UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar DE INVLOED VAN CHIRURGISCHE EN IMMUNOLOGISCHE CASTRATIE OP DE TESTOSTERON CONCENTRATIE EN HET GEDRAG VAN DE HENGST door Lisa DE LANGE Promotoren : Jan Govaere Cyrillus Verviers Literatuurstudie in het kader van de Masterproef 2016 Lisa De Lange

2 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

3 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar DE INVLOED VAN CHIRURGISCHE EN IMMUNOLOGISCHE CASTRATIE OP DE TESTOSTERON CONCENTRATIE EN HET GEDRAG VAN DE HENGST door Lisa DE LANGE Promotoren : Jan Govaere Cyrillus Verviers Literatuurstudie in het kader van de Masterproef 2016 Lisa De Lange

4 Voorwoord Men werd in de praktijk geconfronteerd met volgende situatie. Een hengst werd gecastreerd omwille van zijn ongewenst mannelijk/seksueel gedrag. Dit paard, vervolgens ruin won enkele weken na de castratie een koers. Bij de dopingcontrole werd het paard positief bevonden op testosteron. Met andere woorden, de concentratie aan testosteron in de urine was hoger dan het toegelaten gehalte (20 ng/ml). De vraag was vervolgens of dit paard exogeen testosteron toegediend gekregen had, of dit enkel te wijten kon zijn aan het endogeen testosteron dat nog circuleerde na de castratie. Aangezien er in de literatuur nog onduidelijkheid heerst over het verloop van de endogene testosteron hoeveelheid na de castratie, koos ik ervoor om dit verder uit te zoeken. Vervolgens werd mij aangeraden om de verschillende geneesmiddelen dewelke gebruikt worden om de voortplanting van de hengst te onderdrukken ook in deze literatuurstudie te bespreken. Graag zou ik Dr. Peter Corty willen bedanken voor het toevertrouwen van deze problematiek, evenals mijn promotor Dr. Jan Govaere om mij te begeleiden tijdens het schrijven van deze literatuurstudie. Vervolgens zou ik graag een dankwoord richten aan iedereen die mij heeft bijgestaan tijdens het schrijven van deze literatuurstudie, en vooral tijdens de volledige opleiding diergeneeskunde. Ik dank mijn ouders die mij de kans gegeven hebben om deze opleiding te volgen, mijn familie, vrienden, medestudenten en de familie Corty, voor hun vertrouwen, steun en geduld tijdens deze boeiende opleiding.

5 Inhoudsopgave Samenvatting... 1 Inleiding HENGST EN HORMONEN DE HYPOTHALAMO-HYPOFYSAIRE AS TESTOSTERON EN OESTROGENEN HENGST EN CASTRATIE CHIRURGISCHE CASTRATIE Invloed op het testosteron gehalte Invloed op het gedrag Diagnostische benadering : testiculair weefsel en cryptorchidie Klinisch onderzoek, rectaal onderzoek en echografie van een cryptorch Hormonale testen om testiculair weefsel aan te tonen Androgenen Oestrogenen Serum anti-müllerian hormoon IMMUNOLOGISCHE CASTRATIE GnRH agonisten Werking Deslorelin implantaat GnRH immunisatie GnRH antistof productie Invloed op het testosteron gehalte Invloed op het gedrag Bijkomende factoren en bijwerkingen GnRH antagonisten en geconjugeerde GnRH toxines Bespreking Referenties : Bijlagen... 26

6 Samenvatting In deze literatuurstudie wordt er in het eerste deel kort ingegaan op de fysiologische regeling van de geslachtshormonen bij de hengst. Ook zullen de structuur en de eigenschappen van bepaalde androgenen en bepaalde oestrogenen toegelicht worden. In het tweede deel wordt ingegaan op de endocriene gevolgen van de chirurgische castratie en worden de verschillende preparaten dewelke zorgen voor een immunologische castratie beschreven. Na chirurgische castratie nemen de gehaltes aan geslachtshormonen af. Deze geslachtshormonen zorgen deels voor de uiting van het mannelijk/seksueel gedrag. Wanneer het gehalte aan testosteron afneemt, neemt gelijkmatig het libido van de hengst af. Er is echter een variatie aantoonbaar in de daling van testosteron na castratie. Ook verschilt het effect op het gedrag, niet alle gecastreerde hengsten gedragen zich vervolgens als ruin. Wanneer een hengst chirurgisch gecastreerd wordt, is het noodzakelijk dat al het testiculair weefsel verwijderd wordt. Indien testiculair rest weefsel aanwezig gebleven is, of wanneer men te maken heeft met een cryptorche hengst, waarbij een of beide testikels tijdens de ontwikkeling niet ingedaald zijn, is het van belang om dit te diagnosticeren. Verschillende onderzoeksmethodes zijn hierbij aangewezen, waaronder een klinisch onderzoek, gevolgd door een rectaal en eventueel een echografisch onderzoek. Indien deze methodes geen uitsluitsel geven is een hormonaal onderzoek aangewezen. Men kan de plasma testosteron concentratie, het gehalte aan androstenedione (dewelke een voorloper van de androgenen is) in het bloed, evenals andere androgeen derivaten in de urine, bepalen. Ook de bepaling van oestrogenen, in het bloed, feces of urine, is waardevol om testiculair weefsel aan te tonen. Naast deze twee hormonen, neemt het belang van het antimüllerian hormoon toe. Dit hormoon is in een hogere concentratie aanwezig in het serum van een cryptorch in vergelijking met de hengst. Chirurgische castratie is een invasieve en irreversibele manier om de voortplanting van de hengst te elimineren. Een alternatief is immunocastratie. Verschillende preparaten die inwerken op de endocriene regeling van de geslachtshormonen kunnen gebruikt worden. GnRH agonisten en vaccins tegen GnRH zijn de meest courante preparaten. Het gebruik van GnRH antagonisten en GnRH toxines bij de hengst dient nog verder onderzocht te worden. Trefwoorden: Castratie, Endocrien, Hengst, Immunologische castratie, Testosteron 1

7 Inleiding Hengsten worden voor diverse redenen gecastreerd. De hoofdreden is waarschijnlijk het uitgesproken mannelijk gedrag van het dier. Bepaalde ongewenste (seksuele of agressieve) gedragingen worden grotendeels uitgeschakeld na castratie. Dominantie tegenover andere paarden en ruiter, evenals bijten, slaan, vocaliseren, snuiven, horen tot de karakteristieke mannelijke gedragingen. Daarnaast zijn hengsten vaak moeilijker hanteerbaar dan merries, en kunnen ze niet samen gehuisvest worden. Na de chirurgische castratie wordt geen testosteron, noch andere androgenen, geproduceerd waardoor het mannelijk gedrag afneemt. Echter de daling in testosteron is verschillend naargelang het individuele dier, ook is het effect op het gedrag verschillend. Wanneer het gehalte aan endogeen testosteron bij een ruin hoger is dan de grenswaarde, dient men zich af te vragen of dit te wijten is aan de aanwezigheid van testiculair rest weefsel, of indien men te maken heeft met een unilaterale cryptorch, waarbij de ingedaalde testikel reeds verwijderd werd. Om dit te diagnosticeren kan men verschillende hormoon concentraties bepalen, deze zullen hoger of lager zijn bij een cryptorch in vergelijking met een hengst of een ruin. Castratie waarbij de testes en bijballen chirurgisch verwijderd worden is een onomkeerbare methode. Als alternatief kunnen de dieren immunologisch gecastreerd worden. Wanneer eigenaars hun dier in de toekomst nog als fokdier wensen te gebruiken, of wanneer om medische redenen een operatie niet haalbaar is, is immunologische castratie gunstiger (Schonert et al. 2012). Men kan langdurig gonadotropine releasing hormoon (GnRH) agonisten toedienen, dit leidt tot een down regulatie van de GnRH receptoren en een desensibilisatie voor de hypofyse gonadotropines. Ook het gebruik van vaccins die zorgen voor de vorming van antistoffen tegen GnRH werden beschreven. Het gebruikt van GnRH antagonisten, die de receptoren ter hoogte van de hypofyse blokkeren, en GnRH toxines dewelke de gonadotropine synthese verhinderen, werd ook beschreven (Fraser 1982; Sabeur et al. 2003). 2

8 1. HENGST EN HORMONEN 1.1. DE HYPOTHALAMO-HYPOFYSAIRE AS Figuur 1: Het Hypothalamo-hypofysair complex en zijn interacties met de testiculaire structuren (A : Activine, E: Estrogenen, I: Inhibine, PRL: Prolactine, T: Testosteron) (Naar Amann 1993) De hypothalamus staat in voor de synthese en de secretie van verschillende hormonen. Het gonadotropinreleasing hormone (GnRH) heeft het meeste invloed op de regulatie van de voortplanting. De vrijstelling van GnRH is niet continu, maar in frequente intermitterende pieken (Garner en Hafez 2004). Nadat GnRH wordt vrijgesteld, zal het via de bloedvaten de hypofyse bereiken, waar het op specifieke receptoren ter hoogte van de adenohypofyse bindt (Amann 1993) (figuur 1). Na binding worden verschillende andere hormonen gereleased waaronder LH (Luteinising hormone) en FSH (Follicle stimulating hormone) dewelke van groot belang zijn in de regulatie van de voortplanting. Per dag zijn er vier, tot meer dan acht, GnRH- en LH- pieken, telkens gevolgd door een piek van testosteron (Senger 2003) (figuur 2). Figuur 2 uit Pathways to pregnancy and parturition (Senger 2003) LH en FSH werken in op de Sertoli cellen en de Leydig cellen ter hoogte van de testes. Odell (1989) toonde aan dat het voornamelijk de Leydig cellen zijn, die de grootste bron zijn van testosteron bij het mannelijk dier. Het testosteron bereikt de tubuli seminferi waar het invloed heeft op de spermatogenese (Chaffaux 1992). 3

