Eindwerk. Gebruik van cycline D1 in de pathologie. Stedelijk Ziekenhuis Anatoom-pathologie. bij de diagnose van maligne melanomen

Transcriptie

1

2 Eindwerk Studiegebied Gezondheidszorg Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie Afstudeerrichting Medische Laboratoriumtechnologie Academiejaar Studente De Wispelaere Ine Thema Gebruik van cycline D1 in de pathologie bij de diagnose van maligne melanomen Stageplaats Stedelijk Ziekenhuis Anatoom-pathologie

3 diagnose van melanomen Woord vooraf Een eindwerk schrijven en het uitvoeren van een praktisch gedeelte brengt heel wat met zich mee. Zonder de hulp van heel wat mensen zou deze taak moeilijker zijn geweest. Daarom wil ik graag een dankwoordje richten aan de mensen die voor het opstellen van dit eindwerk meer dan hun uiterste best hebben gedaan om het in goede banen te leiden. Veel dank gaat uit naar Dr. M Haspeslagh en Dr. E. Steenkiste. Ik dank hen voor de mogelijkheid om bij hen stage te lopen en een eindwerk tot stand te brengen. Ook dank ik hen voor de zeer goede begeleiding en het vertrouwen dat ze in mij hadden gedurende deze stage periode. Het was voor mij dan ook een heel goede ervaring. De collega s met wie ik gedurende deze periode heb samengewerkt, bedank ik voor de goede sfeer, de nodige informatie en voor het leren van de dagelijkse routine in het laboratorium. Ik breng ook een dankwoordje uit naar mevrouw Kaat Van Oostveldt en mevrouw Nicole Kellner, opleidingscoördinator,voor de goede begeleiding van school uit, voor het bijbrengen van de kennis die ik nodig had om de taken in het laboratorium tot een goed einde te brengen. Ook het departementshoofd, mevrouw Riet Van Dale en het hele team van HOWEST wil ik bedanken om ons de mogelijkheid te bieden om stage te lopen. Deze ervaring brengt ons heel wat bij over hoe het er in een laboratorium aan toe gaat en geeft ons een idee op welke afdeling we later graag zouden terecht komen. Daarnaast wil ik ook mijn ouders, zussen en vriend bedanken, voor de steun en de mogelijkheid die ik van hen kreeg om deze studies tot een goed einde te brengen. 1

4 diagnose van melanomen Lijst met afkortingen en symbolen AD Ag Al BCL-1 CDK DAB GAR GERD kb kda MPF PRAD-1 prb SPF SSMM HMB gedemineraliseerd water antigen antilichaam B-cel leukemie/lymfoom Cycline Dependent Kinase diaminebenzodine goat anti-rabbit gastro-esophageale reflux disease kilobasen kilodalton M-fase promoting factor Parathyroïd adenomatosis Retinoblastoma proteïne S-fase promoting factor Superficieel spreidend maligne melanoom Human Melanoma Black 2

5 diagnose van melanomen Verklarende woordenlijst Acral melanoma Adenocarcinoma Amplificatie Anticholinergisch Antigen Antilichaam Apoptose Biopsie Dermaal DNA polymerase Enzym Epidermaal een subtype van melanoma dat voorkomt op handen en voetenen, dit vaak gelegen onder de nagels maligne tumor van het klierweefsel uit zeer kleine hoeveelheden DNA (enkele moleculen) specifiek een of meer gedeeltes vermenigvuldigen middelen die de werking van het parasympathisch zenuwstelsel blokkeren een molecuul dat in staat is een reactie van het afweersysteem op te wekken zijn eiwitten die door de mens en andere gewervelde dieren worden geproduceerd als antwoord op het binnendringen van een lichaamsvreemde stof of lichaamsvreemde cellen geprogrammeerde celdood afname van weefsel voor het stellen van een histologische diagnose betrekking hebbend op de huid enzymcomplex betrokken bij de DNA-replicatie. Het verdubbelt het DNA door aan elke base de complementerende base te plakken een eiwit dat een chemische reactie in of buiten een cel mogelijk of versnelt deze zonder daarbij zelf verbruikt te worden of van samenstelling te veranderen behorend tot de opperhuid 3

6 diagnose van melanomen Fosforylatie* Goat anti-rabbit Al Gradiënt HMB 45 Inflammatie In situ hybridisatie Kinasen Maligniteit Melanocyten Melanoom*** Melanosoom Metastaseren Mutatie Neoplasie het plaatsen van een fosfaatgroep op een van de reactieve hydroxy-groepen (OH) van een aminozuur van dat eiwit antilichaam tegen konijn Anti-lichamen opgewekt in geiten geleidelijke overgang tussen 2 gebieden HMB-45 is een monoklonaal antilichaam dat reageert tegen een antigen die aanwezig is in tumoren die melanocyten bevatten, zoals melanoma s ontsteking. Waarneembare symptomen van een ontsteking zijn roodheid, warmte, zwelling, pijn en gestoorde functie fluorescent in situ hybridization (afgekort FISH) is een techniek waarbij chromosoom(delen) aangekleurd worden met fluorochromen en vervolgens onder de fluorescentie microscoop bestudeerd kunnen worden. Deze techniek wordt in de cytogenetica gebruikt wordt om ziektes op te sporen die het gevolg zijn van een afwijking van de chromosomen. enzymen die een fosfaat groep kan aanbrengen op een ander eiwit of een ander molecuul (fosforylering) kwaadaardigheid bepaald type huidcel dat melanosomen produceert vorm van huidkanker, kwaadaardig letsel uitgaande van de pigmentcellen in de opperhuid pigmentkorrels uitzaaien van tumorcellen in het lichaam verandering in de normale functie, structuur van een chromosoom abnormale en ongecontroleerde groei van cellen 4

7 diagnose van melanomen Nevi Obesitas Oncologie Overexpressie Parathyroïd adenomatosis Plaveiselcel epitheel Progressie Proteolytische enzymen Proto-oncogen Squameuze cellen Thymidine Transcriptie** Translatie** Translocatie* Tumorigenesis moedervlek, benigne tumor samengesteld uit nevus cellen die zijn afgeleid uit melanocyten zwaarlijvigheid is de medische studie en behandeling van kanker in grotere mate dan normaal aanwezig multiple goedaardige adenomen van de parathyroïd (bijschildklier) epitheelceltype dat voorkomt in de huid, mondholte, slokdarm en vagina. Plaveiselcelepitheel dankt zijn naam aan de vorm van de cellen. Deze zijn plat en liggen op elkaar gestapeld, waardoor ze lijken op een muur van plavei-stenen. voortgang, verderzetting eiwitsplitsende enzymen voorlopers van oncogenen, groeibevorderend effect in een normale cel plaveiselcelepitheel deoxythymidine is het DNA nucleoside T; In de cel biologie wordt het gebruikt om de cellen in de S fase te synchroniseren kopiëren van DNA naar mrna door het enzym RNApolymerase. vertaling van RNA codes tot specifieke ketens aminozuren, namelijk polypeptiden, de bouwstenen van eiwitten verplaatsing, verplaatsing van erfelijk materiaal carcinogenesis, ontwikkeling van kanker; het proces waarbij normale cellen getransformeerd worden in kankercellen 5

