus Figuur 5: Biosynthese van progesteron. (Uit: Niswender et al., 2000) Na luteïnisatie, bij de vorming van het corpus luteum, produceren de luteale cellen progesteron (figuur 5). Voor de biosynthese van progesteron heeft de luteale cel drie bronnen voor cholesterol ter beschikking, wat het basis substraat is voor de vorming van steroïde hormonen. De luteale cel capteert vrij cholesterol uit lage-densiteit lipoproteïne (LDL), hoge-densiteit lipoproteïne (HDL) of cholesterol esters opgeslagen in de cel. Het vrije cholesterol wordt nadien overgebracht naar de mitochondrion en wordt via StAR (steroïdogeen acuut regulatie eiwit) getransporteerd naar de binnenste mitochondriale membraan. Daar wordt het cholesterol via cytochroom p450 omgezet in pregnolone en nadien in het glad endoplasmatisch reticulum omgezet naar progesteron via 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (Niswender et al., 2000). Verschillende studies zijn uitgevoerd om het verloop van progesteron te bepalen tijdens de cyclus. Ginther (1979) vergelijkt de resultaten van verschillende studies van opeenvolgende bloedanalyses. Uit de samenhangende resultaten concludeert Ginther het volgende: binnen 24 tot 36 uur na ovulatie nemen de concentraties van progesteron toe waarna de concentraties progressief stijgen op dag 5 tot 7. Deze hoge waarden worden aangehouden tot dag 13 of 14 na ovulatie, daarna volgt een snelle daling tot de lage oestruswaarden (lager dan 1ng/ml) (Ginther, 1979). In 2006 wordt dit aangepast door Ginther et al. naar het volgende verloop: progesteronconcentraties nemen toe vanaf dag 0, tot een maximale concentratie op dag 6. Tussen dag 6 en het begin van de luteolyse (dag 14) daalt de concentratie geleidelijk met 37%, daarna is er een sterke daling van progesteron met een concentratie lager dan 2 ng/ml op dag 16 (Ginther et al., 2006). Dit wordt bevestigd door een nieuwe studie van Ginther et al. (2007a), waar de maximale concentratie wordt vastgesteld op dag 8. Ook Bollwein et al. bevestigen in 2002 een gelijkaardig verloop (figuur 11) met een stijging van progesteron na ovulatie, een maximale concentratie op dag 7 en aansluitend eerst een geleidelijke daling gevolgd door een snelle daling in de luteolyse (Bollwein et al., 2002a). 9

16 5. Beeldvorming van het corpus luteum Voor de identificatie en het opmeten van een corpus luteum maakt men gebruik van de B-mode of brightness mode. Deze modus geeft een 2D-beeld dat correspondeert met de doorsnede van het weefsel. De B-mode wordt naast de identificatie en de opmeting van een weefselstructuur ook gebruikt voor de bepaling van de fysiologische toestand (Ginther en Utt, 2004). De helderheid van de B-mode wordt voorgesteld door tinten grijs, gaande van wit of echogeen naar zwart of anechogeen (Ginther, 2007). Het corpus luteum wordt via echografie geïdentificeerd door het hypoechogeen of donkere weefsel van het corpus luteum te onderscheiden van het meer echogene of blekere weefsel van het ovariële stroma (Bergfelt en Adams, 2007). Tijdens de eerste 24 uur van de ontwikkeling wordt het corpus luteum steeds meer echogeen en krijgt nadien alsmaar een duidelijkere aflijning (figuur 6) (Newcombe, 1996). Figuur 6: Corpus luteum, twee dagen na ovulatie. (Kitty De Clercq, 2015) Om de dwarsdoorsnede van een corpus luteum te bepalen meet men eerst de hoogte en de breedte van dat corpus luteum op een beeld met de maximale diameter van het corpus luteum. Nadien wordt de dwarsdoorsnede berekend door de volgende formule te gebruiken: dwarsdoorsnede = ½ hoogte * ½ breedte * π (Bergfelt en Ginther, 1996) Indien er centraal een bloedklonter aanwezig is, wordt de oppervlakte hiervan apart bepaald en afgetrokken van het totale dwarsdoorsnede gebied (Bergfelt en Ginther, 1996). De dwarsdoorsnede van het corpus luteum bij de merrie (figuur 11) stijgt na ovulatie, met een maximum op dag 2. Nadien is er een trage daling en vervolgens een sterke daling tijdens de luteolyse (Bollwein et al., 2002a; Ginther et al., 2007a). 10

17 II. VASCULARISATIE VAN HET CORPUS LUTEUM TIJDENS DE CYCLUS 1. Doorbloeding van de ovaria De ovariële arterie (figuur 7) is een vertakking van de oarta abdominalis en splitst in twee delen. Enerzijds de uterine tak die zorgt voor de bloedaanvoer naar het oviduct en het voorste deel van de baarmoederhoorn. Anderzijds de ovariële tak die sterk spiraliseert, nauw samenhangt met een vene die van het ovarium direct overloopt naar de uterine tak van de ovariële vene en verschillende takken afgeeft naar de periferie van het ovarium. De ovariële arterie bevindt zich in het craniale deel van de ophangband. De arterie volgt het verloop van de ovariële vene maar er is geen nauwe verbinding tussen beide. Het oppervlak van het ovarium en mesovarium vertoont een sterk uitgebreid arterieel netwerk verbonden met zijtakken van de uterine tak van de ovariële arterie (Ginther, 1979; Bergfelt, 2009). De veneuze drainage van de ovaria bestaat uit een uitgebreid netwerk van onderling verbonden venen. De ovariële vene (figuur 7) en de vele aftakkingen bezitten belangrijke kleppen op bijna iedere twee centimeter. De venen zijn zowel onderling verbonden, als met takken van de uterine tak van de ovariële vene verbonden. Doorheen de spiralen van de ovariële tak van de ovariële arterie passeert een vene die een tak van de uterine tak van ovariële vene draineert (Ginther, 1979). oa= ovariële arterie uboa= uterine tak van de ovariële arterie eia= arteria iliaca externa ua= uterine arterie bua= tak van de uterine arterie iia= arteria iliaca interna ipa= arteria pundenda interna va= vaginale arterie ubva= uterine tak van de vaginale arterie cvc= vena cava caudalis ov= ovariële vene Figuur 7: Schematische weergave van het lateraal aanzicht van de arteriën (rood) en venen (blauw) van het linker ovarium en de uterus bij de merrie (de oranje gekleurde bloedvaten behoren niet tot het voortplantingsstelsel). (Uit: Ginther, 2007) 11

18 2. Vascularisatie van het corpus luteum Het corpus luteum is een van de meest gevasculariseerde organen in het lichaam (Reynolds et al., 1994). Dit uitgebreid vasculair netwerk is van groot belang voor de luteale functie, zowel voor de aanvoer van de progesteron precursoren, als voor de afvoer van progesteron uit de luteale cellen (Ferreira-Dias et al., 2006). De angiogenese tijdens de ontwikkeling van het corpus luteum voorziet voor bijna iedere luteale cel contact met de nieuw gevormde capillairen, wat van groot belang is voor de endocriene functie (Zheng et al., 1993). De studie van Müller et al. (2009) toont aan dat de oorsprong van de vascularisatie van het equine corpus luteum in de theca interna van de preovulatoire follikel gelegen is. Figuur 8: Schematische weergave van de relatie tussen de doorbloeding van de preovulatoire follikel en de karteling van de granulosa met een normale versus een gesepteerde evacuatie. Bij normale evacuatie bereikt de doorbloeding van de follikel zijn maximum 24 uur voor de ovulatie en neemt de doorbloeding af vanaf 6 uur voor de evacuatie. Enkele uren voor deze evacuatie vindt de karteling van de granulosa plaats, geassocieerd met doorbloedingssignalen (kleuren Doppler) ter hoogte van het basale gebied van de follikel en tegenover het apicale gebied. Bij gesepteerde evacuatie stijgt de doorbloeding van de follikel tussen 24 uur en 1 uur voor het begin van de evacuatie. De karteling en de doorbloedingssignalen zijn verspreid over de periferie van de follikel, inclusief het apicale gebied. (Uit: Gastal en Gastal, 2011) 12

