UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar REGULATIE VAN SEIZOENSGEBONDEN VOORTPLANTING BIJ DE GROTE HUISDIEREN (HENGST EN RAM) MET NADRUK OP DE LANGE TERMIJN EFFECTEN VAN HET TIJDELIJK ONDERDRUKKEN VAN SPERMATOGENESE Door Emily CAPPELLE Promotoren: Prof. Dr. Peter Daels Dr. Eline Wydooghe Literatuurstudie in het kader van de Masterproef 2016 Emily Cappelle

2

3 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

4 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar REGULATIE VAN SEIZOENSGEBONDEN VOORTPLANTING BIJ DE GROTE HUISDIEREN (HENGST EN RAM) MET NADRUK OP DE LANGE TERMIJN EFFECTEN VAN HET TIJDELIJK ONDERDRUKKEN VAN SPERMATOGENESE Door Emily CAPPELLE Promotoren: Prof. Dr. Peter Daels Dr. Eline Wydooghe Literatuurstudie in het kader van de Masterproef 2016 Emily Cappelle

5 VOORWOORD Graag zou ik mijn hoofdpromotor Prof. Dr. Peter Daels willen bedanken voor de kans die hij mij bood om dit onderwerp uit te werken. Ondanks zijn drukke agenda was hij steeds bereid mij te helpen om alles tot een goed einde te kunnen brengen. Eveneens zou ik mijn copromotor Dr. Eline Wydooghe willen bedanken voor haar bijdrage en interesse in deze literatuurstudie. Grote dank ook aan mijn zus Cynthia die, ondanks de vele uren werk die ik haar soms bezorgde met het nalezen van mijn literatuurstudie, altijd paraat bleef staan om mij te helpen. Mijn ouders zou ik ook willen bedanken omdat ze, hoewel ze aangaven niet te begrijpen waarover ik schreef, steeds bereid waren hulp te bieden en mij te steunen. Als laatste zou ik mijn vrienden willen bedanken voor de vele peptalks en morele steun tijdens de soms lange dagen (en nachten) werk aan deze literatuurstudie.

6 VOORBLAD TITELBLAD VOORWOORD INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING... 1 INLEIDING... 2 LITERATUURSTUDIE SPERMATOGENESE BIJ HENGST EN RAM INWENDIGE STRUCTUUR VAN DE TESTES VAN SPERMATOGONIA TOT SPERMATOZOA FYSIOLOGIE VAN HET GESSLACHTSAPPARAAT BIJ HENGST EN RAM PARACRIENE EN AUTOCRIENE REGULATIE Testosteron Oestrogenen Inhibine ENDOCRIENE REGULATIE Gonadotropin-releasing hormone (GnRH) Luteïniserend hormoon (LH) Follikelstimulerend hormoon (FSH) SEIZOENSGEBONDEN VOORTPLANTING Seizoensgebonden verschillen Fotoperiodische controle van de voortplanting TIJDELIJKE ONDERDRUKKINGSMECHANISMEN VAN DE SPERMATOGENESE BIJ DE HENGST WAAROM GONADALE SUPPRESSIE BIJ DE HENGST? PROGESTAGENEN GNRH AGONISTEN GNRH ANTAGONISTEN VACCINATIE TEGEN GNRH KISS1 GEN ALS MOGELIJK DOELWIT VOOR EEN DNA-IMMUNOCASTRATIE VACCIN Wat is het KISS1 gen? Vaccinatie tegen KISS1 gen bij de ram KRUIDENPREPARATEN Epigallocatechine-3-gallaat BESPREKING REFERENTIELIJST... 25

7 SAMENVATTING Alsmaar meer stijgt de vraag naar het gebruik van technieken voor het tijdelijk onderdrukken van de spermatogenese bij de hengst. Via deze technieken kan immers een gonadale suppressie, met bijhorende verminderde seksuele activiteit en agressief gedrag, bekomen worden die reversibel is in tegenstelling tot bij het toepassen van chirurgische castratie. De fysiologie van de voortplanting bij de grote huisdieren (hengst en ram) kan als model gebruikt worden voor de artificiële tijdelijke onderdrukkingsmechanismen. Hengst en ram kennen namelijk van nature uit een seizoensgebonden voortplanting, beperkt tot een bepaalde periode van het jaar, met een gedaalde gonadale activiteit buiten hun voortplantingsseizoen. Deze gonadale suppressie herstelt zich volledig bij aanzet van hun volgende voortplantingsseizoen. Het gebruik van progestagenen, GnRH agonisten, GnRH antagonisten en vaccins tegen GnRH zijn reeds onderzochte technieken om op een artificiële manier een tijdelijke gonadale suppressie te bewerkstelligen bij de hengst. Vaccinatie tegen het KISS1 gen en het gebruik van het natuurlijke groene thee extract epigallocatechine-3-gallaat hebben reeds een gelijkaardige suppressieve werking bij andere dieren bewezen. Deze laatst vermelde technieken zijn tot op de dag van vandaag nog niet toegepast bij de hengst, maar zouden als mogelijk alternatief kunnen onderzocht worden voor de reeds bestaande tijdelijke gonadale onderdrukkingsmechanismen. SLEUTELWOORDEN: Gonadale suppressie - Hengst - Ram - Seizoen - Voortplanting 1

8 INLEIDING Seizoensgebonden voortplanting is een natuurlijk gebeuren waarbij de reproductieactiviteit plaatsgrijpt tijdens een bepaalde periode van het jaar. Voor veel in het wild levende dieren verzekert dit mechanisme dat hun jongen geboren worden in de lente of de zomer wanneer de omgevingsomstandigheden optimaler zijn voor de overleving van hun nakomelingen (21). Zowel de ram als de hengst kennen een dergelijke seizoensgebonden voortplanting. Bij de hengst zal het voortplantingsseizoen zich situeren in de lente, bij de ram in de herfst (7). Beide dieren baseren de duur van hun voortplantingsseizoen op waarnemingen van de fotoperiode in combinatie met de fotoperiodische geschiedenis (37). Lichtsignalen, die door de retina in het oog ontvangen worden, onderdrukken het neurogeen signaal dat de pijnappelklier aanstuurt tot de productie en secretie van het hormoon melatonine (29). Deze pijnappelklier is het orgaan bij uitstek dat, via de secretie van het melatonine, de hele hormonale cascade van de spermatogenese zal sturen door controle op de secretie van het gonadotropin-releasing hormone (GnRH) in de hypothalamus (7). Buiten het voortplantingsseizoen vindt er zowel bij de hengst als bij de ram een tijdelijke reductie in testikelgrootte, spermaproductie en reproductiegedrag plaats, alsook een dalende concentratie in de hormonen die betrokken zijn bij de spermatogenese (23, 24). Het artificieel nabootsen van de reversibele gonadale suppressie bij de hengst kan worden ingezet met als doel eventueel ongewenst seksueel en agressief gedrag te onderdrukken, zonder hierbij te moeten overgaan tot de onomkeerbare chirurgische castratie (46). De reeds onderzochte technieken met een dergelijk effect bij de hengst werken allen in op het GnRH, of de doelwitcellen van dit hormoon, om de verdere hormonale cascade voor aansturing van de spermatogenese te onderdrukken. Tot deze technieken behoren het gebruik van progestagenen, GnRH agonisten, GnRH antagonisten en vaccinatie tegen het GnRH (53). Mogelijke alternatieven voor deze reeds bestaande technieken zijn vaccinatie tegen het KISS1 gen of het gebruik van het natuurlijke groene thee extract epigallocatechine-3-gallaat. Vaccinatie tegen het KISS1 gen met het oog op gonadale suppressie werd reeds onderzocht bij de ram (78). Dit KISS1 gen, coderende voor kisspeptiden, blijkt immers mede verantwoordelijk te zijn voor het aansturen van de GnRH secretie alsook voor de aanzet van de puberteit en controle op de volwassen vruchtbaarheid (70). Onderzoeken bij de rat naar het effect van intraperitoneale injecties met epigallocatechine-3-gallaat, toonden een werkzaamheid aan van dit gallaat als onderdrukkend middel voor de gonadale activiteit (80). In deze literatuurstudie wordt na een overzicht over de werking van de spermatogenese ingegaan op de specifieke mechanismen waarmee hengst en ram het seizoen kunnen waarnemen om hierop hun voortplantingsseizoen te baseren. De artificiële toepassingsmogelijkheden voor het onderdrukken van de spermatogenese bij de hengst worden beschreven alsook hun werking en de mogelijke effecten op lange termijn. 2

