UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar KRAAKBEENREGENERATIE: STATE OF THE ART. Door. Bart BROECKX

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar KRAAKBEENREGENERATIE: STATE OF THE ART Door Bart BROECKX Promotor: Dr. Geert Verhoeven Medepromotor: Prof. dr. Bernadette Van Ryssen Literatuurstudie in het kader van de Masterproef

2

3 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar KRAAKBEENREGENERATIE: STATE OF THE ART Door Bart BROECKX Promotor: Dr. Geert Verhoeven Medepromotor: Prof. dr. Bernadette Van Ryssen Literatuurstudie in het kader van de Masterproef

4 VOORWOORD Na het schrijven van dit tweede deel van mijn masterproef, zou ik graag een aantal mensen willen bedanken. Zonder hen was dit niet tot stand gekomen. Dr. Geert Verhoeven reikte me ook voor het tweede deel een onderwerp aan. Hij was altijd bereikbaar voor vragen en bood hulp waar nodig. Ook het herhaaldelijk nalezen was voor hem geen probleem. Bovendien is hij één van de personen die mij al vele jaren begeleidt en me de kans heeft geboden om kennis te maken met de wereld van de diergeneeskunde. Oprecht bedankt voor het vertrouwen, de gegeven kansen en al deze fijne jaren! Professor dr. Bernadette Van Ryssen zou ik willen bedanken voor haar aanwijzingen, vlotte hulp en het herhaaldelijk nalezen. De volgende personen zou ik ook willen bedanken voor hun hulp: Professor dr. Daniël Saris, dr. Alan Getgood, dhr. Kris Motmans. Mijn familie zou ik ook willen bedanken voor hun steun en hulp waar nodig gedurende de voorbije jaren. Afgelopen jaar was zeker niet altijd even gemakkelijk, des te meer blijkt dat gezondheid absoluut één van de belangrijkste zaken is in het leven. Speciale dank aan mijn mama voor het nalezen en ook gewoon voor al de rest! Tot slot (en ook hier geldt last but not least) zou ik graag mijn vriendin Astrid willen bedanken. Ook zij heeft het afgelopen academiejaar zeker haar deel tegenspoed gehad, maar ondanks dat alles is ze de beste vriendin die je je kan wensen. Bedankt voor alles! En ik hoop met heel mijn hart dat er nog veel jaren mogen volgen! Voor altijd in ons hart Lea Van den Langenbergh Mijn lieve schoonmama

5 SAMENVATTING... 1 ABSTRACT INLEIDING LITERATUURSTUDIE LICHAAMSEIGEN HERSTEL STIMULATIE VAN DE LICHAAMSEIGEN HERSTELMOGELIJKHEDEN Lavage en debridement Verwijderen van oppervlakkige kraakbeenschade Stimulatie van beenmerg Osteotomie TRANSPLANTATIETECHNIEKEN Autologe weefseltransplantatie Perichondriale/periostale grafts Osteochondrale transplantatie of mozaïekplastie Allogeneïsche weefseltransplantatie TISSUE ENGINEERING Matrix Cellen Signaalmoleculen Toepassingen BESLUIT LITERATUURLIJST BIJLAGE Lijst van gebruikte afkortingen De auteur en de promotor geven de toelating deze literatuurstudie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen hiervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze literatuurstudie berust bij de promotoren. De auteur en de promotoren zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

6 SAMENVATTING Hyalien kraakbeen is een belangrijk onderdeel van synoviale gewrichten. Verschillende aandoeningen kunnen dit kraakbeen beschadigen. De lichaamseigen herstelmogelijkheden van deze defecten zijn beperkt en bovendien afhankelijk van de graad van beschadiging. Het probleem van dit beperkte herstel tracht men op te lossen vanuit twee invalshoeken: enerzijds door het lichaamseigen herstel te bevorderen, anderzijds door middel van transplantatietechnieken. Doorheen de jaren zijn verscheidene nieuwe technieken ontwikkeld en heeft men reeds bestaande technieken aangepast, maar tot nu toe zonder het bereiken van een restitutio ad integrum. Een multidisciplinaire aanpak (met onder meer chirurgie, fysiotherapie, ultrageluid) is veelbelovend. Deze literatuurstudie tracht een overzicht te geven van veel gebruikte chirurgische behandelingen en nieuwe ontwikkelingen. ABSTRACT Hyaline cartilage is an important part of synovial joints. Damage to this cartilage has many different etiologies. The intrinsic repair of these defects is limited and is influenced by the severity of the damage. Two different concepts are being used in an attempt to restore cartilage defects: techniques that try to improve the intrinsic repair and transplantation techniques. Throughout the years, many new techniques and modifications of existing ones have been developed, without a restitutio ad integrum though. A multidisciplinary approach (consisting of surgery, physiotherapy and ultrasound, for example) is promising. This review addresses the most widely used surgical techniques and new developments. Key words: animal cartilage intrinsic repair tissue engineering transplantation

7 1. INLEIDING Hyalien gewrichtskraakbeen is een belangrijk onderdeel van synoviale gewrichten 30. Dit kraakbeen vormt een glijvlak en verzorgt op die manier een vlotte beweging met een minimale weerstand 8,30. Een heleboel aandoeningen, waaronder trauma, osteochondritis dissecans en standafwijkingen, kunnen aanleiding geven tot beschadiging van het kraakbeen en omliggende weefsels 25,35,49. Osteoarthritis (OA) is eigenlijk het gemeenschappelijke eindpunt van al die verschillende aandoeningen 35. In Amerika zouden één op vijf volwassen honden getroffen worden door OA 38. In een studie bij katten ouder dan twaalf jaar, werd bij negentig procent radiologisch bewijs gevonden voor OA. Deze populatie was niet ad-random gekozen maar bij geen van deze katten was OA het hoofdprobleem en was het vinden van deze aandoening dus eerder toeval 22. In Amerika leden reeds in 2005 ongeveer 27 miljoen volwassen Amerikanen aan OA 34. In deze studie wordt getracht een overzicht te geven van de intrinsieke herstelmogelijkheid van het lichaam en de verschillende ingrepen en benaderingen die men gebruikt om kraakbeen te herstellen. 2. LITERATUURSTUDIE 2.1 LICHAAMSEIGEN HERSTEL De lichaamseigen mogelijkheden om kraakbeen te herstellen zijn eerder beperkt 49. Dit wordt duidelijk als we de evolutie van verschillende types letsels bestuderen. We onderscheiden oppervlakkige en diepere (tot op het subchondrale bot) beschadigingen van het gewrichtsoppervlak 9,25,49. Oppervlakkige, chondrale of partial-thickness defecten tasten enkel het hyaliene kraakbeen aan. In de nabijheid van het letsel treedt lokaal een vermeerdering van chondrocyten op 49. Deze zal echter onvoldoende zijn om het letsel te herstellen, zodat het zeer lang blijft bestaan. Progressie naar fullthickness defecten kan optreden. Diepe, osteochondrale of full-thickness defecten herstellen daarentegen wel. Het herstelweefsel heeft echter een ander uitzicht en andere samenstelling dan het oorspronkelijke weefsel en wordt fibrocartilago genoemd. Fibrocartilago bevat meer collageen type I, minder glycosaminoglycanen, niet-kraakbeenspecifieke proteoglycanen, is stijver en kan beschouwd worden als een combinatie van bindweefsel en kraakbeen 9,10,45. Bovendien is de biomechanische kwaliteit in vergelijking met het oorspronkelijke kraakbeen ook duidelijk inferieur 7,25. Dit weefsel vindt zijn oorsprong in de beschadiging van het subchondrale bot. Hierdoor ontstaat een lokale bloeding, waaruit een bloedklonter ontstaat. Deze bloedklonter kan slechts defecten opvullen met een diameter tussen 1 en 2 mm 25 : de heling van zowel grotere als kleinere defecten kan dus verminderd zijn. Mesenchymale cellen uit het beenmerg migreren naar deze bloedklonter en vermeerderen er lokaal onder invloed van onder meer platelet derived growth factor (PDGF). Na differentiatie produceren deze cellen een extracellulaire matrix die qua samenstelling wel steeds meer evolueert in de richting van het hyaliene kraakbeen (een geleidelijke stijging van het collageen type II) maar nooit meer de originele staat bereikt 19,36. Het herstel blijft dus beperkt tot het minderwaardige fibrocartilago 45. 2