19 Het type van ovulatie heeft een invloed op de doorbloeding van een nieuw gevormd corpus luteum. Bij de normale evacuatie verdwijnt de vascularisatie ter hoogte van de apex vóór de ovulatie en centreert de doorbloeding zich aan de basis van de preovulatoire follikel (figuur 8). De bloedvaten puilen uit in het antrum waardoor karteling van de granulosa zichtbaar is met echografie, aan de basis van de follikel en recht tegenover de apex (Gastal en Gastal, 2011). Na de ovulatie neemt de vascularisatie toe vanaf het basale derde, via het middelste derde tot het apicale derde. Na 5,5 dagen is dezelfde hoeveelheid doorbloeding aanwezig aan de apex in vergelijking met de basis (Ginther et al., 2007c). Indien de vascularisatie ter hoogte van de apex niet wordt geëlimineerd vóór de ovulatie dan verlengt de evacuatie en worden er echogene septa gevormd. Men spreekt van de gesepteerde evacuatie, zoals eerder vermeld. De karteling van de granulosa en de kleuren Doppler signalen kunnen in dit geval waargenomen worden ter hoogte van het basale derde, het middelste derde én het apicale derde van de preovulatoire follikel (figuur 8). Na ovulatie zullen deze perifere bloedvaten de ontwikkeling van nieuwe bloedvaten ter hoogte van alle onderdelen van het nieuw gevormde corpus luteum ondersteunen (Ginther et al., 2007c; Gastal en Gastal, 2011). In 2006 bestuderen Ferreira-Dias et al. de microvascularisatie van het equine corpus luteum. Aan de hand van een in situ studie worden de vasculaire gebieden en de totale DNA, RNA en eiwit inhoud bepaald, dit laatste om de cellulaire groei en regressie na te gaan. De vasculaire gebieden zijn groter in de vroege luteale fase (corpus haemorrhagicum) en de mid-luteale fase (mid-corpus luteum) ondanks dat het aantal bloedvaten in de luteale fase groter zijn in de mid- en late luteale fase. Dit zou te wijten kunnen zijn aan het verkleinen van de bloedvaten lumina door contractie (Ferreira-Dias et al., 2006). In het midden van de luteale fase stijgt het aantal DNA, wat wijst op hyperplasie van het luteale weefsel, zowel door luteale als endotheliale celproliferatie (Roberto da Costa et al., 2005). De vorming van nieuwe bloedvaten uit bestaande bloedvaten in het corpus luteum wordt geregeld door verschillende angiogene factoren. Deze factoren, zoals cytokines, groeifactoren, enzymen, worden geproduceerd door de omgevende cellen (Galvão et al., 2013). De vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) blijkt de belangrijkste factor te zijn voor de angiogenese in het equine corpus luteum. Al-zi abi et al. (2003) bestudeerden het patroon van de endotheelcelproliferatie tijdens de luteale fase via immunohistochemie en in situ hybridisatie. Tijdens de vroege en mid-luteale fase treedt endotheelcelproliferatie op en is er een hoge expressie van VEGF mrna en eiwit in de luteale cellen, samen met een dens capillair netwerk. Samen met andere bevindingen in de studie duidt dit op het belang van VEGF in de regeling van de angiogenese in het corpus luteum bij het paard (Al-zi abi et al., 2003). Uit recent onderzoek blijkt dat volgende angiogene factoren aanwezig zijn bij de merrie in de granulosacellen, theca interna cellen, luteale cellen en de omgevende bloedvaten: VEGF A, VEGF B, Ang 1, Ang 2 en hun receptoren VEGF-R1, VEGF-R2 en Tie2. Voornamelijk Ang 2 met zijn receptor Tie 2 en VEGF A met zijn receptor VEGF-R2 spelen een rol in de luteale vascularisatie. En Ang 1 heeft een functie in de stabilisatie van de bloedvaten. Tijdens luteale regressie daalt de VEGF A en 13

20 zal de combinatie van Ang2 met zijn receptor Tie2 in afwezigheid van VEGF A een belangrijke bijdrage leveren aan de regressie (Müller et al., 2009). Er is een belangrijke interactie tussen immuuncellen en endotheelcellen. Immuuncellen produceren cytokines die de proliferatie, migratie en activatie van endotheelcellen beïnvloeden (Naldini en Carraro, 2005). Ook in het corpus luteum zijn immuuncellen aanwezig die zorgen voor de opbouw, het onderhoud en de regressie. Er zijn verschillende cytokines die bijdragen aan de angiogenese van het corpus luteum bij de merrie, zoals TNF (tumor necrose factor), IFY (interferon γ) en FASL (Fas Ligand). De tumor necrose factor zorgt voor een stijging van de VEGF aanmaak door de luteale cellen, die op zijn beurt opnieuw inwerkt op de TNF secretie (Galvão et al., 2013). 3. Beeldvorming en verloop van de vascularisatie 3.1. Doppler echografie Doppler echografie is een veelgebruikte methode voor de transrectale studie over de beweging van het bloed in het genitaal stelsel. Het is gebaseerd op het bekende fenomeen van het Doppler effect van geluid (Ferreira et al., 2011). Informatie over de bloedstroom wordt toegevoegd aan het echografisch beeld in de B-mode. De probe is het stilstaande voorwerp dat geluidsgolven uitzendt en de rode bloedcellen zijn de bewegende reflectoren die de terugkerende geluidsgolven veroorzaken. De Doppler shift is het verschil tussen de uitgezonden frequenties en de terugkerende frequenties. Deze is constant wanneer de bron en de ontvanger van de geluidsgolven stilstaan tegenover elkaar en de Doppler shift stijgt of daalt naarmate de rode bloedcellen naar of weg van de probe bewegen. Wanneer de bloedcellen naar de probe toe bewegen, meet de probe een hogere frequentie bij de terugkerende geluidsgolven dan bij de uitgezonden geluidsgolven. Men spreekt in dit geval van een positieve Doppler verschuiving. Indien de bloedcellen van de probe weg bewegen ontstaat er een negatieve Doppler verschuiving (Ginther en Utt, 2004). Figuur 9: Spectrale mode evaluatie van de arterie van de mesometrium aanhechting (de gele cursor is geplaatst op een arterie (rood) van de mesometriumaanhechtin g om de snelheden van de uterine bloedstroom op te vangen). (Uit: Ferreira et al., 2011) 14