9 Door LH en FSH wordt aldus de testiculaire functie gestimuleerd, en wordt de productie van de spermatozoïden en de steroid hormonen gefavoriseerd. Dit geproduceerde testosteron komt in de algemene circulatie terecht, waar het zorgt voor een negatieve feedback op de hypothalamus TESTOSTERON EN OESTROGENEN De testiculaire hormonen hebben een invloed op de ontwikkeling van het mannelijk geslachtstelsel. Ze hebben ook invloed op morfologische kenmerken zoals de bespiering (Chaffaux 1992), en op het seksueel gedrag. De hoeveelheid circulerende hormonen is afhankelijk van de hoeveelheid testosteron dat gesynthetiseerd wordt evenals van zijn transport en clearance (Chaffaux 1992). Testosteron is een hormoon (androgeen) dat voornamelijk geproduceerd wordt ter hoogte van de Leydig cellen van de testes als respons op de pulsatiele LH secretie (Odell 1989). Testiculair testosteron wordt 500 maal verdund als het de perifere circulatie bereikt. Deze dilutie, samen met zijn korte halfwaarde tijd, zorgt ervoor dat er geen downregulatie is van het GnRH feedback systeem. Wanneer echter exogeen testosteron toegediend wordt, vindt deze downregulatie wel plaats waardoor er geen testosteron meer geproduceerd wordt door de Leydig cellen, wat op zijn beurt nadelig is voor de spermatogenese. Het testosteron gehalte bij de hengst kent individuele verschillen (Pineda 2003). Het is seizoen en leeftijd afhankelijk. McKinnon toonde in 2011 aan dat het testiculair gewicht en het testiculair volume in de lente en zomer toenamen, met vervolgens een verhoogde sperma productie, een verhoogd libido, en verhoogde plasma concentraties aan onder andere LH en FSH. In een studie van Raeside (1978) werd gevonden dat de testosteron concentratie het hoogste is in de maand september (figuur 3). Ook zijn er verschillen zichtbaar tijdens het voortplantings seizoen ten opzichte van het niet voortplantings seizoen (Raeside 1978). Aangezien GnRH in pulsen vrijgesteld wordt, is het testosteron gehalte verschillend in de loop van de dag (Nett 1993). Eenmalige testosteron bepaling is vervolgens weinig informatief, waardoor de bepaling na een hcg stimulatie test aangewezen is (Cox et al., 1975) (zie verder). De testosteron concentratie kent ook verschillen in functie van de leeftijd. Tijdens de puberteit vindt een trage stijging van testosteron plaats, deze begint rond de leeftijd van 68 weken en stijgt tot de leeftijd van weken ouderdom (Naden et al., 1990, Clay et al., 1992). Algemeen wordt aangenomen dat de concentratie aan testosteron bij de hengst varieert tussen de pg/ml (Cox et al. 1973). 4

10 Figuur 3: Testosteron concentratie (Gevulde staven) en oestrogenen concentratie (Lege staven) in het perifeer bloed bij de volwassen hengst gedurende 14 maanden (Naar Raeside et al. 1978). De oestrogenen worden, na een aromatisatie proces, gevormd uit testosteron. Dit vindt bij de hengst, in tegenstelling tot bij andere diersoorten, plaats ter hoogte van het testiculair weefsel (Pineda 2003). Echter, verschillende auteurs zijn er nog niet over eens of het aromatisatie proces van de androgenen plaats vindt ter hoogte van de Sertoli en/of de Leydig cellen (Hejmej et. al 2005). De gevormde oestrogenen kunnen onderverdeeld worden in gebonden oestrogenen (na conjugatie) (het oestrone sulfaat), en ongebonden oestrogenen (oestradiol 17 β) (Schonert et al. 2012). Achtennegentig procent van de geproduceerde oestrogenen zijn gebonden oestrogenen (Raeside 1978). Oestradiol 17 β heeft invloed op verschillende orgaan systemen en zou verantwoordelijk zijn voor het hengstachtig gedrag (Schonert et al. 2012). Zoals dit het geval is voor testosteron is ook de concentratie aan oestrogenen in het bloed verschillend tijdens het jaar. De concentraties waren, in een studie van Raeside (1978), het hoogst in mei en het laagst in november en december (Figuur 3, Raeside 1978). De intra-testiculaire hoeveelheid oestradiol stijgt met de testiculaire maturatie (Stewart and Roser 1998). De fysiologische functie van deze testiculaire oestrogenen is nog onbekend (Raeside 1978). Zoals bij testosteron, oefenen de oestrogenen, aanwezig in de perifere bloed circulatie, een negatief feedback effect uit op de hypothalamo-hypofysaire as, waardoor de pulsatiele vrijstelling van GnRH, FSH en LH onderdrukt wordt (Amann 1993). 2. HENGST EN CASTRATIE 2.1. CHIRURGISCHE CASTRATIE Bij de castratie van mannelijke dieren worden de testes en de bijballen verwijderd, waardoor zowel de spermatogenese als de hormoon productie stilgelegd wordt. Een alternatief is de vascularisatie van deze structuren uitschakelen waarna de testes atrofiëren (De Fourmestraux et al. 2014). 5

11 2.1.1 Invloed op het testosteron gehalte Aangezien testosteron geproduceerd wordt ter hoogte van de testes, nemen de hormonale concentraties na chirurgische castratie af. In verschillende studies werden de concentraties aan testosteron bepaald voor en na de castratie. De bloednames werden al dan niet voorafgegaan door een injectie met hcg. Bij ruinen, waar geen testiculair weefsel aanwezig is, is de basale testosteron concentratie laag, en is er geen respons op de injectie met hcg (Cox et al. 1986). De hoeveelheid hcg die gebruikt werd varieert volgens de studie, maar Cox et al. (1986) toonde aan dat hetzelfde resultaat bekomen werd na de injectie van 6000 IU en IU hcg. Ook toonde Cox et al. (1986) aan dat de bloedname tussen 30 en 120 min na de injectie kon plaatsvinden (Cox et al. 1986). Echter in een studie van Pader (2006) (zie verder) vond de bloedname 24h na de injectie met hcg plaats. In een studie van Pader et al. (2006) werd het testosteron gehalte vóór- en na de chirurgie geëvalueerd. Er werd bij een aantal hengsten op verschillende tijdstippen bloed genomen om de hormoon concentraties te bepalen. Als eerste, één dag voor de operatie. Na deze eerste bloedname werd er IU hcg (Chorulon) toegediend. Vierentwintig uur later, vóór de operatie, werd het gehalte aan testosteron na stimulatie gemeten. Dezelfde dag werd de castratie uitgevoerd. Eén uur na de castratie vond opnieuw een bloedname plaats. Deze werden 90 dagen later herhaald, en op dag 91, na injectie van UI hcg op dag 90, werd het testosteron gehalte nogmaals gemeten. De concentratie aan testosteron voor de chirurgie was individueel verschillend, ten gevolge van het seizoen, de leeftijd en de excitatie toestand op het moment van de bloedname. Er vond een positieve respons plaats op de stimulatie met hcg. Een maand na de castratie was een significante daling in testosteron aantoonbaar. Drie maanden na de castratie was de concentratie aan testosteron lager dan 2 nmol/l (0.58 ng/ml). Wat betekent dat er geen testiculair restweefsel aanwezig was. De exacte tijdstip wanneer de concentratie onder dit gehalte komt, werd niet aangetoond. In de studie van De Fourmestraux et al. (2014) was de aangeduide grenswaarde voor de afwezigheid van testiculair weefsel 3 nmol/l (0.87 ng/ml). Een bloedname vond plaats tussen 3-4 weken na de castratie, de grenswaarde was op dat moment bereikt. In verschillende andere studies werden andere grenswaarden gebruikt. Arighi en Bosu (1989) concludeerden dat de paarden effectief ruinen waren indien het gemeten gehalte lager was dan 0.12 ng/ml, Voermans et al. (2006) nam 0.12 ng/ml als grenswaarde. Wanneer de paarden in de studie van Nett et al. (1993) een testosteron concentratie lager dan 100 pg/ml (0.1 ng/ml) vertoonden werden ze beschouwd als ruin, indien de concentratie hoger was dan 200 pg/ml (0.2 ng/ml) werd er geconcludeerd dat er testiculair restweefsel aanwezig was. Cox et al. (1973) nam nog andere grenswaarden aan: onder de 40 pg/ml (0.04 ng/ml) was het paard ruin. In geen van deze laatste studies wordt vermeld op welk tijdstip na de castratie deze gehaltes bereikt worden, wat wel het geval is in de studie van Palme et al. (1998). Deze auteur gebruikt dezelfde threshold als Cox. et al. (1973), nl nmol/l (40 pg/ml), dewelke bekomen werd na gemiddeld 4h (0.5 24h) Invloed op het gedrag Samen met de daling in de hormoon concentratie, voornamelijk de testosteron concentratie, vermindert het mannelijk/seksueel gedrag van de ruin. Het is echter niet zo dat chirurgische castratie bij de hengst 100% effectief is in het elimineren van het 6