8 Aangezien er veel meer gradaties zijn in kraakbeenschade, is de opdeling in partial- en full-thickness defecten misschien wat te beperkt om letsels te beschrijven. Daarom kan men de gemodificeerde Outerbridge classificatie gebruiken 39. Deze omvat vijf graden. Graad nul betekent dat het kraakbeen intact is. Graad één duidt op kraakbeenverweking. Graad twee zijn die defecten (oppervlakkige ulceratie, fibrillatie of fissuren) die minder dan vijftig procent van de totale kraakbeendikte omvatten. Graad drie zijn de diepere defecten die minimum vijftig procent van de dikte omvatten, maar het onderliggende subchondrale bot ligt niet bloot. Qua heling komen graad één tot en met drie overeen met de oppervlakkige kraakbeendefecten. De laatste graad is graad vier: dit is een full-thickness defect met volledige denudatie van het subchondrale bot. De heling van deze defecten komt overeen met die van de full-thickness defecten. 2.2 STIMULATIE VAN DE LICHAAMSEIGEN HERSTELMOGELIJKHEDEN Lavage en debridement Een lavage houdt eigenlijk niet veel meer in dan het grondig spoelen van een gewricht. Dit kan gebeuren met behulp van naalden of een artroscoop. Verschillende soorten spoelvloeistof kunnen gebruikt worden (onder meer NaCl en Ringer) 25. Men vermoedt dat door het spoelen débris en ontstekingsfactoren worden verwijderd uit het gewricht 36. Recent onderzoek bij het konijn toonde duidelijk aan dat lavage een gunstig effect had op de evolutie van OA 18. Lavage blijkt dus wel degelijk effectief te zijn om de progressie van OA te vertragen. Deze techniek zal echter geen herstel induceren. Andere technieken zijn dus nodig om het kraakbeen weer tot zijn oorspronkelijke staat terug te brengen. Een andere studie vergeleek behandeling met corticosteroïden en lavage, placebo en lavage en tot slot gewrichtsaspiratie met toediening van corticosteroïden met elkaar. Dit toonde aan dat de combinatie van corticosteroïden en lavage betere resultaten gaf dan de andere twee groepen 47. Jammer genoeg was de blindering niet volledig en bovendien namen enkel patiënten met inflammatoire arthritis deel aan dit onderzoek. De resultaten van dit onderzoek kunnen dus niet zomaar doorgetrokken worden naar de behandeling van onder meer OA. Lavage is ook een onderdeel van een debridement van een gewricht 25. Hierbij wordt er dus niet alleen gespoeld, maar worden er ook gewrichtsmuizen en osteofyten verwijderd, eventueel gecombineerd met een meniscectomie in geval van een knieprobleem Verwijderen van oppervlakkige kraakbeenschade Shaving, laser abrasion en radiofrequentie ablatie zijn technieken waarbij beschadigd kraakbeen uit de gewrichten wordt verwijderd 25,26. Het gebruiken van een laser en radiofrequentie zijn alternatieven voor het mechanische snijden 25,46. Het probleem is dat dit principe misschien wel logisch lijkt (nl. het verwijderen van slecht weefsel), maar ze zorgt voor meer schade 26. Uit onderzoek bleek namelijk dat het wegsnijden niet enkel invloed 3

9 had op het zieke maar ook op het naburige gezonde weefsel: het aantal chondrocyten in de omgeving van het verwijderde beschadigde kraakbeen daalde. Of dit door apoptose of necrose gebeurde, is niet duidelijk. Bovendien veranderde het metabolisme van de resterende chondrocyten niet. Er zijn dus minder chondrocyten die met eenzelfde metabolisme een veel groter defect moeten opvullen. Deze technieken zijn niet de enige waarbij men snijdt in het kraakbeen (zie verder). Het is wel zo dat deze technieken enkel dit wegsnijden tot doel hebben. Daarom zijn deze technieken eigenlijk sowieso gedoemd te mislukken. Dit blijkt duidelijk uit een studie bij konijnen waarbij shaving vergeleken wordt met abrasie chondroplastie 31 (zie verder). Bij geen van de 40 gebruikte konijnen waarop shaving was toegepast, werd een herstel van het gecreërde defect gezien. Bovendien leek het overblijvende kraakbeen verder te degenereren en dit reeds na vier weken. Het gebruik van deze techniek zonder verdere ingrepen is dus sterk af te raden. Het gebruikte instrumentarium blijkt ook zijn invloed te hebben: een studie bij schapen vergeleek de toegebrachte schade van het mechanische snijden en radiofrequentie ablatie met elkaar. Gedurende de ganse onderzoeksperiode van 24 weken bleek dat radiofrequentie ablatie het voor elk criterium beter deed (met andere woorden minder schade toebracht) dan het zuiver mechanisch snijden Stimulatie van beenmerg In deze groep zitten de technieken die gebaseerd zijn op het creëren van een toegang tot het beenmerg doorheen het subchondrale bot 25. Hierdoor probeert men herstel op gang te brengen. Drie technieken worden gebruikt: Pridie drilling, microfracture en abrasie chondroplastie. In 1959 ontstond dankzij Pridie een nieuwe techniek waarbij er gaten werden geboord doorheen het subchondrale bot dat aan de oppervlakte bloot lag 25,27. Dit wordt Pridie drilling genoemd. Microfracure is eigenlijk een modificatie van Pridie drilling 43. Waar bij Pridie drilling de diameter van de geboorde gaten ongeveer 2 à 2,5 mm bedraagt, is dit bij microfracture slechts 0,5 1 mm 25. Hierdoor blijft de integriteit van het subchondrale bot beter bewaard. Bovendien kan deze techniek artroscopisch worden uitgevoerd 25. Bij beide technieken dient men ook steeds een debridement te doen van het aangetaste gewricht 27,42. Microfracture wordt nu het meest toegepast 36,43. In een poging om het herstelweefsel te verbeteren, probeerde men microfracture te combineren met het gebruik van de groeifactor bone morphogenetic protein 7 (BMP-7) 32. Zowel het gebruik van enkel microfracture als BMP-7 ten opzichte van de controlegroep (zonder behandeling) gaf betere resultaten. De combinatie van beide bleek ook superieur te zijn ten opzichte van de controlegroep én de behandeling met één van beide. Het herstelweefsel was echter nog steeds geen hyalien kraakbeen. Bij abrasie chondroplastie (ook wel artroscopische abrasie arthroplastie 29 genoemd) wordt er met behulp van een artroscoop een deel van het subchondrale bot afgeschraapt tot er bloed vanuit het onderliggende weefsel stroomt. Daarnaast wordt er een debridement uitgevoerd van het omliggende weefsel waarbij onder meer osteofyten verwijderd worden. De techniek is geëvolueerd sinds zijn ontstaan: aanvankelijk werden speciale boren gebruikt om meerdere openingen te creëren 2. Het verschil tussen deze techniek en de eerste twee was dan ook zeer beperkt en bovendien afhankelijk 4