21 Bij Doppler echografie wordt gebruik gemaakt van verschillende modaliteiten. In de spectrale mode (figuur 9) kan de bloedstroom in een specifiek bloedvat worden bepaald door de cursor in het lumen van dat bloedvat te plaatsen (Ginther en Utt, 2004) en wordt de bloedstroomsnelheid grafisch voorgesteld. Een positieve Doppler-shift wordt als een positieve uitwijking van de nullijn weergegeven, het omgekeerde geldt voor een negatieve Doppler-shift. Bepaalde parameters zoals de piek systolische snelheid (PSV), de eind diastolische snelheid (EDV) en de maximale gemiddelde snelheid (TAMV) worden vermeld op het spectrum (Ginther, 2007). De kleuren mode (figuur 10) maakt een kwalitatieve evaluatie van de bloedstroom in weefsels en organen mogelijk. De bloedvloei wordt aan de hand van een kleurcode weergegeven naargelang de richting en de snelheid van de bloedstroom. Bloed dat naar de probe toestroomt krijgt een rode kleur, bloed dat weg stroomt van de probe krijgt een blauwe kleur. Hoe sneller het bloed stroomt, hoe intenser de kleuren (Ferreira et al., 2011). De power mode (figuur 10) is een andere vorm van de kleuren mode waarbij power verwijst naar het aantal rode bloedcellen bij een bepaalde snelheid. In deze mode wordt er één kleur gebruikt, waarbij de intensiteit de maat is voor de power (Ferreira et al., 2011). Desondanks het beeld traag wordt gevormd, is de power mode gevoeliger voor zwakke bloedstroom, is er geen invloed van de hoek die de probe maakt met de bloedstroom en heeft het artefact aliasing (dit wordt verder uitgelegd op de volgende pagina) geen effect (Ginther en Utt, 2004). Figuur 10: Echografie beelden van het corpus luteum van 2 merries; in de B-mode, de kleuren mode en de power mode (Kitty De Clercq, 2015). Bij het gebruik van Doppler echografie moet er rekening gehouden worden met de Doppler hoek of hoek van insonatie. Dit is de hoek tussen de richting van de uitgezonden pulsen en de richting van de 15

22 bloedstroom. Indien de probe loodrecht op een bloedvat wordt gericht, aldus onder een grote Doppler hoek, zullen er weinig rode bloedcellen naar of weg van de probe bewegen. Dit resulteert in weinig Dopplerverschuiving. Bij het maken van beelden onder een kleine hoek worden hogere frequenties waargenomen. De bloedstroomsnelheid is recht evenredig met de Doppler-shift frequentie en omgekeerd evenredig met de cosinus van de Doppler hoek (Ginther en Utt, 2004). Verschillende instellingen zijn van belang om een optimaal beeld te verkrijgen. De frequentie van de geluidsgolven hangt af van de gebruikte probe. Bij sommige probes ligt deze frequentie vast, bij andere probes kan deze aangepast worden door de gebruiker. De akoestische power kan ook worden ingesteld door de gebruiker en stelt de energie van de golven voor. Bij een hogere power kunnen zwakkere signalen worden vastgesteld (Ginther en Utt, 2004). De probes kunnen geluidsgolven zowel continu als gepulseerd uitzenden en ontvangen. Bij continuous wave Doppler worden continu golven uitgezonden en worden de terugkerende golven opgevangen door een ander element. Bij pulsed wave Doppler worden golven in pulsen uitgezonden en worden de gereflecteerde golven door hetzelfde element terug opgevangen. De pulsed wave technieken worden vaak gebruikt bij onderzoek naar de bloedstroom. Het interval tussen de pulsen wordt de puls repetitie frequentie (PRF) genoemd, die nauw samenhangt met de snelheid. Bij voorkeur worden hoge PRF waarden gebruikt, waardoor ook hoge bloedsnelheden kunnen gemeten worden. Bij dieper gelegen structuren wordt een lage PRF waarde gebruikt met als nadeel dat snelle bloedvloei niet gedetecteerd kan worden en er meer kans is op aliasing. (Ginther en Utt, 2004) Bij het gebruik van Doppler echografie moet men bedacht zijn op mogelijke artefacten. Een veel voorkomend artefact is het aliasing artefact. Wanneer te lage PRF- of snelheidswaarden zijn ingesteld, zullen de Dopplersignalen van hoge snelheden de verkeerde kleurcode krijgen en bijgevolg een stroomrichting aangeven in de tegengestelde richting. Dit artefact kan voorkomen worden door het verhogen van de PRF of de snelheidswaarden. De PRF moet minimaal het dubbele van de frequentie van een Doppler signaal zijn. In oude films kan men af en toe een analoog verschijnsel waarnemen waarbij autowielen achteruit lijken te draaien, aangezien het aantal beelden per seconde dat wordt opgenomen door de camera te weinig is voor de snelle beweging van de autobanden (Ginther en Utt, 2004; Ginther, 2007). Het flash artefact is een kleine uitbarsting van kleur op een bepaalde plaats in het beeld dat kan optreden door de beweging van weefsel (darmen of bloedvaten) of door de beweging van het dier. Deze ongewenste signalen van lage stroomsnelheid worden voorkomen door de filters correct in te stellen (Ginther, 2007). Andere mogelijke artefacten die voorkomen zijn het blooming artefact, spiegel artefact 3.2. Verloop van de vascularisatie in het corpus luteum Doppler echografie biedt twee uiteenlopende modaliteiten voor de weergave van de doorbloeding van het corpus luteum. Enerzijds de spectrale mode die de snelheid van het bloed in een specifiek bloedvat grafisch weergeeft, anderzijds de kleurenmode waarbij een impressie van de omvang van de doorbloeding van het corpus luteum wordt verkregen. De kleuren mode krijgt in dit geval de voorkeur 16

23 aangezien de spectrale mode slechts informatie weergeeft over een klein deel van de doorbloeding en het verkrijgen van een bruikbaar spectrum dikwijls veel tijd vraagt (Ginther, 2007). In de kleuren Doppler mode wordt de doorbloeding weergegeven aan de hand van een kleurcode naargelang de richting en de snelheid van de bloedstroming in het corpus luteum. Dit staat tegenover de recentere power Doppler mode die de bloedstroom toont als een soort gloed, ongeacht de richting van de stroming (Ferreira et al., 2011). Voor de kwantificatie van de vascularisatie van het corpus luteum krijgt power Doppler de voorkeur. Reeds verschillende jaren wordt deze Doppler techniek gebruikt voor onderzoek naar de bloedcirculatie van het corpus luteum in de humane geneeskunde (Miyazaki et al., 1998). De nadelen van power Doppler zijn een trage beeldvorming en het feit dat er geen gegevens over de snelheid of de richting van het bloed worden weergegeven. Deze wegen echter niet op tegen de voordelen: er is een hogere sensitiviteit voor zwakkere bloedstroming met bijgevolg een meer nauwkeurige kwantificatie van de doorbloeding, er is geen effect van de Doppler hoek wat van pas komt bij de transrectale Doppler echografie van het ovarium en er is geen invloed door aliasing (Ginther, 2007). Bijkomend wordt er een onderscheid gemaakt tussen een objectieve en een subjectieve kwantitatieve evaluatie. Voor een objectieve evaluatie worden stilstaande beelden met de grootste dwarsdoorsnede van het corpus luteum gekozen uit een video opname, waarna de kleurenpixels van deze beelden worden geselecteerd en opgeslagen. Om de omvang van de doorbloeding kwantitatief voor te stellen worden het aantal pixels geteld door gespecialiseerde software, zoals ImageJ (National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA) (Ginther, 2007). Het relatief aantal pixels wordt gebruikt als een semikwantitatieve parameter voor de luteale bloedstroming (Bollwein et al., 2002a). Bij de subjectieve evaluatie wordt er aan de hand van een scoresysteem (score 1 tot 4, van minimaal tot maximaal) een subjectieve kwantificatie van de vasculaire perfusie bepaald. De score hangt af van het geschatte percentage kleurenpixels op het beeld. Dit is een subjectieve evaluatie aangezien deze gebaseerd is op het oordeel van de persoon die de schatting uitvoert. Indien men gebruik maakt van realtime beelden waarbij er geen kennis is van de oorsprong of indien de schatting door een tweede persoon wordt uitgevoerd die zich onbewust is van de oorsprong, kan de subjectieve evaluatie worden omgezet naar een objectieve evaluatie (Ginther, 2007). Beide methoden van evaluatie werden vergeleken. Zowel de objectieve als subjectieve evaluatie blijken effectief, maar de selectie en evaluatie van een stilstaand beeld uit een video opname neemt meer tijd in beslag (Ginther, 2007). In een andere studie van Ginther et al. (2007b) wordt de bloedstroming zowel door deze objectieve en subjectieve methode vastgesteld, als door de bepaling van de diameter van de vasculaire streng dicht bij de aanhechting aan het ovarium. Kleuren Doppler signalen worden gebruikt om de arteriën in de vasculaire streng aan te duiden (Ginther et al., 2007b). De voorbije jaren zijn er verschillende studies over de luteale bloedstroming uitgevoerd. Bollwein et al. (2002a) gaan op zoek naar een niet invasieve benadering om de doorbloeding van het corpus luteum te meten aan de hand van transrectale kleuren Doppler echografie. Bovendien wordt het verband 17