9 LITERATUURSTUDIE 1 SPERMATOGENESE BIJ HENGST EN RAM 1.1 INWENDIGE STRUCTUUR VAN DE TESTES De spermatogenese bij hengst en ram is een proces dat plaatsgrijpt in de testes van deze dieren. Zoals uit figuur 1 blijkt, bestaat de inwendige structuur van de testes vnl. uit tubuli seminiferi. Dit zijn buisjes die grotendeels opgebouwd zijn uit 3 celtypes; de peritubulaire spiercellen, de Sertoli cellen en de germinale cellen (1). Fig. 1 Schematische voorstelling van de anatomie en celbiologie van zoogdiertestes (uit Schlatt en Ehmcke, 2014) De peritubulaire spiercellen omvatten de externe laag van de tubuli seminiferi en zorgen bij contractie dat het sperma door de buisjes wordt geduwd. De Sertoli cellen bevinden zich onder de peritubulaire spiercellen, waarbij hun cytoplasma reikt tot aan het lumen van de tubuli seminiferi. De Sertoli cellen omgeven de zich ontwikkelende germinale cellen en voorzien deze van de nodige voedingsstoffen en groeifactoren. De germinale cellen ontwikkelen zich van spermatogonische stamcellen, die zich aan de basaalmembraan bevinden, tot de uiteindelijke spermatozoa die in het lumen van de tubuli seminiferi terechtkomen (2). Tussen de verschillende tubuli seminiferi bevindt zich de interstitiële ruimte waarin onder andere bloedvaten, immuuncellen, fibroblasten en ook Leydig cellen voorkomen (2). De Leydig cellen staan in voor de productie van testosteron. Zoals in figuur 2 aangegeven, diffundeert dit androgeen zowel in de nabijgelegen bloedvaten alsook in de tubuli seminiferi. Testosteron draagt bij tot vier kritische processen; het onderhouden van de bloed testis barrière, het vervolledigen van de meiose die de spermatocyten doormaken, het adhereren en elongeren van de spermatiden aan de sertoli cellen en het loslaten van mature spermatozoa in het lumen van de tubuli seminiferi. Testosteron is met andere woorden noodzakelijk om het proces van de spermatogenese tot een goed einde te brengen (1). 3

10 Fig. 2 De anatomie van de testes en het proces van de spermatogenese (uit Smith en Walker, 2014) 1.2 VAN SPERMATOGONIA TOT SPERMATOZOA In figuur 2 wordt eveneens het proces van de spermatogenese geïllustreerd. Dit proces begint met een proliferatie van de spermatogonische stamcellen ter hoogte van de basaalmembraan van de tubuli seminiferi. Dit resulteert in de productie van 2 nieuwe stamcellen, enerzijds om de groep van stamcellen te onderhouden en anderzijds om ongedifferentieerde spermatogonia te vormen die voorbestemd zijn om zich verder te differentiëren tot spermatozoa (1, 3). De nog ongedifferentieerde spermatogonia ondergaan heel wat mitotische delingen, met incomplete cytokinese, waarbij ze ketens van spermatogonia vormen. Eens de ketens een lengte van 16 of 32 verbonden spermatgonia hebben bereikt, vormen ze zich om tot gedifferentieerde spermatogonia die later zullen ontwikkelen tot spermatozoa (1). De gedifferentieerde spermatogonia ondergaan een serie van delingen met finaal een mitose die resulteert in de productie van preleptotene spermatocyten. Deze preleptotene spermatocyten initiëren het proces van de meiose. Aan het einde van de meiose worden er ronde haploïde spermatiden gevormd (1, 3). Deze ondergaan een differentiatie naar uitgerekte spermatiden en uiteindelijk spermatozoa die zich losmaken en in het lumen van de tubuli seminiferi terecht komen (1). 2 FYSIOLOGIE VAN HET GESSLACHTSAPPARAAT BIJ HENGST EN RAM Om de productie van spermatozoa en testosteron op een zo efficiënt mogelijke manier te laten verlopen, maakt het lichaam gebruik van een complex communicatiesysteem tussen allerlei organen en celtypes. Hiertoe behoren de endocriene, paracriene en autocriene regulatie. De endocriene regulatie is verantwoordelijk voor het synchroniseren van de reproductie processen met fysiologische gebeurtenissen zoals de puberteit, omgevingsfactoren, seizoen en voeding. Hierbij staan de pijnappelklier, de hypothalamus en de hypofyse centraal als modulerende organen. De paracriene en autocriene regulatie grijpen plaats op lokaal niveau in de testes. Paracriene factoren worden geproduceerd door een bepaald celtype en lokken respons uit bij een ander celtype in hetzelfde orgaan. Autocriene factoren daarentegen worden geproduceerd door een bepaald celtype en hebben effect op hetzelfde celtype (4). 4