10 van aanpassingen van de chirurg. Later werd het dak van de subchondrale plaat volledig verwijderd. Hierdoor ontstond een volledige zone van herstelweefsel in plaats van verschillende lokale maar geïsoleerde zones 29. Onderzoek bij de hond toonde aan dat er wel degelijk herstelweefsel werd gevormd en de techniek dus superieur was ten opzichte van de controlegroep. Het herstelweefsel is echter fibrocartilago 2. Het is belangrijk dat de bloedklonter die lokaal ontstaat, ter plaatse blijft. Omwille hiervan raadt men humane patiënten aan gedurende twee maanden niet te steunen op het aangetaste been 29. Het eerder vermelde onderzoek bij konijnen waar men abrasie chondroplastie vergeleek met chondral shaving toonde duidelijk aan dat de eerste techniek superieur was. Post-operatief werden de konijnen ad random in twee groepen verdeeld waarbij de ene continue passieve beweging en de andere intermitterende actieve beweging als nabehandeling ondergingen. De continue passieve beweging gaf duidelijk betere resultaten zowel qua vulling van het defect als kwaliteit van het herstelweefsel. De juiste reden hiervan is ongekend maar men vermoedt dat het wordt veroorzaakt door een betere voeding van het kraakbeen door de continue beweging 31. Autologe matrix-geïnduceerde chondrogenesis (AMIC) is ook een modificatie van microfracture 20,43. Men voert nog steeds eerst de microfracture uit, maar combineert dit met het aanbrengen van een collageen type III/I membraan op het defect 14,43. Deze techniek blijkt echter geen betere maar net slechtere resultaten te geven in vergelijking met microfracture alleen 14. Tot hiertoe is men bij geen enkele van de technieken erin geslaagd om het echte hyaliene kraakbeen te vormen. Het herstelweefsel blijft dus steeds het (minderwaardige) fibrocartilago Osteotomie De exacte definitie van elleboogdysplasie staat nog ter discussie. Het is meestal een probleem van het mediale deel van de processus coronoïdeus van de ulna en de mediale condyl van de humerus. Het geheel van problemen aan de mediale zijde wordt medial compartment disease (MCD) genoemd 15. Een van de mogelijke behandelingen van ellebooygdyplasie is gebaseerd op humane operatietechnieken. Deze techniek wordt sliding humeral osteotomy (SHO) genoemd en zorgt voor een redistributie van het gewicht van het beschadigde mediale naar de intacte laterale zijde van het gewricht. Dit om verdere degeneratie te voorkomen en terug een normaal contactoppervlak met intact kraakbeen in het gewricht te creëren. Ze is dus enkel mogelijk dankzij het unicompartimentale karakter van de ziekte 16. Een onderzoek 16 toonde een duidelijke verbetering aan qua manken, pijn en levensstijl van de dieren. Het nadeel van dit onderzoek is wel dat er geen controlegroep aanwezig was en bovendien de meeste van de criteria gebruikt voor post-operatieve evaluatie subjectief waren. Een belangrijke voorwaarde voor het uitvoeren van SHO is dat het laterale deel van het gewrichtsoppervlak intact is aangezien dit deel van het gewricht nu het gewicht zal dragen. Dit kan best geëvalueerd worden door middel van een pre-operatieve artroscopie. Een systematische histologische of artroscopische analyse van het gewricht na de ingreep is niet gebeurd. Bij vier honden is er wel fibrocartilago aan het mediale compartiment vastgesteld op necropsie of artroscopie. Bovendien was het laterale compartiment niet visueel beschadigd. Deze techniek is veelbelovend maar dient nog verder onderzocht te worden. Er zijn een aantal variaties op SHO ontwikkeld: men kan 5