12 ongewenst seksueel/mannelijk gedrag. Indien de ruin nog ongewenst mannelijk gedrag vertoont, is dit niet te wijten aan de aanwezigheid van het ter plaatse laten van een deel van de bijbal of aan de aanwezigheid van heterotopisch testikel weefsel. De epididymis bevat geen cellen die androgenen kunnen produceren, waardoor dit geen oorzaak is van het persisterend mannelijk gedrag (Schumacher 1996). Er werd ook nooit een verband aangetoond tussen het hengstachtig gedrag bij ruinen en de productie van androgenen door de adrenale cortex (Schumacher 1996). Wanneer de castratie effectief is, met andere woorden wanneer de testikels volledig verwijderd werden, maar de ruin vertoont nog seksueel gedrag is dit psychisch van aard (Cox et al. 1986). Twintig tot 30% van de ruinen vertonen aangeleerd seksueel gedrag tegenover merries, onafhankelijk van de leeftijd van de dieren op het moment van de castratie (Line et al. 1985). Dit wordt vervolgens als normaal beschouwd. In het geval van een uni- of bilaterale, abdominale, abdomino-inguinale of inguinale cryptorch, wordt het persisterend mannelijk gedrag veroorzaakt door het resterend testiculair weefsel. De aanwezigheid van persisterend mannelijk gedrag die psychisch is van aard, en de aanwezigheid van testiculair rest weefsel, moeten van elkaar gedifferentieerd worden door initieel een grondig klinisch onderzoek. Na de palpatie, het rectaal onderzoek en een echografisch onderzoek, is een hormonaal onderzoek aangewezen Diagnostische benadering : testiculair weefsel en cryptorchidie Klinisch onderzoek, rectaal onderzoek en echografie van een cryptorch Een cryptorch is een mannelijk paard waarbij één (unilaterale cryptorch) of beide (bilaterale cryptorch) testikels tijdens de groei van het dier niet ingedaald zijn in het scrotum. De testikels bevinden zich vervolgens in het lieskanaal of in de buikholte. Om na te gaan of het abnormaal of seksueel gedrag het gevolg is van de aanwezigheid van testiculair weefsel, waardoor de productie van testosteron mogelijk is, moet eerst en vooral een grondig klinisch onderzoek uitgevoerd worden. Men palpeert het scrotum en de liesstreek om hun inhoud te beoordelen, en om na te gaan of er eventueel littekens, of een subcutane bindweefsel streng verbonden met dit litteken, van een vroegere castratie waarbij de ingedaalde testikel reeds verwijderd werd, aanwezig zijn. Indien men bij palpatie geen testikel heeft kunnen vast stellen gaat men over tot een rectaal onderzoek (Stickle and fessler 1978), waarbij men ter hoogte van de inwendige liesring voelt of deze klein of afwezig is, evenals de aan- of afwezigheid van een intra-abdominale testikel wordt onderzocht (Cox et al. 1986). Indien de hoger vermelde onderzoeksmethoden geen uitsluitsel geven kunnen echografie van de inguinale regio (Schambourg et al. 2006) en transrectale echografie (Jann and Rains 1990) uitgevoerd worden Hormonale testen om testiculair weefsel aan te tonen 7

13 Androgenen De bepaling van de plasma testosteron concentratie kan gebruikt worden om de aanwezigheid van testiculair weefsel, en dus de diagnose van cryptorchidie te stellen. Silberzahn (1989) toonde aan dat de testosteron concentratie na hcg stimulatie bij bilaterale cryptorchen een graduele stijging vertoonde zoals dit het geval is bij hengsten. Ruinen daarentegen vertonen geen respons op de hcg stimulatie (Silberzahn 1989). Volgens Cox et al. is er bij het paard testiculair weefsel aanwezig indien de concentratie aan testosteron voor en na de hcg stimulatie lager dan 40 pg/ml is (Cox. et al., 1975). Cox et al. (1986) rapporteerde dat 6.7% van deze testen geen eenduidig resultaat met zich mee brengen. Illera et al. (2003) vergeleek de sensitiviteit en specificiteit van testen waar testosteron, oestrone sulfaat en androstenedione gebruikt werden voor de diagnose van cryptorchidie. Er werd gevonden dat de bepaling van testosteron samenging met een hoog aantal vals negatieve resultaten, met een lage negatief voorspellende waarde en een lage sensitiviteit in vergelijking met de andere hormonen (Illera et al. 2003). Androstenedione is, zowel bij mannelijke (testes) en vrouwelijke (ovaria) dieren, een precursor hormoon van androgenen en oestrogenen. Het is betrokken bij de regulatie van onder andere de puberteit, de controle van de folliculaire groei, de mannelijke fysiologie en speelt ook een rol bij verschillende voortplantings pathologieën (Inoue et al. 1993, Muyan et al. 1993, Eisenhower et al.1994, Hoffman and landeck 1999). Er was reeds een beetje informatie beschikbaar over de mogelijkheid van het gebruik van de bepaling van androstenedione om cryptorchen te diagnosticeren (Silberzahn et al. 1989). In een studie van Illera et al. (2003), werd de androstenedione concentratie in het serum bepaald. Er waren maar een klein aantal vals positieve resultaten en een klein aantal vals negatieve resultaten. In deze studie werd aangetoond dat de bepaling van androstenedione samengaat met een hogere sensitiviteit, specificiteit en dat het efficiënter is dan de bepaling van testosteron (zie boven) en oestrone sulfaat (zie later). Een alternatief is de gas chromatography/mass spectrometry test zoals beschreven werd door Leung et al. (2011). Er is maar één urine staal nodig en de test is toepasbaar op hengsten vanaf twee jaar. De diagnose van cryptorchidie wordt bevestigd wanneer 5(10)-estrene-3β,17α-diol en 4-estrene-3,17-dione in de urine stalen van ruinen aanwezig zijn. Deze twee steroïden worden geproduceerd tijdens de biosynthese van androgenen (zie figuur 4). Bovendien kunnen er ook nog andere testiculaire steroïdale merkers aangetoond worden, onder andere testosteron, nandrolone, estrone en 17β-estradiol. Deze vier zijn minder specifiek maar kunnen bij aanwezigheid gebruikt worden als bijkomend bewijs voor de aanwezigheid van testiculair weefsel (Leung et al. 2011). 8

14 Figuur 4: De biosynthese van androgenen, oestrogenen, en sommige C18 steroiden in hengsten. Naar Leung et al. (2011) Oestrogenen De bepaling van de hoeveelheid oestrogenen kan ook waardevol zijn om een cryptorch en een ruin de onderscheiden. Aangezien 98% van de geproduceerde oestrogenen gebonden oestrogenen zijn (Raeside 1978), is het bepalen van ongebonden oestrogenen verwaarloosbaar. Cox et al. beschreef de bepaling van plasma oestrone sulfaat als diagnostisch middel voor het aantonen van testiculair weefsel. In een studie van Silberzahn et al. (1989) vond er bij bilaterale cryptorchen, na een injectie met hcg, een stijging in de plasma oestrogeen concentratie plaats. Deze stijging was iets minder uitgesproken dan de bij de hengst, doch duidelijker dan bij ruinen die geen respons vertonen op de injectie met hcg. Wanneer de gemeten concentraties hoger waren dan 400 pg/ml concludeerden Silberzahn et al. (1989) dat het paard cryptorch was. Indien de waarde lager was dan 50 pg/ml, was het paard ruin. Tussen deze waarden is een andere diagnostische test aangewezen. Deze test is niet toepasbaar bij paarden jonger dan 3 jaar oud aangezien de testiculaire productie van oestrone sulfaat verwaarloosbaar is bij jonge hengsten (Gaillard and Silberzahn, 1987). In een studie van Illera et al. (2003) werd de concentratie aan oestrone sulfaat in het serum vergeleken met deze van testosteron en androstenedione. Uit deze vergelijking bleek dat de positief voorspellende waarde voor oestrone sulfaat lager was, de hoeveelheid vals positieve resultaten hoger en de specificiteit lager dan voor de twee andere hormonen. De bepaling van fecale ongeconjugeerde oestrogenen kan ook gebruikt worden als diagnostisch middel. In een studie van Palme et al. (1994) werden verschillende hengsten, ruinen en cryptorchen onderzocht. De hoeveelheid fecale oestrogenen bij de hengst was gemiddeld 130 nmol/kg, terwijl dit bij ruinen gemiddeld 12 nmol/kg was. Hengsten met een niet ingedaalde testikel hadden een gemiddelde concentratie van 113 nmol/kg, en hengsten waar beide testikels niet ingedaald waren 64 nmol/kg. Door de fecale oestrogenen te meten is het dus mogelijk om testiculair rest weefsel te detecteren. Ook deze test is niet bruikbaar op paarden jonger dan 2 jaar (Palme et al. 1994). 9

