SEIZOENSGEBONDEN VOORTPLANTING BIJ DE MERRIE MET NADRUK OP FARMACOLOGISCHE METHODEN VOOR MANIPULATIE

Transcriptie

1 SEIZOENSGEBONDEN VOORTPLANTING BIJ DE MERRIE MET NADRUK OP FARMACOLOGISCHE METHODEN VOOR MANIPULATIE Laura Betzel Studentennummer: Promotor: Prof. dr. Peter Daels Promotor: Drs. Kaatje Ducheyne Onderdeel van de Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad master in de diergeneeskunde Academiejaar:

2 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

3 VOORWOORD Tijdens het schrijven van deze masterproef heb ik professionele en steunende hulp gekregen door verschillende mensen die ik graag zou willen bedanken. Een grote dank gaat naar mijn promotor Prof. dr. Peter Daels die steeds met antwoorden en tips aan mijn zij stond. Verder gaat mijn dank naar mijn copromotor drs. Kaatje Ducheyne voor het lezen van dit werk. Een grote dank gaat ook naar mijn vriendin Judith Schmittgens voor het proeflezen en de mentale steun die zij mij heeft gegeven. Maar vooral zou ik van harte mijn ouders willen bedanken die steeds in mij bleven geloven, ook op momenten waar ik het zelf niet meer deed. De hulp die ik door jullie tijdens mijn hele studie heb ervaren, is met woorden niet te beschrijven.

4 INHOUDSOPGAVE 1. SAMENVATTING INLEIDING DE FYSIOLOGIE ACHTER DE SEIZOENGSEBONDEN VOORTPLANTING Hormonale regulatie Transitieperiode Hypothalamus-ovariële as Het paracriene mechanisme op het niveau van de hypofyse DE KLINISCHE TOEPASSING Manipulatie van de transitieperiode door wijziging van de fotoperiode Het klassieke schema voor de manipulatie van de fotoperiode De vaststelling dat 15 uren licht of één uur licht tijdens de fotosensitieve fase voldoende zijn De vaststelling dat bij paarden een korte-dag lichtschema aangehouden gedurende 35 dagen voldoende is De vaststelling dat een minimale lichtintensiteit voldoende is om de melatonine-secretie te onderdrukken De vaststelling dat blauw licht een groter effect heeft Farmaceutische manipulatie van cycliciteit bij anovulatoire merries FSH Equine pituitary extract Human chorionic gonadotropin Dopamine antagonist Oestrogeen Progesteron GnRH/GnRH-agonisten Progestagenen Recombinant equine LH (relh) Prostaglandine Aanwezigheid van de hengst Andere manieren van manipulatie DISCUSSIE REFERENTIELIJST... 37

5 1. SAMENVATTING Dit werkt geeft de hormonale regulatie van de seizoensgebonden voortplanting bij de merrie weer. Verder worden de meest effectieve methodes van manipulaties achterhaald om de eerste ovulatie zo vroeg mogelijk in het jaar te stimuleren. Naast een groot aantal aan medicaties blijkt de manipulatie door licht de effectiefste methode te zijn. Onderzoeken bewijzen dat de ovariële activiteit vooral op fotoperiodische veranderingen baseert. Melatonine speelt hierbij een cruciale rol. Maar recente studies tonen aan dat er naast de hypothalamus-ovariële as ook een paracrien mechanisme op het niveau van de hypofyse moet bestaan. Echter is op dit vlak meer onderzoek nodig. Tot op heden is niet duidelijk welke functie het paracriene mechanisme bij de long-day breeders heeft. Alhoewel het paracriene mechanisme zowel bij long-day als short-day breeders kon worden nagewezen, biedt het achterliggende mechanisme enkel verklaring voor short-day breeders. Op het einde van dit werk worden verschillende farmaceutische producten opgesomd die een bewijsbaar effect op de ovariële activiteit hebben. Naast de fotoperiode en de farmaceutische manipulatie kon aangetoon worden dat de aanwezigheid van de hengst en een goede voedingstoestand stimulerende factoren zijn. 2. INLEIDING Het fokken van paarden is een oude traditie. Archeologische ontdekkingen uit de jaren vóór Christus bevestigen hun vroeg bestaan en gebruik als nutsdieren (Waran, 2007). Mensen leerden vroeg dat men door geschikte kruising het uithoudingsvermogen en de prestatiekracht van paarden kon verbeteren. Men begon enkel de beste dieren met elkaar te kruisen wat de genetische vooruitgang van de verschillende rassen in de hand werkte. De laatste jaren heeft men door toegenomen microbiologische kennis inzichten verworven in de genetische DNA-codes en de werking van genen onderling. Hierdoor kon men niet alleen wenselijke eigenschappen voortbrengen, maar ook een nieuwe financiële markt creëren. Door de stijgende vraag naar specifieke kruisingen ontstonden nieuwe laboratoria en leveranciers voor sperma. Verder ontwikkelde men nieuwe voortplantingstechnieken zoals embryotransplantatie en intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Hierdoor is men niet alleen in staat om drachtpercentages te verhogen, maar ook om de volledige dracht door een andere merrie te laten uitvoeren. Het voordeel bij het laatst genoemde is dat de dieren kunnen blijven presteren en niet uit de sport gehaald moeten worden (Riera, 2009). Ondanks de enorme wetenschappelijke vooruitgang blijft de voortplanting van de merrie voor een groot gedeelte gebonden aan seizoenen. Wij zijn tot nu toe niet in staat om een ovariële activiteit op te starten, waardoor het tijdstip van de eerste ovulatie, vooral in de transitieperiode, een onvoorspelbare gebeurtenis blijft. Er zijn wel verschillende manieren gevonden om de ovariële activiteit van de dieren te stimuleren, maar zelfs met moderne technieken zijn dergelijke manipulaties slechts in beperkte mate mogelijk (Murphy et al., 2013 en Malschitzky et al., 2001). In de fokkerij streeft men naar veulens die zo vroeg mogelijk in het jaar worden geboren. Dit levert een aanzienlijk voordeel omdat zij vroeger aan hun training kunnen beginnen en mentaal meer matuur zijn, waardoor zij een noemenswaardig prestatievoordeel tegenover hun jongere concurrentie hebben (Ginther, 1992 en Squires, 2008). De wens om vroege veulens te produceren wordt vooral gezien bij volbloed renpaarden doelend op de universele geboortedatum 1 januari voor alle veulens. Uiteindelijk streeft men naar een merrie die zo vroeg mogelijk in het voorjaar begint te ovuleren om haar tijdig te kunnen insemineren. Om die reden manipuleren fokkers vaak het heropstarten van de ovariële 5

6 activiteit. Hierdoor wordt vermeden dat de officiële start van het fokseizoen op 15 januari wordt gemist. Standaard wordt er op 1 december begonnen met het verlengen van het daglicht. Het doel van mijn literatuurstudie in het kader van de masterproef is om het seizoensgebonden aspect van voortplanting bij de merrie toe te lichten. De focus ligt hiervoor op het onderliggende aspect van de fotoperiodiciteit. Er wordt een link gelegd tussen het stimulerende effect van licht en de hieruit resulterende hormonale beïnvloeding. Hiervoor zal de correlatie tussen melatonine en hormonen zoals het gonadotropin-releasing hormone (GnRH), het follikelstimulerend hormoon (FSH) en het luteïniserend hormoon (LH) besproken worden. Nadien wordt de manipulatie door farmaceutische producten besproken en hun invloed op de cycliciteit achterhaald. Om hun aangrijpingspunten beter te kunnen begrijpen zal ik eerst de hormonale regulatie van de oestrus bespreken en hierop gebaseerd hun werkingsmechanisme uitleggen. Binnen de grote diversiteit aan producten zal de focus worden gelegd op de meest gebruikte geneesmiddelen. 3. DE FYSIOLOGIE ACHTER DE SEIZOENGSEBONDEN VOORTPLANTING 3.1 Hormonale regulatie Paarden behoren tot de polyoestrische lange-dag voortplanters (long day breeders) waardoor hun voortplanting seizoensgebonden is (Aurich, 2011). Onder normale omstandigheden worden de merries tussen de maanden april en september regelmatig hengstig (Murphy et al., 2013). Door deze gelimiteerde tijdspanne heeft het veulen een grotere overlevingskans omdat het in een niet te koude omgeving wordt geboren en op jonge leeftijd voldoende toegang heeft tot voedsel. Dieren die zich seizoensgebonden voortplanten oriënteren zich op een toe- respectievelijk afnemende daglichtlengte en worden lange-dag resp. korte-dag voortplanters genoemd. Merries reageren op de toegenomen daglichtlengte in het voorjaar waardoor hun normale ovariële activiteit terug opstart (Daels, 2006). Tijdens de wintermaanden daarentegen neemt het aantal lichturen per dag af waardoor de merrie in een status van seksuele inactiviteit terecht komt, meer bepaald een toestand van actieve onderdrukking van haar ovariële activiteit (Guillaume et al., 2000). Deze periode wordt anoestrus genoemd. Figuur 1: Hormoonprofiel tijdens de oestruscyclus uit Brinsko et al., (2011) 6 De cycluslengte bij de merrie bedraagt dagen, onderverdeeld in een luteale (dioestrus) en folliculaire fase (oestrus). De luteale fase is een constante en bedraagt 14 of 15 dagen, de folliculaire fase daarentegen is variabel en bedraagt 4-7 dagen (range: 2-12 dagen) (zie figuur 1) (Brinsko et al., 2011). Vooral in begin van het jaar kan de duur van de folliculaire fase sterk

7 uiteenlopend zijn en dit kan verklaard worden door de lagere LH-concentratie. Tijdens de folliculaire fase neemt de secretie van oestrogeen toe. De toename in oestrogeenconcentratie is gelinkt aan gedragsveranderingen zoals frequent urineren, staart slaan, slaan en agressiviteit tegenover mens en andere dieren. Echter blijken de gedragsveranderingen niet in correlatie te staan met de meetbare oestrogeenconcentratie (Pryor, 2005). De oestrus cyclus wordt door verschillende hormonen gereguleerd. Melatonine en GnRH hebben hier een dominerende functie. Neurosecretorische cellen in de hypothalamus staan in voor de secretie van het gonadotropinreleasing hormone (GnRH). GnRH wordt in de lokale portale circulatie gestort en via dit portale netwerk naar de adenohypofyse getransporteerd. Onderzoekers stelden vast dat de aminozuursequenties van GnRH erg verschillend zijn tussen de verschillende diersoorten (Millar, 2005). Men vermoedt dat elk diersoort twee tot drie verschillende soorten GnRH moleculen bezit, meest voorkomend hierbij zijn GnRH I en II (Cheng en Leung, 2005). GnRH I zou in de hypofyse kunnen binden en instaan voor de vrijstelling van FSH en LH. Daarentegen zou GnRH II de puberteit controleren en zijn invloed uitoefenen op het voortplantingsgedrag en het eten, maar ook op de energiebalans (Cheng en Leung, 2005). Niet alleen GnRH heeft verschillende subtypen, maar ook de GnRH receptoren (GnRH-R) zijn verschillend. De cytoplasmatische staart van GnRH I en II receptoren verschilt sterk in aminozuursequentie. Beide GnRH subtypen hebben een verschillende affiniteit ten opzichte van hun receptor. GnRH I heeft een hogere affiniteit voor de GnRH-R I receptoren, GnRH II receptoren heeft een hogere affiniteit voor GnRH-R II receptoren. Wanneer GnRH de neurohypofyse heeft bereikt, stimuleert het hormoon de lokale productie en secretie van het follikelstimulerend hormoon (FSH) en het luteïniserend hormoon (LH). De vrijstelling van GnRH gebeurt in pulsen. Indien de pulsfrequentie hoog is, maar de amplitude laag, wordt voornamelijk de LH-secretie gestimuleerd. Het omgekeerde geldt indien de frequentie traag en de amplitude hoog is. In het laatste geval wordt vooral de FSH-secretie gestimuleerd. Een hoge pulsfrequentie en een lage amplitude worden tijdens de luteale fase gezien. Een trage pulsfrequentie en een hoge amplitude worden tijdens de folliculaire fase gezien (Irvine en Lynn, 1994). LH en FSH komen in de algemene circulatie terecht en kunnen op deze manier de ovaria bereiken. FSH heeft een stimulerend effect op het ontstaan van folliculaire golven, LH staat in voor de rijping van de dominante follikel. Indien een dominante follikel is ontstaan, begint deze met de aanmaak van oestrogeen, wat een positief feedback mechanisme heeft op de LH-productie. Naast oestrogeen begint de dominante follikel met de aanmaak van inhibine. Beide hormonen zorgen voor een onderdrukking van de FSHsecretie (zie figuur 2). De cyclus bestaat uit verschillende folliculaire golven, bij de merrie zijn dit meestal een of twee. Tijdens deze golven ontwikkelt zich een groot aantal follikels, maar slechts één, soms twee follikel worden dominant. Deze follikel neemt sterk in grootte toe en kan uiteindelijk al dan niet ovuleren. Op het moment van de ovulatie is de folliculaire grootte tussen cm en de ovulatie vindt meestal 48 uren voor het einde van de oestrus plaats. De folliculaire grootte op het moment van de ovulatie is 7 Figuur 2: Hormonale activiteit van de merrie tijdens de oestrus en dioestrus uit Brinsko et al., (2011).