11 Fig. 3 Schematische voorstelling van de hormonale controle op de testiculaire functie (Uit Animal Physiology: From Genes to Organisms, 2012) 2.1 PARACRIENE EN AUTOCRIENE REGULATIE Testosteron Testosteron wordt geproduceerd door de Leydig cellen en draagt bij tot het onderhouden van een adequate bloed-testis barrière. Door binding op zijn receptoren lokt dit androgeen eveneens een respons uit bij de volgende cellen (5): Germinale cellen: Testosteron is essentieel voor zowel de mitose als de meïose van deze cellen (6). Sertoli cellen: De mannelijke geslachtshormonen moduleren de genexpressie, proliferatie en differentiatie van deze cellen (5). Leydig cellen: Testosteron blijkt terug te acteren op de Leydig cellen om de werking van de steroïdogenetische enzymen te reguleren. Hierbij heeft testosteron dus een autocriene functie waarbij het zijn eigen secretie in de hand heeft (5). Mannelijk fenotype: Het androgeen zorgt voor een inductie en behoudt van het mannelijk fenotype en stimuleert de seksuele organen (2). Spermatogenese: Testosteron is samen met het follikelstimulerend hormoon (FSH) verantwoordelijk voor de ontwikkeling en het onderhoud van de spermatogenese (1). De concentraties aan testosteron zijn veel hoger in de testes dan in het bloed, omdat een substantiële portie van dit hormoon vastgehouden wordt in het intralobulair vocht door complexatie met androgeen bindingsproteïnen gesecreteerd door de Sertoli cellen. Alleen deze hoge concentraties van testiculair testosteron zijn adequaat voor het behouden van de spermaproductie (6). Gonadotropin releasing hormone (GnRH): Het androgeen heeft een inhiberend effect op de productie en secretie van GnRH in de hypothalamus (Fig. 3). Dit zorgt op zijn beurt voor een afname in de vrijstelling van het luteïniserend hormoon (LH) dat een stimulerend effect heeft op de testosteronproductie (zie verder). Door deze negatieve feedback houdt testosteron zijn eigen productie deels in de hand (2, 7). Testosteron acteert ook terug op het anterieure deel van de hypofyse om de responsiviteit van de LH secreterende cellen op het GnRH te verminderen (6). 5

12 2.1.2 Oestrogenen Oestrogenen maken een belangrijk deel uit van de paracriene-autocriene as. Dit hormoon ontwikkelt zich vanuit de enzymatische conversie van androgenen tot oestrogenen, gereguleerd door het aromatase enzyme (5). Oestrogenen spelen een rol in de vroege ontwikkeling van de spermatogenese en zullen deze ook beïnvloeden (8). Verschillende onderzoeken bewijzen de bovenvermelde stelling. Zo toonden Siphatur et al. (2003) aan dat de aromatase expressie bij de hengst afhankelijk is van de leeftijd. De Leydig en Sertoli cellen zijn namelijk positief aan aromatase voor en tijdens de puberteit. Bij de volwassen hengst vertonen de Sertoli cellen in mindere mate een aromatase activiteit, in tegenstelling tot bij de Leydig cellen waar deze gelijkaardige blijft (9). Dit zorgt ervoor dat er veranderingen plaatsvinden in de intra-testiculaire concentraties van oestradiol en oestrogeen conjugaten (nl. verhoging tijdens de testiculaire rijping), terwijl er geen leeftijdsafhankelijk effect te zien is in de testosteronconcentraties (10). Het feit dat verschillende celtypes in de testis, inclusief de germinale cellen, kern oestrogeenreceptoren tot expressie brengen bewijst eveneens dat oestrogenen een rol spelen in de spermatogenese (11). Hoewel er twee verschillende oestrogeen receptoren geïdentificeerd zijn, een oestrogeen receptor alfa (ERα) en een oestrogeen receptor bèta (ERβ), blijft een gedeelte van hun werkingsmechanisme onduidelijk (5). Uit een onderzoek van O Donnell et al. (2001) blijkt dat zowel ERα en ERβ voorkomen in de Leydig cellen terwijl in de Sertoli cellen en de zich ontwikkelde kiemcellen enkel ERβ werd gevonden (12). De oestrogeen afhankelijke ERα signalering is onder andere vereist tijdens de neonatale periode om een normale volwassen spermatogenese en vruchtbaarheid te verzekeren. Oestrogenen reguleren ook de vochtabsorbtie ter hoogte van de epididymis en concentreren op die manier het sperma (13). Lubahn et al. (1993) voerden een experiment uit met mannelijke muizen knock-out voor het gen van de oestrogeen receptor en toonden hiermee nog eens aan dat oestrogenen nodig zijn voor de functionele rijping van de spermatozoa en de vruchtbaarheid. De muizen waar de oestrogeen receptor niet tot expressie werd gebracht vertoonden immers een slechte vruchtbaarheid (14). Buiten dit alles nemen de oestrogenen, net zoals de androgenen, deel aan de negatieve feedbackmechanismen op de LH secretie buiten het voortplantingsseizoen (15). Bijkomende onderzoeken zijn noodzakelijk om de exacte rol van oestrogenen in het voortplantingsproces bij adulte dieren te bepalen, alsook het werkingsmechanisme van dit hormoon dient nog verder opgehelderd te worden (8). 6

13 2.1.3 Inhibine Voorlopig ontbreekt het nog aan concrete informatie over de specifieke functie van inhibine bij de hengst en ram. Uit verschillende onderzoeken bij de rat blijkt dat de productie van dit glycoproteïne zich hoofdzakelijk lokaliseert ter hoogte van de Sertoli cellen. De reeds aangetoonde subunits van dit inhibine in de Leydig en de germinale cellen wijzen erop dat dit hormoon mogelijks ook in deze cellen wordt geproduceerd (5). Inhibine heeft een onderdrukkende werking op de secretie van het follikelstimulerend hormoon (FSH) in de hypofyse (2, 7). FSH is een hormoon dat de Sertoli cellen aanspoort tot het vormen van spermatozoa (5). De hersenen meten de plasma inhibine concentraties en gebruiken deze als informatie voor de maximale potentiële spermaproductie. Wanneer er een hoge concentratie aan inhibine gemeten wordt, zal dit zorgen voor een inhibitie van de FSH secretie (2). 2.2 ENDOCRIENE REGULATIE De lokale processen en feedback mechanismen vanuit de testes staan zelf onder controle van een meer omvattend mechanisme: de endocriene regulatie. De belangrijkste hormonen hierbij betrokken zijn het gonadotropin-releasing hormone (GnRH), het follikelstimulerend hormoon (FSH) en het luteïniserend hormoon (LH). GnRH wordt geproduceerd in de hypothalamus, LH en FSH in de hypofyse (Fig. 3). De endocriene regulatie werkt dus over de hypothalamo-hypofysaire-testes as (HPT-as) (5) Gonadotropin-releasing hormone (GnRH) De hypothalamus secreteert op een pulsatieve wijze GnRH en stimuleert op die manier de episodische productie en secretie van FSH en LH vanuit de hypofyse (4). Dit FSH en LH vormen de overgang tussen de endocriene en de paracriene regulatie en zijn nodig om een dissociatie te kunnen maken tussen het aansturen van de spermatogense of de steroïdogenese ter hoogte van de testes (2, 5). GnRH is een decapeptide dat geproduceerd wordt in de GnRH neuronen van de hypothalamus (16, 17). Excitatie van deze hypothalamische neuronen leidt tot het vrijkomen van de GnRH peptiden uit hun secretorische granulen (18). Na deze secretie kent GnRH een transport door de axonen van de GnRH neuronen naar de terminale uiteinden, welke synapsen vormen met de bloedvaten van de primaire capillaire plexus in de eminentia mediana van de hypofyse (17). De peptiden diffunderen er in het capillaire bloed en gaan vervolgens via het hypofysaire portaal systeem naar de sinusoïde capillaire plexus in de adenohypofyse. Daar verlaat een gedeelte van het GnRH de capillairen om er te binden op de GnRH receptoren van zijn target cellen, de gonadotrope cellen (18). Stimulatie van de gonadotrope cellen resulteert in de synthese en secretie van de gonadotropinen: LH en FSH (16). 7