15 Naast de bepaling van oestrogenen in het bloed en in de feces, kan ook de hoeveelheid urinaire oestrogenen bepaald worden om de aanwezigheid van testiculair weefsel te bevestigen. Zowel bij hengsten als bij cryptorchen zijn de concentraties aan oestrogeen in de urine 2000 tot maal hoger (Palme et al. 1998) Serum anti-müllerian hormoon Sertoli cellen zijn gekarakteriseerd door bepaalde moleculaire merkers, onder andere het anti-müllerian hormoon (AMH), het anti-müllerian hormoon receptor (AMHR) en de androgeen receptor (AR). In een studie van Almeida et al. (2012) werd aangetoond dat de hoeveelheid AMH en AMHR verhoogd is in de tubuli seminiferi van een cryptorche testis in vergelijking met de testis van gewone hengsten. De normale Sertoli cel maturatie in de testis gaat gepaard met een verhoogde expressie van onder andere AR en een gedaalde expressie van het anti-müllerian hormoon (Almeida et al. 2012). Bij cryptorchen vindt de maturatie van Sertoli cellen onvoldoende plaats in de niet gedaalde testes (Almeida et al. 2012). Er dient opgemerkt te worden dat de hoeveelheden die terug gevonden werden in een cryptorche testis, dezelfde zijn als deze bij hengstenveulens vóór de puberteit (Ball et al. 2008, Almeida et al. 2012). Naast de leeftijd hebben ook het geslacht, hengstenveulens vertonen hogere waardes dan merrieveulens (Claes et al. 2013), en het seizoen (Claes et al. 2013) een invloed op de AMH concentraties. Ook Claes et al. (2013) bevestigd dat de bepaling van de AMH concentratie in het serum diagnostisch gebruikt kan worden. Claes et al. (2013) vergeleek de concentraties aan AMH en testosteron van intacte hengsten onderling en vervolgens intacte hengsten met ruinen en cryptorche hengsten. Gemiddeld is het gehalte aan AMH bij intacte hengsten 19.8 ng/ml, met hogere waarden in mei en juni (Claes et al. 2013). Deze stijging komt overeen met de stijging van de gonadotropines en de steroid hormonen (Taya et al. 2000). Bij diezelfde dieren werd aangetoond dat het gehalte aan testosteron meer variatie vertoond, de gemiddelde concentratie in het serum is pg/ml, met evenals hogere waarden in de lente (Claes et al. 2013). Een zwakke maar significant positieve correlatie werd geobserveerd tussen de concentratie aan AMH en Testosteron in het serum bij de hengst (Claes et al. 2013) (figuur 5). Figuur 5 naar Claes et al. 2013: Seizoen variatie in AMH (volle lijn) en testosteron (stippellijn) concentratie in intacte hengsten. Vervolgens vergeleken Claes et al. (2013) ook de verschillen in serum testosteron en AMH concentratie bij 10

16 ruinen, cryptorche hengsten en intacte hengsten. De gemiddelde AMH concentratie is hoger bij cryptrochen dan bij intacte hengsten. De AMH concentratie bij ruinen ligt onder de detectie limiet. Er werd ook een verschil opgemerkt tussen cryptorchen met of zonder een ingedaalde testikel in het scrotum. De concentratie aan AMH is hoger bij deze zonder een ingedaalde testikel dan deze met een ingedaalde testikel, deze laatsten vertonen dezelfde waarden als de intacte hengsten (Figuur 6 en 7). Figuur 6 naar Claes et al. 2013: Gemiddelde serum concentraties in cryptorche hengsten, intacte hengsten, en ruinen. Figuur 7 naar Claes et al 2013: Gemiddelde serum concentraties aan AMH in cryptorche hengsten met één ingedaalde testikel in het scrotum, bilaterale cryptorchen, en intacte hengsten. Vervolgens kan er besloten worden dat de bepaling van de concentraties van AMH en testosteron in het serum gebruikt kunnen worden voor de diagnose van cryptorchidie. Aangezien de concentratie aan AMH bij ruinen lager is dan de detectie limiet, kan er gesuggereerd worden dat de productie van circulerend AMH voornamelijk in de testis plaatsvindt (Claes et al., 2013). Testosteron daarentegen wordt zowel in de testis als ter hoogte van de adrenale cortex geproduceerd (Morganti et al., 2010), dus de bepaling van de AMH concentratie is een meer specifieke test dan de bepaling van testosteron om de diagnose van cryptorchidie bij de hengst te stellen IMMUNOLOGISCHE CASTRATIE Vaak wenst men het mannelijk gedrag reversibel te onderdrukken, voornamelijk wanneer dit seksueel of agressief gedrag de prestaties van het dier beïnvloeden, evenals indien ze gevaarlijk zijn voor zowel dier als eigenaar (Stout en Colenbrander 2004). Er bestaan verschillende minimaal invasieve methodes welke het mannelijk dier tijdelijk of permanent castreren: (1) de chronische toediening van GnRH agonisten zorgen voor down regulatie van de GnRH 11

17 receptoren en een desensibilisatie voor de hypofyse gonadotropines; (2) de immunisatie tegen GnRH waarbij antistoffen zorgen voor de neutralisatie van GnRH; (3) het gebruik van GnRH antagonisten die de GnRH receptoren ter hoogte van de hypofyse blokkeren, waardoor het endogeen GnRH niet meer kan binden (Fraser 1982). Ook het gebruik van GnRH toxine conjugaten leiden tot een interruptie van de hypofysaire gonadotropine fysiologie (Sabeur et al. 2003). Progestagenen, zoals bijvoorbeeld altrenogest (Miller et al., 1997), kunnen ook gebruikt worden. Ze onderdrukken de GnRH en LH secretie, waardoor de testosteron gehaltes dalen. Een belangrijk nadeel bij het gebruik van progestagenen is dat de lange termijn effecten en bijwerkingen nog niet gekend zijn. Robert en Beaver (1987) toonden centraal zenuwstoornissen aan. Ook zijn progestagenen doping positief en mogen ze enkel bij het niet voedsel producerende paarden gebruikt worden (Herbert en Trigg 2005) GnRH agonisten Werking GnRH agonisten zijn peptiden die enkel van GnRH verschillen wat betreft de enzymatische degradatie. Ze zijn resistenter tegenover peptidasen en de receptor binding affiniteit is verhoogd. Door op positie 6, glycine te vervangen door een D-aminozuur en door het C-terminaal glycinamide residu te vervangen door een ethylamide groep bekomt men een agonist dat 200 keer potenter is dan het oorspronkelijk GnRH (Karten en Rivier, 1986). Continue blootstelling leidt tot een verminderde pulsatiele secretie van LH ten gevolge van een down regulatie van de GnRH receptoren in gonadotrope cellen (Hazum and Conn, 1988; Ludwig 2008) en een interferentie van de second messenger systemen (Hunckle and Conn 1988). Daardoor is er een verminderde LH en FSH secretie waardoor finaal de concentratie aan gonadale steroïden verlaagd is. Zolang de GnRH agonist, in een concentratie hoger aan de threshold grens, aanwezig is in de circulatie, wordt de pulsatiele LH secretie onderdrukt (D Occhio and Aspden, 1996) Deslorelin implantaat Schonert et al. (2012) beschreef in een case studie de effecten van een gonadotropine releasing hormone super agonist. Bij een drie jaar oude Arabische volbloed werd een subcutaan 4.7mg deslorelin-acetate implantaat (Suprelorin, Virbac Germany) (een synthetisch GnRH analoog) geïmplanteerd. Verschillende zaken werden geëvalueerd, onder andere de FSH, LH en andere gonadotropine concentraties, evenals het gedrag van de hengst. Deslorelin acetaat bindt op de GnRH receptoren en veroorzaakt initieel een stimulatie van de hypofyse met vervolgens verhoogde LH en FSH concentraties. Dit stimulerend effect leidt tot een verhoging van de serum testosteron en oestrogeen concentraties. Vervolgens, door een verlaagde afbraak van de GnRH agonist ter hoogte van de receptoren, vindt een interruptie van de hypofyse-hypothalamus as plaats (Padula 2005), met een verminderde LH en FSH secretie. Wat op zijn beurt leidt tot het dalen van de testosteron hoeveelheid (Padula 2005; Junaidi et al. 2007). Deslorelin is aldus biologisch actief. 12

