BREED-SPECTRUM BETA- LACTAMASE PRODUCERENDE BACTERIËN BIJ DIEREN IN ZOO S

Transcriptie

1 BREED-SPECTRUM BETA- LACTAMASE PRODUCERENDE BACTERIËN BIJ DIEREN IN ZOO S Aantal woorden: Claudia De Ruyck Studentennummer: Promotor: Chloë De Witte Promotor: Prof. dr. Freddy Haesebrouck Onderdeel van de Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad master in de diergeneeskunde Academiejaar:

2 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

3 Voorwoord Graag wil ik een dankwoord schenken aan de mensen die mij geholpen hebben tot het bekomen van deze masterproef. Eerst wil ik mijn co-promotor Chloë De Witte heel erg bedanken voor de begeleiding met het beperkt onderzoek van de masterproef en al het werk dat ze erin gestoken heeft. Ik wil haar ook bedanken voor de fijne samenwerking, de steun en de goede raad die ze mij gaf. Ten tweede wil ik mijn promotor Professor dr. Freddy Haesebrouck bedanken om mijn masterproef te evalueren en te bekritiseren. Ten derde wil ik de mensen van het laboratorium vakgroep pathologie, bacteriologie en pluimveeziekten, oa. Arlette en Serge, bedanken om te helpen bij het uitvoeren van de testen in het laboratorium. Ik wil ook de faculteit Diergeneeskunde te Gent bedanken om het beperkt onderzoek mogelijk te maken. Tevens wil ik Annemieke Smet bedanken om mijn vragen te beantwoorden en haar kennis te delen. Om niet te vergeten wil ik de twee zoo s, de Zoo van Antwerpen en Paira Daiza, bedanken om stalen te verzamelen zodat het onderzoek van start kon gaan. Tot slot wil ik mijn ouders bedanken om deze studie waar te maken en alle steun die ze mij geboden hebben. Daarnaast wil ik ook mijn vrienden en familie bedanken om er altijd voor mij te zijn.

4 Inhoudsopgave Voorwoord... Inhoudsopgave... 1 Samenvatting Introductie Situering BSBLs definitie BSBLs classificatie Prevalentie Voedselproducerende dieren Gezelschapsdieren Wilde dieren Verspreiding in Europa Probleemstelling Co-resistentie Verspreiding tussen mens en dier of omgeving en dier Preventie Doelstelling Materiaal en methodes Verzamelen van meststalen Detectie en identificatie van ceftiofur-resistente Enterobacteriaceae Antimicrobiële gevoeligheid testen PCR Gelelektroforese Sequenering Resultaten Identificatie van de geïsoleerde bacteriën Antimicrobiële gevoeligheid PCR en gelelektroforese Sequenering Discussie Conclusie Referentielijst Bijlagen Tabellenlijst Figurenlijst... 41

5 1 Samenvatting Intensief gebruik van beta-lactam antibiotica heeft geleid tot de ontwikkeling en wereldwijde verspreiding van breed-spectrum beta-lactamase (BSBL) producerende bacteriën. Deze BSBLs omvatten zowel de extended-spectrum beta-lactamasen (ESBLs), klasse C beta-lactamase (AmpC) als metallo-beta-lactamasen (MBLs). De voorbije jaren is de prevalentie van BSBL producerende bacteriën sterk gestegen zowel bij mens als dier. Zoo dieren kunnen een reservoir vormen van BSBL producerende bacteriën voor andere dieren en mensen. BSBL producerende bacteriën werden opgespoord in de mest van zoo dieren afkomstig uit Pairi Daiza en de Zoo van Antwerpen. Het voorkomen van resistentie werd nagegaan tegenover betalactam antibiotica en andere antibiotica. Bij mogelijke BSBL producerende bacteriën werd finaal nagegaan welke resistentie enzym types aanwezig waren door middel van PCR en sequenering. Uit de mest van 20 van de 38 zoo dieren werden 36 verschillende kolonietypes geïsoleerd op een selectief milieu dat ceftiofur bevatte. Hiervan behoorden 77,8% (28/36) tot de Enterobacteriaceae en 16,7% (6/36) tot de Pseudomonaceae. Uit één staal werd een Enterococcus faecalis stam geïsoleerd, die intrinsiek resistent is aan ceftiofur. Uit een ander staal werd een Achromobacter spanius isolaat bekomen. De overgrote meerderheid van de Enterobacteriaceae (93%, 26/28) werd geïdentificeerd als E. coli en een minderheid als Klebsiella pneumoniae (3,5%, 1/28) en Citrobacter freundii (3,5%, 1/28). Alle geïsoleerde stammen vertoonden resistentie tegenover ampicilline, ceftiofur, cefalexine en cefoxitine, wat indicatief is voor aanwezigheid van ESBLs. Bij Citrobacter freundii werd resistentie tegen amoxicilline-clavulaanzuur gedetecteerd, alsook aanwezigheid van het gen dat codeert voor AmpC. Daarenboven werd er multi-resistentie opgemerkt tegenover andere antibiotica, met name: nitrofurantoïne, florfenicol en trimethoprim. Bij de Enterobacteriaceae werden genen aangetoond die coderen voor de volgende beta-lactamasen : TEM (29%, 8/28), CTX-M-1 (82%, 23/28), SHV en CMY-2 (3,5%, 1/28). Bepaalde stammen waren positief voor 2 resistentiegenen. In deze studie werd aangetoond dat BSBL producerende bacteriën voorkomen bij 37% (14/38) van de onderzochte zoo dieren in België. Het is aangewezen om het voorkomen van antibiotica resistentie bij bacteriën van zoo dieren verder op te volgen. Bovendien dient ook onderzoek opgestart te worden naar factoren die dit voorkomen beïnvloeden, om zo de verspreiding van BSBLs te onderdrukken of tegen te gaan. 5