14 De activiteit van de GnRH neuronen is niet continu, maar kent een episodisch verloop (19). Als gevolg hiervan wordt GnRH pulserend gesecreteerd in het vaatstelsel en hebben de gonadotropinen de neiging om hetzelfde episodische patroon te volgen. De episodische aard van de endogene GnRH secretie is vereist voor een aanhoudende, consequente gonadotrope functie (20) Luteïniserend hormoon (LH) Het gesecreteerde LH bindt op zijn receptoren ter hoogte van de testiculaire Leydig cellen om deze te stimuleren tot de productie en secretie van het androgeen testosteron. Hierdoor fluctueren de plasma testosteron concentraties in de gonaden van hengst en ram parallel met de LH pulsaties (7) Follikelstimulerend hormoon (FSH) FSH speelt een kritieke rol in het controleren van de spermatogenese. Dit hormoon oefent een invloed uit op de sertoli cellen door deze te stimuleren tot de productie van onder andere oestrogenen, inhibine en activine (8). Bovendien is FSH, net als testosteron, vereist voor het initiëren van de spermatogenese voor de pubertijd alsook voor het remodelleren van de spermatiden (5). Testosteron en FSH stimuleren ook de ontwikkeling van de germinale cellen en werken synergetisch om het aantal germinale cellen te maximaliseren (8). 2.3 SEIZOENSGEBONDEN VOORTPLANTING Bij heel wat diersoorten (zo ook bij ram en hengst) vindt de reproductie activiteit plaats tijdens een bepaalde periode van het jaar. Seizoensgebonden voortplanting is een natuurlijk proces dat veel in het wild levende dieren ervan verzekert dat hun jongen in de lente of de zomer geboren worden. Dit omdat bepaalde omgevingsfactoren, zoals de temperatuur en de aanwezigheid van voedsel, dan optimaler zijn voor overleving van de nakomelingen (21). Door timing van hun paringsgedrag verhogen heel wat diersoorten dus de kans op nageslacht en overleving van deze nakomelingen (22) Seizoensgebonden verschillen Hengst en ram kennen beiden een seizoensgebonden voortplanting. Aangezien de merrie een lange dracht kent ( dagen), situeert haar voortplantingsseizoen zich tijdens het voorjaar. Dit om te verzekeren dat de partus plaatsgrijpt tijdens de lente of de zomer, wanneer de omstandigheden optimaler zijn voor overleving van het veulen. Het voortplantingsseizoen van de hengst is hieraan aangepast waardoor hij zijn grootste gonadale activiteit kent tijdens de lente en de zomer, dus bij toenemende daglichtlengte. De ooi heeft daarentegen een korte dracht (gemiddeld 145 dagen), waardoor het voortplantingsseizoen zich tijdens de herfst situeert. De ram kent daardoor zijn grootste gonadale activiteit bij een afnemende daglichtlengte (7). 8

15 Wanneer hengst en ram zich buiten het voortplantingsseizoen bevinden zal dit zich vertalen in een verminderde testikelgrootte, spermaproductie en reproductie gedrag alsook een dalende hormonale concentratie van testosteron, LH en FSH. Deze dieren zullen echter geen volledige stopzetting van spermaproductie kennen buiten hun voortplantingsseizoen alhoewel er wel een significante reductie zal zijn (23, 24). Zoals uit figuur 4 en 5 blijkt zullen deze seizoensgebonden verschillen groter zijn bij de ram dan bij de hengst. Fig. 4 Seizoensgebonden verschillen bij de Black Racka ram geobserveerd gedurende 1 jaar van december tot en met november (uit Sarlos et al., 2013) Fig. 5 Seizoensgebonden verschillen geobserveerd bij 8 fertiele hengsten (uit Roser, 2012) 9

16 2.3.2 Fotoperiodische controle van de voortplanting Heel wat stimuli zoals de fotoperiode, temperatuur, body condition score, voeding en leeftijd oefenen een effect uit op de reproductiecyclus (25). De fotoperiode kan hierbij als een van de belangrijkste stimuli aangegeven worden (26). Lichtsignalen worden door de retina ontvangen en hoofdzakelijk verwerkt door het fotopigment melanopsine dat zich lokaliseert in de intrinsieke fotosensitieve retinale ganglioncellen (27). Deze ganglioncellen vormen de retino-hypothalamische weg naar de suprachiasmatische nucleus (SCN) in de hypothalamus (28). Outputs van de suprachiasmatische nucleus worden via de paraventriculaire nucleus van de hypothalamus (PVN) door de intermediolaterale cellen van het bovenste ruggenmerg (IML) naar het superieure cervicale ganglion (SCG) getransporteerd dat via zijn postganglionaire zenuwvezels een neurogeen signaal stuurt naar de pinealocyten in de pijnappelklier (Fig. 6) (29). Neuronogene stimulatie van de pinealocyten in de pijnappelklier leidt tot de productie en secretie van het hormoon melatonine via activatie van het snelheidsbeperkende enzyme N-acetyltransferase (NAT) (30). Fotosignalen (licht) inhiberen het vrijkomen van de neurotransmitter norepinefrine, waardoor het neurogeen signaal niet kan worden doorgegeven en de pinealocyten niet worden aangespoord tot het secreteren van melatonine (31). Onderzoeken tonen aan dat licht met een spectrum in de korte golflengtes ( nm) het meest effectief is om de melatoninesecretie te inhiberen aangezien het melanopsine vooral gevoelig is aan de korte golflengtes, namelijk deze van blauw licht (32, 33). Fig. 6 Route van het neurogeen signaal voor stimulatie van de melatonineproductie (uit Walton et al., 2011) De pijnappelklier zorgt dus voor een omzetting van het neurogeen signaal naar een hormonaal signaal in de vorm van melatonine. Door de inhiberende werking van licht op de melatonine secretie, kent de melatonineconcentratie een circadiaan ritme en zal de productie van dit hormoon het hoogste zijn tijdens de uren van duisternis. De duur van de dagelijkse melatonine secretie is met andere woorden negatief gecorreleerd met de tijd dat het dier vrijgesteld is aan daglicht (34). De verkorting van het melatonine signaal tijdens de korte zomernachten en de uitbreiding ervan tijdens de lange winternachten geeft een endocriene voorstelling van het aantal uren licht en donker op een dag (35). 10