18 Deze veranderingen in de concentraties hebben een invloed op het gedrag. Initieel werd een verhoogd mannelijk gedrag beschreven, dat vanaf dag 15 afnam, de hengst had geen interesse meer in merries noch in ruinen. Uiteindelijk, rond dag 45 steeg het testosteron gehalte opnieuw, met het gevolg dat het mannelijk gedrag ook terug tot uiting kwam. Figuur 8 naar Schonert et al. (2012) : vergelijking tussen de serum concentraties van testosteron (nmol/l), oestradiol-17 β (pmol/l), oestrone sulphate (nmol/l), FSH (ng/ml) and LH (ng/ml) in het perifeer bloed van een hengst vóór (D0) en na de subcutane applicatie van een implant dewelke 4.7mg deslorelin acetaat bevat (I: dag van de implantatie (D0); II: het paard vertoonde hengst-achtig gedragingen (D15); III: het paard vertoonde opnieuw agressief gedrag (D45); IV: chirurgische castratie (D52)). Falomo et al. (2013) beschreven hetzelfde resultaat. Ook in deze studie werd een 4.7mg deslorelin acetaat implant (Suprelorin Virbac Frankrijk) geïmplanteerd bij verschillende hengsten. Een initiële stijging met vervolgens een daling in testosteron vond plaats. De testosteron concentratie was lager dan de basaal waarde gedurende de volgende 42 dagen. In deze studie zijn de resultaten m.b.t. het gedrag minder duidelijk. Terwijl er contradictorische bevindingen aantonen dat het effect van deslorelin nog niet 100% gekend is, kan er hier enerzijds geconcludeerd worden dat deslorelin een goedkoop en gebruiksvriendelijk middel is om tijdelijk agressief gedrag te onderdrukken. Een bijkomend voordeel is dat het een reversibel effect heeft en een goede tolerantie kent GnRH immunisatie Actieve immunisatie tegen GnRH is een tweede manier om hengsten immunologisch te castreren. Dit leidt tot de vorming van een immunologische barrière tussen de hypothalamus en de hypofyse voorkwab. Antistoffen binden op GnRH ter hoogte van de hypothalamo-hypofysaire circulatie, waardoor de binding van GnRH op de gonadotropine receptoren ter hoogte van de hypofyse verhinderd wordt (Herbert en Trigg 2005). Om te leiden tot een inhiberend effect, moet de concentratie aan antistoffen een bepaalde threshold gehalte overschrijden. De secretie van gonadotropines, waaronder testosteron, zal verminderen (Chappel et al. 1980; Schanbacher 1984; Dowsett et al. 1991; Bonneau and Enright 1995, Herbert en Trigg 2005) en het voortplantingsgedrag wordt vervolgens onderdrukt (Herbert en Trigg 2005). 13

19 Naast de castratie effecten, en de effecten op het gedrag, wordt immunisatie tov GnRH ook gebruikt om hengsten die drager zijn van het equine viral arteritis virus te elimineren (Stout en Colenbrander 2004). Het virus zit bij de dragers ter hoogte van de accessoire geslachtsklieren, en wordt tijdens de ejaculatie in het sperma gesecreteerd (Timoney en McCollum 1993). Het ontwikkelen en het in stand houden van het dragerschap is testosteron afhankelijk (McCollum et al. 1994). Het elimineren van asymptomatische dragers is van belang aangezien deze een belangrijk reservoir voor het virus zijn. De virus uitscheiding bij persistent geïnfecteerde hengsten stopt na castratie. Vaccinatie tegen GnRH leidt tot de daling en suppressie van de testosteron productie gedurende een bepaalde periode, waardoor de drager status van de hengsten geëlimineerd kan worden (Stout en Colenbrander 2004). Ook Fortier et al. (2002) toonde aan dat een dagelijkse behandeling met GnRH antagonisten tot een tijdelijke eliminatie van het virus in het sperma leidde GnRH antistof productie Janett et al. (2009) testte een vaccin (Equity) op vijf hengsten. De antistof concentraties werden op verschillende tijdstippen individueel bepaald. Na de 2 de vaccinatie steeg de hoeveelheid aan GnRH antistoffen. Deze was het hoogst binnen de twee weken na de derde vaccinatie. Vervolgens daalt de concentratie opnieuw. Ook werd aangetoond dat de antistof productie individueel verschillend is (figuur 9). Figuur 9 naar Janett et al : Antistof hoeveelheden na vaccinatie met Equity bij 5 hengsten (A-E) (pijlen: tijdstippen van de vaccinatie) Invloed op het testosteron gehalte Ten gevolge van de stijging in GnRH antistoffen in de studie van Janett et al. (2009) daalde de hoeveelheid testosteron ook vanaf de tweede vaccinatie. Deze bleef verlaagd gedurende 6 maanden. De testosteron concentraties bij de controle dieren was hoger en vertoonde meer fluctuaties. Bij de gevaccineerde dieren werden individuele verschillen in respons aangetoond (figuur 10) 14

20 Figuur 10 naar Janett et al : (links) de individuele plasma testosteron concentraties bij 5 hengsten (A-E) na vaccinatie met Equity. (Rechts) de individuele plasma testosteron concentratie bij de controle dieren (F-H). In een studie van Clement et al. (2005) werden acht hengsten op herhaalde tijdstippen gevaccineerd met 1mg GnRH equivalent met tandem peptide OVA gebonden aan 2ml CoVaccine adjuvant. Vier van deze acht hengsten vertoonden een daling in de testosteron hoeveelheid (Good responders (figuur 11)). De GnRH hoeveelheid was hoger bij deze good responders. Figuur 11 naar Clement et al. (2005), Testosteron levels (ng/ml) na vaccinatie In een studie van Malmgrem et al. (2001) daalt de testosteron hoeveelheid rond 4 weken na de vaccinatie (GnRH-BSA conjugaat gebonden aan Equimune adjuvantia). De afwezigheid van voldoende testosteron heeft een negatieve invloed op de spermatogenese. Er is minder sperma productie, de motiliteit van de spermatozoïden daalt, en er zijn meer morfologische abnormaliteiten. In de studie van Turkstra et al. (2005) induceert het gebruikte vaccin (1mg peptide equivalent van G6k-GnRHtandem-dimer gebonden aan ovalbumin (OVA) in CoVaccine HT adjuvantia) een snelle en complete reductie 15

21 van de serum testosteron concentratie. Twee weken na de tweede immunisatie vindt een hoge stijging van de GnRH antilichamen plaats. Ook hier met als gevolg een verminderde sperma motiliteit en een verminderde testis functie. Voor het toedienen van de booster vaccin, waren weinig effecten zichtbaar. Door de tijdstip van het toedienen van dit booster vaccin te veranderen, kan men dus de aanvang van de castratie effecten reguleren (Turkstra et al. 2005) Invloed op het gedrag Ten gevolge van de vaccinatie met Equity (Janett et al. 2009) en samengaand met de daling in testosteron werd een verminderd libido waargenomen vanaf de 2 de immunisatie. Echter, dit was niet even uitgesproken bij alle hengsten en voor het einde van de studie was het libido bij bepaalde individuen terug als voor de behandeling. Deze variabele effecten op het gedrag kunnen verklaard worden doordat het seksueel gedrag niet alleen testosteron afhankelijk is. Zoals hoger beschreven wordt het onder andere ook beïnvloed door de leeftijd en de seksuele ervaring van de onderzochte dieren (Stout 2005). De gevaccineerde hengsten in de studie van Malmgrem et al. (2001) vertoonden een verlaagd libido. Vanaf 4 weken na de toediening, werd aangetoond dat de interesse in de teaser merrie daalde, de tijd tussen het binnen komen in de mating hall en de erectie was verlengd, en de erecties waren zwakker. Bij sommige hengsten was de sperma afname toch mogelijk, wat ook hier waarschijnlijk het gevolg is van de leeftijd en de ervaring van de hengsten. Clement et al. (2005) toonde aan dat in zijn studie geen effect op het libido waargenomen kon worden. Het effect op het gedrag is dus verschillend, het seksueel gedrag kan niet volledig onderdrukt worden door de vaccinatie tegen GnRH Bijkomende factoren en bijwerkingen Tussen de verschillende hengsten bestaat er een variatie in het bekomen effect na de vaccinatie tegen GnRH. De mate waarin de testes onderhevig zijn aan de gevolgen van deze immunisatie, wordt beïnvloed door de leeftijd, de seksuele maturiteit, en de duur van de behandeling (Malmgrem et al. 2001). Ook is de genetische variatie een beïnvloedende factor (Cooper en Herbert 2001). Bij het gebruik van GnRH vaccins, wordt de gewenste hoeveelheid antistoffen pas bekomen na meerdere vaccinaties. Dit is tijdrovend, onpraktisch en duur (Herbert en Trigg 2005). Bijkomende nadelen zijn de systemische en lokale bijwerkingen die kunnen aanwezig zijn na de vaccinatie. Bij het gebruik van improvac bij de merrie (Imboden 2006), of andere GnRH vaccins (Dowsett et al. 1991, 1996; Dalin et al. 2002) werden naast lokale effecten zoals stijfheid ter hoogte van de nek, waar het vaccin toegediend werd, ook koorts en apathie waargenomen. Bij het gebruik van Equity (Janett et al. 2009) werden geen systemische bijwerkingen waargenomen. De hengsten vertoonden wel een kleine, maar niet pijnlijke, zwelling ter hoogte van de injectie plaats. De lokale weefsel reactie kan verklaard worden door de verschillen in de gebruikte adjuvantia. Malmgrem et al. (2001) gebruikte equimune als adjuvans. Een weefsel reactie op de injectie plaats werd aangetoond, met oedeem en pijn. Wel werd opgemerkt dat de hengsten met de meest uitgesproken lokale reactie hogere GnRH antilichaam gehaltes hadden. Volgens Dalin et al. (2002) kunnen de negatieve effecten uitgelokt door de adjuvantia verminderd worden door de hoeveelheid adjuvantia te verminderen. Ook het Freunds adjuvans kan gebruikt worden. Dit is een op olie gebaseerd vaccin. Bij het gebruik van dit 16