6 2 Introductie 2.1 Situering BSBLs definitie Beta-lactam antibiotica worden frequent gebruikt ter behandeling van bacteriële infecties in zowel de humane- als diergeneeskunde (Tabel 1). Over het algemeen wordt deze klasse van antibiotica opgedeeld in 6 groepen: de penicillines, cefalosporines (1 e tot en met 4 e generatie), carbapenems, cephamycines, monobactams en beta-lactamase inhibitoren. Intensief gebruik van dergelijke antibiotica heeft echter geleid tot de ontwikkeling en wereldwijde verspreiding van breed-spectrum beta-lactamase (BSBL) producerende bacteriën. Deze BSBLs komen vooral voor bij Enterobacteriaceae zoals Escherichia (E.) coli, Salmonella enterica, Enterobacter spp., Klebsiella spp. en Citrobacter spp. BSBLs inhiberen de werking van de klassieke beta-lactam antibiotica (voornamelijk penicilline), alsook deze van oxyimino-beta-lactam, de derde generatie cefalosporines (zoals ceftiofur, ceftazidime en cefotaxime) en monobactam (zoals aztreonam) (Smet et al., 2008; Smet et al., 2010; Guenther et al., 2011; Shaikh et al., 2014). Dergelijke verworven resistentie mag echter niet verward worden met natuurlijke ongevoeligheid. Enterobacteriaceae en Pseudomonas spp. zijn bijvoorbeeld van nature ongevoelig voor penicilline G, oxacilline, macroliden, lincosamiden, streptogramines, glycopeptiden, bacitracine en cefalosporines 1 e generatie. Klebsiella spp. bezitten een natuurlijke resistentie tegen ampicilline en amoxicilline, terwijl Enterobacter spp. en Citrobacter spp. een natuurlijke ongevoeligheid vertonen tegenover ampicilline, amoxicilline, amoxicilline-clavulaanzuur, cefazoline en cefoxitine. Tabel 1: Frequent gebruikte beta-lactam antibiotica in de humane- en diergeneeskunde (Smet, 2009, p. 8). De BSBLs omvatten zowel de extended-spectrum beta-lactamasen (ESBLs), klasse C beta-lactamase (AmpC) als metallo-beta-lactamasen (MBLs). Bacteriën die ESBLs produceren, zijn resistent tegenover de meeste beta-lactam antibiotica, inclusief de derde en vierde generatie cefalosporines, maar niet tegen cephamycine en carbapenems. Ze zijn ook gevoelig aan de combinatie amoxicilline- 6