8 diagnose van melanomen Tumor suppressorgen Ulceratie in normale cellen hebben deze genen een groeiremmend effect op de celcyclus vorming van een zweer * Figuur zie bijlage 1 ** Figuur zie bijlage 3 *** Figuur zie bijlage 5 6

9 diagnose van melanomen Lijst van tabellen en figuren Figuren Figuur 1: Cycline D1 wordt gecodeerd door het CCND1 gen...11 Figuur 2: Cyclines in de celcyclus...14 Figuur 3: Invloed van cycline D1 op het Rb eiwit...15 Figuur 4: Verschil in positief patroon voor cycline D1 tussen melanomen en Spitz nevi...20 Figuur 5: Directe methode...21 Figuur 6: Indirecte methode...22 Figuur 7: Indirecte methode met peroxidase enzym...24 Figuur 8: Microm HMP Figuur 9: Medite Medizintechniek...25 Figuur 10: Microm HM 350 S...26 Figuur 11: Shandon Varistain Figuur 12: DAKO Autostainer Plus...27 Figuur 13: Hemaluin - eosine kleuring...33 Figuur 14: De huid...36 Figuur 15: Cycline D1 kleuring bij concentratie van 1/200 ( vergroting 20x)...38 Figuur 16: Cycline D1 kleuring bij concetratie 1/100 (vergroting 20x)...39 Figuur 17: Cycline D1 kleuring bij concentratie 1/50 (vergroting 20x)...40 Figuur 18: Cycline D1 kleuring bij nevi...43 Figuur 19: Cycline D1 kleuring bij Spitz Nevi...44 Figuur 20: links: HMB 45 kleuring (vergroting 10 x) rechts: cycline D1 kleuring ( 40x)

10 diagnose van melanomen Tabellen Tabel 1: Vergelijking tumorsuppressorgenen en proto-oncogenen [17]...17 Tabel 2: Amplificatie en translocatie van het chromosoom 11q Tabel 3: Gradatie positiviteit...37 Tabel 4: Resultaten samenvatting...41 Tabel 5: Correlatie ulceratie cycline D1 positiviteit

11 diagnose van melanomen Inhoudsopgave Inhoudsopgave Woord vooraf 1 Lijst met afkortingen en symbolen 2 Verklarende woordenlijst 3 Lijst van tabellen en figuren 7 Inhoudsopgave 9 1 Inleiding, situatieschets en probleemstelling 11 2 Literatuurstudie Wat is cycline D1 en wat is zijn rol in de celcyclus? Wat is een kankercel Wat is de rol van cycline D1/ BCL-1/PRAD-1 bij kanker Doel van dit onderzoek 20 3 Materiaal en methode Immunohistochemische kleuring: principe Materiaal Apparatuur en benodigdheden Reagentia Methoden Bewerking van het staal Immunohistochemische kleuring Tegenkleuren van de immunohistochemische coupes 35 4 Onderzoek en resultaten Onderzoek Op punt stellen van de immunohistochemische kleuring cycline D Eigenlijk onderzoek Resultaten 38 9

12 diagnose van melanomen Positieve controle 38 5 Discussie en besluiten Vergelijking cycline D1 expressie bij melanomen, nevi en Spits nevi Besluit over de kleuring cycline D1 in melanomen, nevi en Spitz nevi Besluit over de vergelijking cycline D1 HMB Besluit over gradiënt van de kleuring cycline D Correlatie tussen aanwezigheid van ulceratie en cycline D1 positiviteit 46 Samenvatting 47 Literatuurlijst 49 Bijlagen 53 Bijlage 1 Mutaties 53 Bijlage 2 Transcriptie en translatie van genen 54 Bijlage 3 Cellen in de huid 55 Bijlage 4 Vergelijking Hemaluin-eosine, HMB 45 en cycline D1 kleuring 56 Bijlage 5 Melanocyten 57 Bijlage 6 Tabel van reagentia 58 Bijlage 7 Tabel met resultaten 60 Colofon 64 Voor akkoord verklaring 65 10

13 diagnose van melanomen Literatuurstudie 1 Inleiding, situatieschets en probleemstelling Cycline D1 is een eiwit van 36 kda groot dat wordt gecodeerd door het gen CCND1 (BCL-1). Het behoort samen met cycline D2 en cycline D3 tot de familie van D cyclines. We vinden dit gen terug op de lange arm van chromosoom 11. [4] Figuur 1: Cycline D1 wordt gecodeerd door het CCND1 gen Cycline speelt een rol bij de regulering van de overgang tussen verschillende fasen in de celcyclus. Dit gebeurt door een associatie met een cycline afhankelijk ( dependent ) kinase (CDK). Door deze associatie kunnen de kinasen geactiveerd worden. De groep van cycline D kan het CDK4 en CDK6 binden en activeren. De activatie van CDK4 en CDK6 kan leiden tot de fosforylatie van het retinoblastoma eiwit (prb). Cycline D1 is afhankelijk van groeifactoren voor zijn expressie en komt vroeg op gang in de G1 fase van de celcyclus. Bij verhoogde expressie van cycline D1, kan de cel overgaan naar de S-fase van de celcyclus. Cycline D kan ook een CDK onafhankelijke rol spelen in de celcyclus, namelijk de rol als transcriptieregulator. Cycline D1 is dus betrokken bij zowel de progressie van de celcyclus als bij de celgroei. Wanneer er zich problemen voordoen met dit gen, dan kan het cycline D1 overgeëxpreseerd worden. Dit kan resulteren in een tumor. In bepaalde tumoren stijgt de cycline D1 concentratie. 11

14 diagnose van melanomen Literatuurstudie In de oncologie (tumorigenesis) speelt cycline D1 een rol in tal van tumoren: - Parathyroïd adenoom - Mantelcel lymfoom - Barrett dysplasie/ adenocarcinoom van de slokdarm - Borstcarcinoom - Maligne melanoom van de huid In ons onderzoek werd nagegaan of de cycline D1(DAKO) bruikbaar is als discriminerende merker voor maligniteit. Dit in de differentiële diagnose tussen het maligne melanoom met goedaardige navocellulaire nevi en Spits nevi. Na het op punt stellen van de immunohistochemische kleuring cycline D1, is het onze opzet na te gaan of cycline D1 kan gebruikt worden bij de diagnose van maligne melanomen in de huid. Hierbij werd de immuunhistochemische (over-) expressie van cycline D1 vergelijken bij 5 goedaardige nevi, 5 Spitz nevi en 20 melanomen. Het onderzoek voor dit eindwerk werd uitgevoerd in het labo anatomo-pathologie van het Stedelijk ziekenhuis te Roeselare. Het werd met zorg begeleid door Dr. E. Steenkiste en Dr. M. Haspeslagh. 12