22 adjuvans is er ook een reactie ter hoogte van de injectie plaats. Om ethische redenen (Herbert en Trigg 2005) wordt dit adjuvans echter niet meer gebruikt. Turkstra et al. (2005) gebruikte een water oplosbare adjuvantia. Geen van beide induceerde een weefselreactie. Bij de groep die gevaccineerd werd met GnRH/Carbopol (1mg peptide equivalent van G6k- GnRH-tandem-dimeer gebonden aan ovalbumin (OVA) in Carbopol HT adjuvantia), was er wel een grotere variatie in antilichaam respons (1-27%) ten opzichte van de groep gevaccineerd met GnRH/COVaccine (1mg peptide equivalent van G6k-GnRH-tandem-dimer gebonden aan ovalbumin (OVA) in CoVaccine HT adjuvantia). Deze variatie werd ook bevestigd in andere studies (Chappel et al 1980; Schanbacher et al. 1984; Malmgrem et al 2001). Een voordeel bij het gebruik van immunisatie tegen GnRH ten opzichte van het gebruik van GnRH agonisten, is dat er initieel geen stimulerende werking plaatsvind na het toedienen van het vaccin (Herbert en Trigg 2005) GnRH antagonisten en geconjugeerde GnRH toxines Naast de GnRH agonisten en de immunisatie tegen GnRH kunnen ook GnRH antagonisten gebruikt worden om de gonadotropine vrijstelling te onderdrukken. De GnRH antagonisten werken in op dezelfde receptoren als het oorspronkelijk GnRH ter hoogte van de hypofyse. Tijdens hun ontwikkeling worden stapsgewijs hydrofobe residuen, die de proteolyse blokkeren, ingebouwd, wordt de GnRH receptor affiniteit verhoogd, en worden de farmacokinetische eigenschappen van de molecule verhoogd (Fraser 1988). Doordat deze GnRH antagonisten op de receptoren binden kan het endogeen GnRH niet meer binden, wat leidt tot een directe suppressie van de gonadotropine vrijstelling (Conn and Crowley, 1994; Schalley, 1999). Het gebruik van GnRH antagonisten heeft het voordeel dat ze sneller werken zonder een initiële stijging van de gonadotropine secretie, zoals dit het geval is bij het gebruik van GnRH agonisten, en hun effect is sneller reversibel (Huirne and Lambalk 2001). Het nadeel zijn de hoge kosten van het product (Stout en Colenbrander 2004). In een studie van Hinojosa et al. (2001) werden bij vier jonge hengsten 100 µg/kg antarelix (een GnRH antagonist) toegediend. Binnen de 48h na de toediening vond een daling plaats in de plasma concentraties van FSH, LH en oestradiol. Na 4 6 weken waren de concentraties aan oestradiol en LH terug naar hun initiële waarde gestegen, terwijl het gehalte aan FSH verlaagd bleef. In de concentraties aan plasma testosteron daarentegen werd geen significante daling waargenomen. In een studie van Fortier et al. (2002) waar tweemaal daags 10 µg/kg antarelix of cetrorelix (beide GnRH antagonisten) gedurende dagen toegediend werd, waren de testosteron concentraties wel voldoende onderdrukt om de tijdelijke secretie van het EVA virus te verhinderen. In deze studie was het libido van de volwassen hengsten niet onderdrukt (Fortier et al. 2002) in tegenstelling tot bij de jonge hengsten in de studie van Hinojosa et al. (2001). Ook aan GnRH gebonden toxines kunnen gebruikt worden om de gonadotropine synthese te verhinderen. Door proteïne synthese inhibitoren te koppelen aan GnRH of aan GnRH analogen, kan men de vrijstelling van hypofysaire gonadotropines inhiberen (Herbert en Trigg 2005). Echter, nog maar enkele studies m.b.t. het gebruik van GnRH gebonden toxines werden uitgevoerd (Sabeur et al. 2001) en dit op mannelijke honden. Verder studies zijn dus noodzakelijk bij het paard. 17

23 Bespreking Soms wordt een hengst gecastreerd omwille van zijn ongewenst seksueel / agressief gedrag. Echter, na het bestuderen van de literatuur, kan opgemerkt worden dat dit ongewenst gedrag niet 100% geëlimineerd wordt na castratie. Dit persisterend gedrag is niet te wijten aan het ter plaatse laten van een deel van de bijbal, noch aan de aanwezigheid van heterotopisch testikel weefsel, zoals men kan denken (Schumacher 1996). Het is psychisch van aard (Cox et al. 1986), en het wordt beïnvloed door de leeftijd en de ervaring van de hengst voor de castratie. Het testiculair weefsel produceert verschillende hormonen, van dewelke de concentraties bepaald kunnen worden om de diagnose van cryptorchidie te stellen. Wanneer men verschillende studies vergelijkt, kan men concluderen dat de bepaling van het anti-mullerian hormoon de meest specifieke test is. Uit de bestudeerde literatuur blijkt dat er onvoldoende eenduidigheid is met betrekking tot de daling van het testosteron gehalte na de chirurgische castratie. Sommige intacte hengsten vertonen lage concentraties aan testosteron, dewelke kunnen overlappen met de hoge concentraties gevonden bij ruinen (Cox et al. 1973; Cox 1982). De verschillende auteurs hanteren andere concentraties bij dewelke het paard als ruin beschouwd kan worden. Ook het moment waarbij deze waarden bereikt worden, werd nauwelijks bestudeerd. Het British horseracing authority medication and doping control startte een onderzoek in 2014 waarin men de concentraties voor en na castratie wenst te bepalen zodat deze problematiek uitgeklaard kan worden (zie bijlage document BHA). Zoals in deze literatuurstudie beschreven werd kunnen GnRH agonisten gebruikt worden om de voortplanting te onderdrukken. Echter de effecten en de chronische toediening van deze agonisten bij hengsten worden bediscussieerd en de bevindingen zijn controversieel (Shonert 2012). Schonert (2012) en Falomo (2013) beschreven dezelfde resultaten bij het gebruik van een GnRH agonist, het deslorelin implataat. Initieel werd een stijging in de hormoon gehaltes, samengaand met een verhoogde uiting van het mannelijk gedrag aangetoond, waarna beide afnamen. Ook Boyle et al. (1991) en Johnson et al. (2003) beschreven dezelfde resultaten. Andere auteurs, Montovan et al. (1990) en Stout en Colenbrander (2004), geloven dat de GnRH agonisten niet geschikt zijn voor de reductie van de serum concentraties van gonadotropines, testosteron en oestrogenen. In deze studies werd geen ruin-achtig gedrag bekomen bij de behandelde hengsten. Schonert et al. (2012) concludeerde dat de sensitiviteit van de hengsten ten opzichte van de GnRH implantaten individueel verschillend zijn. De initiële stijging in hormoon concentraties en mannelijk gedrag zoals beschreven bij het gebruik van GnRH agonisten is niet aanwezig bij het gebruik van anti-gnrh vaccins, wat een voordeel kan zijn. Een bijkomend voordeel bij het gebruik van GnRH vaccins is dat men de aanvang van de castratie effecten kan reguleren door de tijdstip wanneer het booster vaccin toegediend wordt te beïnvloeden. Meerdere vaccinaties zijn dus nodig, wat tijdrovend, onpraktisch en kostelijk is, dit als een nadeel aanzien worden (Herbert en Trigg 2005). Een ander nadeel bij het gebruik van deze vaccins zijn de systemische en lokale bijwerkingen, die min of meer uitgesproken, of afwezig zijn, afhankelijk van het gebruikt vaccin. Equity (Janett et al. 2009) is hier het meest geschikt aangezien dit vaccin geen systemische bijwerkingen veroorzaakt, en de lokale weefselreacties ter hoogte van de injectie plaats niet pijnlijk zijn. Zoals dit het geval is bij het gebruik van GnRH agonisten is ook bij het gebruik van anti-gnrh vaccins de respons van de dieren individueel verschillend, en, het seksueel gedrag kan niet volledig onderdrukt worden. 18