11 de humerus roteren rond zijn as over vijf à tien graden (Slododan Tepic, persoonlijke mededeling) of een osteotomie uitvoeren op de proximale ulna (Ingo Pfeil, persoonlijke mededeling). Beide technieken zouden toegepast kunnen worden ter behandeling van MCD. 2.3 TRANSPLANTATIETECHNIEKEN Autologe weefseltransplantatie Perichondriale/periostale grafts Zowel het perichondrium als het periost bevatten progenitorcellen die kunnen differentiëren tot chondrocyten of osteocyten 30. De operatie bestaat uit het verwijderen van het beschadigde kraakbeen tot het onderliggende subchondrale bot bloedt. Vervolgens wordt de perichondriale of periostale graft in het defect gehecht 6. Er zijn meerdere nadelen aan deze techniek 6,25. Er is sowieso een tweede operatieplaats nodig, namelijk die plaats vanwaar het periost of perichondrium wordt gehaald. Dit kan voor het perichondrium ter hoogte van de ribkraakbeenderen zijn, voor het periost ter hoogte van de tibia. Bovendien dient deze operatie via artrotomie te gebeuren (wat natuurlijk invasiever is dan via artroscopie). Een ander probleem is dat eigenlijk niet geweten is of dit perichondrium of periost echt bijdraagt (en in welke mate dan) aan het weefselherstel. Door het schrapen tot er bloed uit het subchondrale bot komt, kan het herstelweefsel dus zowel uit het beenmerg komen, als uit het omliggende kraakbeen, periost of perichondrium. De rol van het periost of perichondrium kan verder in vraag gesteld worden aangezien in de autologe chondrocytimplantatie (ACI) het geen rol speelt of er nu gewoon collageen of periost wordt gebruikt 4 (zie verder). De resultaten van deze techniek zijn nogal variabel: een studie bij konijnen gedurende een periode van 36 weken toonde aan dat periosttransplantatie inferieur was in vergelijking met mozaïekplastie, ACI, een controlegroep en implantatie van mesenchymale stamcellen 23. Een andere, humane, studie over tien jaar tijd, toonde geen verschil tussen Pridie drilling en perichondriale grafting maar beide technieken gaven wel een verbetering hoewel er geen controle-groep was zonder behandeling Osteochondrale transplantatie of mozaïekplastie Deze techniek is gekend onder verschillende namen: mozaïekplastie, osteochondrale transplantatie, autologe osteochondrale grafting of transfer systeem (OATS). De term mozaïekplastie wordt eerder gebruikt bij het opvullen van kleinere defecten in tegenstelling tot OATS dat gebruikt wordt voor de grotere 10. Deze ingreep bestaat uit het transplanteren van één of meerdere osteochondrale plugs van een donorplaats (die minder gewicht draagt) naar een andere plaats binnen hetzelfde gewricht waar zich een letsel bevindt 4,10,21. Het is belangrijk dat het oppervlak van de plugs niet uitsteekt boven het oppervlak van het omliggende kraakbeen om het inwerken van abnormale krachten tegen te gaan. Een theoretisch model 50 maakte duidelijk dat het kraakbeen aan de tegenoverliggende zijde van de getransplanteerde plugs aan abnormale krachten werd onderworpen bij reeds de kleinste afwijkingen in de plaatsing van zo n plug. Wat de gevolgen van deze kracht in vivo zijn, dient nog onderzocht te worden 50. Bovendien bleek ook dat er ter hoogte van de grenzen tussen de plug en het omliggende 6

12 kraakbeen, zelfs bij een perfecte plaatsing, een discontinue verdeling van de krachten is 50. Eén van de andere mogelijke problemen heeft betrekking op de evolutie van de donorplaats 4,21. Een artroscopie één jaar na uitvoering van de ingreep, toonde dat alle donorplaatsen waren opgevuld met fibrocartilago 4. Een andere studie waarbij MRI gebruikt werd, toonde ook een (op zijn minst gedeeltelijke) opvulling van het gecreërde defect. Bij 89% van de geëvalueerde patiënten had het herstelweefsel wel een andere densiteit dan het omliggende kraakbeen en was het suggestief voor fibrocartilago of fibreus weefsel 28. Het is dus nog niet bewezen dat er effectief een echte degeneratie is van de donorplaats 21,28. Ook bij de hond met osteochondritis dissecans in de elleboog werd OATS getest, al dan niet in combinatie met proximale osteotomie van de ulna, maar de resultaten van dit onderzoek waren inconsistent 17. Bovendien werd dit onderzoek gevoerd zonder controlegroep of blindering en met voornamelijk subjectieve criteria ter beoordeling van de progressie. Verder onderzoek is dus nodig. Deze techniek werd ook gecombineerd met een dagelijkse behandeling met ultrageluid bij de hond om het effect op het herstel te evalueren 10. Het gebruik van ultrageluid bleek duidelijk positieve effecten te hebben: op basis van het macroscopische uitzicht en histologie bleek het kraakbeen een meer normaal hyalien uitzicht te hebben, het subchondrale bot regenereerde sneller en er was een betere integratie van de osteochondrale plug en het herstelweefsel met het omgevende kraakbeen 10. Er is nog ruimte voor verder onderzoek aangezien nog niet geweten is wat de ideale frequentie, positie en duur van de therapie is Allogeneïsche weefseltransplantatie Deze techniek is gebaseerd op het feit dat de lichaamseigen herstelmogelijkheden beperkt zijn 49. Daarom leek het misschien makkelijker om, door middel van allografts, osteochondrale defecten op te vullen. Deze techniek heeft, zoals elke techniek, zijn voor- en nadelen en lijkt sterk op OATS. De voordelen zijn onder meer (in vergelijking met OATS) dat er geen donorsite binnen de patiënt is (zodat er ook geen risico op degeneratie is) en dat het osteochondrale weefsel van de donor van dezelfde plaats in het gewricht kan gehaald worden 25,33. De nadelen zijn het risico op ziektetransmissie, een beperkt aantal donoren en immunologische problemen 25,33,44. Ook de eerder vermelde problemen bij OATS geassocieerd met een niet-exacte plaatsing van de allograft zijn hier van toepassing 50. Vaak wordt er, ten onrechte, aangenomen dat er bij transplantatie van het kraakbeen geen immunologische problemen zullen optreden 25. Onderzoek bij de hond (gedurende 11 maanden) vergeleek de humorale en celgemedieerde imuunrespons en antilichaamafhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC) tussen osteochondrale grafts die men gematched en niet-gematched had voor dog leukocyte antigen 44. De humorale respons en ADCC bleken duidelijk sterker te zijn in de dieren die niet-gematched waren. Er was geen verschil in celgemedieerde immuunrespons. Hetzelfde onderzoek vergeleek ook de invloed van bewaring op de immuunrespons, meer bepaald het verschil tussen cryopreservatie en verse grafts. De grafts die bewaard werden door cryopreservatie verminderden opnieuw significant de humorale respons en ADCC indien men de twee groepen nietgematchede grafts vergeleek. Bij de gematchede grafts bleek enkel de ADCC positief beïnvloed te 7