7 clavulaanzuur omdat ESBLs geïnactiveerd worden door clavulaanzuur en andere beta-lactamase inhibitoren, zoals sulbactam en tazobactam. ESBLs worden voornamelijk gedetecteerd bij E. coli en Klebsiella pneumoniae (Hassan et al., 2013). AmpCs worden niet geïnhibeerd door clavulaanzuur en tazobactam. Bacteriën die deze beta-lactamasen vormen, zijn resistent tegenover alle beta-lactams met uitzondering van de dipolaire ionische methoxy-imino-cefalosporines, zoals cefepime en carbapenems. AmpCs hydrolyseren eveneens derde generatie cefalosporines en cephamycines. Productie van MBLs maken bacteriën resistent tegenover alle beta-lactams met uitzondering van aztreonam. MBLs worden niet geïnhibeerd door clavulaanzuur, sulbactam en tazobactam (Smet et al., 2010). Productie van beta-lactamase enzymen die de beta-lactamring van beta-lactam antibiotica hydrolyseren, is niet het enige resistentiemechanisme tegenover deze antibiotica. Er werden nog drie andere mechanismen beschreven, namelijk (1) verlagen van celmembraan permeabiliteit waardoor antibiotica minder snel opgenomen kunnen worden, (2) modificatie van het penicilline bindend proteïne waardoor antibiotica niet meer kunnen binden en (3) productie van een efflux systeem waardoor antibiotica uit het cytoplasma van de bacteriën wordt gepompt (Rubtsova et al., 2010). De genen coderend voor BSBLs zijn aanwezig op het bacterieel chromosoom en/of op plasmide(n) en kunnen ontstaan door puntmutaties in bla genen die coderen voor beta-lactamasen met een nauwer spectrum (Smet et al., 2008). Dergelijke mutaties gebeuren spontaan, maar hun voorkomen wordt verhoogd bij aanwezigheid van stressfactoren, zoals contact met antibiotica. Andere bacteriën kunnen op hun beurt deze resistentie verwerven door overdracht van resistentiegenen. Genen gelegen op het chromosoom worden vooral verticaal overgedragen, terwijl genen gelokaliseerd op overdraagbare plasmiden, conjugatieve transposons of niet overdraagbare plasmiden voornamelijk horizontaal overgedragen worden. Bij deze laatsten gebeurt de transfer via mobilisatie, insertie van een conjugatief transposon, transformatie of transductie. Antibiotica resistentiegenen coderend voor een enzym, zoals het beta-lactamase, liggen meestal op extrachromosomale DNA-fragmenten en worden voornamelijk horizontaal overgedragen (Shaikh et al., 2014; Madec et al., 2016). Daarnaast bestaat er ook natuurlijke genetische transformatie, waarbij bacteriën enkelstrengig DNA opnemen vanuit de omgeving. Dit DNA is voornamelijk afkomstig van dode bacteriën. Wanneer het donor DNA homoloog is aan het acceptor DNA, kan recombinatie ontstaan (Figuur 1-2). Hierbij vervangt het donor DNA een streng van het acceptor DNA (Vaidya, 2011). Wanneer dit donor DNA resistentiegenen bevat, wordt de acceptor bacterie zelf resistent (Figuur 1). De paring van DNA met een homoloog chromosoom kan gebeuren via crossover (CO) of niet-crossover (NCO). CO recombinatie wordt bekomen door het double Holliday Junction (DHJ) model, terwijl NCO recombinatie wordt bekomen door het Synthesis Dependent Strand Annealing (SDSA) model. De meeste recombinaties worden via het SDSA type gevormd (Rubtsova et al., 2010). 7

8 Figuur 1: Visuele weergave van een recombinatie dat geïnitieerd wordt door een dubbelstrengige breuk van het DNA en daarna gepaard wordt met een homoloog chromosoom. 1 Figuur 2: Voorbeeld van een recombinatie tussen DNA van een bacterie en bacteriofaag (Olorunniji et al., 2017, p. 2). 1 ten laatste geconsulteerd op 12/3/