24 De anti-gnrh vaccins en GnRH antagonisten ook andere toepassingen, zoals het elimineren van dragers van het equine viral arteritis virus (McCollum et al. 1994; Fortier et al. 2002; Stout en Colenbrander 2004). Tot nu toe zijn alleen GnRH agonisten en anti-gnrh vaccins de enigste twee methodes die succesvol kunnen gebruikt worden om te fertiliteit van verschillende diersoorten te beïnvloeden (Herbert en Trigg 2005). Wat betreft de GnRH antagonisten en de GnRH gebonden toxines is bijkomend onderzoek noodzakelijk. 19

25 Referenties : Almeida, J., Conley, A.J., Mathewson, L. and Ball, B.A. (2012) Expression of anti-müllerian hormone, cyclindependent kinase inhibitor (CDKN1B), androgen receptor and connexin 43 in equine testes during puberty. Theriogenol. 77, Almeida J., A.J. Conley, B.A. Ball, (2013) Expression of anti-müllerian hormone, CDKN1B? Connexin 43, androgen receptor and steroidogenic enzymes in the equine cryptorchid testis. EVJ 45 (2013) Amann R.P. (1993) Functional anatomy of the adult male. In: MCKINNON A.O., VOSS J.L. Equine reproduction Arighi, M., Bosu, W.T.K. (1989): comparison of homonal methods for diagnosis of cryptorchidism in horses. Equine Vet. Sci. 9, Ball, B.A., Conley, A.J., Grundy, S.A., Sabeur, K. and Liu, I.K. (2008) Expression of anti-mullerian hormone (AMH) in the equine testis. Theriogenology 69, Bonneau, M. and Enright, W.J. (1995) Immunocastration in cattle and pigs. Livestock Prod. Sci. 42, Burger, D., Janett, F., Imboden, I., Zientara, S., Timoney, P., Thun, R., (2004). Treatment of an equine arteritis virus-shedding stallion by immunization against GnRH. Proceedings of the 15th International Congress, Porto Seguro. Anim. Reprod 1, 1281 Burger, D., Janett, F., Vidament, F., Stump, R., Fortier, G., Imboden, I., Thun, R., (2006). Immunization against GnRH in adult stallions effects on semen characteristics, behaviour and shedding of equine arteritis virus. Anim. Reprod. Sci. 94, Chaffaux S. Le testicule de l'etalon, glande endocrine (1992). Rec. Méd. Vét., 1992, 168, 11-12, Chappel, S.C., Ellinwood, W.E., Huckins, C., Herbert, D.C. and Spies, H.G. (1980) Active immunization of male Rhesus monkeys against luteinizing hormone releasing hormone. Biol. Reprod. 22, Clay CM, Clay JN. (1992) Endocrine and testicular changes associated with season, artificial photoperiod, and the peri-pubertal period in stallions. Vet Clin North Am Equine Pract 1992;8: Clement F., Vidament M., Daels P., Van der Meer F., Larry J.L., Colenbrander B., Turkstra J., (2005) Immunocastration in stallions: effect on spermatogenesis and behaviour. Animal reproduction science 89 (1-4) Conn, P.M., Crowley Jr., W.F., (1994). Gonadotropin-releasing hormone and its analogs. Ann. Rev. Med. 45, Coomer R.P.C., Gorvy D.A., McKane S.A., Wilderjans H., (2016) Inguinal percutaneous ultrasound to locate cryptrochid testes. Equine Vet. Educ. (2016) 28 (3) Cooper, D.W., Herbert, C.A., (2001). Genetics, biotechnology and population management of over-abundant mammalian wildlife in Australasia. Reprod. Fertil. Dev. 13,

26 Cox J.E. (1982) Blood test for equine cryptorchidism. Vet. Rec. 110, 211 Cox, J.E., Redhead, P.H. and Dawson, F.E. (1986) Comparison of the measurement of plasma testoserone ans plasma oestrogens for the diagnosis of cryptorchidsm in the horse. Equine vet. J Cox, J.E. (1986) Behaviour of the false rig: Causes and treatments. Vet. Rec. ll0, Cox J.E., William J.H., Rowe P.H., Smith J.A. (1973) Testosterone is normal, cryptorchid and castrated male horses. EVJ 1973, Apr, 5,2, Cox, J.E., Edwards, G.B., Neal, P.A. (1975) Suprapubic paramedian laparotomy for equine abdominal cryptorchidism. Vet. Rec. 97, Cox, J.E., Edwards, G.B. and Neal, P.a. (1997) Suprapubic paramedian laparotomy for equine abdominal cryptorchidism. Vet. Rec. 97, D Occhio, M.J., Aspden, W.J., (1996). Characteristics of luteinizing hormone (LH) and testosterone secretion,pituitary responses to LH-releasing hormone (LHRH), and reproductive function in young bulls receiving the LHRH agonist deslorelin: effect of castration on LH responses to LHRH. Biol. Reprod. 54, Dalin, A.M., Andresen, O., Malmgren, L., (2002). Immunization against GnRH in mature mares: antibody titres, ovarian function hormonal levels and estrous behaviour. J. Vet. Med. 49, De Fourmestraux C., O. Geffroy, B. Siliart, O. Albaric and C. Tessier (2014): evalutation of success rate of laparoscopic castration without orchidectomy in 32 mature horses. EVE 2014, 26 (1) Dowsett, K.F., Pattie, W.A., Knott, L.M., Jackson, A.E., Hoskinson, R.M., Rigby R. P.G. and Moss, B.A. (1991) A preliminary study of immunological castration in colts. J. Reprod. Fert. Suppl. 44, Dowsett, K.F., Knott, L.M., Tshewang, U., Jackson, A.E., Bodero, D.A.V., Trigg, T.E., (1996). Suppression of testicular function using two dose rates of a reversible water soluble gonadotrophin releasing hormone (GnRH) vaccine in colts. Aust. Vet. J. 74, Eisenhower K.M., P.M. McCue, D.K. Nayden, Y. Osawa, J.F. Roser, (1994) Localization of aromatase in equine Leydig cells, Domestic Anim. Endocrinol. 11 (1994) Falomo M.A., Normando S., Zanibellato E., Romagnoli S., (2013) Sexual behavior and serum testosteron concentration in stallions treated with slow-release implants of deslorelin acetate. Journal of veterinary behavior 8, Fortier, G.,Vidament, M., DeCraene, F., Ferry, B., Daels, P.F., (2002). The effect of GnRH antagonist on testosterone secretion, spermatogenesis and viral excretion in EVA-virus excreting stallions. Theriogenology 58, Fraser, H.M., (1982). Antifertility effects of GnRH. J. Reprod. Fertil. 64, Fraser, H.M., (1988). LHRH analogues: their clinical physiology and delivery systems. Baillieres Clin. Obstet. Gynaecol. 2,

27 Gaillard and silberzahn (1987) Gaillard, J-L., Silberzahn, P., 1987 Aromatization of 19-norandrogens by equine testicular microsomes. Journal of biological Chemestry 262, Garner, D.L., Hafez, E.S.E., (2004). Espermatozóide e plasma seminal (Sperm andseminal plasma). In: Hafez, E.S.E., Hafez, B. (Eds.), Reproduc ão Animal, seventhedition. Manole, São Paulo, pp Hazum, E., Conn, P.M., (1988). Molecular mechanism of gonadotrophin releasing hormone (GnRH) action: I. the GnRH receptor. Endocrinol. Rev. 9, Hejmej, A., Gorazd, M., Kosiniak-Kamysz, K., Wiszniewska, B., Sadowska, J. and Bilinska, B. (2005): Expression of aromatase and oestrogen receptors in reproductive tissues of the stallion and a single cryptorchid visualised by means of immunohistochemistry. Domest. Anim. Endocrinol. 29, Herbert C.A., Trigg T.E. (2005) applications of GnRH in the control and management of fertility in female animals. Animal Reprod. Sci Hinojosa A.M., Bloeser J.R., Thomson S.R.M., Watson E.D., (2001) The effect of a GnRH antagonist on endocrine and seminal parameters in stallions. Theriogenology 56: Hoffman B., A. Landeck, (1999) Testicular endocrine function, seasonality and semen quality of the stallion, Anim. Reprod. Sci. 57 (1999) Huckle,WR., Conn, PM., (1988). Molecular mechanisms of gonadotrophin releasing hormone (GnRH) action: II. The effector system. Endocrinol. Rev. 9, Hunckle, WR., Conn, PM., (1988) Molecular mechanism of gonadotropin releasing hormone (GNRH) action. 1. The GNRG receptor. Endocrine reviews, volume 9, issue 4, pages Nov 1988 Huirne, J.A.F., Lambalk, C.B., Gonadotrophin-releasing-hormone-receptor antagonists. Lancet 358, Illera J.C., Silvan G., Munro C.J., Lorenzo P.L., Illera M.J., Liu I.K.M., Illera M.(2003) Amplified androstenendione enzymeimmunoasay for the diagnosis of cryptorchidism in male horse: comparison with testosterone and estrone sulphate methods. Journay of steroid biochemistry and molecular biology 84 (2003) Imboden, I., Janett, F., Burger, D., Crowe, M.A., Hässig, M., Thun, R., (2006). Influence of immunization against GnRH on reproductive cyclicity and estrous behavior in the mare. Theriogenology 66, Inoue J., W.A. Cerbito, N. Oguri, T. Matsuzawa, K. Sato, Serum levels of testosterone and oestrogens in normal and infertile stallions, Int. J. Androl. 16 (1993) Janett F., Stump R., Burger D., Thun R. (2009) Suppression of testicular function and sexual behaviour by vaccination against GnRH (Equilty) in the adult stallion. Animal reproduction science 115, Jann, H.W. and Rains, J.R. (1990) diagnostic ultrasonography for the evaluation of cryptorchidism in horses. J. Am. Vet. Med. Assoc. 196, Johnson, C.A., Thompson, D.L.J., Cartmill, J.A., (2003). Effects of deslorelin acetate implants in horses: single implants in stallions and steroidtreated geldings and multiple implants in mares. J. Anim. Sci. 81,