8 afhankelijk van het ras en ook van het seizoen. Kleinere rassen kunnen al bij een diameter < 30mm ovuleren, daarentegen kunnen grotere rassen een diameter > 45mm bereiken op het ogenblik van de ovulatie. Verder is de folliculaire grootte in begin van het jaar gemiddeld groter vergeleken met het najaar (Brinsko et al., 2011). Figuur 3: Het schema uit Ginther et al., (2007) toont de estradiolen LH-concentratie voor de ovulatie. Figuur 4: Het schema uit Ginther et al., (2006) geeft het onderdrukkend effect van progesteron op LH weer. 8 De folliculaire golven beginnen enkele dagen voor het einde van de luteale fase. Multipele follikels groeien gelijkmatig aan eenzelfde snelheid en bereiken op het einde van deze fase een diameter van gemiddeld mm (Ginther et al., 2007). Na bereiken van deze grootte splitst de groeicurve op. Terwijl de diameter van de meeste follikels terug daalt, neemt de groei van één follikel sterk toe. Deze splitsing wordt voorafgegaan door hormonale veranderingen (zie figuur 3). Gemiddeld twee dagen voor de splitsing stijgt de concentratie van LH en oestradiol. Twee dagen voor de ovulatie heeft oestradiol zijn hoogste concentratie bereikt, de LH-concentratie stijgt tot dit tijdstip enkel maar traag aan. Van zodra oestradiol begint te dalen is er een snelle stijging van de LH-concentratie meetbaar (Ginther et al., 2007). Na de ovulatie wordt de follikel omgevormd tot een corpus luteum dat begint met de aanmaak van progesteron. Progesteron onderdrukt de LH-secretie. Van zodra de progesteronconcentratie een drempelwaarde van 2.0 ng/ml heeft bereikt heeft dit een onderdrukkend effect op LH (zie figuur 4). De maximale progesteronconcentratie wordt rond dag 6 bereikt (16ng/ml). Indien geen dracht werd herkend, wordt het corpus luteum terug afgebroken, waardoor de aanmaak van progesteron stopt. Luteolyse begint vanaf dag 14 met het definitieve einde op dag 16. Op dit ogenblik daalt de progesteronconcentratie <2 ng/ml (Ginther et al., 2006). Na de luteolyse begint de LH-concentratie terug te stijgen. Gastal et al. (1999) hebben het onderdrukkende effect van progesteron op LH aangetoond. Hiervoor werden verschillende hoeveelheden progesteron intraveneus toegediend. Geen progesteron werd toegediend aan de controlegroep, 30 mg progesteron werd toegediend aan de laag gedoseerde groep, 100 mg aan de intermediair gedoseerde groep en 300 mg aan de hoog gedoseerde groep. Binnen de controlegroep en de laag gedoseerde groep kon geen verschil in LH-concentratie worden vastgesteld. Binnen de intermediair en hoog gedoseerde groep was er een verschil in folliculaire grootte meetbaar. De afmetingen van de dominante follikel waren kleiner in vergelijking met de controlegroep (27.3 +/- 1.8 mm vs /- 1.5 mm). Dit verschil in grootte kon niet worden gezien bij secundaire follikels. Gebaseerd op deze gegevens concludeerden de auteurs dat LH geen rol speelt tijdens het ontstaan

9 van een dominant follikel maar wel in zijn finale groeifase van een dominant follikel (Gastal et al., 1999). Dus indien progesteron tijdens het ontstaan van de folliculaire golven wordt toegediend, leidt dit tot een lagere concentratie van LH. Een lagere concentratie van LH heeft een kleinere folliculaire diameter tot gevolg. Maar niet alleen progesteron, ook oestradiol lijkt een inhiberend effect op de LH-concentratie te hebben. Van zodra oestradiol begint te dalen is er een duidelijke stijging van LH meetbaar (zie figuur 5). Figuur 5: De figuur uit Ginther et al., (2006) brengt de toegenomen LH-concentratie in samenhang met de estradiol-concentratie. Tussen dag -2 en dag 1 is de toename rond 4,5 keer groter in vergelijking met dag - 10 tot -2. Tot op heden spreken auteurs elkaar tegen of oestradiol een stimulerend of een inhiberend effect op LH-secretie heeft. Indien men exogeen oestradiol aan het begin van de preovulatoire piek toedient leidt dit tot een lichte daling van de LH-concentratie. De inhibitie van LH stijgt naarmate exogeen oestradiol dichter bij de ovulatie wordt toegediend. Dit effect is vermoedelijk gebaseerd op de expressie van oestrogeen-alfa receptoren. Bij aanwezigheid van dergelijke receptoren kan oestrogeen binden en via een negatieve feedback tot een verminderde vrijstelling van GnRH leiden. Een verminderde vrijstelling van GnRH beïnvloedt op haar beurt de vrijstelling van LH (Lindzey et al., 2006). Twee dagen voor de ovulatie hebben de follikels een diameter van > 35 mm bereikt en brengen vermoedelijk de oestrogeen-alfa receptoren tot expressie. Van zodra een dominant follikel is ontstaan, begint deze met de aanmaak van oestradiol en inhibine, wat de sterke suppressie van LH zou kunnen verklaren. Dergelijke resultaten duiden aan dat er een continu negatief effect uitgaande van oestradiol op LH bestaat, maar deze impact varieert afhankelijk van het moment van de cyclus (Donadeux en Ginther, 2003; Ginther et al., 2007). Het negatieve effect wordt bekrachtigd door wetenschappelijke experimenten op muizen. Onderzoekers toonden aan dat het toedienen van exogeen oestradiol een negatief effect had op de preovulatoire LH piek (Moore et al., 2012). Andere auteurs beweren dat oestradiol een stimulerende ovariële factor is (Mitcham et al., 2010). Naast de werking blijft ook de trigger voor de plotse oestradioldaling en het feedback mechanisme van LH en oestradiol bij het paard ongekend. Verder onderzoek is op dit vlak nodig. Een mogelijke verklaring voor het plotse dalen van oestradiol biedt het experiment van Ndiaye et al., De onderzoekers dienden exogeen hcg aan koeien toe en analyseerden aansluitend de folliculaire vloeistof-veranderingen. Na de toediening van hcg werd er duidelijk minder mrna coderend voor het aromatase enzym tot expressie gebracht (het aromatase enzym staat in voor de omzetting van testosteron naar oestradiol). Indien LH een bepaalde drempelwaarde heeft bereikt zou dit de daling van estradiol kunnen induceren en zou een mogelijke verklaring voor de plotse daling van estradiol kunnen zijn (Ndiaye et al., 2005). Betreffend het feedback mechanisme is een vergelijkbaar mechanisme gevonden bij de koe. In een groep van 21 koeien werden 11 koeien geïmmuniseerd met oestradiol antiserum en 10 koeien werden 9

10 met een placebo behandeld. Aansluitend werden de LH-concentraties onderling vergeleken. Uiteindelijk bleek dat de geïmmuniseerde koeien geen verhoogde preovulatoire LH-piek vertoonden en niet ovuleerden alhoewel multiple folliculaire golven aanwezig waren. Bijkomend werd de folliculaire activiteit in zes geïmmuniseerde koeien geobserveerd en opgemerkt dat er bij dergelijke dieren frequenter folliculaire cysten aanwezig waren. Follikels bereikten bovengemiddelde afmetingen zonder te ovuleren. Wetenschappers concludeerden dat het gebrek aan een preovulatoire LH-piek de oorzaak is voor de anovulatoire follikels. Waarschijnlijk stimuleert de voorafgaande oestradiol piek via een positief feedback mechanisme de toename van LH secretie (Kaneko et al., 2002). Maar uit een aantal in vitro studies bleek dat oestradiol slechts indirect instaat voor deze LH toename. Via het positief feedback mechanisme stimuleert oestradiol de vrijstelling van GnRH wat op zijn beurt tot de vrijstelling van LH leidt (Baldwin et al., 1991). Er is een reciprook effect van LH op oestradiol beschreven. LH zou ook een negatief effect op estradiol hebben. Behandelingen met hcg buiten de folliculaire fase hebben geen meetbaar effect maar wel indien de follikels een grootte >35 mm hebben bereikt. Dit negatief effect is vermoedelijk gebaseerd op de aanwezigheid van LH-receptoren op de granulosa- en cumulus cellen (cellen die de oocyten omgeven). Tijdens de folliculaire fase neemt de expressie van LH-receptoren sterk toe (Goudet et al., 1999). Verder onderzoek is ook hier nodig. Naast de hormonale regulatie wijzen experimenten met geovariëctomiseerde merries erop dat er ook extraovariële factoren moeten bestaan. Deze hypothesis is gebaseerd op het feit dat geovariëctomiseerde merries een seizoensgebonden hormoonpatroon volgen. Tijdens het equivalent van de anoestrus-fase (november-april) is de LH-concentratie van geovariëctomiseerde merries vergelijkbaar met die van intacte merries tijdens de anoestrus- of mid-dioestrus-fase. Daarnaast is het LH-profiel van geovariëctomiseerde merries tijdens het voortplantingsseizoen (mei-oktober) vergelijkbaar met dit van intacte merries tijdens oestrus. Het exogeen toedienen van oestradiol heeft zes dagen na de injectie een toename van de LH secretie tot gevolg (D. Sharp et al., 1991). De toename in LH tijdens het opstarten van het voortplantingsseizoen werd tevens in beide groepen (gecastreerde en intacte merries) gezien (Garcia en Ginther, 1976). Vergelijkbaar aan de LHconcentratie is ook de FSH-concentratie, zelfs een lichtbehandeling heeft in beide groepen hetzelfde stimulerend effect (Ginther et al., 1979). Om het onderliggende mechanisme te kunnen verklaren is er nog verder onderzoek nodig. 10