17 Twee keer per jaar, eens tijdens het voorjaar en eens tijdens het najaar, komt eenzelfde duur aan daglichtlengte voor (behalve deze van de zonnewenden) met als gevolg dat een eendagsbeleving van het melatoninepatroon niet voldoende is voor het dier om een onderscheid te kunnen maken tussen voor-en najaar en zijn reproductiecyclus hierop te baseren. Om dit probleem op te lossen slaan de dieren informatie op over de voorgaande fotoperiodiciteit die ze dan vergelijken met de huidige daglichtlengte (36). Het melatonine signaal in combinatie met de fotoperiodische geschiedenis geeft het dier nauwkeurige en eenduidige informatie over het seizoen (37). Het gesecreteerde melatonine regelt op zijn beurt de productie en secretie van het gonadotropin-releasing hormone (GnRH) in de hypothalamus. Bij de hengst veroorzaakt het melatonineprofiel een stijgende GnRH secretie in de lente en de zomer met een bijhorende verhoogde spermatogenese. Tijdens de herfst wordt er een daling in de GnRH secretie en spermatogese genoteerd. De ram daarentegen reageert omgekeerd op hetzelfde melatonineprofiel en kent een stijgende GnRH secretie in de herfst (5, 7). Samengevat heeft de stimulus van de fotoperiode dus een verschillend effect op de reproductie activiteit bij hengst en ram (25). Toch zijn beide mechanismen in zeker zin te vergelijken. Bij de ram worden namelijk al tekenen van de reproductieactiviteit gedetecteerd in de lente, maar wordt het nog effectief onderdrukt tot in de herfst (38). De redenen voor het verschillend effect van melatonine bij hengst en ram zijn niet specifiek onderzocht, maar kunnen een variabiliteit bevatten van de anatomische plaatsen waar melatonine op inwerkt bij de verschillende species (39). Zo is de expressie van melatonine receptoren erg species specifiek; de pars tuberalis van de hypofyse wordt beschouwd als het enige doelwitweefsel van melatonine dat alle zoogdieren gemeenschappelijk hebben (40). Bij de ram bevindt er zich een hoge concentratie aan melatonine receptoren dicht bij het mediobasale deel van de hypothalamus (41). Nonno et al. (1995) vonden daarentegen geen melatonine receptoren in de hypothalamus van het paard, maar wel in de pars distalis en de pars tuberalis van de hypofyse (42). In een studie van Stankov et al. (1991) werd dan weer een extreem lage densiteit aan melatonine receptoren in de hypothalamus gevonden bij het paard (43). Het is dus niet exact geweten of de hersenregio s die betrokken zijn bij de fotoperiodische controle van de reproductie dezelfde zijn bij hengst en ram. Verder onderzoek is hiervoor vereist (39). 3 TIJDELIJKE ONDERDRUKKINGSMECHANISMEN VAN DE SPERMATOGENESE BIJ DE HENGST Uit de voorgaande bespreking blijkt dat de tijdelijke onderdrukking van de spermatogenese bij hengst en ram een natuurlijk gebeuren is dat zich bij de aanzet van het volgend voortplantingsseizoen volledig herstelt. De fysiologie achter deze gonadale suppressie kan ons inzichten verschaffen over de mogelijkheid tot het artificiële toepassing van een tijdelijke onderdrukking van de spermatogenese, zonder hierbij schade te berokken aan de latere vruchtbaarheid van het dier. 11

18 3.1 WAAROM GONADALE SUPPRESSIE BIJ DE HENGST? De expressie van seksueel of agressief gedrag bij hengsten buiten de fokkerijomstandigheden is vaak ongewenst omdat het de goede prestaties van de hengst tijdens training of wedstrijden negatief kan beïnvloeden (44). Ook kan het de eigenaar, berijder of anderen in gevaar brengen (45). Vroeger was chirurgische castratie de klassieke benadering voor het verwijderen van de bron aan testosteron in de hoop zo dit ongewenst seksueel en agressief gedrag te onderdrukken. Dit is echter niet wenselijk wanneer het dier later als dekhengst dienst moet doen en bovendien brengt het een zeker risico (op bijvoorbeeld bloedingen) met zich mee, vooral dan bij oudere dieren. Bovendien is chirurgische castratie niet altijd even succesvol als middel om seksueel en agressief gedrag te reduceren bij paarden (46). Gonadale suppressie zou buiten dit alles ook bijdragen tot het elimineren van het Equine Virale Arteritis-virus (EVA-virus). Hengsten vormen namelijk een belangrijk reservoir voor dit virus, aangezien de mogelijkheid bestaat tot persistentie hiervan ter hoogte van hun accessorische geslachtsklieren. Tijdens de zaadlozing kan dit virus in het sperma terecht komen en zo een mogelijke besmettingsbron vormen voor de merries (47). Uit onderzoek is gebleken dat het persisteren van het EVA-virus testosteron afhankelijk is (48). Reeds verschillende studies onderzochten of langdurige behandelingen met GnRH vaccins of antagonisten, die een suppressie van de testosteronproductie veroorzaken, ook een effectieve behandeling zouden kunnen zijn voor het elimineren van het EVA-virus. Fortier et al. (2002) onderzochten het effect van een korte termijnbehandeling (35-38 dagen) met een GnRH antagonist bij 5 hengsten met het EVA-virus. Slechts 2 van de 5 onderzochte hengsten bleven negatief voor het virus na de behandeling (49). Burger et al. (2005) voerden daarentegen een immunisatie uit tegen GnRH bij adulte hengsten met het EVA-virus en vonden daarbij een positief verband tussen immunisatie en het virusvrij worden van al de behandelde hengsten (50). 3.2 PROGESTAGENEN Werking: Een niet invasief alternatief voor de chirurgische castratie is het gebruik van progestagenen (zoals altrenogest) die de LH secretie ter hoogte van de hypofyse onderdrukken en op die manier een suppressie van de testiculaire testosteron secretie veroorzaken (51). Squires et al. (1997) voerden een onderzoek uit bij 20 hengsten (tussen de 3 en de 18 jaar oud) naar de effecten van het eenmaal daags toedienen van een hoge dosis (0,088mg/kg lichaamsgewicht) altrenogest. In deze studie werden de hengsten onderverdeeld in 5 groepen van telkens 4 hengsten. Hiertoe behoorde een controle groep (Controle), een groep die gedurende 150 dagen eenmaal daags behandeld werd met de hoge dosis altrenogest (Alt-150), een andere groep die een behandeling aan dezelfde dosis onderging, maar dan gedurende 240 dagen (Alt-240) en als laatste nog een groep die 12