15 diagnose van melanomen Literatuurstudie 2 Literatuurstudie 2.1 Wat is cycline D1 en wat is zijn rol in de celcyclus? Cycline D1 is een interessant proto-oncogen dat zijn rol speelt in de celcyclus van normale cellen en kankercellen. Tijdens de celdeling zullen cellen een aantal fasen doorlopen. De eerste fase die de cellen zullen doorlopen is de G1 fase. In deze fase zal het celvolume toenemen, door RNA en eiwitsynthese en dit in aanwezigheid van groeifactoren. Deze fase is de voorbereiding op de volgende fase, de S-fase of synthese fase. In de G1 fase kunnen cellen ook in rust gaan indien niet genoeg groeifactoren aanwezig zijn, de G0 fase genoemd.[17] De S-fase is de volgende stap in de celcyclus. Hier vindt de synthese van DNA plaats. Na de S-fase volgt de G2 fase, deze fase is een voorbereiding op de M-fase of mitose fase (kerndeling).[17] Wanneer een cel overgaat naar een volgende fase dan passeert het telkens een controlepunt of checkpoint. De controle punten in de celcyclus worden ingelast om fouten in het DNA te kunnen herstellen. Op deze controlepunten wordt de celdeling stilgelegd en gecontroleerd of er eventueel DNA schade is opgetreden. Indien er DNA schade is opgelopen dan wordt deze hersteld of gaat de cel in apoptose.[17] De overgang naar een volgende fase in de celcyclus van deze cellen gebeurt via deze controle punten, die afhankelijk zijn van schakeleiwitten. De schakeleiwitten die de overgang verzorgen van de G1-fase naar de S-fase, zijn de S-phase promoting factors (SPF). De schakeleiwitten voor de overgang van de G2-fase naar de M-fase, worden Mphase promoting factors (MPF) genoemd. Promoting factors bevatten kinase als actief bestanddeel. Deze kinasen worden ondermeer geactiveerd door binding met cyclines. Kinasen die voor hun activatie afhankelijk zijn van cyclines worden cycline dependente kinasen genoemd, CDK s.[17] 13

16 diagnose van melanomen Literatuurstudie Het is op deze momenten dat de cyclines tussenkomen in de celcyclus. Er bestaan verschillende cyclines die op verschillende momenten van de celcyclus binden met de aanwezige kinasen. Cycline D1, D2 en D3 vinden we terug in de G1-fase. Ze behoren allen tot de cycline D familie en hebben biochemisch een vrij analoge structuur. [16,17] ( M-fase ) (G2-fase ) (G1-fase) (S-fase ) Figuur 2: Cyclines in de celcyclus Cyclines zullen tijdens de celcyclus binden met CDK s. Op deze manier worden de kinasen geactiveerd. De cycline D s die voor komen in de G1 fase zullen CDK4 en CDK6 binden en activeren. Deze CDK s kunnen het retinoblastoma eiwit (prb) fosforyleren. [7,16,17,18] Niet gefosforyleerd prb bindt E2F. Bij de fosforylatie van prb komt E2F vrij. Niet gefosforyleerd prb functioneert dus als repressor voor het E2F. E2F is een transcriptiefactor die betrokken is in de G1-fase en de S-fase. Als E2F vrijkomt kunnen de genen afgelezen worden die DNA polymerase en thymidine kinase produceren. [5,7,15] 14

17 diagnose van melanomen Literatuurstudie P16 Figuur 3: Invloed van cycline D1 op het Rb eiwit Het regulatorisch gen p16 vormt een complex met CDK4/6 en voorkomt de binding van cycline D1 met deze cycline dependente kinasen. Inactivatie van p16 of overexpressie van cycline D1 komt ten gunste van de progressie naar de S-fase. [5] De cycline D s zijn afhankelijk van groeifactoren, indien er genoeg groeifactoren aanwezig zijn dan kan de cel overgaan naar de S-fase. De concentratie van cyclines stijgt dus naar het eind van de doorlopen fase, bij de hoogste concentratie gaat de cel over naar de volgende fase. Daarna komen de cyclines los en worden afgebroken door proteolytische enzymen, waardoor de concentraties aan cycline-cdk s weer gaat dalen. Aan dit cyclisch stijgen en dalen, van de concentratie van cycline in de celcyclus, dankt het uiteindelijk zijn naam ( to cycle ).[17] 15

18 diagnose van melanomen Literatuurstudie 2.2 Wat is een kankercel Wanneer een cel ongecontroleerd kan delen door een defect in de celcyclus van die cel, dan kan deze cel uitgroeien tot een kankercel. Als deze gemuteerde cel zich kan delen en blijven delen, ontstaat een tumor. Tumoren kunnen zowel goedaardig als kwaadaardig zijn. Goedaardige tumoren blijven altijd gelokaliseerd. Kwaadaardige tumoren zijn veel agressiever, met lokale destructie van het weefsel. Ze bevatten bovendien vaak de mogelijkheid van metastasering, waarbij ze zich verspreiden over het ganse lichaam. Bij de mutatie van een gen gaan we het onderscheid maken tussen twee vormen, mutatie in de tumor supressor genen en een mutatie in de proto-oncogenen. Wanneer er een mutatie ontstaat in een proto-oncogen dan evolueert het proto-oncogen naar een oncogen. Deze mutatie is een activerende mutatie, waarbij de cel ongecontroleerd kan blijven delen. Er is een kankercel ontstaan. Bij proto-oncogenen is het defect van 1 allel genoeg om tot overexpressie te leiden van het gen. Wanneer er zich een mutatie voordoet in de tumor suppressor genen, die in een normale cel een groeiremmende functie uitvoeren, dan verliest deze zijn functie. Het gen komt niet meer tot expressie waardoor hij een cel niet kan remmen in zijn groei. De cellen die onder controle stonden van dit gen kunnen ongecontroleerd gaan groeien. De functie van dit gen gaat slechts verloren bij de uitschakeling van beide allelen van het gen. Mensen die al een mutatie bevatten bij de geboorte, door een erfelijke aandoening, zijn hierdoor benadeeld. Zij zullen al bij een volgende (tweede) toevallige mutatie een functie verlies, van het betreffende gen, oplopen.[17] 16

19 diagnose van melanomen Literatuurstudie Tabel 1: Vergelijking tumorsuppressorgenen en proto-oncogenen [17] Aantal mutaties om een kanker te veroorzaken Verlies of activatie van de functie van het gen Tumor suppressor genen twee allelen uitschakelen om een kanker te veroorzaken. Desactiverende mutatie, verlies van zijn remmende functie Proto-oncogenen 1 allel uitschakelen is al voldoende activerende mutatie, waarbij de functie bevorderd wordt, ongecontroleerde deling Rol in normale cel Groeiremmend effect Groeibevorderend effect Proto-oncogenen hebben slechts 1 uitgeschakeld allel nodig om een kanker te veroorzaken tegenover tumorsuppressor genen waarbij beide allelen uitgeschakeld moeten zijn om kanker te veroorzaken. Proto-oncogenen voeren in een normale cel een groeibevorderende functie uit. Als deze uitgeschakeld worden kunnen we spreken van een activerende mutatie. Tumorsuppressor genen hebben een groeiremmend effect, we spreken van een desactiverende mutatie bij mutaties. 2.3 Wat is de rol van cycline D1/ BCL-1/PRAD-1 bij kanker Het exprimeren van cycline D1 gebeurt in verschillende tumoren op verschillende manieren. Een eerste manier waarbij cycline D1 geëxprimeerd wordt, komt voort uit een translocatie van het chromosoom 11, die het CCND1gen bevat dat cycline produceert en chromosoom 14, t(11;14) (q13;q32). Door deze translocatie wordt het BCL-1 gen (B-cel leukemie/lymfoom) veranderd en cycline D1 wordt overgeëxprimeerd. Dit is het geval bij mantelcellymfomen. Het eiwit cycline D1 kan gedetecteerd worden in alle mantelcellymfomen. Dit is een belangrijke toepassing van de immuunhistochemische kleuring cycline D1 in de pathologie. [1,20] Een tweede manier waarop cycline D1 overgeëxprimeerd wordt, is het gevolg van een translocatie van het PRAD-1 gen(parathyroïd adenomatosis), aanwezig op chromosoom 11q13 met het gen dat het parathyroïd hormoon produceert. 17