11 3.2 Transitieperiode Hypothalamus-ovariële as Indien de dagen kort zijn, wordt de functie van de hypothalamo-hypofysaire-gonadale as geblokkeerd. Pas met een toenemende daglichtlengte worden de merries rond de maand april terug hengstig (Hughes et al., 1975). Tijdens het opkomen van ovariële activiteit speelt het hormoon melatonine een belangrijke rol. Melatonine wordt tijdens de duisternis door de epifyse geproduceerd en werkt als een soort dagelijkse recorder (Murphy et al., 2013) die voornamelijk bepalend is voor het circadiaans ritme. Het circadiaans ritme is de trigger voor zich dagelijks herhalende fysiologische toestanden, meest bekend hierbij is het slaap-waakritme of de variatie van bloeddruk en lichaamstemperatuur. Door dergelijk ritme wordt ook het opkomen van de ovariële activiteit getriggerd. Het circadiaans ritme is een 24 uren-ritme waardoor elke fysiologisch toestand na 24 uur wordt herhaald. Eén van de belangrijkste externe factoren die een dergelijk ritme bepalen is het licht, ook Zeitgeber genoemd. Figuur 6. De figuur uit Wever (1992) geeft de verandering van het endogene ritme weer indien mensen los van externe stimuli staan. De zwarte balk geeft de actieve fase weer, de witte de rustfase. Naast het circadiaans ritme bestaat er een endogeen ritme maar deze staat, in tegenstelling tot het circadiaans ritme, los van externe factoren. De tijdspanne van het endogene ritme varieert rond de 24 uur, maar zijn exacte duur wordt genetisch bepaald. Dieren die permanent onder licht en gelijkblijvende omgevingstemperatuur worden gehouden volgen hun endogeen ritme, echter komt dit na verloop van tijd niet meer overeen met de werkelijke tijd (zie figuur 6). De onderzoeker R.A. Wever is dit effect bij de mens nagegaan. In de jaren 1964 tot 1989 leefden 447 mensen in een ondergrondse omgeving los van externe stimuli. Zij verbleven in een omgeving los van het dag/nacht-ritme en wisselende omgevingstemperatuur. De vrijwilligers volgden hun eigen endogeen ritme. Uit het onderzoek bleek dat de meeste mensen een 25 uren-ritme hebben aangenomen. Uitzonderlijk volgden sommige mensen een 33 uren-ritme of een 16 uren-ritme (Wever, 1992). Kooistra en Ginther (1975) beschreven vroeg de effecten van het endogene ritme. Merries gehouden onder constant licht op het einde van het voortplantingsseizoen gingen toch over in een anovulatoire fase. Ook Scraba en Ginther, 1985 hebben gekeken welk effect een constante fotoperiode op de cyclische activiteit van de merrie heeft. Hiervoor heeft men gedurende 1 jaar een fotoschema van 16 uren licht en 8 uren duisternis aangehouden. Slechts 50% van de merries heeft zijn cyclische activiteit behouden tijdens de winterperiode. Hetzelfde mechanisme hebben Kooistra en Ginther, 1975 gezien in begin van het jaar, tijdens het opstarten van het voortplantingsseizoen. Merries die in een constant donkere omgeving werden gehouden begonnen te ovuleren. 11

12 Onder normale omstandigheden zorgt het overheersende circadiaans ritme voor een synchronisatie van het endogene ritme en de werkelijke tijd. Licht heeft hierbij de dominerende functie en wordt door lichtgevoelige ganglioncellen, ook intrinsiek fotosensitieve retinale ganglioncellen (iprgc) genoemd, waargenomen. Deze zijn naast de staafjes en kegeltjes een speciale klasse van neuronen, die zich op de retina bevinden. In vergelijking met staafjes en kegeltjes staan de lichtgevoelige ganglioncellen niet in voor het vormen van beelden maar wel voor het regelen van het circadiaans ritme. Door licht worden fotosensitieve ganglioncellen op de retina geactiveerd. Op die manier getriggerd beginnen de ganglioncellen het fotopigment melanopsin aan te maken. Dit lichtsignaal wordt langs de retino-hypothalamische as naar de nucleus suprachiasmaticus (SCN) gestuurd, een rostrale regio van de hypothalamus (Murphy et al., 2013) Figuur 7 uit Brinsko et al., (2011) geeft de hormonale regulatie van de oestrus bij de merrie weer. De SCN verwerkt de ontvangen lichtsignalen in een golfvormig patroon en stuurt deze signalen langs cervicale ganglia naar de epifyse of pijnappelklier. Ondanks deze verbinding leidt het waarnemen van lichtsignalen tot een verminderde vrijstelling van de neurotransmitter norepinephrine op niveau van de epifyse. Norepinephrine stimuleert normaal de synthese van melatonine door de epifyse. Alhoewel het effect van de fotoperiode goed gekend is, ontbreekt het specifieke werkingsmechanisme van melatonine op de GnRH-secretie. Men gaat ervan uit dat de GnRH-secretie indirect via een verschillend aantal van neurotransmitters beïnvloed wordt (Malpaux et al., 1999). De nocturnale melatonine-secretieduur geeft de lengte van de nacht weer en reguleert de pulserende secretie van GnRH. GnRH stimuleert de secretie van de gonadotrope hormonen LH en FSH (zie figuur 7). Figuur 8 uit Peltier et al., (1998) geeft de LHconcentratie in verschillende groepen merries weer: ovary-intact mares with sham implants (INT), ovary-intact mares with melatonin implants (INTM), ovariectomized mares with sham implants (OVX), and ovariectomized mares with melatonin implants (OVXM). Shown are least-squares means ± SEM. De proef van Peltier et al., (1998) achterhaalde het effect van melatonine op de LH-concentratie bij geovariëctomiseerde alsook intacte merries. In figuur 8 is te herkennen dat de LH-concentratie in geovariëctomiseerde merries duidelijk hoger is in vergelijking met intacte merries. Binnen de intacte groep hebben de merries met een melatonine implantaat een hogere LH-concentratie vergeleken met de placebo behandelde dieren. Echter lijkt er geen verschil te zijn in het behandeling-ovulatie interval tussen placebo en melatonine behandelde merries (16.2 ± 1.93 dagen vs ± 2.16 dagen). Dergelijke behandeling had geen effect op de oestradiol en progesteron concentraties. Peltier et al., (1998) linken de toegenomen LH-concentratie in de ovary-intact mares with melatonin implants groep (INTM-groep) aan een toegenomen GnRH-secretie door de hypothalamus. Echter spreken andere auteurs deze resultaten tegen (Brinsko et al., 2011). Ze beweren dat melatonine een inhiberend effect op de GnRH-secretie heeft (zie figuur 8). Een mogelijke verklaring voor de foutieve conclusie van Peltier et al., (1998) zou kunnen zijn dat hun bereikte melatonine-concentratie duidelijk afwijkt van de natuurlijke nocturnale piek (76pg/ml vs pg/ml onder natuurlijke omstandigheden). 12

13 3.2.2 Het paracriene mechanisme op het niveau van de hypofyse Er is al lang geweten dat de GnRH-secretie bij fotoperiodische species, zoals het paard en het schaap, door de daglengte gereguleerd wordt. Recente studies tonen aan dat naast de hypothalamus-ovariële as ook een paracrien mechanisme op het niveau van de hypofyse bestaat. Dit paracriene mechanisme heeft een bijkomende controlerende functie op de LH- en FSH-vrijstelling. Onderzoekers konden op niveau van de pars tuberalis van de hypofyse een hoge densiteit aan melatonine-receptoren aantonen (Lincoln en Clarke, 1994). Wanneer deze receptoren na de binding van melatonine geactiveerd worden, kon een gedaalde prolactine-secretie worden vastgesteld. Men vermoedt dat dit mechanisme een effect op de seizoensgebonden voortplanting heeft en los staat van de directe invloed van de hypothalamus. Dus samengevat is de seizoensgebonden voortplanting op twee mechanismen gebaseerd: de hypothalamo-hypofysaire-ovariële as en op niveau van de hypofyse, door paracriene prolactine-secretie (Tortonese, 2016). Om de toename van prolactine te achterhalen werd de morfologie van gonadotrope en lactotrope cellen in microanatomische onderzoeken met elkaar vergeleken. Gonadotrope cellen worden omgeven door een cluster van lactotrope cellen (zie figuur 9). Hun interactie lijkt een belangrijke invloed op de reproductieve functie bij fotoperiodische dieren te hebben (Childs, 2006). Het aandeel van gonadotrope cellen in de pars distalis blijft heel het jaar constant, het aandeel in de pars tuberalis stijgt in de reproductieve fase (Tortonese et al., 2001). Hiertegen zijn de lactotrope cellen enkel aanwezig in de pars distalis, hun aandeel stijgt tijdens de zomermaanden. Met andere woorden stijgt het aantal lactotrope cellen bij het schaap tijdens de niet-reproductieve fase (zomer), bij het paard tijdens de reproductieve fase. De lactotrope/gonadotrope celpopulatie ondergaat dus een circanuale verandering Lactotrope regulatie van de gonadotrope functie: Lactotrope cellen, enkel aanwezig in de pars distalis, stellen prolactine vrij en dit prolactine heeft een invloed op de gonadotrope functie. Echter is voor deze beïnvloeding de aanwezigheid van prolactine-receptoren noodzakelijk. In 2008 kon het team van Henderson et al. prolactinereceptoren in de pars distalis van de hypofyse van het paard in situ aantonen (zie figuur 9). Voor verder onderzoek werd er gebruik gemaakt van hypofyse cellen, ontnomen tijdens de reproductieve en niet-reproductieve fase. Deze cellen worden in monolayer culturen gebracht (Hodson et al., 2010). Groep één was een controlegroep, groep twee werd behandeld met prolactine (PRL), groep drie met Figuur 9 uit Townsend et al.,(2004): Immunofluorescerende opname van LH en prolactine in de pars distalis van het paard. LHgonadotrope cellen (rood) zijn omgeven door lactotrope cellen (groen). thyrotrophin releasing hormone (TRH; TRH stimuleert de prolactine-secretie), groep vier met bromocriptine (dopamine-agonist; inhibeert prolactine-secretie) en groep vijf met bromocriptine in combinatie met prolactine. GnRH heeft een permanent effect op LH, onafhankelijk van het seizoen. Tijdens de zomermaanden hebben prolactine en TRH geen effect op de GnRH-gerelateerde LHrespons. Daarentegen leidt bromocriptine tot een stijging van de GnRH-gerelateerde LH-concentratie alsook de basale LH-concentratie. Van zodra prolactine bijkomend werd toegediend (groep vijf) werd een sterke onderdrukking van LH gezien. De LH-concentraties lagen onder de basale waardes (Hodson et al., 2010). De resultaten wijzen erop dat prolactine geen direct effect op de LH-concentratie heeft maar wel het gecombineerde gebruik van prolactine en dopamine. Buiten het voortplantingsseizoen 13

14 hebben de verschillende behandelingen geen meetbaar effect gehad waardoor de hormonale interactie seizoensafhankelijk moet zijn (zie figuur 10 en 11). Figuur 10: De figuur uit Hodson et al., (2010) geeft de LH-respons op verschillende GnRH-concentraties tijdens de niet-reproductieve fase van het paard weer. Elke groep werd op verschillende manieren behandeld: (A) medium (Control; CON); (B) rat prolactin (500 ng/ml; rprl); (C) thyrotropin-releasing hormone (10-7 M; TRH); (D) bromocriptine (10 8 M; Br); en (E) Br + rprl. De LH-respons is voor elke GnRH-concentratie (0, 10 10, 10 9, 10 8 en 10 7 M) per onderzoek weergegeven. In de controlegroep stijgt de LH-respons naargelang de GnRH-concentratie. Geen behandeling stimuleert de LH-respons op GnRH. De maximale LH-concentraties zijn lager vergeleken met het voortplantingsseizoen Figuur 11: De figuur uit Hodson et al., (2010) geeft de LH-respons op verschillende GnRH-concentraties tijdens de reproductieve fase van het paard weer. Elke groep werd op verschillende manieren behandeld: (A) medium (Control; CON); (B) rat prolactin (500 ng/ml; rprl); (C) thyrotropin-releasing hormone (10-7 M; TRH); (D) bromocriptine (10 8 M; Br); en (E) Br + rprl. De LH-respons is voor elke GnRH-concentratie (0, 10 10, 10 9, 10 8 en 10 7 M) per onderzoek weergegeven. Groep A was een controlegroep. Door bromocriptine alleen, maar vooral in combinatie met verschillende GnRH-concentraties wordt de LH-respons gestimuleerd. Vergeleken met de controlegroep heeft de LH-respons duidelijk toegenomen. De combinatie van bromocriptine en prolactine onderdrukt de LH-respons. 14

15 Figuur 12: De figuur uit Hodson et al., (2010) geeft de FSH-respons op verschillende GnRH-concentraties tijdens de niet reproductieve fase van het paard weer. Elke groep werd op verschillende manieren behandelt: (A) medium (Control; CON); (B) rat prolactin (500 ng/ml; rprl); (C) thyrotrophin-releasing hormone (10-7 M; TRH); (D) bromocriptine (10 8 M; Br); en (E) Br + rprl. De FSHrespons is voor elke GnRH-concentratie (0, 10 10, 10 9, 10 8 en 10 7 M) per onderzoek weergegeven. In de controlegroep stijgt de respons naargelang de GnRH-concentratie. Maximale en basale FSH-concentratie waren hoger vergeleken met de reproductieve fase. Geen behandeling kon de FSH-respons op GnRH manipuleren. Figuur 13: De figuur uit Hodson et al., (2010) geeft de FSH-respons op verschillende GnRH-concentraties tijdens de reproductieve fase van het paard weer. Elke groep werd op verschillende manieren behandelt: (A) medium (Control; CON); (B) rat prolactin (500 ng/ml; rprl); (C) thyrotropin-releasing hormone (10-7 M; TRH); (D) bromocriptine (10 8 M; Br); en (E) Br + rprl. De FSH-respons is voor elke GnRH-concentratie (0, 10 10, 10 9, 10 8 en 10 7 M) per onderzoek weergegeven. Tijdens de reproductieve fase kon nog door een behandeling nog door verschillende GnRH-concentraties een stimulatie van FSH worden gezien. 15