13 worden door de bewaring door middel van cryopreservatie. De geringste immunologische reactie was dus aanwezig bij de gematchede graft bewaard door cryopreservatie. In het synoviale vocht vond men een zelfde evolutie 44. Foto-oxidatie is een andere techniek die mogelijk de immunogeniteit van allografts verlaagt 1,48. Deze techniek bestaat uit een aantal stappen 48 : de graft wordt in een oplossing van methyleenblauw geplaatst en blootgesteld aan een halogeenlichtbron. Hierna wordt ze gespoeld en ontvet. Om de graft te steriliseren, wordt ze vervolgens met een lage dosis gamma-straling bestraald. De juiste waarde van deze techniek dient verder onderzocht te worden, aangezien de studies tot hier toe zonder (of met te kleine) controlegroepen werden uitgevoerd 1,48. Naast immunogene reacties, worden ook het aantal overlevende cellen en de bewaringsduur beïnvloed door de wijze waarop men de graft bewaart TISSUE ENGINEERING Tissue engineering wordt door Hunziker 25 gedefinieerd als de kunst van het opnieuw opbouwen van de weefsels van zoogdieren, zowel qua strucuur als functie. Er zijn twee grote opties 8,25. De eerste bestaat erin het herstelweefsel (een chondrale of osteochondrale graft) volledig in vitro te creëren en vervolgens in te planten in het defect. De andere optie is dat slechts de bouwsteen in vitro wordt gecreëerd en dan vervolgens ingeplant wordt. Beide technieken hebben een aantal voor- en nadelen. Het voordeel van de eerste techniek is dat we een betere controle hebben over het hele productieproces indien men over de geschikte bioreactors beschikt. De nadelen zijn talrijk. Er kunnen problemen optreden qua fixatie en biocompatibiliteit, het nabootsen van de werkelijke belasting in vivo is moeilijk na te maken in vitro. Ook immunologische verwikkelingen kunnen optreden en het geheel moet ook perfect passen in het defect. De voordelen van de tweede techniek zijn dat het ontstaan van het weefsel in vivo gebeurt en zich dan ook aan de omstandigheden kan aanpassen, een betere integratie (of toch een hogere kans hierop) en een betere invulling van het defect. Het nadeel is dat het geheel moeilijker te controleren valt aangezien cellen uit het beenmerg of uit andere omliggende weefsels ook een rol kunnen spelen. Vaak wordt gekozen voor de tweede benadering, hoewel ook een combinatie van beide mogelijk is (bv. ACI). Bij tissue engineering kan men drie componenten gebruiken: een matrix, cellen en signaalmoleculen 8,20, Matrix De matrix is eigenlijk het (tijdelijke) onderkomen van de cellen 8. Deze moet aan een heleboel voorwaarden voldoen 11,24,25. Het is belangrijk dat de matrix goed gefixeerd kan worden in het defect. Daarnaast moet de matrix voldoende stevigheid (en tegelijk ook elasticiteit) vertonen om het regenererende weefstel te beschermen. Ook het volume moet constant blijven zodat het ingeplante weefsel niet uitsteekt of onder het oppervlak van het kraakbeen zit. Cellen moeten zich makkelijk kunnen hechten. Een zekere poreusheid is ook nodig zodat de ingeplante cellen kunnen migreren of zodat cellen vanuit de omgeving kunnen infiltreren. De matrix moet afbreekbaar zijn zodat deze kan vervangen worden door het herstelweefsel. Het is wel belangrijk dat bij de afbraak van de matrix geen toxische moleculen worden gevormd. De biocompatibiliteit is vanzelfsprekend van belang aangezien 8

14 men zo min mogelijk immunologische afweerreacties wilt zien optreden. Naast cellen is het ook belangrijk dat de matrix signaalmoleculen kan dragen en vrijstellen indien men deze wilt toevoegen. Dit zijn de basisvoorwaarden. Om de matrix bovendien eenvoudig in gebruik te maken voor de chirurg, zouden nog een aantal eigenschappen handig zijn 24,25. Indien de matrix artroscopisch wordt geplaatst, is het wenselijk dat deze vloeibaar is tijdens het aanbrengen en dan uithardt zonder verandering in volume. Voor een artrotomie is het dan misschien weer makkelijker als de matrix wat steviger is zodat deze in het defect kan geduwd worden. Het is duidelijk dat het zeer moeilijk zal zijn om te voldoen aan al deze criteria. Er zijn heel veel verschillende soorten matrices. Een mogelijke opdeling is de op proteïnegebaseerde polymeren, de op koolhydratengebaseerde polymeren, de kunstmatige polymeren en de overige. Een groot probleem van de kunstmatige of synthetische polymeren is vaak de biocompatibiliteit 20. Eén van de veel gebruikte matrices is op basis van collageen en behoort dus tot de categorie van de op proteïnegebaseerde polymeren. Zelfs een matrix zonder cellen en groeifactoren kan weefselherstel bevorderen aangezien deze matrix ervoor zorgt dat de bloedklonter die ontstaat bij full-thickness defecten, het volledige defect zal opvullen zodat de critical range waarbinnen laesies dienen te zitten, wegvalt Cellen Er zijn twee grote bronnen waar men de cellen uit kan halen voor gebruik in tissue engineering: enerzijds heeft men de chondrocyten, anderzijds de progenitor- of mesenchymale stamcellen uit het beenmerg, periost, perichondrium, vet of synovium 7,11,20,25,51. Chondrocyten hebben als voordeel dat ze reeds het juiste fenotypische karakter hebben, maar aangezien kraakbeen slechts een beperkt aantal van die chondrocyten bevat, dient men ze te vermeerderen in vitro voor gebruik 7,8,11,20,25. Dit kan leiden tot dedifferentiatie 5. Bovendien moet men om chondrocyten te oogsten, een defect creëren dat uit zichzelf niet zal herstellen. Stamcellen zijn daarentegen eenvoudiger te oogsten, komen in grotere aantallen voor en kan men met de juiste cultuuromstandigheden tot chondrogene cellen laten differentiëren 7,8,11,20,25. Het gebruik van chondrocyten van patiënten met OA kan mogelijks problemen opleveren aangezien deze chondrocyten een veranderd metabolisme hebben 13. Of deze veranderingen invloed hebben op hun capaciteit tot vorming van kraakbeen na implantatie, was tot voor kort onduidelijk. Een recente (humane) studie vergeleek daarom de chondrogene capaciteit van chondrocyten van OA-patiënten met normale chondrocyten 13. Tijdens de expansie in monocultuur bleek de expressie tussen beide groepen nog te variëren. Deze verschillen verdwenen echter bijna volledig bij het zaaien in een matrix. Het lijkt dus mogelijk om chondrocyten van patiënten met OA te gebruiken, op voorwaarde dat men matrixgeassisteerde chondrocytimplantatie toepast (zie verder). Twee beperkingen van deze studie zijn wel het geringe aantal proefpersonen in beide groepen en dat men, aangezien het een in vitro studie was, de invloed van het aangetaste gewricht op het implantaat niet kent. Het is mogelijk dat het daar aanwezige milieu de synthese en dus het herstel beïnvloedt. 9