20 diagnose van melanomen Literatuurstudie Hieruit volgt dat in zeldzame gevallen waarbij cycline D1 overgeëxprimeerd wordt, een parathyroïd adenoom kan ontstaan.[1] PRAD-1 en BCL-1 liggen op niet meer dan 130 kb afstand van elkaar en houden in zekere zin dan ook verband met elkaar. De PRAD-1 word de gelijke genoemd van BCL-1 oncogen in lymfoïde neoplasieën. Het breakpoint locus van het BCL-1gen ligt op 130 kb van het PRAD-1.[3] Het overexprimeren van cycline D1 kan ook het gevolg zijn van DNA amplificatie. Dit komt voor in heel wat kankers van de darmen, borst, longen, hoofd en nek, en blaas. Het gaat hier over een amplificatie van chromosoom 11q13. [2, 3, 11, 12, 15, 18, 19] Er werd ook een DNA amplificatie van chromosoom 11q13 gevonden bij een subtype van melanomen, namelijk de acrale melanoma s. In andere melanomen werd deze amplificatie niet altijd gevonden. [6,14] Tabel 2: Amplificatie en translocatie van het chromosoom 11q13 categorie proto-oncogen activatiemechanisme type tumor Celcyclus geassocieerd eiwit cycline cycline D1 amplificatie oesophagus-, maagcarcinoom translocatie mantelcellymfoom In de tabel zijn enkele mogelijke mutaties te zien. Waarbij ook is beschreven welke types tumoren ze kunnen veroorzaken. 18

21 diagnose van melanomen Literatuurstudie Bij melanomen is de rol van cycline D1 en het mechanisme van het overexprimeren van cycline D1 minder goed gekend. Niet enkel de melanomen met cycline D1 amplificatie vertonen immers een verhoogd geëxprimeerd cycline D1. Er werden, tijdens verschillende onderzoeken, melanomen gevonden die overdeëxprimeerd cycline D1vertoonden, maar waarbij geen amplificatie van chromosoom 11q13 gevonden werd. Niet alleen de tumoren met cycline D1 amplificatie kunnen het eiwit overexprimeren, maar ook een groot deel met een normale hoeveelheid kopieën. Wel weten we dat in alle gevallen van amplificatie er ook cycline D1overgeëxprimeerd wordt. In deze gevallen is bovendien de graad van proliferatie hoger. Voor de andere gevallen waarbij cycline D1 overgeëxprimeerd wordt, (bij een normaal aantal kopieën) zijn andere factoren betrokken die een invloed hebben op de cycline D1 die wordt overgeëxprimeerd. Deze factoren zijn tot nog toe niet gekend. [6] Normale melanocyten in histologisch normale huid, vertonen geen cycline D1 expressie. Ook goedaardige pigmentcelletels van de huid (nevus/ nevi) vertonen geen cycline D1 overexpressie.[12] Het kan moeilijk zijn voor pathologen om het morfologisch onderscheid te maken tussen Spits nevi en melanomen. Spitz nevi zijn goedaardige pigmentletsels. Er kan dan ook worden verondersteld dat cycline D1 niet wordt overgeëxprimeerd in goedaardige Spitz nevi. Maar na een studie, om het onderscheid te maken tussen maligne melanoma en Spits nevi, werd deze hypothese herzien. Spitz nevi vertonen een aankleuringspatroon met een gradiënt naar de diepte toe (verlies van positieve kernen naar de diepte). Voorlopig is de oorzaak van het overexprimeren van cycline D1 in Spitz nevi niet gekend. Amplificatie is niet altijd de oorzaak van het overexprimeren. Dit werd aangetoond doordat in een studie via een in situ hybridisatie techniek, amplificatie werd uitgesloten.[12] Er wordt dus zowel in maligne melanomen als in Spitz nevi cycline D1 overgeëxprimeerd. Maar een studie toonde een verschil in patroon van aankleuren. In Spitz nevi, is er verlies van positiviteit van cycline D1 in de diepere dermis. In tegenstelling tot vele cellen in neoplastische melanomen die sterk positief zijn voor cycline D1. In melanomen is er dus geen negatieve gradiënt naar de diepte toe.[12] 19

22 diagnose van melanomen Literatuurstudie Figuur 4: Verschil in positief patroon voor cycline D1 tussen melanomen en Spitz nevi Spitz nevi: verlies van positiviteit van cycline D1 in de diepere dermis. Melanomen: geen negatieve gradiënt naar de diepte toe. 2.4 Doel van dit onderzoek In ons onderzoek, in het labo pathologie Stedelijk Ziekenhuis Roeselare, werd nagegaan of de cycline D1(DAKO) bruikbaar is als discriminerende merker voor maligniteit. Dit in de differentiële diagnose tussen het maligne melanoom met goedaardige navocellulaire nevi en Spits nevi. 20

23 Diagnose van melanomen Materiaal en methode 3 Materiaal en methode 3.1 Immunohistochemische kleuring: principe De kleuring van immunohistochemische stalen berust op het toevoegen van een met enzym gemerkt antilichaam. Het toevoegen van dit gemerkt Al kan op twee verschillende manieren gebeuren, direct of indirect. Directe methode: De antigenen die aanwezig zijn in de weefsel coupe worden aange- toond door een antilichaam die gebonden is met een enzym. Hier gebeurt alles in één enkele stap. [13] E E E Antigenen X Al gemerkt met enzym tegen Ag- X Figuur 5: Directe methode Het met enzym gemerkt Al bindt zicht op de antigenen. Wanneer een substraat toegevoegd word, dan zal het enzym dit substraat omzetten in een gekleurd product. 21

24 Diagnose van melanomen Materiaal en methode Indirecte methode: Bij de indirecte methode wordt gebruik gemaakt van een primair en een secundair Al. Het is het secundair Al dat gelabeld is met een enzym. In een eerste stap wordt het primair Al gebonden en in de tweede stap wordt een gelabeld Al gebonden. Dit gelabeld Al bind met het primair Al, we kunnen dus eigenlijk spreken van een antiantilichaam.[13] Antigenen X Konijn Anti-X E E E GAR gemerkt met een enzym Figuur 6: Indirecte methode Tweestappen methode: Als eerste stap wordt een konijn antilichaam (primair Al) toegevoegd die zich bindt met de antigenen. Als tweede stap wordt een met enzym gemerkt anti- konijn antilichaam (secundair Al) toegevoegd. Dit gemerkt antilichaam zal zich dus binden met het primaire antilichaam. Er ontstaat dus een antigen- primair Al-secundair Al-complex. 22

25 Diagnose van melanomen Materiaal en methode Bij het toevoegen van een substraat kan door de aanwezigheid van het enzym, dit substraat omgezet worden naar een gekleurd product. Via de lichtmicroscoop worden de resultaten geïnterpreteerd, dit gebeurt door de pathologen. Voor het opsporen van cycline D1 wordt gebruik gemaakt van het peroxidase enzym. Het peroxidase wordt bereid uit de mieriks-wortel. Het word ook nog wel de horse radisch peroxidase genoemd. Er word gebruik gemaakt van DAB ( diaminobenzidine) en H 2 O 2. Peroxidase kan in aanwezigheid van H 2 O 2 organische stoffen katalyseren. DAB wordt gebruikt als elektronen donor om de reactie te laten plaats vinden. Door de omzetting van het substraat naar een bruin onoplosbaar complex kan deze gemakkelijk gedetecteerd worden onder de microscoop.[13] 23