16 De prolactine-concentratie is tijdens de lange zomermaanden duidelijk hoger. Dit geldt echter niet enkel voor de prolactine-, maar ook de dopamine-secretie (Tortonese, 1999). Anders gezegd wordt het suppressieve effect van prolactine en dopamine op de GnRH-gerelateerde gonadotropine-secretie tijdens de niet-reproductieve fase van het schaap en tijdens de reproductieve fase van het paard gezien. Bij het schaap wordt naast LH-secretie ook de FSH-secretie geïnhibeerd (zie figuur 12 en 13). Het inhiberende effect op FSH wordt bij het paard niet gezien (Moore et al., 2012). Hierdoor werd duidelijk dat het effect tussen short- en longday-breeders verschillend moet zijn. Bij het schaap werd het reproductieve systeem tijdens de zomermaanden volledig onderdrukt, waartegen bij het paard de gevoeligheid van gonadotropine tegenover GnRH wordt beïnvloed (McArdle et al., 2002). Men vermoedt dat bij het paard op deze manier een desensibilisatie van de GnRH-receptoren wordt voorkomen. Over het effect bij het paard is nog verder onderzoek nodig Intracellulaire signaaloverdracht door prolactine en dopamine dat die gonadotrope respons op GnRH moduleert: GnRH bindt op de G-protein-coupled receptor waardoor Gq en/of G11 proteïne geactiveerd worden. Deze proteïnen stimuleren fosfolipase C (PLC) waardoor diacylglycerol geproduceerd wordt. Diacylglycerol activeert proteïne kinase C (PKC). Bovendien activeert GnRH de mitogen-activated protein kinase (MAPK). Prolactine activeert na binding op zijn receptor JACK2, STAT5 en MAPK. Indien dopamine aan zijn D2 receptor bindt worden de adenylyl cyclase, cyclic adenosine monofosfaat, protein kinase A, PLC en PKC geactiveerd. Samengevat spelen dus PLC en PKC een gemeenschappelijke rol in de cascade-gemedieerde activatie van de GnRH-, prolactin- en dopamine-receptoren. Bij seizoensgebonden voortplanters kunnen noch prolactine noch dopamine alleen de GnRH GnRH Figuur 14: De figuur uit Hodson et al., (2012) toont het effect van GnRH op LH tijdens GnRH verschillende behandelingen. GnRH (A) medium (Con); (B) medium + oplossing die de concentratie van PKC- en PLCinhibitoren verlaagt (Con + solvents); (C) prolactine + bromocriptine (PRL + Br); (D) Bis-1 + U73122 (specifieke inhibitoren van PKC resp. PLC); (E) Bis-1 + Br; en (F) U PRL. De LHrespons wordt weergegeven bij verschillende GnRH-concentraties (0, 1 en 10 nm). In het experiment wordt duidelijk dat de suppressie door prolactine samen met bromocriptine evenredig is met de suppressie door PKC- en PLC-inhibitoren. gonadotrope secretie onderdrukken. Pas de combinatie van de twee leidt tot een suppressie van de PKC- en PLCsignaaltransductie waardoor de GnRHgemedieerde LH-secretie geïnhibeerd wordt. Dit mechanisme wordt bevestigd door het toedienen van specifieke PKC- en PLCantagonisten (zie figuur 14). Slechts de gecombineerde toediening van de twee antagonisten leidt tot een inhibitie. Van zodra de antagonisten separaat werden toegediend was geen effect herkenbaar (Hodson et al., 2012). In vivo stijgt het gehalte aan melatonine tijdens de nacht waardoor de prolactine-secretie geïnhibeerd wordt. De PKC- en PLC-signaling pathways gaan niet meer door.. 16

17 Gonadotrope regulatie van de lactotrope functie: De associatie tussen geactiveerde melatonine-receptoren in de pars tuberalis, gonadotrope cellen in de pars tuberalis en pars distalis alsook lactotrope cellen, enkel aanwezig in de pars distalis, vraagt een morfologische connectie van de verschillende celtypen. Studies bewijzen dat gonadotrope cellen het stimulerende effect van GnRH op de prolactine-secretie sturen (Denef, 2008). Van zodra GnRH wordt toegediend aan een hypofysencelcultuur die aangemengd is met een lactotrope celcultuur, is er een duidelijke stijging van de prolactine-concentratie meetbaar. Verder kan dit effect worden gezien bij een cultuur bestaande uit αt3 1 gonadotrope cellen. Deze cellen zijn in staat GnRH-receptoren tot expressie te brengen. Van zodra dergelijke cellen met lactotrope cellen worden gemengd kan de functie van GnRH om prolactine te secreteren tot stand komen. Iets gelijkaardigs wordt gezien indien het medium, verkregen door een GnRH-gestimuleerde gonadotrope cultuur, wordt gemengd met een lactotrope celcultuur (Denef en Andries, 1983). Door dit onderzoek wordt duidelijk dat niet alleen gonadotrope cellen het effect van GnRH op de prolactine-secretie stimuleren, maar dat een dergelijk effect ook wordt gezien na de bijmenging van secretieproducten verzameld uit gonadotrope cellen. Na de binding van GnRH op de gonadotrope GnRH-receptoren moet er een signaaloverdracht vanuit de gonadotrope naar de prolactine cellen plaatsvinden. Vroegere studies hebben reeds aangetoond dat de primaire gonadotrope secretieproducten LH en FSH niet kunnen instaan voor deze signaaloverdracht. Er konden noch LH- noch FSH-receptoren in de hypofyse van het paard worden aangetoond (Henderson et al., 2008). De prolactine-secretie moet dus wel door een ander, tot nu toe niet gekend, secretieproduct gemedieerd worden. In deze studie werd duidelijk dat de prolactine-secretie noch door de primair gonadotrope secretieproducten LH of FSH noch door GnRH kan worden gekregen. Er moet een tot nu toe ongekende transductieweg bestaan die na de activatie van de melatonine-receptoren geactiveerd wordt en de prolactine-secretie stimuleert Folliculostellate cellen: Tijdens duisternis worden melatonine-receptoren in de pars tuberalis van de hypofyse geactiveerd. Echter bevat deze regio geen lactotrope cellen wat erop wijst dat een ander mechanisme verantwoordelijk moet zijn voor de melatonine-geïnduceerde suppressie van prolactine (Tortonese, 2016). In long- en short-day breeders blijft de gonadotrope celpopulatie ter hoogte van de pars distalis constant tijdens de winter en zomer. Hiertegen wordt er wel een kwantitatieve toename van de lactotrope celpopulatie en hun intercellulair contact tijdens de zomermaanden gezien (Townsend et al., 2004). De toegenomen intercellulaire communicatie is gebaseerd op ultrastructurele veranderingen. De verhouding van het ruw endoplasmatisch reticulum, de secretiegranules en het totale celgetal is duidelijk toegenomen. Experten vermoeden dat de intercellulaire communicatie door folliculostellate cellen wordt gestuurd. Dergelijk celtype heeft geen endocriene functie, de signaaltransductie gebeurt via gap-junctions. Deze gap-junctions bestaan onderling en met andere endocriene cellen waardoor een 3-dimensinaal netwerk ontstaat (Denef, 2008). Folliculostellate cellen stellen follistatin vrij dat een inhiberend effect op de prolactine-secretie heeft. Ook bij deze celpopulatie kunnen ultrastructurele veranderingen worden waargenomen tijdens de zomermaanden. Indien de daglichtlengte stijgt worden de cellen groter en het aandeel aan ruw endoplasmatisch reticulum en adherens junctions neemt toe (Tortonese et al., 2015). Verder zijn er veranderingen in het secretorische product waar te nemen. De VEGF isovormen veranderen naargelang het seizoen en hebben een effect op de gonadotrope en lactotrope functie (Castle-Miller et al., 2015). Bovendien lijkt 17

18 het secretieproduct een auto-regulerend effect te hebben door activatie van de VEGF-receptor 2 (Castle-Miller et al., 2017). Uit het onderzoek blijkt dat folliculostellate cellen een signaal-overdragende functie hebben. Vermoedelijk staan zij in voor de signaaloverdracht tussen lactotrope en gonadotrope cellen en hebben zij een inhiberende functie op de prolactine-secretie. Het systeem laat zich als volgt samenvatten (zie figuur 15): Indien de dagen kort zijn is de secretieduur van melatonine langer. Melatonine werkt in op melatoninegevoelige cellen in de pars tuberalis en onderdrukt via een paracrien mechanisme de Figuur 15: De figuur uit Tortonese (2016) toont de hormonale regulatie bij het schaap tijdens korte en lange dagen. FSC, folliculostellate cells; LD, long days; OC, optic chiasm; PRL, prolactin receptor; prolactine-secretie SD, short days; DA, dopamine neuronen in de pars distalis. Van zodra de concentratie aan prolactine daalt wordt de PKC- en PLC-signaaltransductie onvolledig geblokkeerd waardoor de GnRH-gemedieerde LH-secretie (bij het schaap ook de FSH-secretie) toeneemt. Door de onvolledige blokkade van de PKC- en PLC-signaaltransductie daalt niet enkel de LHsecretie maar ook de activiteit van de dopamine- en GnRH-receptoren. De veranderingen worden in short- en long-day breeders tijdens de zomermaanden gezien. Men gaat ervan uit dat beide groepen op de fotoperiodieke stimulatie op een evenredige manier reageren alhoewel hun reproductieve cyclus verschillend is. Het effect tussen de twee groepen moet verschillend zijn. Bij short-day breeders wordt de gonadotrope as volledig geblokkeerd van zodra de endocriene concentratie van dopamine stijgt. Bij long-day breeders lijkt de primaire functie de controle van de LH- en FSH-secretie te zijn en verder de fine-tuning van de gonadotrope respons op GnRH (Tortonese, 2016). 18