24 tussen de luteale bloedstroming, de dwarsdoorsnede van het corpus luteum en de concentratie van progesteron in het plasma nader onderzocht. Aansluitend op de progesteronbepaling en de meting van de dwarsdoorsnede, worden drie beelden gemaakt van het corpus luteum met de power-mode. Nadien wordt het totaal aantal kleurenpixels in het corpus luteum geteld met een computer gestuurd analyse systeem. Het aantal kleurenpixels (figuur 11) stijgt na ovulatie en heeft een constante, maximale waarde tussen dag 5 tot dag 7. Vanaf dag 7 is er een daling te zien tot dag 15; in enkele gevallen is de bloedstroming te zien tot dag 17 of dag 19 (Bollwein et al., 2002a). Figuur 11: Het primaire corpus luteum in de luteale fase. (A. dwarsdoorsnede (mm 2 ), B. vascularisatie van het luteaal weefsel (aantal pixels per echobeeld), C. circulerende progesteron concentraties (ng/ml) (opwaartse pijlen tonen aan dat de gemiddelde maximale dwarsdoorsnede voorafgaat aan de gemiddelde maximale vascularisatie, die op zijn beurt voorafgaat aan de gemiddelde maximale progesteronconcentratie; neerwaartse pijlen illustreren dezelfde volgorde in de daling van de waarden tijdens regressie). (Uit: Bergfelt en Adams, 2007; Bron: Bollwein et al., 2002a) In 2007 onderzoeken Ginther et al. de luteale bloedstroming aan de hand van een schatting, door verscheidene operators, van het percentage van het corpus luteum dat kleuren Doppler signalen vertoont. Verder zoekt men naar het verloop van de bloedstroming vóór de sterke daling van de progesteronconcentratie tijdens de luteolyse. Dag 1 tot dag 6 na ovulatie is er een constante stijging te zien in het percentage van het corpus luteum met kleuren Doppler signalen. Op dag 10 wordt het maximale percentage bereikt, nadien volgt een geleidelijke daling in de preluteolyse (dag 10 tot dag 14) en een snellere daling in de luteolyse (dag 15 tot dag 17). Voorts wordt er geen aanwijzing gezien van een plotse stijging of daling in de bloedstroming voorafgaand aan de sterke daling van progesteron in de luteolyse (Ginther et al., 2007a). Dit laatste komt dus niet overeen met de stijging van de luteale bloedstroming een dag voor de daling van progesteron zoals gezien bij het rund (Miyamoto et al., 2005). Tijdens de studie van Sichtar et al. (2013) naar het gebruik van luteale bloedstroming voor de diagnose van vroege dracht worden vergelijkbare resultaten teruggevonden voor de progesteronconcentratie en vascularisatie tijdens de luteale fase bij niet drachtige merries, zoals 18

25 beschreven bij Bollwein et al. (2002a) en Ginther et al. (2007a). Het verschil in het tijdstip waarop de maximale doorbloeding wordt bereikt tussen de studie van Bollwein (dag 5) en de studie van Ginther (dag 10) is mogelijks te wijten aan de verschillende methodologische benadering: het verschil in het aantal merries, het verschillende aantal echo-onderzoeken, het gebruik van de power mode tegenover de kleuren mode, de verschillende rassen en leeftijden van de merries (Sichtar et al., 2013). III. INVLOED VAN PROSTAGLANDINE Prostaglandine F2α (PGF) of synthetische analogen hebben een sterke luteolytische werking. Bij niet drachtige merries wordt er tussen dag 13 en 16 na de ovulatie PGF vrijgesteld uit het endometrium. Via de systemische circulatie bereikt dit hormoon de ovaria en zorgt daar voor de aanvang van de regressie van het corpus luteum (Brinsko et al., 2011). Merries zijn veel gevoeliger voor de luteolytische effecten van PGF in vergelijking met andere diersoorten (Ginther, 1992). In vergelijking met koeien hebben de luteale celmembranen van merries namelijk een veel grotere affiniteit voor prostaglandine (Kimball en Wyngarden, 1977). Door de injectie van PGF volgt een geïnduceerde luteolyse met invloeden op de hormonenconcentraties en de vascularisatie van het corpus luteum. 1. Invloed op de progesteron concentratie Ginther et al. (2007b) bestuderen het effect van PG F2α eenmalige toediening op dag 8 tijdens mid-dioestrus op de progesteron-, LH-, FSH-, estradiol- en cortisolconcentraties. Een stijging van progesteron doet zich voor 0 tot 5 minuten na de PGF injectie, met een maximale waarde op 10 minuten na de toediening. Nadien daalt de concentratie tot onder de waarden van de controle groep binnen de 40 minuten. De kortstondige stijging van progesteron juist na de injectie wordt waarschijnlijk veroorzaakt door de directe actie van PGF op de luteale cellen (Noden et al, 1978; Ginther et al., 2007b). Utt et al. (2007) bevestigen de stijging in progesteron na een enkele bolus van PGF met een maximale waarde op 10 minuten na de injectie, voorafgaand aan de progesteronafname. (Utt et al., 2007). In 2009 onderzoeken Ginther et al. de hypothese dat de directe stijging van progesteron (en andere hormonen) na een enkele bolus PGF eerder een niet-fysiologisch dan een fysiologisch effect voorstelt. Men vergelijkt de reacties van progesteron (en andere hormonen) na een enkele intraveneuze bolus PGF en na een intraveneuze infusie van PGF gedurende twee uur met een snelheid die de concentraties nabootst van natuurlijke PGF pulsen. Beide interventies zorgen voor een verkorting van de cyclus door vervroegde luteolyse met vijf dagen, ondanks er geen stijging is te zien van de progesteronconcentratie na toediening van het infuus. Deze resultaten bevestigen de hypothese dat de stijging van progesteron na een enkele PGF injectie niet fysiologisch is (Ginther et al., 2009). 19