19 deze dosis altrenogest eveneens gedurende 240 dagen toegediend kreeg met supplementair nog elke 4 uur 80 µgram GnRH subcutane injecties van dag 151 tot dag 240 (Alt GnRH). Uit de resultaten van dit onderzoek bleek dat altrenogest de serum concentraties van LH en testosteron, de totale scrotum omtrek, de dagelijkse spermatozoa output, het percentrage van normale spermatozoa en het libido deed dalen. Een significante afname in sperma motiliteit was eveneens merkbaar in de groepen die gedurende 240 dagen behandeld werden, maar niet in de groep die de behandeling gedurende 150 dagen ondergingen. Verondersteld wordt dat de onderdrukkende effecten van altrenogest hoofdzakelijk gemedieerd worden door een negatieve feedback remming op de LH uitscheiding. Bijgevolg dalen de testosteronconcentraties wat een verminderde spermaproductie en reductie in seksueel gedrag met zich meebrengt (51). Fig. 7 Wijzigingen in de totale scrotum Fig. 8 Wijzigingen in de dagelijkse sperma omtrek van de verschillende groepen output van de verschillende groepen (uit Squires et al., 1997) (uit Squires et al., 1997) Fig. 9 Wijzigingen in serum testosteron Fig. 10 Wijzigingen in het percentage concentraties en serum LH concentraties van normale spermatozoa (uit Squires et al., 1997) (uit Squires et al., 1997) 13

20 Miller et al. (1997) behandelden hengsten ouder dan 5 jaar met 0,044mg/kg lichaamsgewicht altrenogest (de dosis die nodig is voor het onderdrukken van de oestrus bij de merrie) gedurende 30 dagen en bemerkten hierbij geen verschil tussen dagelijkse sperma output, spermatozoa morfologie en motiliteit en plasma FSH concentraties voor en na de behandeling met altrenogest. Een vermindering qua seksueel gedrag werd eveneens niet geregistreerd al kan het zijn dat er hogere dosissen nodig zijn om een respons te krijgen en verminderd seksueel gedrag te bekomen aangezien dit gedrag bij oudere hengsten meestal dieper ingeworteld is. Daartegenover stelden de onderzoekers op het einde van de behandeling wel een suppressie vast in de concentraties van LH (daling met 3,2 ng/ml), testosteron (daling met 0,79 ng/ml), oestrogeen conjugaten (daling met 118,6 ng/ml) en inhibine (daling met 1,7 ng/ml) in vergelijking met de waarden voor de behandeling (52). Een nadeel van progestagenen gebruik is de noodzaak ervan om dagelijks in hoge dosissisen toegediend te worden om het seksueel gedrag onder controle te krijgen. Best wordt er ook rekening mee gehouden dat de progestageen toediening aan hengsten in vele sporten als doping wordt beschouwd. Als laatste zijn er vaak ook bijkomende regels in landen waar paarden als voedselproducerende dieren geclassificeerd worden en is het mogelijk dat het gebruik van progestagenen bij de hengst verboden is (53). Lange termijn effecten: Het gebruik van lage dosissen altrenogest gedurende een korte periode (30 dagen) veroorzaakten na afloop geen nadelige effecten op de sperma kwaliteit en kwantiteit alsook de testosteronconcentraties herstelden zich uiteindelijk 60 dagen na stopzetting van de therapie. LH, oestrogeen conjugaten en inhibine concentraties namen 30 dagen na stopzetting van de behandeling opnieuw hun oorspronkelijke waarde aan van voor de behandeling (52). Negentig dagen na het beëindigen van een langdurige behandeling (150 of 240 dagen) met altrenogest aan hoge dosissen (0,088 mg/kg lichaamsgewicht) noteerden de onderzoekers een gedeeltelijke reversie van de gonadale suppressie. Er werden niet langer negatieve effecten op de totale scrotum omtrek, de dagelijkse sperma output en de progressieve beweeglijkheid van spermatozoa gevonden. De concentraties aan LH, testosteron en het percentage aan normale zaadcellen in het ejaculaat hadden echter nog niet dezelfde waarden aangenomen als voor de toediening van altrenogest. Hiervoor zal wellicht meer dan 90 dagen vereist zijn (51). Aangezien de lange termijn effecten van de toediening van altrenogest bij de hengst nog niet volledig gekend zijn, is enige voorzichtigheid vereist bij het gebruik hiervan bij hengsten die later nog in de fokkerij dienen ingezet te worden. 14

21 3.3 GNRH AGONISTEN Werking: Zoals eerder vermeld is de activiteit van de GnRH neuronen niet continu, maar kent het een episodisch verloop (19). Hierdoor wordt het GnRH pulserend gesecreteerd in de bloedsomloop en heeft de gonadotropinesecretie de neiging om hetzelfde episodische patroon te volgen (20). Wanneer er continu GnRH agonisten of langwerkende GnRH agonisten worden toegediend, zullen deze met een hoge affiniteit binden aan de GnRH receptoren en bootsen op die manier de cellulaire respons na die geïnduceerd wordt door het GnRH zelf (54). Deze reactie omvat een verhoging van second messenger signalering in de doelcellen en leidt in eerste instantie tot een verhoogde synthese en uitscheiding van de gonadotropinen. Deze stimulerende respons is echter van voorbijgaande aard, want zo zal een voortdurende blootstelling aan de agonist uiteindelijk de synthese en secretie van de gonadotropinen doen dalen met als gevolg een onderdrukking in de secretie van testosteron. Dit wordt verklaard door het feit dat door de continue bezetting van de GnRH receptoren een versnelde internalisatie en degradatie van de receptor zal plaatsvinden zonder een daarbij compenserende toename in de GnRH receptor synthese (20). Bovendien kan door de continue stimulatie een ontkoppeling plaatsvinden van de receptor met de intracellulaire second messenger wegen in gonadotrope cellen (55). Bij een aantal diersoorten blijkt de continue toediening van hoge dosissen GnRH agonisten de hypofyse ongevoelig te maken voor GnRH, en zo een effectief middel te zijn om de gonadotropine afgifte te doen dalen. Er zijn echter duidelijke diersoortverschillen qua gevoeligheid voor het downregulerende effect van GnRH agonisten. De reden voor deze differentiële respons op de GnRH agonisten tussen de diersoorten is niet bekend (56). Uit onderzoeken bij de hengst bleek dat het gebruik van agonisten ofwel geen of slecht een beperkt onderdrukkend effect had (57, 58, 59). Soms werd er zelfs een verbeterde gonadotropine secretie waargenomen (60, 61). Hieruit kan besloten worden dat de meeste paarden relatief bestand zijn tegen langdurige, diepe reproductieve onderdrukking van deze agonisten. De toediening van een hoge dosis GnRH agonisten lijkt dus geen zinvolle manier te zijn in het onderdrukken van het voortplantingsgedrag bij de hengsten (53). Lange termijn effecten: Een significante vermindering in serum testosteronconcentraties, in testiculair volume en spermatogenese door langdurige blootstelling aan GnRH agonisten werd onder andere reeds beschreven bij volwassen mannelijk rhesusapen en honden (62, 63). Bij deze dieren wordt het suppressieve effect van de agonisten volledig omgekeerd na stopzetting van het toedienen van de agonisten (16). Aangezien bij deze dieren de reproductie activiteit volledig herstelt na het stopzetten van de therapie, en uit de meeste studies bij de hengst blijkt dat bij toediening van GnRH agonisten de testosteronconcentraties nauwelijks dalen en de spermatogenese vaak behouden blijft, zou kunnen besloten worden dat de fertiliteit van de hengsten niet nadelig verandert na het gebruik van GnRH agonisten. Toch is enige voorzichtigheid nodig bij het stellen van deze hypothese, vanwege de extreme variabiliteit tussen de diersoorten. Verder onderzoek bij de hengst is hiervoor vereist. 15