19 4. DE KLINISCHE TOEPASSING 4.1 Manipulatie van de transitieperiode door wijziging van de fotoperiode In 2011 verklaarde Panzani et al.: Artificial photoperiod treatment is currently the best method to hasten the first ovulation of the breeding season in winter anoestrus mares. However, this is not easy to apply in large herds of mares and, to be effective, has to be planned in the northern hemisphere in December at the latest. In de fokkerij streeft men naar veulens die zo vroeg mogelijk in het jaar worden geboren. Verschillende manipulaties zijn beschreven om de cyclische activiteit te stimuleren. Om effectief te werken dienen fokkers voornamelijk met de volgende vijf punten rekening te houden: Het klassieke schema voor de manipulatie van de fotoperiode, de vaststelling dat 15 uren licht of één uur licht tijdens de fotosensitieve fase voldoende zijn, een korte dag licht schema aangehouden gedurende 35 dagen voldoende is, een minimaal hoeveelheid licht of blauw licht voldoende is om de melatonine secretie te onderdrukken Het klassieke schema voor de manipulatie van de fotoperiode Om de cyclische activiteit vroeg in het jaar op te starten begint de behandeling reeds in de voorafgaande late herfst. Dat betekent dat merries in de noordelijke hemisfeer vanaf 1 december onder het artificiële fotoperiode schema worden gezet (Brinsko et al., 2011). Hierbij hoeft het licht niet geleidelijk aangepast te worden. In tegendeel, het effect is groter indien er een duidelijk verschil met de natuurlijke fotoperiode herkenbaar is (Palmer en Guillaume, 1992). Midden februari, gemiddeld 70 dagen na de aanvang van de artificiële fotoperiode, wordt een normale cyclische activiteit verwacht. Verschillende fotoperiode schemata worden voorgesteld. Het kunstmatige licht kan ofwel in het begin of op het einde van de dag (Palmer en Guillaume, 1992) ofwel opgesplitst tijdens de ochtend en de avond worden aangezet (Sharp et al., 1993). Het Experiment van Guillaume et al. (2000) analyseerde op welk tijdstip van de dag de lichtbehandeling het grootste effect heeft. Bij alle groepen werd een lichtschema van 14,5 uren licht en 9,5 uren duisternis per etmaal toegepast. In groep 1 maakten de onderzoekers gebruik van een 10 lux sterke lichtbron die vanaf uur werd aangezet (lage ochtend intensiteit). De merries ovuleerden gemiddeld 64 ± 15 dagen na begin van de lichtbehandeling. In groep 2 werd het licht op hetzelfde tijdstip aangezet maar de gebruikte lichtbron was 10 keer sterker, namelijk 100 lux (hoge ochtend intensiteit). De eerste ovulatie werd na 62 ± 6 dagen gezien. In groep 3 en 4 werd het licht aangezet tussen uur. De hierbij gebruikte lichtbron had een intensiteit van 10 (lage avond intensiteit) resp. 100 lux (hoge avond intensiteit). De merries in groep 3 ovuleerden na 73 ± 5 dagen, de merries in groep 4 na 49 ± 13 dagen. In vergelijking werd de eerste ovulatie in de controlegroep na 134 ± 15 dagen gezien. Uit dit experiment werd duidelijk dat er geen significant verschil bestaat in het behandelingseffect tussen ochtend en avond behandeling maar dat er wel een verschil bestaat met de controlegroep (natuurlijke photoperiode) die significant later ovuleerden. De afnemende lichtintensiteit van >1000 lux overdag naar 10 lux in de avond wordt niet waargenomen als begin van de nacht (Palmer en Guillaume, 1992). Het tijdstip van behandeling heeft dus geen meetbaar effect op de aanzet van de eerste ovulatie. 19

20 4.1.2 De vaststelling dat 15 uren licht of één uur licht tijdens de fotosensitieve fase voldoende zijn Veldomstandigheden hebben aangetoond dat uren licht (kunstmatig + natuurlijk) voldoende zijn om een stimulerend effect op de ovariële activiteit te hebben (Brinsko et al., 2011). Ook Palmer en Guillaume bevestigden dat een optimale stimulatie wordt bereikt met 14,5 16 uren licht per etmaal. Verlengen van de lichtperiode zou geen meetbaar verschil geven vergeleken met controlegroepen. Indien melatonine-concentraties gedurende 10 uren na zonsondergang nog hoog zijn werd dit gedefinieerd als een lange nacht (Palmer en Guillaume, 1992). Een fotoperiodiek effect wordt ook gezien indien men in de natuurlijke fotoperiode tijdens de nacht het licht gedurende één uur aanzet. Het interval tussen zonsondergang en lichtstimulus moet 9,5-10 uren bedragen. Deze periode (9h na zonsondergang) wordt ook de fotosensitieve fase genoemd (Palmer et al., 1982). Een ander experiment van Guillaume et al. (2000) onderzocht het effect van 1 uur licht tijdens de fotosensitieve fase. De behandeling werd 35 dagen aangehouden (24 december tot 23 januari). In groep 1 werd het licht voor 1 uur tussen uur aangezet. De gebruikte lichtbron had een intensiteit van 10 lux. In deze groep ovuleerden de merries na 91 ± 20 dagen. Slechts 5 van 10 merries vertoonden geen respons op de behandeling en ovuleerden pas na 110 dagen. Na de bloedstaalname werd duidelijk dat de melatonine-concentratie tijdens de lichtimpuls sterk daalde. De melatonineconcentraties vóór, tijdens en na de lichtimpuls bedroegen 19.8 ± 3.7, 1,7 ± 0,4 resp. 6,1 ± 1,4 pg/ml. Bij slechts 5 van de 10 merries is de melatonine-concentratie tussen uur en zonsopgang terug gestegen. Bij de overige merries uit dergelijke groep bleef de melatonine-concentratie tot zonsopgang laag. In groep 2 werd een 200 lux sterke lichtbron tussen uur aangezet. Dit lichtschema werd aangehouden vanaf 24 december tot 1 juni. Onder dergelijk lichtschema werden de eerste ovulaties na gemiddeld 60 ± 5 dagen gezien. De melatonine-concentratie werd om uur gemeten en bedroeg 57,5 ± 7,7 pg/ml. Groep 3 was een controlegroep gehouden onder natuurlijke lichtgegevens. Hier werd de ovulatie na gemiddeld 123 ± 8 dagen opgemerkt. De melatonineconcentratie om uur bedraagt 28,8 ± 5,1 pg/ml. Hieruit blijkt dat de melatonine-concentratie tijdens de fotosensitieve fase ( uur) het laagst is. Onterecht zou men ervan kunnen uitgaan dat een lichtbehandeling tijdens de fotosensitieve fase minder succesvol is, in vergelijking met andere lichtmethoden. Echter hoeft men ermee rekening te houden dat het lichtinterval in groep 1 niet strikt gedefinieerd is. Bij de merries uit groep 1 werd het begin van de dag, resp. het begin van de donkerperiode, bepaald door de natuurlijke zonsopgang en -ondergang. Hierdoor vindt de overgang van licht naar donker niet alleen geleidelijk plaats maar zal deze ook dagelijks variëren. Onder natuurlijke gegevens kan de intensiteit van de donkerheid hierdoor sterk verschillend zijn. De geleidelijke overgang van dag naar nacht en het verschil in natuurlijke lichtintensiteit kunnen ertoe leiden dat het tijdstip van de fotosensitieve fase een dagelijkse variatie ondergaat. Met andere woorden hoeft deze fase niet om uur plaats te vinden maar wordt beter gedefinieerd als 9,5-10 u na zonsondergang. In het experiment van (Guillaume et al., 2000) wordt hiermee geen rekening gehouden. 20

21 4.1.3 De vaststelling dat bij paarden een korte-dag lichtschema aangehouden gedurende 35 dagen voldoende is Een bijkomend experiment van Guillaume et al. (2000) bepaalt hoe lang een behandeling moet worden aangehouden om de cyclische activiteit te stimuleren. De twee behandelde groepen worden onder 14,5 uren licht en 9,5 uren duisternis gezet beginnend op 1 december. In groep 1 werd de behandeling gedurende 35 dagen aangehouden en in groep 2 werd behandeld tot 13 juli. Groep 3 was een controlegroep die onder de natuurlijke fotoperiode stond. Na de behandeling bleek de stimulatie in groepen 1 en 2 hetzelfde te zijn (76 ± 6 dagen). Dit was gemiddeld 2 maanden vroeger dan de controlegroep (131 ± 3 dagen). In dit experiment is de behandeling op de kortste dag van het jaar begonnen en gestopt wanneer de natuurlijke daglichtlengte met 40 minuten was toegenomen vergeleken met de start van de behandeling. Alhoewel de merries na stopzetten van de behandeling terug aan de natuurlijk kortere daglichtlengte blootgesteld werden, induceerde dit geen ovariële inactiviteit. Het is duidelijk dat een lichtbehandeling van 35 dagen reeds een blijvend, stimulerend effect op de merrie heeft. In contrast hiertoe hebben Sraba en Ginther (1985) gekeken welk effect een constante fotoperiode op de cyclische activiteit van de merrie heeft. Hiervoor heeft men gedurende 1 jaar een fotoschema van 16 uren licht en 8 uren duisternis aangehouden. Slechts 50% van de merries heeft zijn cyclische activiteit behouden tijdens de winterperiode. De verklaring hiervoor is het overheersende endogene ritme De vaststelling dat een minimale lichtintensiteit voldoende is om de melatonine-secretie te onderdrukken Het experiment van Guillaume et al. (2000) heeft geanalyseerd vanaf welke lichtintensiteit een inhiberend effect op de melatonine-secretie meetbaar was. Hiervoor maakten de onderzoekers gebruik van hetzelfde type lamp, slechts het aantal ervan was verschillend. In elke groep werd het licht van aangezet. Reeds één dag voor de behandeling hebben de onderzoekers de melatonine concentraties gemeten. Tussen uur was de concentratie 2,6 ± 0,4 pg/ml en tussen uur 17,1 ± 1,5 pg/ml. Op de dag van de lichtbehandeling werden elke 30 minuten bloedstalen genomen. Het eerste bloedstaal werd om uur en de laatste om uur genomen. Hierin werd het melatonine-gehalte gemeten om te evalueren of de lichtbehandeling hierop al dan niet een effect heeft gehad. In groep 1 gebruikte men 8 lampen, dit komt overeen met 20 lux. In groep 2 werden er vier lampen (12 lux), in groep 3 twee lampen (6 lux), in groep 4 één lamp (3 lux), in groep 5 natuurlijk daglicht (controle). De gemeten melatonine-concentratie in groep 1 was 0,7 ± 0,2 pg/ml, in de andere groepen resp. 2,4 ± 1,1; 2,7 ± 0,8 en 3,3 ± 1,1 pg/ml. In de controlegroep maakte men gebruik van natuurlijk licht. Vanaf uur werden de dieren in een donkere omgeving gebracht. De hier gemeten melatonine-concentraties bedroegen 14,9 ±3,6 pg/ml. In dit experiment werd duidelijk dat een lichtbron van slechts 3 lux reeds een inhiberend effect op de melatonine-secretie heeft maar de gebruikte lichtintensiteit te laag is om een merkelijk verschil met een korte fotoperiode op te meten. Pas vanaf een lichtintensiteit van 10 lux is een duidelijk verschil in behandelings-ovulatie-interval meetbaar (Guillaume et al., 2000). 21

22 4.1.5 De vaststelling dat blauw licht een groter effect heeft In 2011 hebben Murphy et al. zich de vraag gesteld of het volledige spectrum aan licht noodzakelijk is om de vroegtijdige ovulatie van de merrie te stimuleren. De kostenfactor speelt hierbij een belangrijke rol. Standaard wordt de merrie vanaf 1 december op stal onder artificieel licht gezet. De minimale tijdspanne van een lichttherapie duurt 5 weken, kosten die hiervoor per merrie per week gespendeerd moeten worden bedragen volgens Murphy et al. (2013) 120. Figuur 16 uit Murphy et al., (2013). Oogmasker met een 50 lux sterke blauwe lichtbron. De binnenkant bestaat uit aluminium om het licht naar het oog te weerkaatsen. Voor zijn onderzoeken maakte het team gebruik van 59 volbloed merries. De merries waren tussen 5 en 24 jaar oud en werden opgedeeld in drie verschillende groepen. Groep 1 verbleef overdag op de weide en werd in de avond op stal gezet. Vanaf uur werd de daglengte met een 250 lux sterke lichtbron artificieel verlengd. Groep 2 volgde hetzelfde schema maar in plaats van een 250 lux sterke lichtbron werd gebruik gemaakt van een lichtmasker. Dit lichtmasker werd op het hoofd van de merrie aangebracht en was voorzien van een 50 lux sterke blauwe lichtbron, gericht naar de pupil van het rechteroog (zie figuur 16). Groep 3 was een controlegroep en bleef zowel overdag als tijdens de nacht op de weide zonder enige vorm van manipulatie. Om de verschillen tussen de groepen objectief te kunnen meten werd de ovariële activiteit middels rectaal echografie gemonitord. Transrectaal werden follikelgrootte, aantal, aan- of afwezigheid van corpora lutea, tonus van cervix en uterien oedeem beoordeeld. Deze parameter werden aansluitend tussen de verschillende groepen vergeleken. Verder werden er bloedstalen genomen om de progesteron-concentratie te meten. Er was sprake van cyclische activiteit indien follikels een grootte van meer dan 20 mm hadden bereikt, er een corpus luteum of haemorrhagicum aanwezig was en het progesteron-gehalte hoger dan 1 ng/ml was. Een transitionele status werd toegepast indien de follikels groter dan 20 mm waren en de merries een typisch oestrusgedrag vertoonden. Progesteron is tijdens de transitie fase afwezig. Anoestrus werd gedefinieerd als de afolliculaire fase, er zijn geen follikels groter dan 15 mm aanwezig, oestrusgedrag is afwezig en progesteron-gehaltes zijn lager dan 1 ng/ml. Op 20 november en 10 februari werd na het klinische onderzoek een individuele status aan de merries toegewezen: cyclisch, transitioneel of anoestrus. Aan het begin van de proef op 20 november waren er geen verschillen op te merken in de verhoudingen tussen groep 1 en 2, groep 1 en 3 of groep 2 en 3 (zie figuur 17). Echter waren er duidelijke verschillen tegen het einde van de proef op te merken. Op 10 februari was het aantal cyclische merries duidelijk verschillend tussen groep 1 en 3 (87,5% vs. 21%) en tussen groep 2 en 3 (80% vs. 21%) (zie figuur 18). Er was geen verschil op te merken tussen groep 1 en 2 (87,5% vs. 80%). 22