26 2. Invloed op de vascularisatie Bij luteale regressie ziet men een daling in endotheelcelproliferatie en een stijging in de proliferatie van andere celtypes. Twaalf uur na PGF toediening dalen zowel de VEGF mrna en eiwitten als de proliferatiewaarden van de endotheelcellen. Prostaglandine heeft dus een remmend effect op endotheelcelproliferatie, wat samenvalt met een gedaalde VEGF productie óf prostaglandine zorgt voor een gedaalde VEGF expressie waardoor de proliferatie van de endotheelcellen wordt geremd (Al-zi abi et al., 2003). Het in vitro onderzoek van Ferreira-Dias et al. (2006) toont aan dat luteaal weefsel bij de merrie in staat is om de mitogenese van endotheelcellen (BAEC of bovine aorta endotheelcellen) te stimuleren. Door toevoeging van PG F2α aan de luteale explantaten is er een duidelijke afname te zien in de proliferatie van BAEC (Ferreira-Dias et al., 2006). Ook immuuncellen spelen een rol in de luteolyse door de productie van cytokines. TNF, IFNG, FASL zorgen samen voor de gedaalde expressie van VEGF en de downregulatie van de angiogenese. Door de tijdelijke associatie van PG F2α, de cytokines (TNF, IFNG, FASL) en VEGF doet zich regressie voor van bloedvaten in het equine corpus luteum (Müller et al., 2009; Galvão et al., 2013) Aan de hand van verschillende parameters (onder andere de progesteronconcentratie, de telling van het aantal kleurenpixels op een echobeeld van het corpus luteum in de power mode en de diameter en dwarsdoorsnede van de ovariële en uterine arteriën) onderzoeken Hendriks et al. (2006) het effect van PG F2α en hcg toegediend op dag 7 na de ovulatie op de doorbloeding van het corpus luteum en de ovariële en uterine arteriën. De vascularisatie van het corpus luteum vertoont in het begin een daling tussen 0 en 2 uur na de PGF toediening, gevolgd door een toename in de periode van 2 tot 12 uur. Nadien is er opnieuw een daling in de bloedstroming (Hendriks et al., 2006). De stijging tussen 2 en 12 uur na de PGF injectie zou mogelijks te wijten zijn aan de noodzaak om afvalproducten van de luteolyse te verwijderen (Bollwein et al., 2002b). Ook Ginther et al. (2007b) bestuderen het effect van PG F2α eenmalige toediening op dag 8 tijdens mid-dioestrus op de doorbloeding van het corpus luteum (figuur 12). In deze studie wordt de doorbloeding beoordeeld door de schatting van het percentage van het corpus luteum met Doppler signalen voor bloedstroming, uitgevoerd door verscheidene onafhankelijke operators zonder kennis van voorgaande schattingen. Bovendien worden het aantal kleurenpixels geteld ter vergelijking en wordt de diameter van de vasculaire streng bij zijn aanhechting aan het ovarium bepaald. In het eerste uur na de toediening van PGF (PGF groep) of fysiologische zoutoplossing (controle groep) is er een stijging van het percentage van het corpus luteum met Doppler signalen voor bloedstroming te zien in beide groepen. Dit zou mogelijks te wijten zijn aan de vele handelingen met de paarden, waardoor de hartslag toeneemt. Er is dus geen stijging van de doorbloeding geassocieerd met de kortstondige toename van progesteron na de toediening van prostaglandine F2α (Ginther, 2007; Ginther et al., 2007b). Uit deze studie blijkt dat de luteolyse reeds begint voor de afname van de doorbloeding. De daling van het percentage van het corpus luteum met Doppler signalen en de verkleining van de 20

27 diameter van de vasculaire streng treedt pas op bijna een dag na de eerste tekenen van luteolyse (Ginther et al., 2007b). Dit stemt niet overeen met de korte stijging van de luteale bloedstroming tijdens 0,5 tot 2 uur na de prostaglandine injectie, gezien bij het rund (Acosta et al., 2002). De daling van het percentage van het corpus luteum met kleuren Doppler signalen, de verkleining van de diameter van de vasculaire streng en de afname van de dwarsdoorsnede gebeurt gelijktijdig 24 uur na de PGF toediening. Bijgevolg wordt de daling van de vascularisatie in het corpus luteum eerder geassocieerd met luteale structurele regressie dan met de functionele regressie van het gedaalde progesteron (Ginther, 2007). Figuur 12: De gemiddelde waarden van de progesteronconcentratie, het percentage van het corpus luteum met kleuren Doppler signalen voor bloedstroming, diameter van de vasculaire streng dicht bij de aanhechting aan het ovarium en maximale dwarsdoorsnede van het corpus luteum in PG F2α behandelde merries en controle merries. (3 bovenste parameters: in vergelijking met de waarden op het moment van de inspuiting; * aanwijzing voor het eerste verschil tussen PGF groep en de controle groep) (Uit: Ginther et al., 2007b) 21

28 Miró et al. (2015) onderzoeken de veranderingen in het corpus luteum, luteale bloedstroming en progesteronconcentratie in het plasma na PG F2α toediening op dag 10 na ovulatie bij ezels. De dwarsdoorsnede en het progesteronniveau in het plasma nemen duidelijk af maar progesteronconcentraties lager dan 2 ng/ml worden pas bereikt drie dagen na de PGF injectie. Hieruit blijkt het tragere effect van PGF bij ezels in vergelijking met merries en koeien. De eerste drie uren na de interventie is er een toename van de luteale bloedstroming, gevolgd door een progressieve daling zoals gezien bij de koe (Miró et al., 2015). 22

29 ONDERZOEKSSTUDIE I. DOELSTELLINGEN EN ONDERZOEKSONTWERP 1. Doelstellingen Tijdens deze studie wordt een antwoord gezocht op de volgende vragen: Deel I: kan er aan de hand van de vascularisatie nagegaan worden hoe functioneel een corpus luteum is, hoeveel progesteron dat corpus luteum nog produceert? Deel II: kan de daling in functionaliteit van het equine corpus luteum na de toediening van prostaglandine, aan de hand van Doppler echografie, worden waargenomen? Is dit toepasbaar in de praktijk en kan het eventueel de progesteronbepaling in het bloed vervangen? 2. Onderzoeksontwerp Gedurende enkele weken worden iedere dag een aantal merries opgevolgd, steeds rond hetzelfde tijdstip. Vóór de ovulatie wordt de follikelvorming- en groei vastgesteld, wordt het ovulatietijdstip bepaald en worden eventueel meerdere ovulaties opgemerkt. Na de ovulatie wordt de dwarsdoorsnede van het corpus luteum en de doorbloeding van het corpus luteum iedere dag gemeten aan de hand van de transrectale B-mode echografie en Power Doppler echografie. Op de dag van ovulatie spreken we van dag 0. Vanaf dag 4 na ovulatie wordt er elke dag bloed afgenomen voor de bepaling van progesteron. In het eerste deel van het onderzoek worden enkele merries opgevolgd zonder interventie. In het tweede deel krijgen een aantal merries een prostaglandine injectie bij een zeven of acht dagen oud corpus luteum, na de echografische controle van die dag, en worden de merries verder opgevolgd tot dag 10. Gedurende het volledige onderzoek worden de volgende studieparameters iedere dag na ovulatie bijgehouden: de dwarsdoorsnede van het corpus luteum, de doorbloeding van het corpus luteum en de plasma progesteron concentratie. II. MATERIAAL EN METHODEN 1. Studiepopulatie en interventie Acht proefpaarden van de vakgroep voortplanting en verloskunde van de faculteit diergeneeskunde in Merelbeke worden opgevolgd zoals besproken. De merries behoren tot verschillende rassen en leeftijden en vertonen geen gezondheidsproblemen. Ze staan afwisselend op de weide (bijvoedering met hooi) en op stal (bijvoedering met hooi en krachtvoer). 23