22 3.4 GNRH ANTAGONISTEN Werking: Een alternatief voor het gebruik van hoge dosissen agonisten voor het onderdrukken van de gonadotropine afgifte is het gebruik van GnRH antagonisten die competitief de GnRH receptoren bezetten. De antagonisten zorgen voor een snelle en ingrijpende onderdrukking van de gonadotropine secretie door het bezetten en stabiliseren van de GnRH receptoren in een inactieve configuratie. Het voordeel ten opzichte van GnRH agonisten is dat de antagonisten sneller werkzaam zijn en geen initiële hyperstimulatie veroorzaken van de gonadotropinesecretie. Hoewel ze vaak moeten worden toegediend, wordt het effect van de antagonisten snel gemanipuleerd en omgekeerd (64). Nadeel van de GnRH antagonisten is de hoge kostprijs die verbonden is met de werkzame dosissen (44). Hinojosa et al. (2001) onderzochten het effect van antarelix, een potente GnRH antagonist, die aan de dosis van 100 µg/kg lichaamsgewicht aan 4 Shetland pony hengsten werd teogediend. Uit hun onderzoek bleek dat bij het gebruik van deze antagonist de serumconcentraties van LH, FSH, testosteron en oestrogenen significant daalden. De totale sperma output nam bijna met 50% af, alsook een daling in libido werd waargenomen. De spermatozoa motiliteit en morfologie werden niet significant aangetast door de behandeling (65). Fig. 11 Sperma karakteristieken van 4 hengsten 2 weken voor en 2 weken na het toedienen van een GnRH antagonist (antarelix) (uit Hinojosa et al., 2001) Een gelijkaardig onderzoek werd uitgevoerd door Fortier et al. (2002) waarbij ze 6 volwassen hengsten gedurende 35 tot 38 dagen behandelden met een GnRH antagonist. Vier ervan werden behandeld met 0,01 mg/kg lichaamsgewicht antarelix en twee met cetrorelix aan dezelfde dosis. Het testosteronlevel daalde tot op basaal niveau binnen de week van de behandeling, behalve bij 1 hengst. Spermaconcentratie en spermamotiliteit daalden eveneens en het aantal afwijkende spermatozoa nam toe. Een effect op het libido werd niet bekomen (49). Fig. 12 Effect na toediening van een GnRH antagonist op de testosteronconcentratie. Dag 0 = einde van de behandeling (uit Fortier et al., 2002) 16

23 Fig. 13 spermakarakteristieken bij de behandeling met een GnRH-antagonist. Dag 0 = einde van de behandeling (uit Fortier et al., 2002) Lange termijn effecten: Hinojosa et al. (2001) onderzochten de reversibiliteit van het effect op het libido en de testiculaire veranderingen niet, maar uit de waarden van hun metingen kan er worden opgemaakt dat naarmate de behandeling vorderde er opnieuw een stijging in de LH, FSH, testosteron en oestradiol concentraties kon worden waargenomen (65). Dit gegeven suggereert enige vorm van reversibiliteit. Fortier et al. (2002) merkten in hun onderzoek een volledig herstel op qua testosteronniveau, sperma kwaliteit en kwantiteit tussen de 75 en de 110 dagen na het beëindigen van de behandeling (49). Beide onderzoeken tonen aan dat het gebruik van GnRH antagonisten een effectief middel is voor het onderdrukken van de spermatogenese en hierbij geen permanente schade berokkent aan de fertiliteit. De hoge kostprijs van de GnRH antagonisten is echter een groot nadeel waardoor hun gebruik in de praktijk beperkt blijft (44). 3.5 VACCINATIE TEGEN GNRH Werking: De korte afstand (en tijd) dat GnRH onderweg is in de capillairen, is waar het mogelijk kan aangevallen worden door antistoffen. Als er voldoende antistoffen aanwezig zijn in de bloedcirculatie die de eminentia mediana binnengaat, zal vrijwel alle GnRH die afgescheiden werd in de primaire plexus stevig gebonden worden aan antilichamen. Deze binding met antistoffen neutraliseert het GnRH, hetzij door zijn diffusie doorheen de capillaire wanden te verhinderen door de omvang van het complex, of hetzij door het maskeren van de receptorbindingsplaatsen op de GnRH molecule zelf, waardoor deze niet kan binden op zijn receptoren ter hoogte van de hypofyse. Dit resulteert in een verlies van gonadale stimulatie met daaropvolgend een daling in de productie van steroïde hormonen en een vermindering in seksueel gedrag en spermatogenese (18). Aangezien een GnRH molecule zelf te klein is om een immuunreactie uit te lokken, wordt bij de bereiding van een vaccin het GnRH (of een gemodificeerde vorm van het hormoon) geconjugeerd aan een vreemd eiwit dat de antigeniciteit verleent. Ook een adjuvans wordt toegevoegd om de vorming van antilichamen te verbeteren (18). 17

24 Turkstra et al. (2005) onderzochten het effect van vaccinatie tegen GnRH op 12 4-jarige Shetland pony s gebruik makende van 2 verschillende GnRH vaccins bestaande uit een niet-minerale olie adjuvans. Ze verdeelden de hengsten in 3 groepen (elk bestaande uit 4 hengsten), waarbij groep 1 geïnjecteerd werd met 2 ml van een GnRH/CoVaccine (bevattende GnRH antigenen en CoVaccine als adjuvans), groep 2 met 2 ml GnRH/Carbopol (bevattende GnRH antigenen en Carbopol als adjuvans) en groep 3 dat geïnjecteerd werd met CoVaccine HT adjuvans zonder antigenen (controlegroep). Alle groepen kregen na 6 weken een booster immunisatie. Uit dit onderzoek bleek dat het GnRH/Covaccine de meest effectieve resultaten gaf. De titers aan antilichamen tegen het GnRH stegen snel bij alle dieren 2 weken na de tweede vaccinatie. Op hetzelfde moment daalde het serum testosteronniveau maximaal voor de verdere duur van het experiment alsook de spermamotiliteit, scrotum omtrek en aantal spermatozoa daalden duidelijk. Bij de GnRH/Carbopol groep konden dezelfde resultaten slechts bij een minderheid (meestal slechts bij één) van de behandelde hengsten worden waargenomen (66). Fig. 15 Antilichaamtiters tegen GnRH bij de hengsten geïnjecteerd met verschillende GnRH vaccins op dag 0 en 6 weken later (uit Turkstra et al., 2005) Fig. 14 Serum testosteronconcentratie van hengsten geïnjecteerd op dag 0 en 6 weken later met het GnRH/CoVaccin (bovenste grafiek), GnRH/Carbopol (middelste grafiek) en Fig. 16 Spermakarakteristieken van hengsten met de controle emulsie (onderste grafiek) gevaccineerd op week 0 en week 6 met (uit Turkstra et al., 2005) verschillende GnRH vaccins (uit Turkstra et al., 2005) Vanzelfsprekend is de effectiviteit van de vaccinatie afhankelijk van de titers aan anti-gnrhantistioffen die bereikt worden en de precieze samenstelling van het vaccin. Vaccins gemaakt op een oliebasis lokken ernstigere reacties uit ter hoogte van de injectieplaats met als gevolg dat deze vaccins niet altijd geschikt zijn voor commerciële doeleinden. Een water oplosbare formulering van hetzelfde vaccin zorgt voor een aanzienlijke reductie in weefselreacties, maar de anti-gnrh- antistoffentiters zijn hierbij wel lager (67). Uit verschillende studies blijkt er ook een individuele variabiliteit te bestaan qua responsiviteit. Bij de volwassen hengst is er een hogere incidentie van lokale weefselreacties ter hoogte van de injectieplaats dan bij jongere dieren, hoewel dit gedeeltelijk een factor is die bepaald wordt door het aantal toegediende injecties (44). 18