26 Diagnose van melanomen Materiaal en methode Figuur 7: Methode met primair antilichaam en polymeer. 24

27 Diagnose van melanomen Materiaal en methode 3.2 Materiaal Apparatuur en benodigdheden Figuur 8: Microm HMP 110 De Microm HMP 110 wordt gebruikt voor het automatisch inbedden van de weefsels in paraffine. Figuur 9: Medite Medizintechniek De Medite Medizintechnik wordt gebruikt voor het handmatig inbedden van weefsel in paraffine. De weefsel worden hier correct georiënteerd zodat ze op de correcte manier worden doorgesneden. 25

28 Diagnose van melanomen Materiaal en methode Figuur 10: Microm HM 350 S De Microm HM 350 S wordt gebruikt voor het snijden van coupes vertrekkend vanaf de paraffineblokken. Figuur 11: Shandon Varistain 24-4 De Shandon Varistain 24-4 wordt gebruikt voor de hematoxyline-eosine kleuring, de papanicolau kleuring en het deparaffineren van coupes. 26

29 Diagnose van melanomen Materiaal en methode Figuur 12: DAKO Autostainer Plus De Autostainer Plus, van DAKO, wordt gebruikt voor de immunohistochemische kleuringen van coupes. Verder worden ook nog cassettes gebruikt om de coupes in te bedden, een warmplaat (37 C), een microgolfoven, dekglaasjes (gecoate de kglaasjes voor immunohistochemische kleuringen) en een droogstoof (60 C) Reagentia Zie bijlage 6. 27

30 Diagnose van melanomen Materiaal en methode 3.3 Methoden Bewerking van het staal Allereerst gebeurt de identificatie van het staal. De stalen komen aan met een aanvraag formulier. We gaan na of alle nodige gegevens zijn ingevuld en geven het formulier een stempel met de datum en een biopsienummer (E nummer vb. E75426). Daarna leggen we de biopten in een cassette, waarbij voor kleine weefsel stukjes gebruik gemaakt wordt van een vloeipapiertje in de cassette. We noteren het staalnummer op de cassette. We meten het weefsel stukje(s) en noteren de lengte en het aantal fragmenten op het aanvraag formulier. Soms wordt gebruikt gemaakt van een tekening. Indien nodig worden de biopten bijgesneden, dan worden ook de sneden op de figuur aangeduid. We sluiten de cassette af met een dekseltje en plaatsen deze in formol 4%. Daarna doorlopen de stalen een aantal fasen. Van het inbedden in paraffine tot het kleuren van coupes. Voorbehandeling: - 1 e bad formol 4% gedurende 1u - 2 e bad methanol gedurende 1u - 3 e bad methanol gedurende 1u - 4 e bad methanol gedurende 1u - 5 e bad methanol gedurende 1u - 6 e bad methanol gedurende 1u - 7 e bad methanol gedurende 1u 30 min - 8 e bad xyleen gedurende 1u - 9 e bad xyleen gedurende 1u - 10 e bad xyleen gedurende 1u 30 min - 11 e bad paraffine 60 C gedurende 2u - 12 e bad paraffine 60 C gedurende 2u Dit gebeurt overnacht omdat dit proces enige tijd in beslag neemt. 28

31 Diagnose van melanomen Materiaal en methode Uitbedden in paraffine: - Neem een cassette die de voorbehandeling heeft ondergaan. - Neem het dekseltje van de cassette - Neem een ijzeren cupje, aangepast aan de grote van het in te bedden weefselstukje - Vul het cupje met paraffine en breng het weefsel stukje op zijn snijvlak in de paraffine. - Plaats even op de koelplaat en druk het weefselstukje aan, kijk nog eens of het weefsel stukje correct georiënteerd ligt. - Plaats de cassette boven op het cupje en druk het aan. - Vul de cassette op met paraffine. - Laat stollen op de koelplaat. - Maak de blokjes schoon, zodat ze gemakkelijk in de houder kunnen geplaatst worden en zo makkelijk te snijden Snijden van de coupes: - Zet de veiligheid op en plaats dan de te snijden blok in de houder. - Breng de houder met de blok verder weg van het mes met het knopje - Zet de veiligheid af en breng de blok naar beneden met het grote wiel (zijkant Microm) - Breng de blok dichterbij het mes met het knopje maar zorg ervoor dat de blok het mes niet raakt. - Door een druk op het kleine wiel (zijkant Microm) plaatsen we de machine in de TRIM stand. - Door een druk op de pedaal word het snijden gestart. Bij een tweede druk kan de machine gestopt worden. - Ga door tot je diep genoeg bent in de blok en ga dan over naar de feed stand door een druk op het kleine wiel (zijkant Microm). - Als je aan het snijden bent op de feed stand dan neem je voorzichtig de lijntjes vast tot een goede lengte verkregen wordt. 29

32 Diagnose van melanomen Materiaal en methode - Leg de machine stil door een druk op het pedaal, neem het hele lijntje op en leg deze op een houten bordje. - Plaats het juiste nummer (het E nummer dat op het blokje staat) op een etiket en kleef dit naast het lintje. Kleven van de coupes - Neem een draagglaasje en noteer met een potlood het juiste nummer van de te kleven coupe. - Breng enkele druppels Stick-on (verdunning 2/100ml AD) - Snij met een fijn mesje een vierkantje uit het diepst afgesneden lintje - Kleef dit stukje op zone drie van het draagglaasje. Zone 3 Zone 2 Zone 1 E Leg het draagglaasje met de coupe op de verwarm plaat en strek uit met 2 fijne prikkers. - Giet het overtollig Stick-on af en laat drogen op de verwarmplaat. - Na enkele minuten plaatsen de coupes in een rekje - Droog in de microgolf oven, 1 rekje 7 min op 360W, 2rekjes 8 min. - Plaats daarna in een rekje voor de kleuring. Afhankelijk van de grote worden verschillende stukjes coupe gekleefd: Kleine lintjes: 2 vierkantjes aan elkaar. We nemen twee van deze aan elkaar hangende vierkantjes en leggen die boven elkaar als volgt: E

33 Diagnose van melanomen Materiaal en methode Grote lintjes: 1 vierkantje. We leggen twee vierkantjes boven elkaar: Van grote weefsels nemen we soms 1 lintje: Uitstrekken van de coupe: E75384 E75383 E75385 Hematoxyline-eosine kleuring: - 1 e bad xyleen 4 min - 2 e bad xyleen 4 min - 3 e bad alcohol min - 4 e bad alcohol 90 4 min - 5 e bad alcohol 70 + ammoniak 4 min - 6 e bad alcohol 90 / - 7 e bad water 1min - 8 e bad hematoxyline 5 min - 9 de bad stromend water 10 sec - 10 e bad zure alcohol (HCL 1/100ml) 1sec - 11 e bad stromend water 1sec - 12 e bad alcohol 70 + ammoniak / - 13 e bad water + ammoniak 1 min 31