23 Figuur 17 uit Murphy et al., (2013): Status op 20 november In groep 1 waren 9/16 merries cyclisch (56,25%), 3/16 (18,75%) merries waren in de transitionele fase en 4/16 (25%) waren in anoestrus. In groep 2 waren 8/25 (32%) cyclisch, 6/25 (24%) in de transitionele fase en 11/25 (44%) in anoestrus. In groep 3 waren 5/19 (26,32%) merries cyclisch, 2/19 (10,53%) in de transitionele fase en 12/19 (26,32%) in anoestrus Figuur 18 uit Murphy et al., (2013): Status op 10 februari In groep 1 waren 14/16 merries cyclisch (87,5%), 2/16 (12,5%) merries bevonden zich in de transitionele fase en geen merrie was in anoestrus. In groep 2 waren 20/25 merries cyclisch (80%), 2/25 (8%) in de transitionele fase en 3/25 (12%) was in anoestrus. In groep 3 waren slechts 4/19 merries cyclisch (21,05%), 2/19 (10,53%) waren in de transitionele fase en nog 13/19 (68,42%) merries waren in anoestrus. De studie van Murphy et al. (2013) heeft aangetoond dat een 50 lux sterke blauwe lichtbron ter hoogte van één oog even effectief is als bovenhangend artificieel licht. Reeds in januari is er een duidelijke toename van de cyclische activiteit herkenbaar (zie figuur 19 en 20) Figuur 19 uit Murphy et al., (2013) toont hoe veel merries op 20 januari geovuleerd hebben. De cyclische activiteit is in groep 1 en 2 duidelijk hoger in vergelijking met groep 3. Figuur 20 uit Murphy et al., (2013) toont hoe veel merries op het einde van de proef geovuleerd hebben. 23

24 4.2 Farmaceutische manipulatie van cycliciteit bij anovulatoire merries Ondanks de enorme wetenschappelijke vooruitgang blijft de voortplanting van de merrie voor een groot gedeelte gebonden aan seizoenen. Wij zijn tot nu toe niet in staat om ovariële activiteit op te starten waardoor het tijdstip van de eerste ovulatie, vooral in de transitieperiode, een onvoorspelbare gebeurtenis blijft. Er zijn wel farmaceutische producten gekend die de ovariële activiteit van de dieren beïnvloeden, maar zelfs met de huidige kennis zijn deze beperkt werkzaam (Malschitzky et al., 2001). Daarom wordt aan het onderzoek van werkingsmechanismen en de ontwikkeling van nieuwe producten een groot belang gehecht. Farmaceutische manipulatie van de cyclus wordt niet enkel bij transitionele merries ingezet, er bestaat ook een brede markt voor cyclische merries. Dit is onder andere gelinkt aan de handel met zowel gekoeld als diepvries sperma. Het is van groot belang dat merries op een voorspelbaar tijdstip ovuleren zodat sperma effectief gebruikt kan worden. Dit resulteert uit het feit dat sperma slechts enkele uren fertiel blijft, afhankelijk van de manier van bewaring. Het tijdvenster van gekoeld sperma bedraagt uren, het tijdvenster van diepvries sperma daarentegen slechts 12 uren (Green et al., 2007) FSH Doel: Inductie multipele ovulaties: geschikt voor embryotransplantatie Anoestrus/ transitionele fase Aangeraden dosis: Om multipele ovulaties te induceren wordt aangeraden om twee keer per dag een dosis van 12 mg efsh intramusculair te injecteren. De behandeling wordt best 3-5 dagen aangehouden (Steven et al., 2011). Indien follikels 25 mm zijn wordt aangeraden om twee keer per dag een dosis van 12,5 mg efsh intramusculair te injecteren. Indien follikels een grootte van 35 mm hebben bereikt wordt de behandeling met een eenmalige intraveneuze hcg injectie gestopt (Steven et al., 2011). In de studie van Meyers-Brown et al. (2017) werd er de gecombineerde gebruik van equine FSH samen met een LH-behandeling in de niet cyclische merrie beschreven. Hiervoor werden merries in 3 groepen onderverdeeld met elk een verschillende behandeling. Het behandelingseffect werd transrectaal via een echografie opgevolgd. Groep A kreeg 2 keer per dag een dosis van 0.65 mg refsh in 1.3 ml fosfaat gebufferde saline-oplossing (PBE) toegediend tot dat de follikels een grootte van 35mm hadden bereikt. Hierna werd de behandeling gedurende 36 uren stopgezet. Na 36 uren werd er 2500 IU hcg geïnjecteerd. Aan groep B werd eveneens twee keer per dag 0.65 mg refsh in 1.3 ml PBS toegediend. Wanneer de follikels een grootte van 29 mm hadden bereikt werd de behandeling met refsh gereduceerd tot één keer per dag. Bijkomend werd 1.5 mg relh in 2 ml PBS toegediend. Men bleef dergelijke merries opvolgen en indien transrectaal een folliculaire grootte van 32 mm meetbaar was werd de behandeling met refsh stopgezet en de behandeling met relh naar 3 keer per dag verhoogd. Groep C was een controlegroep en heeft naast de artificiële fotoperiode geen verdere behandeling ondergaan (16 uren licht, beginnend vanaf 1 december). Groep A en B werden aan natuurlijke lichtomstandigheden blootgesteld. 24

25 Alle merries werden transrectaal opgevolgd tot aan de dag van hun eerste ovulatie. Aansluitend werden alle merries met hetzelfde type en hoeveelheid sperma geïnsemineerd. Een dracht werd op 14 en 24 dagen postovulatoir middels echografie vastgesteld. Een detecteerbare hartslag op dag 24 werd als drachtig geclassificeerd. Volgende parameters uit tabel 1 werden genoteerd: Tabel 1 uit Meyers-Brown et al., (2017) geeft de folliculaire ontwikkeling en het aantal ovulaties weer na behandeling met refsh of refsh+relh en in de controlegroep. Uit de gegevens is te herkennen dat groep C duidelijk meer tijd nodig had om een folliculaire grootte van 35 mm te bereiken in vergelijking met groep A en B. Tussen groep A en B blijkt er geen verschil te zijn. Ook het aantal ovulaties en het aantal follikels komt overeen tussen groep A en B maar is beduidend hoger in vergelijking met controlegroep C. Opvallend was dat het aantal anovulatoire follikels in de controlegroep beduidend lager was dan in groep A en B. Eveneens was het drachtpercentage beduidend lager in groep A en B. Figuur 21 uit Meyers-Brown et al., (2017) toont de FSH- en LH-concentratie na de behandeling met refsh of refsh+relh en in de controlegroep. Om dergelijke waarnemingen te kunnen verklaren controleerde het team van Meyers-Brown et al. (2017) de hormonale concentratie van FSH en LH in het bloed (zie figuur 21). De FSH-concentratie in groep A en B was beduidend hoger in vergelijking met de controlegroep. De LH-concentratie was laag in groep A en was duidelijk gestegen in groep B op dag 4-9 van de behandeling. De LH-concentratie bij de controlegroep was voor de eerste keer gestegen op dag 2-7 en is voor een tweede keer gestegen op dag (zie figuur 21). Reeds meerdere auteurs konden een 25

26 LH-suppressie waarnemen na herhaalde behandeling met refsh (Jennings et al., 2009; Meyers-Brown et al., 2010). De LHsuppressie is vermoedelijk gelinkt aan de hoge oestrogeen-concentratie in groep A en B. Estrogeen concentraties in groep A en B zijn hoger omdat de folliculaire groei in dergelijke groepen door de refsh behandeling gestimuleerd werd (zie figuur 22). Oestrogeen, geproduceerd door ovariële follikels, onderdrukt de preovulatoire stijging van LH en verklaart het verhoogde aantal anovulatoire follikels in groep A en B (Ginther et al., 2007). Figuur 22 uit Meyers-Brown et al., (2017) toont de inhibine- en de oestradiol-concentratie na de behandeling met refsh of refsh+relh en in de controlegroep. De inhibine-concentratie in groep A en B is evenredig gestegen, net zoals de oestradiol concentratie (zie figuur 22). Inhibine- alsook oestrogeenplasmaspiegels zijn laag in controlegroep C. De stijging van inhibine en oestradiol is gelinkt aan de gestimuleerde folliculaire groei en is onafhankelijk van de gekozen behandeling met refsh en/of LH (Meyers- Brown et al., 2017). In groep B was het progesteronlevel duidelijk verhoogd en dit is gelinkt aan de LH-behandeling (zie figuur 23). LH onderhoudt het corpus luteum waardoor hogere gehaltes aan progesteron geproduceerd werden. Figuur 23 uit Meyers-Brown et al., (2017) toont de progesteronconcentratie na de behandeling met refsh of refsh+relh en in de controlegroep. Uit deze studie bleek dat merries, behandeld met refsh, na behandelingsstop sneller terugkeren naar een diepe anoestrus vergeleken met merries behandeld met refsh en LH Equine pituitary extract Equine pituitary extract (EPE) bevat hoge concentraties aan efsh en equine LH en is hierdoor in staat om multiple ovulaties te induceren. EPE is echter commercieel niet beschikbaar en kan omwille van deze redenen niet worden gebruikt (Lapin en Ginther, 1977). 26

27 4.2.3 Human chorionic gonadotropin Doel: Inductie ovulatie Anoestrus (in late transitie) Aangeraden dosis: IU (IM of IV) IU (IM of IV) Figuur 24 uit Steven et al., (2011) toont het behandelings-ovulatie interval in 214 cyclische merries na hcg injectie ( units). Op moment van de behandeling hadden de merries een folliculaire grootte van 35 mm. hcg is het meest gebruikte product om de ovulatie bij de merrie te induceren (Newcombe en Cuervo-Arango, 2017). hcg heeft bij paarden dezelfde werking als LH. Toediening van hcg heeft een directe werking op het ovarium en leidt binnen 48 uren tot ovulatie (zie figuur 24) (Steven et al., 2011). Naast hcg kan GnRH gebruikt worden om een ovulatie te induceren. GnRH werkt in op de hypofyse met vrijstelling van LH-pulsen tot gevolg. Hart et al. (1984) heeft vastgesteld dat de LHsecretie in het begin van het jaar lager is waardoor minder goede behandelingsresultaten met GnRH worden bekomen. Aangezien zijn directe en efficiëntere werking wordt daarom in begin van het jaar een behandeling met hcg verkozen. Later in het jaar, indien de merrie reeds cyclisch is, blijkt er geen verschil in efficiëntie tussen de twee producten te zijn (Mc Cue et al., 2007). Voor een effectieve hcg behandeling kunnen injecties meerdere keren per dag worden herhaald. Maar de studie van Serres et al. heeft aangetoond dat de kans op ovulatie na de derde injectie duidelijk afneemt. De kans op succes in deze studie was 2.1%, 13.3% en 33.3% na de eerste, tweede en derde injectie, respectievelijk (Serres et al., 2010). Green et al. (2007) heeft de kans op ovulatie na hcg administratie gemeten aan de hand van uteroovariële parameters. De meerderheid van de 353 behandelde merries ovuleerde binnen uren na de hcg behandeling (0 24 h, 13%; h, 60%; h, 13%; h, 6%; >96 h, 8%). Een succesvolle ovulatie wordt vooral gezien indien de folliculaire grootte op het tijdstip van de behandeling tussen 35 en 39 mm bedroeg (kans op ovulatie bij een folliculaire grootte van 34mm was 3.1%; bij 35 39mm 57.5%; bij mm 27.5%; bij mm 8.4%; bij mm 2.4% en bij 55 mm 1.1%). Bij de overgrote meerderheid van de merries was er 24 uren na hcg behandeling een daling in oedeem en een verlies in cervixtonus meetbaar (toename in oedeem: 17,0%; daling in oedeem: 44,7%; geen veranderingen in oedeem: 38,3%. Een gelijkblijvende tonus was bij 22,5% van de merries palpeerbaar, een lichte daling bij 63,3% en duidelijk verlies bij 14,2%). Om het aantal ovulaties te verhogen kan men preovulatoire follikels kleiner dan 30mm best met een combinatie van FSH en hcg behandelen (Green et al., 2007). Door het gecombineerde gebruik van FSH samen met hcg bij een folliculaire grootte van 28mm heeft men een even grote kans op ovulatie in vergelijking met hcg behandeling bij een folliculaire grootte van 35 mm (Squires, 2008). 27