30 In deel I van het onderzoek worden merries opgevolgd zonder interventie. In deel II van het onderzoek krijgen de merries op dag 7 of dag 8 prostaglandine (dinoprost tromethamine, Dinolytic (Pfizer A.H.), 5mg/ml ) toegediend met een dosis van 5 mg per paard intramusculair. 2. Beeldvorming en metingen De dagelijkse beeldvorming en metingen worden steeds door dezelfde operator en rond hetzelfde tijdstip uitgevoerd met behulp van een Esaote MyLabClassC echotoestel (Esaote, Italië), uitgerust met een 5 tot 10 mhz lineaire LV513 probe (Esaote, Italië) De dwarsdoorsnede van het corpus luteum Voor de bepaling van de dwarsdoorsnede worden er enkele stilstaande beelden gemaakt en opgeslagen van het corpus luteum met een maximale doorsnede. Met behulp van het programma MyLabDesk (Esaote, Italië) worden achteraf de hoogte en de breedte gemeten op deze beelden (figuur 13). Met behulp van de functie distance worden de calipers op de buitenste rand van het corpus luteum geplaatst en staan de hoogtelijn en breedtelijn loodrecht op elkaar. Vervolgens wordt de dwarsdoorsnede berekend met de formule: dwarsdoorsnede = ½ hoogte * ½ breedte * π (Bergfelt en Ginther, 1996) Bijkomend wordt met de functie Tr-Area de oppervlakte bepaald na de handmatige selectie van het corpus luteum (figuur 13). Deze metingen gebeuren steeds door twee personen, onafhankelijk van elkaar maar met kennis van oorsprong, op twee aparte stilstaande beelden. Figuur 13: De bepaling van de dwarsdoorsnede met behulp van het programma MyLabDesk (Esaote, Italië) (D1= hoogte, D2= breedte, A3= oppervlakte in het geselecteerde gebied, met behulp van functie Tr-Area ) (Kitty De Clercq, 2015) 24

31 Voor een minimale variatie bij de beeldopnames worden steeds dezelfde B-mode instellingen diepte: 8,0 cm (7,7 cm volgens Crabtree et al., 2014), gain: 78%, PRC (Dynamic range/sharpness/density): 8/3/1, PST: 4, PRS: 3, power: 80% gehanteerd De bloedstroming in het corpus luteum Na de metingen in de B-mode wordt er overgeschakeld naar de power mode. Nadat de maximale doorsnede van het corpus luteum in beeld is gebracht worden enkele video s van telkens tien seconden opgenomen en opgeslagen (Ginther en Utt, 2004). Vanuit de video s worden steeds twee stilstaande beelden geselecteerd bij maximale doorsnede en maximale doorbloeding van het corpus luteum, aan de hand van het programma Windows Live Movie Maker (Microsoft Corporation, Verenigde Staten, Amerika). De selectie van de beelden gebeurt steeds door twee personen, onafhankelijk van elkaar maar met kennis van oorsprong. Het relatief aantal pixels op de vier geselecteerde beelden wordt bepaald met ImageJ 1.48 software (National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA). De bepaling van het relatief aantal pixels met ImageJ gaat, in het kort uitgelegd, als het volgt: na het openen van het te analyseren echobeeld (figuur 14A), wordt de grootte van dat beeld, uitgedrukt in pixels, aangepast opdat alle beelden hetzelfde formaat hebben bij analyse (figuur 14B). Vervolgens wordt handmatig een selectie gemaakt van het gebied waarin de pixels moeten geteld worden, in dit geval het corpus luteum (figuur 14C), en wordt alles rond deze selectie verwijderd (figuur 14D). De volgende stap is het instellen van een kleuren threshold, die bij iedere analyse dezelfde grenzen moet hebben voor de kleurentint, saturatie en helderheid (figuur 14E). Na het toepassen van deze kleuren threshold (figuur 14F), worden het aantal pixels binnen de oorspronkelijke selectie bepaald (figuur 14G) en geteld (figuur 14H). Dit proces kan semiautomatisch gebeuren met behulp van macro s. Het relatief aantal pixels wordt uitgedrukt in percentages en is een semikwantitatieve parameter voor de bloedstroming (Ginther et Utt, 2004). Voor een minimale variatie bij de beeldopnames worden steeds dezelfde power-mode instellingen frequentie: 5,6 mhz, gain: 45%, PRF: 2,5 khz (2,8 khz volgens Sichtar et al., 2013), PRC: M / 2, PRS: 4, filter: 4 (Ginther et al., 2007a en 2007b), color map P1A gebruikt. 25

32 A B C D E F G H Figuur 14: De bepaling van het relatief aantal pixels in de verschillende stappen, met behulp van ImageJ 1.48 software (Kitty De Clercq, 2015) 26

33 Progesteronconcentratie (ng/ml) 3. Progesteronbepaling Vanaf dag 4 tot en met dag 10 wordt er voor iedere echografische controle bloed afgenomen uit de vena jugularis, in een serumbuis. Na het stollen en binnen het uur na de afname wordt het bloed gecentrifugeerd (4000g, 10 minuten). Het serum wordt overgebracht in een gemerkt epje en ingevroren bij -20 C (Bollwein et al., 2002a; Ginther et al., 2007) in afwachting van de analyse voor de progesteron concentratie. De progesteron analyse wordt uitgevoerd in het labo (Zoolyx NV, Aalst, België) door een elektrochemiluminescentie immunoassay (ECLIA) met een sensitiviteit van 0,15ng/ml. III. RESULTATEN 1. Deel I geen interventie In het eerste deel van het onderzoek worden twee merries opgevolgd zonder de toediening van prostaglandine op dag 7 of dag 8. Een van de twee merries heeft een dubbele, asynchrone, unilaterale ovulatie (Newcombe, 1997; Davies Morel en O Sullivan, 2001), met ongeveer 1 dag verschil tussen de ovulaties. Bijgevolg is de bepaling van de dwarsdoorsnede en het relatief aantal pixels vrijwel onmogelijk. De progesteronconcentratie in het bloed van deze merrie kan wel worden bepaald De progesteronconcentratie Merrie (1CL) Merrie (2 CL) 5 0 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Dag na ovulatie Figuur 15: De progesteronconcentratie van twee merries van dag 4 tot en met dag 10 na ovulatie (merrie A heeft 1 corpus luteum, merrie B heeft 2 corpora lutea) 27