34 Diagnose van melanomen Materiaal en methode - 14 e bad stromend water 10 sec - 15 e bad eosine 50 sec - 16 e bad stromend water 15 sec - 17 e bad alcohol 90 5 sec - 18 e bad papanicolau solution 2a oranje / - 19 e bad alcohol 90 / - 20 e bad papanicolau solution 3b polychrome EA 50 / - 21 e bad alcohol 90 5 sec - 22 e bad alcohol 90 5 sec - 23 e bad alcohol sec - 24 e bad xyleen 3 min Monteren van de coupes: - Draag handschoenen voor dit proces - De coupes bevinden zich in een bakje gevuld met xyleen - Leg enkele dekglaasjes klaar met de gewenste grootte - Breng een druppel canadabalsem aan op het dekglaasje (afgelengd met xyleen) - Neem een voor een met een pincet de coupes uit de xyleen en plaats het dekglaasje met canadabalsem tegen de coupes - Druk het dekglaasje aan - Zorg ervoor dat er geen luchtbellen meer tussen het draagglaasje en het dekglaasje aanwezig zijn. - Neem een papieren doekje en droog voorzichtig het draagglaasje af. - De coupes zijn klaar om onder de microscoop bekeken te worden. 32

35 Diagnose van melanomen Materiaal en methode Immunohistochemische kleuring De coupes worden bekeken door Dr. M. Haspeslagh en Dr. E. Steenkiste. Vaak wordt naast een klassieke hemaluin-eosine kleuring, gebruik gemaakt van aanvullende immuunhistochemische kleuringen. Figuur 13: Hemaluin - eosine kleuring Voorbehandeling van de stalen alvorens de Autostainer kan gestart worden. - Als de coupes gekleefd en gedroogd zijn worden de etiketten aangebracht - Plaats het rekje met de stalen overnacht in de broedstoof - De volgende morgen worden de stalen in de Shandon Varistain 24-4 gedeparaffineerd. - Plaats de coupes in water om uitdrogen uit te sluiten. - Maak een buffer ph 9 en ph 6 aan naargelang de eisen van de stalen. In een verdunning van 1/10 in een volume van 200 ml per bakje. - Plaats de stalen in de juiste buffer - Verwarm op 600 W in de microgolf oven, 7 min indien 2 rekjes, 5 min indien 1 rekje - Laat 1 min rusten en vul indien nodig AD aan. - Verwarm bij 600 W gedurende 5 min - Laat 20 min afkoelen op kamertemperatuur - Plaats de rekjes 10 min in tween 20 33

36 Diagnose van melanomen Materiaal en methode - Plaats de draagglaasjes in de Autostainer - Maak de dopjes los van de reagentia - Start het proces met het scannen van de barcodes - Daarna kan het toestel gestart worden. Proces: - Eerst gebeurt de cleaning van de probe - Daarna worden alle draagglaasjes voor gespoeld met buffer - Daarna worden de draagglaasjes besprenkeld met HRP blocking reagent gedurende 10 min - Daarna is er weer cleaning van de probe - De draagglaasjes worden weer gespoeld met buffer - De draagglaasjes worden besprenkeld met een primaire antilichaam en gedurende 10 min blijft deze op de draagglaasjes. - Tussen de verschillende primaire antilichamen wordt de probe schoongemaakt. - Na die 10 min worden de draagglaasjes weer gespoeld met buffer - Daarna worden de plaatjes besprenkeld met Envision Dual link en dit blijft gedurende 30 min op de draagglaasjes - Probe schoonmaken - Daarna worden de draagglaasjes twee maal gespoeld met buffer - De machine schakelt over naar de toxic waste afvalcontainer (chromogeen in substraat is schadelijk) - Vervolgens wordt het substraat DAB + chromogeen op de draagglaasjes gesprenkeld en dit blijft 10 min op de draagglaasjes zodat het substraat tijd heeft om omgezet te worden in een gekleurd product. - De draagglaasjes worden gespoeld met water. - Machine is klaar druk op OK en save de RUN LOG 34

37 Diagnose van melanomen Materiaal en methode Tegenkleuren van de immunohistochemische coupes - Plaats het rekje gedurende 2 min in hematoxyline - Spoel in water - Dompel in zure alcohol (HCl 1/100ml alcohol) - Spoel in water - Dompel kort onder in water met ammoniak (opblauwen) - Spoelen in water - Dompel 2x in alcohol 90 - Dompel 2x in xyleen 35

38 diagnose van melanomen Onderzoek en resultaten 4 Onderzoek en resultaten 4.1 Onderzoek Op punt stellen van de immunohistochemische kleuring cycline D1 Volgens het protocol van Dako Cytomation, Monoclonal Mouse Anti-Human Cycline D1 werd een positieve controle uitgevoerd op de huid. Hier werd bij het gebruik van En Vision" door DAKO zelf een verdunning aangeraden van 1/300 of 1/200. Er wordt nagegaan bij verschillende concentraties of er een nucleaire kleuring verkregen wordt. De concentratie, waarbij een nucleaire kleuring wordt verkregen, zullen we verder gebruiken voor het uitvoeren van de test op weefsel van goedaardige nevi, goedaardige Spitz nevi en melanomen. Figuur 14: De huid 36

39 diagnose van melanomen Onderzoek en resultaten Eigenlijk onderzoek In dit onderzoek worden 20 melanomen met 5 nevi en 5 samengestelde of dermale Spitz nevi vergelijken op het gebruik van de cycline D1(DAKO) als discriminerende merker voor maligniteit. Dit in de differentiële diagnose van het maligne melanoma met goedaardige navocellulaire nevi en Spits nevi. In het archief gaan we daarom op zoek naar biopten die werden beoordeeld als melanoom, nevi of Spitz nevi en vergelijken de of cycline D1 overgeëxprimeerd wordt. De cycline D1 wordt telkens vergeleken met de resultaten voor HMB45. HMB 45 is een merker die gebruikt wordt voor de bevestiging van melanomen. De coupes worden semi-kwantitatief gescoord voor de dermale component. Ook de aanwezigheid van een negatieve gradiënt naar de diepte wordt beoordeeld. Tabel 3: Gradatie positiviteit Gradatie positiviteit percentage symbool zwak 0-4% + matig 5-20% ++ sterk > 20% +++ Voor het beoordelen van de stalen word in overeenkomst een gradatie toegekend aan de positiviteit van de stalen. Van zwak positief tot sterk positief. Melanomen: E53885, E62115, E64095, E64392, E64993, E66562, E66710, E66815, E67065, E67079, E68163, E68626, E70111, E71498, E72441, E72815, E73285, E73978, E74232 en E Nevi: E52365, E53370, E60505, E61086 en E Spitz nevi: E41123, E64354, E67592, E62443 en E

40 diagnose van melanomen Onderzoek en resultaten 4.2 Resultaten Positieve controle Voor het maken van de concentratie werd telkens humaan anti-cycline D1 verdund in En vision dual link. Door het aanpassen van de concentratie wordt een nucleaire aan kleuring bekomen. Huidbiopsies voor kleuring van cycline D1 bij verdunning 1/200 ( E75757, E75769 en E75798/2) blijken niet goed aangekleurd. Op de figuur is te zien dat er geen nucleaire aankleuring wordt bekomen. Dit betekend dat we bij een verdunning van 1/200 geen goede kleuring bekomen hebben en dat de concentratie nog moet worden verhoogd. De kleuring wordt als goed aanzien indien een nucleaire kleuring wordt bekomen. Figuur 15: Cycline D1 kleuring bij concentratie van 1/200 ( vergroting 20x) 38