28 Junaidi, A. Williamson, P.E., Martin, G.B., Stato, P.G., Blackberry, M.A., Cummins, J.M., and trigg, T.E. (2007) : Pituitary and testicular endocrine responses to exogenous gonadotropin-releasing hormone (GnRH) and luteinising hormone in male dogs treated with GnRH agonsit implants. Reprod. Fertil. Dev. 19, Karten, M.J., Rivier, J.E., (1986). Gonadotrophin-releasing hormone analog design. Structure-function studies toward the development of agonists and antagonists: rationale and perspective. Endocrinol. Rev. 7, Kutzler, M. and Wood, A. (2005): Non-surgical methods of contraception and sterilisation. Theriogenology 66, Leung D.K., Tang, F.P., Wan, T.S. and Wong, J.K. (2011) Identification of cryptorchidism in horses by analysing urine samples with gas chromatography/mass spectrometry. Vet. J. 187, Line, S.W., Hart, B.L., Sanders, L. (1985): effect of prepubertal versos postpubertal castration on sexual and aggressive behaviour in male horses. J. Am. Vet. Med. Assoc. 186, Ludwig, C. (2008): Downregulation der hypophysären GnRH-Rezeptoren mit einem neuen GnRHImplantat beim Rüden. Dissertation, Justus-Liebig-Universität Giessen, Germany Malmgrem, L., Andresen, O. and Dalin, A.M. (2001) : Effect of GnRH immunisation on hormonal levels, sexual behaviour, semen quality and testicular morphology in mature stallions. Equine Vet. J. 33, Martens A. (2015) Cursus bijzondere heelkunde 2015 p. 141 McCollum, W.H., Little, T.V., Timoney, P.J., Swerczek, T.W., (1994). Resistance of castrated male horses to attempted establishment of the carrier state with equine arteritis virus. J. Comp. Pathol. 111, McKinnon A.O., Squires E.L., Vaala W.E. and Varner D.D. (2011), Equine reproduction, second edition, Willey blackwell, 2011, Miguel Alejandro Silve Rua, Celia Raquel Quirino, Rosemary Bastos, Aylton Bartholazzi Junior, Paula Nascimento Santoro, Mariana da Silva Ribeiro, Luis Fonseca Matos, Marcus Antonio Pessanha Barreto. (2015) Evaluation of the sexual behaviour and testosterone concentrations of mangalarga marchador stallions. Applied animal behaviour science 171 (2015) Miller, C.D., Varner, D.D., Blanchard, T.L., Thompson, J.A., Johnson, L., (1997). Effects of altrenogest on behaviour and reproductive function of stallions. Proc. Am. Assoc. Equine Pract. 43, Montovan, S. M., Daels, P. F., Rivier, J., Hughes, J. P., Stabenfeldt, G. H. and Lasley, B. L. (1990): The effect of a potent GnRH agonist on gonadal and sexual activity in the horse. Theriogenology 33, Morganti M, Conley AJ, Vico AE, Munro CJ, Ball BA. (2010) Stallion-like behavior in mares: what is the role of the adrenal glands? Proc 56 Ann Conv Am Assoc Equine Pract 2010;56:314 Muyan M., J. Roser, N. Dybdal, D.M. Baldwin, (1993) Modulation of gonadotropin-releasing hormonestimulated luteinizing hormone release in cultured male equine anterior pituitary cells by gonadal steroids, Biol. Reprod. 49 (1993) Naden J, Amann RP, Squires EL. (1990) Testicular growth, hormone concentrations, seminal characteristics and sexual behaviour in stallions. J Reprod Fertil 1990;88:

29 Nett T.M. (1993) Reproductive endorcrine fonction testing in stallions. MCKINNON A.O., VOSS J.L. Equine reproduction. Philadelphia : Lea and Febiger, 1993, Odell W.D. (1989) the leydig cel. DeGROOT L.J. Endocrinology. Volume 3. Philadelphia: W.B. Saunders company, 1989, Pader K., (2006) Evaluation d'une technique de castration du cheval par laparoscopie. These Tou Padula A.M., (2005) GnRH analogues - agonists and antagonists. Anim. Reprod. Sci. 88, Palme, R., Holzmann A. and Mitterer Th., (1994) measuring fecal estrogens for the diagnosis of cryptorchidism in horses. Theriogenology 42: , 1994 Palme, R. Scherzer S., Stollar K., P. Nagy, Szenci O., Mostl E., (1998) Hormonal diagnosis of equine cryptorchidism. Wien. Tierarzti. Mschr. 85 (1998) Parker R.A., (2016) What is the best test for cryptorchidism? Equine vet. Educ. (2016) 28 (2) Pineda M.H. (2003) Male reproductive system. In: Pineda M.H., DOOLEY M.P. Veterinary endocrinology and reproduction. Fifth edition. Iowa : Blackwell Publishing Company, 2003, Raeside J.I. (1978) Seasonal changes in the concentration of oestrogens and testosterone in the plasma of the stallion. Anim. Reprod. Sci., 1978, 1, Roberts, S.J., Beaver, B.V., (1987). The use of progestins for aggressive and for hypersexual horses. In: Robinson N.E. (Ed.), Current Therapy in Equine Medicine 2. W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp Sabeur, K, Ball, BA, Nett, TM (2001) A gonadotropin-releasing hormone agonist conjugated to pokeweed antiviral protein disrupts reproductive function in male dogs. Biology of reproduction volume 64, 250 Sabeur, K., Ball, B.A., Nett, T.M., Ball, H.H., Liu, I.K., (2003). Effect of GnRH conjugated to pokeweed antiviral protein on reproductive function in adult male dogs. Reproduction 125, Schalley, A.V., (1999). LH-RH analogues: I. Their impact on reproductive medicine. Gynecol. Endocrinol. 13, Schambourg, M.A., Farley, J.A., Marcoux, M. and Laverty, S. (2006) Use of transabdominal ultrasonography to determine the location of cryptorchid testes in the horse. Equine Vet. J. 38, Schanbacher, B.D. (1984) Active immunization against LH-RH in the male. In: Immunological Aspects of Reproduction in Mammals, Ed: D.B. Crighton Butterworths, London. pp Schonert S., Reher M., Gruber A.D. and Carstanjen B., (2012) Use of deslorelin implant for influencing seks hormones and male behaviour in a stallion - case report. Acta veterinarie Hungarica 60 (4), pp Schumacher, J. (1996) Complications of castration. Equine Vet. Educ. 8, Silberzahn P., E.J.M. Pouret, I. Zwain, (1989) Androgen and oestrogen response to a single injection of hcg in cryptorchid horses, Equine Vet. J. 21 (1989)

30 Stewart BL, Roser JF (1998): Effects of age, season and fertility status on plasma and intratesticular immunoreactive inhibin concentrations in stallions. Domest. Anim. Endocrinol. 15:129 Stickle, R.L. and Fessler, J.F. (1978) Retrospective study of 350 cases of equine cryptorchidism. J. Am. vet. med. Ass. 172, Stout, T.A.E. and Colenbrander, B. (2004): suppressing reporductive activity in horses using GnRH vaccines, antagonists or agonists. Anim. Reprod. Sci. 82/83, Stout, T.A.E., (2005) Modulating reproductive activity in stallions: a review. Proceedings of the 4th International Symposium on Stallion Reproduction, Hannover. Anim. Reprod. Sci. 89, Taya K, Nagata S, Tsunoda N, Nagamine N, Tanaka Y, Nagaoka K, (2000) Testicular secretion of inhibin in stallions. J Reprod Fertil Suppl 2000:43 50 Timoney, P.J., McCollum, W.H., (1993). Equine viral arteritis. Vet. Clin. N. Am. Equine Pract. 9, Trigg, T.E., Doyle, A.G., Walsh, J.D. and Swangchanuthai, T. (2006) A revieuw of advances in the use of the GnRH agonist deslorelin in control of reproduction. Theriogenology 66, Turkstra, J.A. (2005): Active immunistaion against gonadotropin-releasing hormone, an effective rool to block the fertility axis in mammals. Phd Thesis, Utrecht University, The Nederlands Voermans, M., Rijkenhuizen, A.B.M. and van der Velden, M.A. (2006) The complex blood supply to the equine testis is a cause of failure in laparoscopic castration. Equine Vet. J. 38,

31 Bijlagen 26