28 4.2.4 Dopamine antagonist Domperidone Doel: Anoestrus Aangeraden dosis: 1,1 mg/kg/dag oraal toedienen Figuur 25 uit Brendemuehl en D. L. Cross (2000) geeft het aantal en de folliculaire grootte van met domperidone behandelde (zwarte punt) en onbehandelde (witte punt) merries weer. Figuur 26 uit Brendemuehl en Cross (2000) toont het prolactin-gehalte in onbehandelde (witte punt) en domperidone-behandelde merries (zwarte punt). Domperidone is een specifieke dopamine D2 receptor antagonist. De studie van Brendemuehl en Cross (2000) toonde aan dat een behandeling met domperidone een stimulerende werking heeft (figuur 25). Niet alleen de folliculaire groei (27,2 mm vs. 15,1 mm) werd gestimuleerd, ook de ovulatie vond vroeger plaats in vergelijking met niet-behandelde merries (51 dagen vs. 129 dagen). Zes van de acht met domperidone behandelde merries vertoonden na hun eerste ovulatie een normale cycliciteit, slechts twee merries hadden een uitgestelde tweede ovulatie. Domperidone kan de bloedhersenbarrière niet passeren en heeft vermoedelijk een indirecte werking op het ovarium, maar het exacte mechanisme is nog niet gekend. Concentraties van dopamine zijn hoger tijdens de fase van anoestrus en zijn omgekeerd evenredig met de gehaltes van LH (Brendemuehl en Cross 2000). Reeds enkele uren na domperidone toediening kunnen verhoogde prolactine plasmaconcentraties worden gemeten (figuur 26). Nequine et al. (1993) heeft bewezen dat een enkelvoudige prolactineinjectie in december een stimulerende werking op de folliculaire groei heeft. Echter was men tot enkele jaren geleden niet in staat prolactinereceptoren op het ovarium van de merrie aan te tonen. Maar in 2014 kon een studie van Oberhaus et al. de aanwezigheid van prolactinereceptoren op het ovarium immunohistologisch belegen. Dit feit steunt de hypothese dat domperidone tot een verhoogde prolactineconcentratie leidt en prolactine na binding op het ovarium een stimulerende werking op de follikels heeft. Langdurige toediening van domperidone verhoogt de LH en oestrogeengehaltes. Deze stijging was 28 dagen na start van de domperidone behandeling (1,1 mg/kg) meetbaar (LH: 7,9 ng/ml vs. 2,3 ng/ml; Oestrogeen: 1,5 ng/ml vs. 0,5 ng/ml). Er kon geen meetbare stijging van FSH worden vastgesteld (Brendemuehl en Cross, 2000). 28

29 Sulpiride Doel: Anoestrus Aangeraden dosis: mg/454 kg Sulpiride is een dopamine antagonist en is in tegenstelling tot domperidone wel in staat om de bloedhersenbarrière te passeren. Hierdoor wordt er niet alleen op het ovarium, maar ook op de hypothalamus en de hypofyse een werking uitgeoefend. Centrale dopamine D2 receptoren worden geblokkeerd waardoor de inhibitorische werking op GnRH wegvalt. De FSH- en LH-secretie wordt gestimuleerd waardoor de eerste ovulatie gemiddeld 33 dagen vroeger wordt gezien in vergelijking met een controlegroep (Brendemuehl en Cross 2000). In 1997 maakten Daels et al. duidelijk dat het behandelingseffect van dopamine antagonisten afhankelijk is van de anoestrus-diepte alsook bijkomende externe factoren. Zij konden geen verkort behandeling-tot-ovulatie interval meten bij merries in diepe anoestrus. Merries zonder folliculaire activiteit kregen twee keer per dag 200 mg sulpiride toegediend. De behandeling werd gestart op 5 februari en eindigde op de dag van de eerste ovulatie of na maximaal 58 behandelingsdagen. De merries werden onder natuurlijke lichtomstandigheden gehouden. Toen deze groep nadien met een onbehandelde groep werd vergeleken, was er geen verschil in behandeling-tot-ovulatie interval meetbaar. Daarentegen was er wel een verschil meetbaar toen de merries naast de sulpiride behandeling aan een verlengde fotoperiode en hogere buitentemperatuur blootgesteld waren. Groep 2 was onderworpen aan een lichtschema van 16 uren licht en 8 uren duisternis. Deze groep ovuleerde na gemiddeld /- 1.9 dagen. Merries onder gelijkaardige omstandigheden maar zonder sulpiride behandeling ovuleerden na 73 +/- 10 dagen. Uiteindelijk kan een stimulerende effect door sulpiride enkel worden bekomen indien de behandeling gecombineerd wordt met een artificieel photoperiode schema en een hogere buitentemperatuur (Daels et al., 2000). Een andere studie van Panzani et al. bevestigde de stimulerende werking van sulpiride. Echter hoeven de follikels bij begin van de behandeling een folliculaire grootte van 15 mm te hebben. In deze studie werd de eerste groep merries behandeld met 1 mg sulpiride/kg/dag. Aansluitend werden de resultaten vergeleken met een controlegroep. De behandelde dieren ovuleerden gemiddeld 25 dagen vroeger in vergelijking met de onbehandelde groep (18 vs. 43 dagen). Bovendien lijkt een sulpiride behandeling geen effect te hebben op het drachtpercentage. Na inseminatie was het drachtpercentage tussen de behandelde en de controlegroep gelijk (Panzani et al., 2011) Oestrogeen Doel: Synchronisatie van ovulatie Aangeraden dosis: 10 mg/dag gedurende 10 dagen (IM) In 2006 toonde de proef van Kelly et al. de betere werking van oestrogeen vergeleken met dopamine antagonisten aan. Hiervoor werd gebruik gemaakt van een groep transitionele merries die gedurende 10 dagen een dagelijkse intramusculaire dosis van 11 mg oestradiol werd toegediend. Vanaf dag 11 tot aan de eerste dag van de ovulatie werd de behandeling gevolgd door een dagelijkse subcutane injectie van 250 mg sulpiride. Om het effect op de prolactine plasmaconcentratie na te gaan werden de bloedwaardes dagelijks gecontroleerd. Uit dit onderzoek bleek dat het prolactinegehalte tijdens de oestradiol-behandeling duidelijk hoger was vergeleken met de periode van sulpiride behandeling (Kelley et al., 2006). 29

30 Van oestradiol wordt ook gebruikt gemaakt tijdens de transitionele fase om de ovulatie van verschillende merries te synchroniseren. In combinatie met progesteron is het inhiberende effect op de folliculaire grootte bijzonder uitgesproken. In tegenstelling tot progesteron is estradiol een sterke inhibitor van de FSH-secretie. Men maakt gebruik van 10 mg oestradiol-17ß dat intramusculair gedurende 10 dagen wordt geïnjecteerd. Vele fokkers dienen op de laatste dag van de behandeling bijkomend 10 mg PGF toe (zie figuur 27). Dit wordt gedaan om een mogelijk gevormd corpus luteum af te breken indien de merries toch vroegtijdig geovuleerd zouden hebben. Na 3-4 dagen komen de merries terug in oestrus, de eerste ovulatie wordt meestal na 7-10 dagen gezien (Steven et al., 2011). Figuur 27 uit Steven et al. (2011) geeft een mogelijke behandelingsoptie beginnend op 1 december weer. Een tien dagen lange behandeling met progesteron/oestradiol start eind januari ( ) Op dag 10 van de steroïdale behandeling wordt PGF2α toegediend om een mogelijk gevormd CL af te breken. Vanaf 15 februari begint men de merries via transrectale echografie op te volgen. Van zodra oedeem aanwezig en een 35 mm grote follikel detecteerbaar is injecteert men een ovulatie-inducerend geneesmiddel. Gewoonlijk maakt men hier gebruik van hcg of deslorelin. Midden februari, 3 weken na de steroïdale behandeling, mag de eerste ovulatie worden verwacht Progesteron Doel: Anoestrus Oestrus suppressie Oestrus synchronisatie Drachtonderhoud Aangeraden dosis: Progesteron in olie: 150 mg/dag IM gedurende dagen Altrenogest (Regumate): mg/kg/dag oraal gedurende dagen Progesteron in olie: 150 mg/dag IM Altrenogest: mg/kg/dag oraal Progesteron in olie: 150 mg/dag IM gedurende 10 dagen Altrenogest: mg/kg/dag oraal gedurende dagen Progesteron in olie: mg/dag IM Altrenogest: mg/kg/dag oraal Binnen deze groep moet een verschil worden gemaakt tussen natuurlijk progesteron en synthetisch progestatieve stoffen zoals altrenogest. De manier van toediening is divers. Naast orale preparaten zijn er ook injecteerbare preparaten beschikbaar. De injectie kan dagelijks of éénmalig met slowrelease formulatie gebeuren. Echter tonen experimenten aan dat altrenogest bij merries in de vroege transitionele fase (follikel < 20 mm) minder werkzaam is vergeleken met progesteron (Steven et al., 2011). Andere auteurs beweren dat exogeen toegediend progesteron tijdens de transitionele fase geen effect heeft op de folliculaire groei en ook niet op het tijdstip van de eerste ovulatie (Lynn en Irvine, 1991). Eén van de voornaamste gebruiksdoelen van progestatieve stoffen is het uitstellen van de oestrus bij de merrie. Door toediening van altrenogest kan de oestrus tot 15,8 dagen worden uitgesteld. Vooral 30

31 MP500 preparaten lijken hier de beste werking te hebben (Storera et al., 2009). Na een progesteronbehandeling is het oestrus-interval variabel, maar bedraagt gemiddeld 4-7 dagen. De eerste ovulatie wordt na 7-12 dagen gezien (Steven et al., 2011). Een artificieel lichtschema in combinatie met exogeen progesteron dat dagen wordt toegediend wordt in de literatuur programming genoemd (Squires, 2008). Indien er na opstarten van de lichttherapie ovariële activiteit wordt gezien kan er progesteron toegediend worden om de cyclus van verschillende merries te synchroniseren. Slechts bij een follikelgrootte > 25 mm kan er gebruik gemaakt worden van progesteron, dergelijk diameter wordt pas op het einde van de transitieperiode bereikt. De literatuur wijst erop dat het gecombineerde gebruik met oestradiol effectiever is in vergelijking met progesteron alleen (Steven et al., 2011) GnRH/GnRH-agonisten Doel: Inductie ovulatie Aangeraden dosis: 500 µg twee keer per dag of 250 µg vier keer per dag Om het effect van GnRH tijdens de transitionele periode bij de merrie te evalueren heeft het team van McCue et al. (1991) een studie met 37 merries in anoestrus opgesteld. De paarden werden in 3 verschillende groepen onderverdeeld. Groep 1 kreeg 10 mg natief GnRH, groep 2 kreeg 10 mg van een GnRH-agonist en groep 3 werd niet behandeld. De medicatie werd elk uur toegediend beginnend op 13 januari, 13 februari en 14 maart. Uit groep 1 bleek dat een behandeling met GnRH hetzelfde behandelingseffect had onafhankelijk van de maand van toediening (aantal ovulaties in januari (4/5), februari (4/5) en maart (3/4)). Merries behandeld met GnRH-agonisten ovuleerden vooral in de maanden februari en maart (aantal ovulaties in februari (4/5), maart (4/4) en januari (2/8)). In deze groep was het aantal ovulaties na GnRH-agonisten behandeling in januari duidelijk lager (McCue et al., 1991). Het GnRH behandelingseffect is niet afhankelijk van het seizoen, echter lijken GnRH-agonisten dit wel te zijn. Het ovulatie interval is afhankelijk van de folliculaire grootte op moment van het begin van de behandeling. Zelfs een ovulatie-stimulerende behandeling met hcg of een GnRH-agonist (Ovuplant ) had geen meerwaarde (Morehead et al., 2001). Van zodra merries in januari of februari ovuleerden en men de GnRH-behandeling stopte na ovulatie keerden de dieren terug naar anoestrus. Omwille van dit feit is de behandeling van transitionele merries middels GnRH minder aangewezen (Morehead et al., 2001) Buserelin Om de cyclische activiteit van de merrie tijdens de transitionele fase te induceren kan buserelin (10 μg subcutaan, 2x per dag) in combinatie met hcg (2500 units IV, 1x per dag) worden gebruikt. HCG wordt geïnjecteerd van zodra de follikels een grootte van 35 mm hebben bereikt. Na 10.6 ± 2.2 dagen induceert een dergelijke behandeling bij 72% van de behandelde merries een ovulatie. Om de ovulatie bij een reeds cyclische merrie te induceren kan buserelin ook zonder een ander combinatiepreparaat worden gebruikt. De meeste merries ovuleren 48 uren na gebruik. De studie van Newcombe en Cuervo (2017) heeft aangetoond dat het effect van buserelin gelijkblijvend is ongeacht de gebruikte dosis. Bij een dosis van 1 mg ovuleerden 84,4% van de merries; bij 0.5 mg 87,9%; bij 0.25 mg 88,5% en bij mg 90%. Dit effect wort evenwel minder gezien bij transitionele merries. Bij 34,5% van de transitionele merries wordt een geregresseerde follikel opgemerkt. Bovendien 31