41 Cycline D1 in de pathologie bij de diagnose van melanomen Onderzoek en resultaten De concentratie wordt voor de helft sterker gemaakt, ook hier zien we dat de huidbiopsies voor kleuring van cycline D1 bij verdunning 1/100 ( E75757, E75769 en E75798/2) niet goed aangekleurd zijn. De kleuring wordt gezien in het cytoplasma. Maar de resultaten worden enkel als positief aanzien, indien de kernen aangekleurd worden. We zoeken verder naar de goede concentratie. Op deze manier stellen we de kleuring op punt. Figuur 16: Cycline D1 kleuring bij concetratie 1/100 (vergroting 20x) 39

42 diagnose van melanomen Onderzoek en resultaten De concentratie wordt nogmaals voor de helft sterker gemaakt. Huidbiopsies voor kleuring van cycline D1 bij verdunning 1/50 (E75757, E75769 en E75798/2) vertonen dit maal wel een nucleaire aan kleuring, zoals op de figuur te zien is. Voor ons onderzoek zullen we dus werken bij een concentratie van 1/50. Figuur 17: Cycline D1 kleuring bij concentratie 1/50 (vergroting 20x) 40

43 diagnose van melanomen Onderzoek en resultaten Tabel 4: Resultaten samenvatting Type Aard Cycline HMB45 positief negatief positief negatief Melanoom Superficieel spreidend 11 (79%) 3 (21%) 9 (60%) 6 (40%) nodulair 4 (80%) 1 (20%) 4 (80%) 1 (20%) Totaal (melanomen) 15 (79%) 5 (21%) 13 (65%) 7 (35%) Naevus Naevoïd 2 (40%) 3 (60%) / / Spitz naevus Gemengd; epitheloïd/ speolcellig 2 (50%) 2 ( 50%) 0 3 (100%) In deze tabel word voornamelijk een vergelijking gemaakt tussen beide kleuringen. Zo kunnen we snel nagaan of de kleuring met cycline D1 in de toekomst kan gebruikt worden tegenover de huidige kleuring met HMB 45. Er kan worden besloten dat niet alle melanomen cycline D1 overexprimeren, in 21% van de gevallen wordt cycline D1 niet overgeëxprimeerd. Ongeveer eenzelfde aantal nodulaire en superficieel spreidende melanomen overexprimeren cycline D1( ± 80%). Opmerking: Bij de superficieel spreidende melanomen en de Spitz nevi valt 1 resultaat, voor cycline D1, uit omdat er geen dermale component in de diepere snede aanwezig is. Beide vertonen een positief beeld in de epidermale component. Bij de klassieke nevi werd geen HMB 45 kleuring uitgevoerd, doch de HMB 45 kleuring kan als negatief worden verondersteld in de diepe dermale component. Bij de Spitz nevi werden slechts in drie gevallen een HMB 45 uitgevoerd. Klassiek ziet men negativiteit voor HMB 45 in de diepe dermale component van een Spitz naevus. 41

44 diagnose van melanomen Onderzoek en resultaten Tabel 5: Correlatie ulceratie cycline D1 positiviteit Type Aard resultaat Aantal gevallen Melanoom Superficieel spreidend C+ / U+ (*) 1 (7%) C / U 3 (20%) C+ / U 11 (73%) C / U + 0 Nodulair C+ / U+ (*) 3 (60%) C / U 0 C+ / U 1 (20%) C / U + 1 (20%) Nevi naevoïd C+ / U+ (*) 0 C / U 2 (40%) C+ / U 3 (60%) C / U + 0 Spitz nevi Gemengd; epitheloïd/ spoelcellig C+ / U+ (*) 0 C / U 3 (60%) C+ / U 2 (40%) C / U + 0 Er wordt nagegaan of er een correlatie (ook in procent uitgedrukt) bestaat tussen ulceratie die gezien werd in de stalen en het positief resultaat voor de cycline D1. In de tabel werden vier mogelijkheden opgesteld. Positief resultaat voor beide (Cycline D1 positief en ulceratie) Ofwel beide negatief Ofwel een resultaat waarbij een van beide positief is. (*) C = Cycline D1 U = ulceratie 42

45 diagnose van melanomen Discussie en besluiten 5 Discussie en besluiten 5.1 Vergelijking cycline D1 expressie bij melanomen, nevi en Spits nevi Besluit over de kleuring cycline D1 in melanomen, nevi en Spitz nevi Voor de naevus zou cycline D1 negatief moeten zijn. Toch kunnen we opmerken dat in enkele gevallen toch een beperkte positiviteit ( 1% van de kernen) gevonden wordt voor cycline D1, dit telkens aan het oppervlak. Er is echter steeds een negatieve gradiënt aanwezig naar de diepte. Deze negatieve gradiënt kan te verklaren zijn door het feit dat ons lichaam constant weerstand biedt tegen gemuteerde cellen. Wanneer op het moment van afname zo n cel aanwezig is, dan wordt deze aangekleurd. Dit betekent niet dat deze persoon een kanker zal ontwikkelen. Het afweer systeem kan zo n cellen nog vernietigen. We spreken pas van een tumor wanneer er een overheersend aantal van deze cellen aanwezig zijn. Figuur 18: Cycline D1 kleuring bij nevi 43

46 diagnose van melanomen Discussie en besluiten Voor Spitz nevi is de helft positief en de andere helft negatief. In 1 Spitz naevus werd geen duidelijke negatieve gradiënt gezien. Immuunhistochemisch is er voor deze casus voor cycline D1 geen verschil met het maligne melanoom. Mogelijks betreft het een agressiever subtype van Spitz naevus ( high risk Spitz naevus). Figuur 19: Cycline D1 kleuring bij Spitz Nevi Besluit over de vergelijking cycline D1 HMB 45 Voor de SSMM (superficieel spreidend maligne melanoom) is HMB 45 vaker positief en dit met een sterkere intensiteit. Voor SSMM is de HMB 45 kleuring dan ook superieur aan de cycline D1 kleuring. Voor superficieel spreidende melanomen bevatten van de 11 gevallen die positief zijn voor cycline D1, 6 gevallen een gradiënt (55%). Voor de nodulaire melanomen werd geen verschil opgemerkt tussen de cycline D1 kleuring en de HMB 45 kleuring. Eenzelfde aantal (80%) kleurt positief. Spitz nevi hebben een wisselend aankleuringpatroon voor zowel HMB 45 als cycline D1. Beide kleuringen zijn dan ook niet overtuigend als discriminator tussen goedaardige en kwaadaardige Spitz nevi en Spitzoïde melanomen. Verder onderzoek met veel meer gevallen kan hierover in de toekomst eventueel meer duidelijkheid brengen. 44

47 diagnose van melanomen Discussie en besluiten Figuur 20: links: HMB 45 kleuring (vergroting 10 x) rechts: cycline D1 kleuring ( 40x) Besluit over gradiënt van de kleuring cycline D1 In het geval van nodulaire melanomen kunnen we besluiten dat van de 4 positieve cycline D1 kleuringen, er 3 geen gradiënt vertonen (75%). De ene kleuring waarbij wel een gradient te vinden is, is beperkt in de diepte. Bij nevi wordt telkens (in 3 van de cycline D1 positieven) een negatieve gradiënt gezien naar de diepte. 45