25 Bij jonge hengsten blijken de vaccinaties over het algemeen ook vrij betrouwbaar te zijn en leiden ze tot een stijging in de circulerende anti-gnrh-antistoffentiters, gevolgd door een vermindering in testosteronconcentratie met een verminderde kwaliteit van sperma en daling in het libido tot gevolg (53). Bij volwassen hengsten is de respons op de vaccinaties minder betrouwbaar en boostervaccinaties zijn regelmatig nodig om een duidelijk onderdrukking van testosteronconcentraties in het bloed en spermaproductiecapaciteit te bereiken (44). Deze individuele variabiliteit kwam onder andere naar voor in de studie van Malmgren et al. (2001). Zij voerden een test uit met een vaccin tegen GnRH bestaande uit 1 ml GnRH-BSA conjugaat en als adjuvans 1 ml Equimune en 0,1 ml aluminium hydroxide. Hiervoor gebruikten ze 4 hengsten, waarvan 3 experimentele (4-5 jaar oud) en 1 controle hengst (23 jaar oud). De 3 experimentele hengsten werden elk vijfmaal geïnjecteerd, de eerste 4 vaccinaties werden toegediend met telkens 2 weken interval, de laatste vaccinatie werd met 4 weken interval gegeven. Alle geïmmuniseerde hengsten produceerden antistoffen tegen het GnRH, al was er een verschil in effect van de immunisatie merkbaar tussen de hengsten. Zo werd er bij 2 van de 3 experimentele hengsten hoge levels aan antilichamen gevonden terwijl er bij de 3 de een matige antilichaamconcentratie werd bekomen. Bij alle hengsten van de experimentele groep werd een verminderd libido (maar geen volledige onderdrukking) waargenomen 4 weken na de eerste immunisatie alsook een afname in testikelomtrek. Twee maand na de eerste immunisatie werd er ook een opmerkelijke verandering in spermakwaliteit geobserveerd bij de 2 hengsten met hoge antilichaamconcentraties (68). Janett et al. (2009) voerden een gelijkaardig experiment uit met 200 µgram van een GnRH-proteïne conjugaat (Equity ) die ze driemaal injecteerden bij 5 hengsten (tussen 6 en 15 jaar) met een interval van 4 en 8 weken (69). De resultaten uit deze studie waren vergelijkbaar met deze uit de studie van Malmgren et al. (2001). Fig. 17 GnRH antilichaamconcentratie bij experimentele hengst A-C en controle hengst D voor en na immunisatie tegen GnRH (Uit Malmgren et al., 2001) Fig. 18 Plasma testosteron concentratie (T) en plasma oestogeensulfaat concentratie (ES) bij de experimentele hengsten A-C en bij de controle hengst D voor en na immunisatie tegen GnRH (uit Malmgren et al., 2001) Fig. 19 Totaal aantal spermatozoa per ejaculaat (TNS), totale spermamotiliteit (TSM) en morfologie van normala spermatozoa (MNS) bij de experimentele hengsten A-C en de controle hengst D voor en na immunisatie tegen GnRH (uit Malmgren et al., 2001) 19

26 Lange termijn effecten: Malmgren et al. (2001) onderzochten de lange termijn effecten van hun immunisatie niet, maar uit gegevens van de studie van Trukstra et al. (2005) blijkt dat bij de vaccinatie van 2-4 jarige hengsten deze nog volledige seksuele rijpheid bereiken na stopzetting van de vaccinatie. Ook herstelt het vermogen tot spermatogense zich tot op het niveau van voor de vaccinaties binnen de 4 maanden nadat GnRH-anitistoffentiters waren afgenomen (66). 3.6 KISS1 GEN ALS MOGELIJK DOELWIT VOOR EEN DNA-IMMUNOCASTRATIE VACCIN Wat is het KISS1 gen? Bij verschillende diersoorten waaronder bij schapen, hamsters, apen, mensen en de merrie werd reeds het hypothalamus kisspeptide ontdekt (70, 71, 72, 73, 74). Het KISS1 gen codeert voor de kisspeptiden en situeert zich ter hoogte van de nucleus arcuatus (ARC) in de mediobasale hypothalamus. De kisspeptiden oefenen hun biologische activiteit uit door te binden aan de Orphan G-Protein Gekoppelde Receptor genaamd GPR54, nu aangeduid als de kisspeptide receptor (KISS1R) (70, 75). Deze kisspeptiden zijn cruciaal voor het begin van de puberteit en de controle van de volwassen vruchtbaarheid (70). Studies van Topaloglu et al. (2014) toonden namelijk aan dat inactivitie en mutatie van het KISS1 gen het falen van de puberale progressie veroorzaakt, alsook een verminderde gonadale afmeting en een laag testosterongehalte en onvruchtbaarheid (76). Dit omdat de kisspeptiden ook verantwoordelijk zijn voor het stimuleren van de GnRH secreties (77) Vaccinatie tegen KISS1 gen bij de ram Han et al (2015) onderzochten de hypothese of het KISS1 gen gebruikt kan worden als doelwit voor de ontwikkeling van een DNA-immunocastratie vaccin. Het immunocastratie effect van een KISS1- antagonische DNA-vaccin bij ram lammeren werd geëvalueerd op basis van identificatie van een specifiek KISS1 antilichamen respons en het beoordelen van het effect op serum testosteron niveau, veranderde gonadale functie en seksueel gedrag. Voor dit onderzoek verdeelden ze 6 mannelijke Hu schapenlammeren in een behandelings- en een controlegroep. Het vaccin (1 mg/mannelijk lam) werd geïnjecteerd in de lammeren tijdens week 0, 3 en 6 van het experiment. Werkzaamheid van het vaccin werd geëvalueerd in termen van KISS1-specifieke IgG-antilichaam reactie, serum testosteron concentraties, scrotum omtrek, testis gewicht, lengte en breedte, de omvang van weefselschade aan de testikels en verandering qua seksueel gedrag. 20