32 vertoonden transitionele merries een verlengd preovulatoir interval (36,8% vertonen een preovulatoir interval van > 48 uren; vergeleken met cyclische merries zijn het hier 8,9%) (Newcombe en Cuervo- Arango, 2017) Deslorelin Figuur 28 uit Steven et al., (2011). Het implantaat bevat Ovuplant en wordt onder vorm van een spuit voor subcutane injectie in de handel aangeboden. De plaats van injectie (dorsale vulvalip) dient vooraf met 1 ml lokaal anestheticum verdoofd te worden. Oorspronkelijk was deslorelin te verkrijgen als een klein implantaat (Ovuplant ) dat net onder de huid werd ingebracht (zie figuur 28). Gemiddeld uren na implantatie van dit preparaat werd een ovulatie geïnduceerd. Het hieraan verbonden nadeel was dat de GnRH-release tot na de ovulatie bleef doorgaan met een desensibilisatie van de hypofyse tot gevolg. Bij een klein percentage merries werd een gelijkaardige desensibilisatie en een gedaalde FSH-vrijstelling opgemerkt. Het gevolg hiervan was een langer interovulatoir interval. Om dit nadeel te voorkomen werden er verschillende slow-release formules ontwikkeld. Maar tot op heden is er geen studie beschikbaar die de LH-release na deslorelinbehandeling heeft achterhaald. Om het effect van deslorelin tijdens de transitionele periode te evalueren heeft het team van Gomes Garbelini et al. (2014) een studie opgesteld. Het doel was om de eerste ovulatie vlotter te laten verlopen en het behandelingseffect van het voor- en het najaar te vergelijken. Om het mogelijke verschil te achterhalen maakten zij gebruik van 200 paarden die in 4 aparte groepen werden onderverdeeld. Groep 1 was een controlegroep. Aan groep 2 werd er 1,5 mg deslorelin intramusculair toegediend en groep 3 kreeg een intraveneuze behandeling met 1,667 IU hcg. Bij groep 4 werd er een gecombineerde behandeling bestaande uit 1,5 mg intramusculair deslorelin en 1,667 IU intraveneus hcg toegepast. Uit deze studie bleek dat het tijdsinterval tussen behandeling en ovulatie gelijk was tussen de groepen, behalve de controlegroep. Deslorelin en hcg zijn geschikt om een ovulatie bij de merrie te induceren maar een combinatie van dergelijke producten biedt geen meerwaarde. Uiteindelijk bleek er ook geen verschil in effectiviteit te zijn tussen het voor- en het najaar (Garbelini et al., 2014). De studie van Mc-Cue et. al (2007) heeft de effecten van hcg en deslorelin op de reeds cyclische merrie vergeleken. Hiervoor maakten zij gebruik van 203 merries en volgden zij deze via transrectaal echografie gedurende één volledig voortplantingsseizoen op. Merries moesten aan bepaalde voorwaarden voldoen om aan deze studie te mogen deelnemen. De merries moesten reeds cyclisch zijn, oedeem vertonen en hun folliculaire grootte moest tussen 35 en 45 mm zijn. De merries werden in drie verschillende groepen verdeeld. Aan groep 1 werd hcg intraveneus aan een dosis van 2500 IU toegediend. Groep 2 werd intramusculair behandeld met deslorelin aan een concentratie van 1,5 32

33 mg/ml. Groep 3 was een controlegroep. Uiteindelijk werd duidelijk dat de tijd tussen behandeling en ovulatie hetzelfde is tussen groep 1 en 2. Indien merries reeds cyclisch zijn, oedeem vertonen en hun follikels groter dan 35 mm zijn is er geen verschil in behandelingseffect tussen deslorelin en hcg meetbaar. Bovendien merkten de onderzoekers op dat het aantal merries dat binnen 48 uur na deslorelin-behandeling ovuleerde gelijkblijvend was tussen cyclus één en vijf. Een afnemende gevoeligheid, zoals deze kan gezien worden bij herhaalde hcg-behandeling of toenemende leeftijd, kan in geval van deslorelin niet bevestigd worden. De duur van behandeling en leeftijd van de merrie lijken geen effect te hebben op de sensitiviteit (Mc Cue et al., 2007) Progestagenen Het effect van progestagenen is afhankelijk van de folliculaire activiteit op moment van toediening. Indien progestatieve stoffen tijdens de transitieperiode worden toegediend leidt dit niet onmiddellijk tot ovulatie. Gemiddeld 15 dagen na stopzetten van de behandeling kan de merrie ovuleren. Daarom worden dergelijke stoffen minder gebruikt om ovulaties te induceren maar meer om de overgang naar oestrus te synchroniseren (Daels, 2006) Recombinant equine LH (relh) Recombinant equine LH is recent op de markt gekomen. De aangeraden intraveneuze dosis is 750 μg en lijkt hetzelfde effect als een hcg-behandeling te hebben. Op dit vlak is verder studie nodig Prostaglandine Doel Verkorten van de interovulatoire periode Aangeraden dosis Dinoprost: 10 mg IM Cloprostenol (Estrumate): 250 μg IM Prostaglandine is een van de meest gebruikte producten en kan van dienst zijn voor verschillende doeleinden. Het wordt bij de cyclische merrie gebruikt. Voorbeelden zijn de inductie van oestrus, oestrus synchronisatie, behandeling van een persisterend corpus luteum, abortus-inductie en het stimuleren van uteruscontracties om de afvoer van vrije vloeistof uit de baarmoeder te verhelpen (Squires, 2008). Om effectief te zijn kan prostaglandine pas na 5-6 dagen postovulatoir worden toegediend. De tijdspanne vanaf behandeling tot aan de eerste ovulatie is afhankelijk van de folliculaire grootte op het ogenblik van PG-toediening. 33

34 4.3 Aanwezigheid van de hengst Naast de manipulatie door farmaceutische producten is de aanwezigheid van hengsten een stimulerende factor. In contrast met in het wild levende paarden worden paarden vandaag meestal van elkaar gescheiden gehouden. In vrije omstandigheden kiest de merrie niet alleen de hengst, zij bepaalt bovendien ook het moment van de dekking. Vooraf vindt er veel interactie plaats tussen de merrie en de hengst (McDonnell, 2000). Van zodra de merrie in de buurt van een hengst wordt gehouden vindt de eerste ovulatie niet alleen vroeger plaats (zie figuur 29), ook het aantal ovulaties tijdens de experimentele periode neemt duidelijk toe (zie figuur 30) (Wespi et al., 2014). In hun proef heeft een groep merries op drie geregelde momenten van de dag gedurende één uur contact met één of twee hengsten gehad. De andere groep merries had geen contact met een hengst. Vanaf 16 februari tot 30 april werd de cyclische activiteit transrectaal opgevolgd. Alhoewel er geen direct fysisch contact heeft plaatsgevonden, lijkt de aanwezigheid van de hengst een stimulerende factor te zijn. De eerste ovulatie vond vroeger plaats (in aanwezigheid van een hengst 23,6 ± 12,6 dagen; in afwezigheid van de hengst 45,0 ± 23,5 dagen) en ook het aantal ovulaties was duidelijk hoger vergeleken met de controlegroep (in aanwezigheid van de hengst 2,80 ± 0,42 ovulaties; in afwezigheid van de hengst 1,83 ± 1,03 ovulaties). Figuur 29 uit Wespi et al., (2014): Tijd tot de eerste ovulatie gemeten vanaf de eerste dag van het experiment. Merries hebben al dan niet contact met een hengst gehad. Figuur 30 uit Wespi et al., (2014): Aantal ovulaties per merrie bij af- resp. aanwezigheid van de hengst In vrije omstandigheden leven paarden in een harem-constellatie. Dit wil zeggen dat een hengst samen met een groep merries leeft. De hengst houdt de kudde bij elkaar en beschermt deze tegen het binnendringen van andere hengsten. Alhoewel de hengst een leidende functie heeft, bepaalt de merrie het tijdstip van de voortplanting. Onder proefomstandigheden heeft de merrie een persoonlijke voorkeur voor een bepaald type hengst. Zij zorgt voor de kwaliteit van de nakomelingen. De hengst daarentegen heeft geen voorkeur en zorgt op die manier voor de kwantiteit van de nakomelingen (McDonnell, 2000). Echter heeft de hengst een duidelijke voorkeur voor merries in oestrus vergeleken met merries in dioestrus. Niet enkel de tijd nodig om tot erectie te komen, ook de tijd tot de eerste sprong en ejaculatie is duidelijk verkort indien de merrie in oestrus is (zie figuur 31) (Jeannerat et al., 2017). 34

35 Maar niet enkel de tijdspanne verschilt naargelang de status, maar ook de kwaliteit van het sperma. Indien de merrie zich in oestrus bevindt is de beschadiging van het sperma door peroxidase duidelijk lager in vergelijking met de dioestrus (zie figuur 32). Hengsten zijn dus in staat om de status van de merrie te detecteren. Verder vonden onderzoekers uit dat de spermakwaliteit hetzelfde is als het sperma of op een dummy of op de merrie wordt afgenomen. De aanwezigheid van een merrie in oestrus speelt een cruciale rol. Echter blijkt ook de fysiologische houding van de hengst tijdens de sperma-afname een invloed te hebben. Van zodra het sperma staand wordt afgenomen is de hoeveelheid sperma duidelijk afgenomen tegenover een afname op een dummy (Meroni et al., 2012). De boven besproken aspecten hebben dus een duidelijke invloed op een succesvolle voortplanting. Figuur 31 uit Jeannerat et al., (2017) geeft weer hoe veel tijd de hengst nodig heeft om tot erectie te komen, de eerste poging doet om te springen en de nodige tijd om tot ejaculatie te komen. De drie tijdspannen worden in dioestrus en oestrus mekaar vergeleken. Figuur 32 uit Jeannerat et al., (2017) toont het verschil in zaadkwaliteit na 24 resp. 48 uren. 4.4 Andere manieren van manipulatie Andere belangrijke factoren die de ovariële activiteit beïnvloeden zijn leeftijd en voeding van de merrie. De studie van Carnevale et al. (1997) toonde aan dat de follikels van jonge merries (tussen 3 en 7 jaren) groter zijn dan deze van oudere merries (>14 jaar), vergeleken tijdens de transitieperiode. Bijkomend heeft vers gras een meetbare invloed op de snelheid van ovulatie. Merries gevoed met groen gras ovuleren sneller in vergelijking met merries gevoed met hooi. 35