48 diagnose van melanomen Discussie en besluiten Bij Spitz naevus is deze beoordeling wat moeilijker daar er in twee gevallen cycline D1 positief was, maar slecht 1 resultaat kan beoordeeld worden op de gradiënt. Het tweede resultaat kan niet worden ingeschat omdat er geen dermale component aanwezig was in de diepere snede. Bij de dermale positieve Spitz naevus was bij ons geen gradiënt te zien voor de diepte Correlatie tussen aanwezigheid van ulceratie en cycline D1 positiviteit Voor geen enkel type is er een duidelijke correlatie te zien tussen ulceratie en de positiviteit voor de kleuring cycline D1. Ulceratie kan in een letsel aanwezig zijn, maar heeft geen invloed op de kleuring cycline D1. Bij de verschillende types zijn er telkens een aantal gevallen waarvoor cycline D1 positief is, maar waarbij niet altijd een ulceratie te zien is. 46

49 Cycline D1 in de pathologie Samenvatting Samenvatting Melanomen zijn agressieve kwaadaardige pigmentletsels van de huid. Maligne melanomen bestaan uit melanoomcellen. Deze cellen zijn de kwaadaardige vorm van normale pigment producerende cellen in de huid ( nevuscellen). Het is dan ook belangrijk onderscheid te maken tussen goedaardige pigmentcelletsels (nevi) en maligne melanomen. Daarom zal elke dermatoloog elk verdacht pigmentcelletsel wegnemen om het microscopisch te laten onderzoeken. In eerste instantie wordt een hemaluin-eosine kleuring uitgevoerd. Maar in sommige gevallen is een aanvullende immunohistochemisch onderzoek noodzakelijk. Een van de vele immunohistochemische kleuringen is de kleuring met antilichamen tegen cycline D1. Cycline D1 is een eiwit dat tussenkomt in de G1-fase in de celcyclus. Wanneer cycline D1 wordt overgeëxprimeerd, kan de cel ongecontroleerd gaan delen. Deze overexpressie komt voor bij verschillende tumoren, waaronder borstcarcinomen, mantelcellymfomen, parathyroïd adenomen, maligne melanomen van de huid en Barret dysplasie/ adenocarcinomen van de slokdarm. Vaak gaat het om amplificatie, inversie of translocatie van het gen CCND1 op chromosoom 11q13. Maar in enkele gevallen is de overexpressie niet gerelateerd met één van deze oorzaken. [2,3,5,11,15,18,19] In een studie werden melanomen onderzocht, waarbij werd opgemerkt dat niet alle melanomen cycline D1 overexprimeren. Volgens deze studie waren voornamelijk acrale melanomen cycline D1positief, doch ook superficieel spreidende en nodulaire melanomen vertoonden soms overexpressie. [10] In een andere studie werd aangetoond dat goedaardige nevi en Spitz nevi afwel negatief zijn voor cycline D1 ofwel een nagatieve gradiënt vertonen voor de diepte. De studie voorgesteld in dit eindwerk betreft 20 melanomen, 5 nevi en 5 samengestelde of dermale Spitz nevi die aangekleurd worden met cycline D1 en vergeleken met de immuunhistochemische kleuring voor maligne melanomen HMB 45. In deze studie kan cycline D1 geen duidelijk onderscheid maken tussen maligne melanomen en Spitz nevi, doch wel met goedaardige naevocellulaire nevi. 47

50 Cycline D1 in de pathologie Samenvatting Een cycline D1 kleuring is dan ook in zekere mate inferieur aan de HMB 45 kleuring, doch een positief resultaat van cycline D1, met name een diffuse positiviteit zonder negatieve gradiënt naar de diepte, pleit vermoedelijk voor maligniteit van het onderzochte pigmentletsel. Na dit onderzoek kan worden besloten dat het gebruik van de cycline D1 kleuring in de toekomst niet zal worden gebruikt binnen het labo. De HMB 45 kleuring blijft behouden in de routine voor het opsporen van maligne melanomen. De cycline D1 kan wel worden gebruikt als aanvullend onderzoek wanneer de HMB 45 kleuring geen duidelijkheid brengt. 48

51 Literatuurlijst [1] Bartkova J, Lukas J, Strauss M, Bartek J.; Cell cycle-related variation and tissue-restricted expression of human cyclin D1 protein;7 december 1993; URL: [ Gezien op 27/02/2009 [2] Bringuier P. P., Tamimi Y., Schuuring E., Schalken J; Expression of cyclin D1 and EMS1 in bladder tumours: relationship with chromosome 11q13 amplification. 1996, Oncogene, 12: ; URL: [ Gezien op 07/03/2009 [3] Carol L. Rosenberg, Emily Wongt, Elizabeth M. Pettyt, Allen E. Balet, Yoshihide Tsujimotot,Nancy L. Harris, and Andrew Arnold; PRAD1, a candidate BCL1 oncogene: Mapping and expression in centrocytic lymphoma ; URL: [ Gezien op 19/02/2009 [4] Dako Cytomation, Monoclonal Mouse Anti-Human Cycline D, Dako Cytomation Denmark, Versie , productionsvej 42. [5] Damian T. McManus, Andreea Olaru, and Stephen J. Meltzer; Biomarkers of Esophageal Adenocarcinoma and Barrett s Esophagus; URL: [ Gezien op 03/03/2009 [6] Edward R. Sauter, Un-Cheol Yeo, Andrea von Stemm, Weizhu Zhu, Samuel Litwin, David S. Tichansky, Giuseppa Pistritto, Mark Nesbit, Dan Pinkel, Meenhard Herlyn and Boris C. Bastian; Cyclin D1 Is a Candidate Oncogene in Cutaneous Melanoma; URL: [ Gezien op 27/02/

52 [7] Jinna Bartkova, Jiri Lukas, Per Guldberg, Jan Aisner, Alexei F. Kirkin, Jesper Zeuthen, and Jiri Bartek2; The p16-cyclin D/Cdk4-pRb Pathway as a Functional Unit Frequently Altered in Melanoma Pathogenesis; URL: [ Gezien op 10/03/2009 [8] Kamal Bani-Hani, Iain G. Martin, Laura J. Hardie, Nicholas Mapstone, Jackie A. Briggs, David Forman, Christopher P. Wild ; Prospective Study of Cyclin D1 Overexpression in Barrett's Esophagus: Association With Increased Risk of Adenocarcinoma; August 16, 2000; Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, No. 16, ; 2000 Oxford University Press; URL: [ Gezien op 24/02/2009 [9] Kanter-Lewensohn L, Hedblad MA, Wejde J, Larsson O.; Immunohistochemical markers for distinguishing Spitz nevi from malignant melanomas; 1997 Sep,;Department of Tumor Pathology, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden, Mod Pathol.;10(9):917-20; URL: [ Gezien op 15/03/2009 [10] Keyomarsi K., Pardee A. B.; Redundant cyclin overexpression and gene amplification in breast cancer cells. 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: ; URL: [ Gezien op 06/03/2009 [11] Leach F. S., Elledge S. J., Sherr C. J., Willson J. K., Markowitz S., Kinzler K. W., Vogelstein B; Amplification of cyclin genes in colorectal carcinomas. Cancer Res., 53: , URL: [ Gezien op 07/03/