15 2.4.3 Signaalmoleculen Signaalmoleculen kunnen mogelijk een belangrijke rol spelen in het creëren van dé oplossing voor kraakbeenregeneratie. Verschillende molecules spelen een rol. De meest onderzochte zijn transforming growth factor-β (TGF-β), insulin-like growth factors (IGFs), de bone morphogenetic proteins (BMPs) en de fibroblast growth factors (FGFs) 7,20,25. De grote moeilijkheden bij het toevoegen van deze signaalmoleculen is het ter plaatse krijgen van voldoende en juiste groeifactoren op het juiste moment 7. Een éénmalige exogene dosis van een groeifactor heeft slechts een korte halfwaardetijd. Een mogelijke oplossing kan gevonden worden in het gebruik van genen, toegediend onder de vorm van bijvoorbeeld een adenovirus. Op die manier kunnen langer, hogere concentraties bereikt worden. Mogelijke nadelen van het gebruik van virale vectors zijn onder meer dat ze immunogeen zijn en mogelijks ook kunnen spreiden in het lichaam. Het gebruiken van de optimale combinatie van één of meerdere (verschillende) groeifactoren in de juiste volgorde is daarmee echter nog niet opgelost. Dit dient nog verder onderzocht te worden Toepassingen Tissue engineering kent nu reeds verschillende toepassingen in de praktijk en deze kan men opdelen in verschillende generaties 8,37. Welke techniek nu juist tot welke generatie behoort, is niet altijd duidelijk aangezien de literatuur het niet altijd eens is 8,37. Een mogelijke opdeling is de volgende 8 : Het oorspronkelijke idee is ACI en daarom wordt dit ook de eerste generatie genoemd. ACI is een techniek die eigenlijk uit twee luiken bestaat 20. Eerst moet men door middel van de artroscoop kraakbeencellen oogsten uit de patiënt. Deze worden vermeerderd ex vivo tot men over voldoende chondrocyten beschikt. Tijdens de tweede ingreep (een artrotomie) worden deze cellen vervolgens ingeplant in het letsel. Hierna worden ze afgedekt door middel van een stuk periost of collageen. Welke van deze materialen men gebruikte, leek geen verschil te maken 4. Deze techniek bleek superieur te zijn aan mozaïekplastie (met opvolging van de patiënt gedurende gemiddeld 1,7 jaar) 4. De combinatie van microfracture met ACI was na één jaar ook duidelijk superieur aan microfracture alleen en AMIC 14. Mogelijke complicaties zijn onder meer het loslaten van het implantaat, periostale hypertrofie en intra-articulaire adhesies 37. Een ander belangrijk probleem is dat de chondrocyten tijdens de vermeerdering in vitro dedifferentiëren (met productie van collageen type I in plaats van het normale type II en een verminderde productie van proteoglycanen) met dus een gedaalde capaciteit om kraakbeen te herstellen 5. Een mogelijke oplossing hiervoor is gekarakteriseerde chondrocytimplantatie (zie verder). Vetrekkend vanuit ACI ging men vervolgens chondrocyten karakteriseren of ex vivo reeds inplanten op het collageen. Dit zijn voorbeelden van de tweede generatie. Gekarakteriseerde chondrocytimplantatie (CCI, ook wel ACI van de tweede generatie genoemd 12 ) is gebaseerd op dezelfde principes als ACI. Het belangrijkste verschil is dat men het fenoytpe van de gecultiveerde chondrocyten test aan de hand van de aanwezigheid van bepaalde merkers aan het celoppervlak. Deze merkers geven info over de 10

16 mate waarin de gecultiveerde chondrocyten in staat zijn hyalien kraakbeen te produceren. De CC score die bepaald wordt aan de hand van die merkers, wordt gebruikt om de chondrocyten te karakteriseren zodat enkel die cellen die goede eigenschappen vertonen, ingeplant worden. Het vermeerderen gebeurt ook op een manier die geoptimaliseerd is om de eigenschappen van de chondrocyten te behouden. Het eindresultaat is dat er een meer homologe populatie met een grotere potentie wordt ingeplant. CCI was duidelijk superieur aan microfracture, zowel na één 41 als na drie jaar 40. Door toepassen van zowel ACI als CCI is men er tot op heden nog niet in geslaagd om zuiver hyalien kraakbeen te produceren (zonder de aanwezigheid van fibrocartilago dus). Een bijkomend nadeel is dat er sowieso twee ingrepen nodig zijn om deze technieken toe te passen. Bovendien gebeurt de implantatie niet artroscopisch en is ze daarom ingrijpender dan bijvoorbeeld microfracture. Men zou dus meer complicaties verwachten. Dit bleek echter niet het geval te zijn bij een vergelijking tussen microfracture en CCI 41. Een tweede modificatie van ACI is de zogenaamde matrixgeassisteerde chondrocytimplantatie of transplantatie (MACI of MACT) 3,20. Hierbij worden nog steeds chondrocyten geoogst en vermeerderd in vitro, maar dan worden ze eerst gezaaid op een collageenmatrix. Vervolgens wordt de matrix met de chondrocyten ingeplant in het defect door middel van een artrotomie (met de cellen gericht naar het subchondrale bot) 3. Een studie (zonder controlegroep) suggereerde een positieve evolutie over een periode van vijf jaar 3, maar deze resultaten dienen dus met de nodige voorzichtigheid geïnterpreteerd te worden. De derde generatie is reeds ontwikkeld maar tot dusver bestaat daar nog zeer weinig klinische informatie over. De modificaties zijn onder meer het toevoegen van signaalmoleculen, eenvoudigere chirurgische technieken en vermeerdering onder invloed van belasting zodat het weefsel van nog betere kwaliteit is. Tot slot is er de vierde generatie waarbij de matrices nog zullen verbeteren, genentherapie wordt toegepast, enz. De onderzoeksmogelijkheden zijn dus zeker nog niet uitgeput. 2.5 BESLUIT Letsels aan het hyaliene gewrichtskraakbeen komen frequent voor en kunnen onder meer pijn en verlies van functie veroorzaken 45. Een heleboel verschillende technieken en invalshoeken om herstel te bekomen, zijn reeds getest. De ene techniek blijkt achteraf soms volledig waardeloos indien alleen toegepast (shaving, debridement en laser abrasion), de andere techniek vertraagt enkel de progressie van OA (lavage). Nog andere technieken slagen er wel in om herstelweefsel te produceren, maar van inferieure kwaliteit (abrasie chondroplastie, Pridie drilling, microfracture, ACI, ). Tot nu is men er dus nog steeds niet in geslaagd het kraakbeen volledig te herstellen. Het is natuurlijk de vraag of dit kan gebeuren indien men enkel de chirurgische methoden toepast. Onderzoeken hebben reeds aangetoond dat onder meer fysiotherapie (continue passieve beweging versus intermitterende actieve beweging) en behandeling met ultrageluid positieve effecten hebben. Een bredere aanpak zal mogelijks het ultieme resultaat opleveren. Deze bredere aanpak kan onder meer bestaan uit de 11