34 Dwarsdoorsnede (cm²) De progesteronconcentratie in het serum van de merrie met een enkele ovulatie (figuur 15) heeft een stijgend verloop met een maximale concentratie op dag 9 en een daling vanaf dag 10. De merrie met een dubbele ovulatie (figuur 15) heeft eveneens een stijgend verloop van de progesteronconcentratie van dag 4 tot en met dag 10. In vergelijking met merrie A is er bij merrie B een lager progesteron level van dag 4 tot dag 7 en een hoger level vanaf dag De dwarsdoorsnede van het corpus luteum Merrie (1 CL) 5 0 D0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Dag na ovulatie Figuur 16: De dwarsdoorsnede van het corpus luteum van een merrie van dag 0 tot en met dag 10. De dwarsdoorsnede van het corpus luteum van de merrie met een enkele ovulatie wordt weergegeven in figuur 16. Deze dwarsdoorsnede is maximaal op dag 4 en verkleint daarna geleidelijk aan. Aangezien de merrie een bijzonder grote preovulatoire follikel had, met een hoogte van 50 mm en een breedte van 45 mm, was het corpus luteum ook aan de grote kant. In het tweede deel van het onderzoek zijn deze dwarsdoorsneden behoorlijk kleiner De doorbloeding van het corpus luteum De laatste studieparameter, de doorbloeding van het corpus luteum, van de merrie met een enkele ovulatie wordt grafisch voorgesteld in figuur 17. Er is een snelle stijging van de doorbloeding na de ovulatie met een maximum op dag 3. Vanaf dag 8 is er een daling van de doorbloeding. 28

35 Progesteronconcentratie (ng/ml) Relatief aantal kleurenpixels (%) Merrie (1 CL) 2 0 D0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Dag na ovulatie Figuur 17: Het relatief aantal kleurenpixels van het corpus luteum van een merrie van dag 0 tot en met dag Deel II met interventie In het tweede deel van het onderzoek worden vijf merries opgevolgd, waarvan drie merries met een enkele ovulatie en twee merries met een dubbele ovulatie (waarvan één synchrone, bilaterale ovulatie en één asynchrone, bilaterale ovulatie (Newcombe, 1997; Davies Morel en O Sullivan, 2001)). Op dag 7 of dag 8 wordt een prostaglandine injectie toegediend aan de merries, na de echografische controle De progesteronconcentratie Merrie A - 1 CL Merrie B - 2 CL (synchroon) Merrie C - 2 CL (asynchroon) 0 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Dag na ovulatie Figuur 18: De serum progesteronconcentratie van dag 4 tot en met dag 10 na ovulatie van drie merries, met de toediening van prostaglandine op dag 7 (aangeduid met een zwarte pijl). 29

36 Progesteronconcentratie (ng/ml) De serum progesteronconcentratie van drie merries die een prostaglandine injectie kregen op dag 7 wordt weergegeven in figuur 18 (bij de merrie met de asynchrone ovulatie worden de dagen geteld vanaf de eerste ovulatie). De dagen na de toediening van PG is er een daling van de progesteron concentratie en 24 tot 48 uur na de prostaglandine injectie is deze concentratie gezakt tot onder 2 ng/ml. Bijgevolg zal het negatieve effect van progesteron op LH één dag tot twee dagen na de prostaglandine injectie worden opgeheven. De twee merries die een prostaglandine injectie kregen op dag 8 vertonen qua progesteronconcentratie in het serum een gelijkaardig verloop (figuur 19): na de toediening van PG is er een duidelijke daling van progesteron binnen de 24 tot 48 uur Merrie D - 1CL Merrie E - 1 CL 5 0 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Dag na ovulatie Figuur 19: De serum progesteronconcentratie van dag 4 tot en met dag 10 na ovulatie van twee merries, met de toediening van prostaglandine op dag 8 (aangeduid met een zwarte pijl) De dwarsdoorsnede van het corpus luteum De toediening van prostaglandine geeft eveneens aanleiding tot een daling van de dwarsdoorsnede in de daaropvolgende dagen. Dit geldt zowel bij de toediening van PG op dag 7 (figuur 20) als op dag 8 (figuur 21). De grafieklijnen bij de merries met een dubbele ovulatie zijn gebaseerd op de gemiddelde dwarsdoorsneden van de corpora lutea op beide ovaria en bij de merrie met de asynchrone ovulatie worden de dagen geteld vanaf de eerste ovulatie. Bij twee van de vijf merries is een stijging te zien in de grootte van het corpus luteum op dag

37 Dwarsdoorsnede (cm²) Dwarsdoorsnede (cm²) Merrie A - 1 CL 6 3 Merrie B - 2 CL (synchroon) Merrie C - 2 CL (asynchroon) 0 D0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Dag na ovulatie Figuur 20: De dwarsdoorsnede van het corpus luteum van dag 0 tot en met dag 10 na ovulatie van 3 merries, met de toediening van prostaglandine op dag 7 (aangeduid met een zwarte pijl) Merrie D - 1 CL Merrie E - 1 CL 3 0 D0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Dag na ovulatie Figuur 21: De dwarsdoorsnede van het corpus luteum van dag 0 tot en met dag 10 na ovulatie van 2 merries, met de toediening van prostaglandine op dag 8 (aangeduid met een zwarte pijl) De doorbloeding van het corpus luteum Het relatief aantal kleurenpixels van het corpus luteum van dag 0 tot en met dag 10 wordt weergegeven in onderstaande grafieken. Na de toediening van prostaglandine op dag 7 (figuur 22) of dag 8 (figuur 23) is er een daling van de doorbloeding, uitgezonderd bij één merrie. 31

38 Relatief aantal kleurenpixels (%) Relatief aantal kleurenpixels (%) Merrie A - 1 CL 8 Merrie B - 2 CL (synchroon) Merrie 3-2 CL (asynchroon) 4 0 D0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Dag na ovulatie Figuur 22: Het relatief aantal kleurenpixels van het corpus luteum van drie merries van dag 0 tot en met dag 10, met de toediening van prostaglandine op dag 7 (aangeduid met een zwarte pijl) Merrie D - 1 CL Merrie E - 1 CL 4 0 D0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Dag na ovulatie Figuur 23: Het relatief aantal kleurenpixels van het corpus luteum van twee merries van dag 0 tot en met dag 10, met de toediening van prostaglandine op dag 8 (aangeduid met een zwarte pijl). 32

39 Ondanks het feit dat de resultaten van de doorbloeding van het corpus luteum vóór de toediening van prostaglandine onregelmatig zijn, vertonen vier van de vijf merries een daling in de doorbloeding na de geïnduceerde luteolyse. Met power Doppler echografie kan in sommige gevallen het effect van de toediening van prostaglandine duidelijk worden opgemerkt (figuur 24). Figuur 24: De doorbloeding van het corpus luteum aan de hand van power Doppler, bij twee merries (A= net vóór van de toediening van prostaglandine; B= de dag na de toediening van prostaglandine) (Kitty De Clercq, 2015) 2.4. Overzicht vóór de toediening van prostaglandine In de onderstaande grafieken (figuur 25) worden de resultaten van de onderzochte merries uit deel II, per studieparameter en enkel uit de periode vóór de toediening van prostaglandine, verzameld. Bijgevolg kunnen meerdere merries per tijdstip vergeleken worden. Iedere merrie heeft in zekere mate een stijgende progesteronconcentratie; bij drie van de vijf merries stijgt de grootte van de dwarsdoorsnede tot een maximum op dag 3 of dag 4, gevolgd door een daling; en het verloop van de doorbloeding in de tijd is zeer onregelmatig. 33