17 toekenning van de juiste techniek aan het juiste letsel, de gepaste nabehandeling, de gepaste medicatie en voedingssuplementen. Elke techniek heeft zijn voor- en nadelen en is toepasbaar in specifieke gevallen. De nabehandeling kent ook verschillen die specifiek kunnen zijn voor een techniek, maar een bredere toepassing van onder meer fysiotherapie dient overwogen te worden. Er is nog geen medicatie gevonden die zorgt voor de heling van kraakbeendefecten 24. De juiste effecten van voedingssuplementen dienen nog verder onderzocht te worden 45. Zeker in dit deel van de (dier)geneeskunde is er nog veel ruimte voor onderzoek. Het belangrijkste is wel dat dit onderzoek ook op de juiste manier gebeurt. Research zonder controlegroepen en blindering gebeurt vaak, maar geeft slechts beperkte aanwijzingen over de werkelijke verbetering en het potentieel van de nieuwe technieken. Als er toch met controlegroepen wordt gewerkt, wordt vaak vergeleken met oude technieken zoals microfracture en OATS. Het loont de moeite om de nieuwere technieken binnen het domein van de tissue engineering onderling te vergelijken om op die manier echt de progressie te kunnen evalueren. Tot slot dienen ook de effecten en evolutie van het herstelweefsel op lange termijn, zeker voor de nieuwere technieken, nog verder onderzocht te worden. Er zijn ook nog andere opties. Het vervangen van gewrichten door een prothese berust niet op het principe van kraakbeenregeneratie maar biedt natuurlijk ook mogelijkheden, zeker bij patiënten met vergevorderde aantasting 36. Welke weg uiteindelijk de juiste zal blijken, blijft (voorlopig?) nog dé te beantwoorden vraag. 3. LITERATUURLIJST 1. Akens M.K., von R.B., Bittmann P., Nadler D., Zlinszky K., Auer J.A. (2001). Long Term in- Vivo Studies of a Photo-Oxidized Bovine Osteochondral Transplant in Sheep. BMC. Musculoskelet. Disord. 2, p Altman R.D., Kates J., Chun L.E., Dean D.D., Eyre D. (1992). Preliminary Observations of Chondral Abrasion in a Canine Model. Ann. Rheum. Dis. 51, p Behrens P., Bitter T., Kurz B., Russlies M. (2006). Matrix-Associated Autologous Chondrocyte Transplantation/Implantation (MACT/MACI)--5-Year Follow-Up. Knee. 13, p Bentley G., Biant L.C., Carrington R.W., Akmal M., Goldberg A., Williams A.M., Skinner J.A., Pringle J. (2003). A Prospective, Randomised Comparison of Autologous Chondrocyte Implantation Versus Mosaicplasty for Osteochondral Defects in the Knee. J. Bone Joint Surg. Br. 85, p Benya P.D., Shaffer J.D. (1982). Dedifferentiated Chondrocytes Reexpress the Differentiated Collagen Phenotype When Cultured in Agarose Gels. Cell 30, p Bouwmeester P.S., Kuijer R., Homminga G.N., Bulstra S.K., Geesink R.G. (2002). A Retrospective Analysis of Two Independent Prospective Cartilage Repair Studies: Autogenous Perichondrial Grafting Versus Subchondral Drilling 10 Years Post-Surgery. J. Orthop. Res. 20, p

18 7. Capito R.M., Spector M. (2003). Scaffold-Based Articular Cartilage Repair. IEEE Eng Med. Biol. Mag. 22, p Chiang H., Jiang C.C. (2009). Repair of Articular Cartilage Defects: Review and Perspectives. J. Formos. Med. Assoc. 108, p Chubinskaya S., Hurtig M., Rueger D.C. (2007). OP-1/BMP-7 in Cartilage Repair. Int. Orthop. 31, p Cook S.D., Salkeld S.L., Patron L.P., Doughty E.S., Jones D.G. (2008). The Effect of Low- Intensity Pulsed Ultrasound on Autologous Osteochondral Plugs in a Canine Model. Am. J. Sports Med. 36, p Coutts R.D., Healey R.M., Ostrander R., Sah R.L., Goomer R., Amiel D. (2001). Matrices for Cartilage Repair. Clin. Orthop. Relat Res. S271 - S de Windt T.S., Bekkers J.E., Creemers L.B., Dhert W.J., Saris D.B. (2009). Patient Profiling in Cartilage Regeneration: Prognostic Factors Determining Success of Treatment for Cartilage Defects. Am. J. Sports Med. 37 Suppl 1, p. 58S - 62S. 13. Dehne T., Karlsson C., Ringe J., Sittinger M., Lindahl A. (2009). Chondrogenic Differentiation Potential of Osteoarthritic Chondrocytes and Their Possible Use in Matrix-Associated Autologous Chondrocyte Transplantation. Arthritis Res. Ther. 11, p. R133 - R Dorotka R., Bindreiter U., Macfelda K., Windberger U., Nehrer S. (2005). Marrow Stimulation and Chondrocyte Transplantation Using a Collagen Matrix for Cartilage Repair. Osteoarthritis. Cartilage. 13, p Fitzpatrick N., Yeadon R. (2009). Working Algorithm for Treatment Decision Making for Developmental Disease of the Medial Compartment of the Elbow in Dogs. Vet. Surg. 38, p Fitzpatrick N., Yeadon R., Smith T., Schulz K. (2009). Techniques of Application and Initial Clinical Experience With Sliding Humeral Osteotomy for Treatment of Medial Compartment Disease of the Canine Elbow. Vet. Surg. 38, p Fitzpatrick N., Yeadon R., Smith T.J. (2009). Early Clinical Experience With Osteochondral Autograft Transfer for Treatment of Osteochondritis Dissecans of the Medial Humeral Condyle in Dogs. Vet. Surg. 38, p Fu X., Lin L., Zhang J., Yu C. (2009). Assessment of the Efficacy of Joint Lavage in Rabbits With Osteoarthritis of the Knee. J. Orthop. Res. 27, p Furukawa T., Eyre D.R., Koide S., Glimcher M.J. (1980). Biochemical Studies on Repair Cartilage Resurfacing Experimental Defects in the Rabbit Knee. J. Bone Joint Surg. Am. 62, p Getgood A., Brooks R., Fortier L., Rushton N. (2009). Articular Cartilage Tissue Engineering: Today's Research, Tomorrow's Practice? J. Bone Joint Surg. Br. 91, p Hangody L., Vasarhelyi G., Hangody L.R., Sukosd Z., Tibay G., Bartha L., Bodo G. (2008). Autologous Osteochondral Grafting--Technique and Long-Term Results. Injury 39 Suppl 1, p. S32 - S39. 13

19 22. Hardie E.M., Roe S.C., Martin F.R. (2002). Radiographic Evidence of Degenerative Joint Disease in Geriatric Cats: 100 Cases ( ). J. Am. Vet. Med. Assoc. 220, p Hui J.H., Chen F., Thambyah A., Lee E.H. (2004). Treatment of Chondral Lesions in Advanced Osteochondritis Dissecans: a Comparative Study of the Efficacy of Chondrocytes, Mesenchymal Stem Cells, Periosteal Graft, and Mosaicplasty (Osteochondral Autograft) in Animal Models. J. Pediatr. Orthop. 24, p Hunziker E.B. (1999). Biologic Repair of Articular Cartilage. Defect Models in Experimental Animals and Matrix Requirements. Clin. Orthop. Relat Res. S135 - S Hunziker E.B. (2002). Articular Cartilage Repair: Basic Science and Clinical Progress. A Review of the Current Status and Prospects. Osteoarthritis. Cartilage. 10, p Hunziker E.B., Quinn T.M. (2003). Surgical Removal of Articular Cartilage Leads to Loss of Chondrocytes From Cartilage Bordering the Wound Edge. J. Bone Joint Surg. Am. 85-A Suppl 2, p Insall J.N. (1967). Intra-Articular Surgery for Degenerative Arthritis of the Knee. A Report of the Work of the Late K. H. Pridie. J. Bone Joint Surg. Br. 49, p Iwasaki N., Kato H., Kamishima T., Suenaga N., Minami A. (2007). Donor Site Evaluation After Autologous Osteochondral Mosaicplasty for Cartilaginous Lesions of the Elbow Joint. Am. J. Sports Med. 35, p Johnson L.L. (2001). Arthroscopic Abrasion Arthroplasty: a Review. Clin. Orthop. Relat Res. S306 - S Junqueira L.C., Carneiro J., Wisse E., Nieuwenhuis P., Ginsel L.A. (2004). Functionele Histologie. 10th Edition. Elsevier Gezondheidszorg, Maarssen. p Kim H.K., Moran M.E., Salter R.B. (1991). The Potential for Regeneration of Articular Cartilage in Defects Created by Chondral Shaving and Subchondral Abrasion. An Experimental Investigation in Rabbits. J. Bone Joint Surg. Am. 73, p Kuo A.C., Rodrigo J.J., Reddi A.H., Curtiss S., Grotkopp E., Chiu M. (2006). Microfracture and Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP-7) Synergistically Stimulate Articular Cartilage Repair. Osteoarthritis. Cartilage. 14, p Lattermann C., Romine S.E. (2009). Osteochondral Allografts: State of the Art. Clin. Sports Med. 28, p , ix. 34. Lawrence R.C., Felson D.T., Helmick C.G., Arnold L.M., Choi H., Deyo R.A., Gabriel S., Hirsch R., Hochberg M.C., Hunder G.G., Jordan J.M., Katz J.N., Kremers H.M., Wolfe F. (2008). Estimates of the Prevalence of Arthritis and Other Rheumatic Conditions in the United States. Part II. Arthritis Rheum. 58, p Levison D.A., Reid R., Burt A.D., Harrison D.J., Fleming S. (2008). Muir's Textbook of Pathology. 14th Edition. Hodder Arnold, Londen. p Lutzner J., Kasten P., Gunther K.P., Kirschner S. (2009). Surgical Options for Patients With Osteoarthritis of the Knee. Nat. Rev. Rheumatol. 5, p Marlovits S., Zeller P., Singer P., Resinger C., Vecsei V. (2006). Cartilage Repair: Generations of Autologous Chondrocyte Transplantation. Eur. J. Radiol. 57, p

20 38. Pfizer Animal Health (1996). Proprietary market research Potter H.G., Linklater J.M., Allen A.A., Hannafin J.A., Haas S.B. (1998). Magnetic Resonance Imaging of Articular Cartilage in the Knee. An Evaluation With Use of Fast-Spin-Echo Imaging. J. Bone Joint Surg. Am. 80, p Saris D.B., Vanlauwe J., Victor J., Almqvist K.F., Verdonk R., Bellemans J., Luyten F.P. (2009). Treatment of Symptomatic Cartilage Defects of the Knee: Characterized Chondrocyte Implantation Results in Better Clinical Outcome at 36 Months in a Randomized Trial Compared to Microfracture. Am. J. Sports Med. 37 Suppl 1, p. 10S - 19S. 41. Saris D.B., Vanlauwe J., Victor J., Haspl M., Bohnsack M., Fortems Y., Vandekerckhove B., Almqvist K.F., Claes T., Handelberg F., Lagae K., van der B.J., Vandenneucker H., Yang K.G., Jelic M., Verdonk R., Veulemans N., Bellemans J., Luyten F.P. (2008). Characterized Chondrocyte Implantation Results in Better Structural Repair When Treating Symptomatic Cartilage Defects of the Knee in a Randomized Controlled Trial Versus Microfracture. Am. J. Sports Med. 36, p Steadman J.R., Rodkey W.G., Rodrigo J.J. (2001). Microfracture: Surgical Technique and Rehabilitation to Treat Chondral Defects. Clin. Orthop. Relat Res. S362 - S Steinwachs M.R., Guggi T., Kreuz P.C. (2008). Marrow Stimulation Techniques. Injury 39 Suppl 1, p. S26 - S Stevenson S. (1987). The Immune Response to Osteochondral Allografts in Dogs. J. Bone Joint Surg. Am. 69, p Todhunter R.J., Spencer A.J. (2003). Chapter 154: Osteoarthritis. In: Slatter D.H. (Editor) Textbook of Small Animal Surgery, 3th Edition, Elsevier Science, Philadelphia, p Turner A.S., Tippett J.W., Powers B.E., Dewell R.D., Mallinckrodt C.H. (1998). Radiofrequency (Electrosurgical) Ablation of Articular Cartilage: a Study in Sheep. Arthroscopy 14, p van Oosterhout M., Sont J.K., Bajema I.M., Breedveld F.C., van Laar J.M. (2006). Comparison of Efficacy of Arthroscopic Lavage Plus Administration of Corticosteroids, Arthroscopic Lavage Plus Administration of Placebo, and Joint Aspiration Plus Administration of Corticosteroids in Arthritis of the Knee: A Randomized Controlled Trial. Arthritis Rheum. 55, p von Rechenberg, Akens M.K., Nadler D., Bittmann P., Zlinszky K., Kastner S.B., Auer J.A. (2006). Mosaicplasty With Photooxidized, Mushroom Shaped, Bovine, Osteochondral Xenografts in Experimental Sheep. Vet. Comp Orthop. Traumatol. 19, p Weisbrode S.E. (2007). Bone and Joints. In: McGavin M.D., Zachary J.F. (Editor) Pathologic Basis of Veterinary Disease, 4th Edition, Mosby Elsevier, St. Louis, p Wu J.Z., Herzog W., Hasler E.M. (2002). Inadequate Placement of Osteochondral Plugs May Induce Abnormal Stress-Strain Distributions in Articular Cartilage --Finite Element Simulations. Med. Eng Phys. 24, p