40 Relatief aantal kleurenpixels (%) Dwarsdoorsnede (cm²) Progesteronconcentratie (ng/ml) Merrie A - 1 CL Merrie B - 2 CL Merrie C - 2 CL Merrie D - 1 CL Merrie E - 1 CL 0 D4 D5 D6 D7 Dag na ovulatie D0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 Dag na ovulatie Merrie A - 1 CL Merrie B - 2 CL Merrie C - 2 CL Merrie D - 1 CL Merrie E - 1 CL Merrie A - 1 CL Merrie B - 2 CL Merrie C - 2 CL Merrie D - 1 CL Merrie E - 1 CL 0 D0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 Dag na ovulatie Figuur 25: De serum progesteronconcentratie, de dwarsdoorsnede van het corpus luteum en de doorbloeding van het corpus luteum van dag 4 tot en met dag 7 na ovulatie, van 5 merries. 34

41 BESPREKING Het stijgend verloop van de progesteron concentratie na ovulatie, met een maximale concentratie op dag 9 en een daling vanaf dag 10, komt overeen met de algemene trend van de progesteronconcentratie in de studie van Ginther et al. (2007a). De daling van progesteron in het bloed na de toediening van prostaglandine is reeds lange tijd een gekend gegeven (Hendriks et al., 2006; Ginther et al., 2007b; Utt et al., 2007). In de studie van Hendriks et al. (2006) daalt het progesteron level 48 tot 72 uur na de prostaglandine toediening tot onder 2 ng/ml. In deze studie worden progesteronwaarden lager dan 2 ng/ml reeds aangetroffen 24 tot 48 uur na de PGF injectie. Deze bevindingen zijn zowel van toepassing bij de toediening van PG op dag 7 als dag 8. Het verloop van de dwarsdoorsnede van het corpus luteum met een maximale grootte op dag 4 gevolgd door een geleidelijke daling van de grootte, is vergelijkbaar met wat Ginther et al. (2007a) heeft aangetoond. Het verloop van de dwarsdoorsneden vóór de toediening van prostaglandine is behoorlijk afwijkend van de resultaten in het eerste deel van het onderzoek en de resultaten van de studie van Ginther et al. (2007a). Dit is mogelijks te wijten aan het feit dat er in dit onderzoek geen referentiepunt wordt gehanteerd voor de oriëntatie van het ovarium, zodat niet altijd dezelfde doorsnede in beeld wordt gebracht bij de opeenvolgende metingen van eenzelfde corpus luteum. In de plaats wordt steeds de grootste doorsnede van het corpus luteum gebruikt. De grootte van de dwarsdoorsnede van het corpus luteum is 24 uur na de toediening van PG op dag 7 of dag 8 gedaald. Dit strookt met de bevindingen van Ginther et al. (2007b). Echter bij twee van de vijf merries is er opnieuw een stijging te zien in de dwarsdoorsnede op dag 10. De resultaten van de laatste studieparameter, de doorbloeding van het corpus luteum uitgedrukt in het percentage kleurenpixels, zijn enigszins afwijkend van wat reeds beschreven werd in de literatuur. Zowel het verloop als de hoeveelheid van de doorbloeding in de tijd vertoont sterke verschillen met de studies van Bollwein et al. (2002a) en Ginther et al. (2007a). Bovendien is er op beide grafieken een zeer onregelmatig verloop op te merken. De doorbloeding van het corpus luteum van de merrie in het eerste deel van het onderzoek, is maximaal op dag 3 gevolgd door een onregelmatige periode en een duidelijke daling vanaf dag 8. In de studie van Bollwein et al. (2002a), die qua methode van bepaling van de doorbloeding het meeste aansluit bij dit onderzoek, stijgt de doorbloeding na ovulatie tot een maximum op dag 5 tot dag 7 om daarna opnieuw te dalen. In deel II veroorzaakt de toediening van prostaglandine een daling van de doorbloeding, uitgezonderd bij één merrie waarbij het relatief aantal kleurenpixels reeds daalt vanaf dag 6. Er zijn enkele redenen die de afwijkende resultaten van de luteale doorbloeding vóór de toediening van prostaglandine mogelijks kunnen verklaren. Enerzijds zijn deze resultaten afkomstig van slechts vijf merries waardoord de variatie tussen de paarden deze resultaten kunnen beïnvloeden. Anderzijds zijn de echografische beelden van het corpus luteum gebaseerd op de grootste doorsnede van het corpus luteum, ongeacht de oriëntatie, en werd reeds tijdens het uitvoeren van de metingen opgemerkt dat het niet eenvoudig is om iedere dag dezelfde doorsnede in beeld te brengen. 35

42 Bij verder onderzoek en voor de bevestiging van bovenstaande resultaten zijn er enkele factoren die bij voorkeur worden aangepast. Allereerst is een grotere studiepopulatie gewenst omwille van de variatie tussen de paarden en om de relevantie van het onderzoek te verbeteren. Van de acht proefpaarden die ter beschikking werden gesteld voor dit onderzoek hadden drie paarden een dubbele ovulatie, wat de interpretatie van de resultaten bemoeilijkt. Bovendien is het wenselijk meerdere cycli van de paarden op te volgen waardoor de merrie als eigen controle kan dienen, door enkele cycli met interventie en enkele cycli zonder interventie te vergelijken. Bij dit onderzoek was er slechts een korte periode van opvolging mogelijk waardoor iedere merrie gedurende slechts 1 cyclus kon worden opgevolgd. Een bijkomende studieparameter die kan worden opgenomen in dergelijk onderzoek is het type van ovulatie de normale follikel evacuatie of de gesepteerde follikel evacuatie, die een invloed heeft op de soort doorbloeding van het nieuw gevormde corpus luteum. Het type ovulatie kan afgeleid worden aan de hand van Doppler echografie van de preovulatoire follikel enkele uren voor de ovulatie (zie 2. Vascularisatie van het corpus luteum ). Deze parameter werd in deze studie niet opgenomen. Bij het analyseren van de beelden werden echter wel enkele grote corpora lutea met een duidelijke trabekel structuur opgemerkt, wat wijst op een gesepteerde follikel evacuatie. Figuur 26: 3D power Doppler echografie van het corpus luteum van een vrouw, 7 dagen na ovulatie. Links boven: longitudinale doorsnede Rechts boven: dwarsdoorsnede Links onder: coronale doorsnede Rechts onder: het eindresultaat van de drie beelden samen (Uit: Jokubkiene et al., 2006) Een volgende aanpassing die kan worden toegepast bij verder onderzoek is de standaardisatie van het in beeld brengen van het corpus luteum. Aan de hand van een referentiepunt voor de oriëntatie van het ovarium kan steeds eenzelfde doorsnede van het corpus luteum in beeld worden gebracht. In deze studie werd steeds de grootste doorsnede van het corpus luteum gebruikt, ongeacht de oriëntatie. Bijkomend kunnen er na de oriëntatie van het ovarium metingen gedaan worden in drie vlakken (xyz) in plaats van twee vlakken (xy), waardoor de dwarsdoorsnede en de doorbloeding preciezer kunnen worden bepaald. Aan de hand van 3D Doppler echografie kan de oriëntatie van het corpus luteum in het ovarium in beeld worden gebracht (figuur 26). Dit werd onder andere reeds toegepast bij het corpus luteum van de mens (Brezinka, 2014) en het rund (Scully et al., 2014). Bovendien kan het volume van het corpus luteum en het volume van een met vocht gevulde ruimte 36