9 2.1.2 BSBLs classificatie De classificatie van BSBLs is complex en is gebaseerd op verschillende technieken. Volgens de Ambler classificatie, gebaseerd op moleculaire structuur (Tabel 3) en de Bush-Jacoby-Medeiros classificatie, gebaseerd op functionele gelijkenissen (Tabel 2-3), kunnen BSBLs in 4 klassen onderverdeeld worden, gaande van A tot D (Shaikh et al., 2014). Ze worden van elkaar onderscheiden op basis van homologie, conservatieve regio s in het enzymstructuur en structuur van het actieve centrum (Rubtsova et al., 2010). Klassen A en D worden gekenmerkt door aanwezigheid van resistentiegenen gelokaliseerd op overdraagbare plasmiden en/of het chromosoom. Daarnaast kunnen deze klassen carbapenem en cephamycine niet hydrolyseren en worden ze geïnactiveerd door clavulaanzuur. Klasse D kan bijkomend oxacilline hydrolyseren. Initieel werd klasse C, een cefalosporinase, beschreven als chromosomaal gecodeerde enzymen, maar recent werden er eveneens overdraagbare plasmidegecodeerde klasse C enzymen geïdentificeerd (Smet et al.,2008; Vaidya, 2011). Bacteriën met een klasse C enzyme kunnen efficiënter breed-spectrum cefalosporines hydrolyseren, waaronder methoxy-imino-cefalosporines en ook carbapenem is er gevoelig voor. Beta-lactamasen uit deze klasse worden niet geïnactiveerd door clavulaanzuur (Smet et al., 2008; Guenther et al., 2011; Watkins et al., 2013; Shaikh et al., 2014). Klasse B omvat de zink bevattende beta-lactamasen en deze worden daarom ook metallo-beta-lactamasen genoemd. Bacteriën die deze klasse bevatten kunnen alle beta-lactam antibiotica afbreken, inclusief carbapenem. Daarnaast zijn ze ook resistent tegen clavulaanzuur, sulbactam en tazobactam. Ze worden wel geïnhibeerd door ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (Rubtsova et al., 2010). Shaikh et al. (2014) deelt de BSBLs op in 9 enzym types, afhankelijk van de soort mutatie: (1) Temoneira (TEM) type beta-lactamase, (2) Sulfhydryl variable (SHV), (3) Cefotax-imase (CTX) M-type, (4) Oxacillinase (OXA), (5) Pseudomonas extended resistance (PER), (6) Guiana extended-spectrum (GES), (7) Vietnamese extended-spectrum beta-lactamase (VEB), (8) Brazil extended-spectrum (BES) en (9) andere ESBL types (zoals SFO-1). Deze enzym types verschillen eveneens per klasse: klasse A omvat TEM, SHV, CTX-M, GES, PER, VEB en BES; klasse B de carbapenemasen zoals Verona integron-encoded metallo-beta-lactamase (VIM) en Inosine-5'-monofosfaat (IMP); klasse C het AmpC enzyme en klasse D OXA en CMY enzymen. CTX-M ESBLs vertonen 40% gelijkenis met TEM en SHV (Hassan et al., 2013). CTX-M beta-lactamasen hydrolyseren efficiënter cefotaxime in vergelijking met ceftazidime. Het is aangetoond dat de expressie en verspreiding van het bla CTX-M gen meer beïnvloed wordt als de promotor opwaarts gelegen is dan wanneer de promotor neerwaarts gelegen zou zijn (Bajaj et al., 2016). Op basis van hun genetische sequentie, wordt CTX-M in 5 fylogenetische groepen opgedeeld, namelijk: CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M- 8, CTX-M-9, CTX-M-25. Recent zijn er 2 nieuwe groepen beschreven: CTX-M-74 en CTX-M-75. Het intensief gebruik van carbapenems heeft geleid tot een wereldwijde verspreiding van deze enzymen (Lahlaoui et al., 2014). Het meest frequent voorkomend enzym type is CTX-M-15, een variant van de CTX-M-1 groep (Smet et al, 2010; Wang et al, 2012; Guenther et al., 2012; Albrechtova et al., 2014; Shaikh et al., 2014). CTX-M-1 wordt frequent beschreven bij mensen, voedselproducerende dieren en wilde vogels. Er wordt een hoge prevalentie van CTX-M-1 beschreven bij Europese dieren, terwijl CTX- M-15 vooral voorkomt bij mensen en runderen (Madec et al., 2016). Daarnaast zijn de TEM en SHV eveneens belangrijke enzym types (Literak et al., 2009; Guenther et al., 2011, Tacão et al., 2014) Chromosoom gemedieerde AmpC genen worden in hoge mate geproduceerd, wat bijdraagt tot hun wereldwijd voorkomen. Een uitzondering hierop is E. coli. Deze bezit een niet induceerbaar AmpC fenotype, waardoor AmpC aangemaakt wordt in lage concentraties. AmpC kan onderverdeeld worden 9

10 in 6 families: CIT, FOX, MOX, DHA, EBC en ACC (Pérez-Pérez en Hanson, 2002). Bij dier-geassocieerde E. coli wordt het plasmide gemedieerde CMY-2, dat behoort tot de CIT familie, het meest frequent gedetecteerd. Daarenboven vertoont het CMY-2 homologie met het AmpC van Citrobacter freundii (Watkins et al., 2013; Bajaj et al., 2016; Madec et al., 2016). De carbapenemasen behoren tot zowel klasse A, B als D (tabel 2). Hierbij worden respectievelijk Klebsiella pneumoniae geassocieerde carbapenemase (KPC), MBL en OXA resistentie enzymen gezien. Ze worden eveneens gedetecteerd in verschillende E. coli stammen, hoewel de meest voorkomende enzymen in E. coli de metallo-beta-lactamasen zijn, waaronder bijvoorbeeld het New Delhi metallobeta-lactamase (NDM-1). Bij aanwezigheid van carbapenemasen wordt frequent co-resistentie gezien tegenover andere klassen van antibiotica (Bajaj et al., 2016). Aangezien carbapenem voornamelijk gebruikt wordt in de humane geneeskunde, zijn gedetecteerde carbapenemasen aanwezig in dieren mogelijks van humane afkomst (Madec et al., 2016). Tabel 2: Classificatie van beta-lactamase producerende bacteriën volgens Bush-Jacoby (Bush en Jacoby, 2010, p.970) 10

11 Tabel 3: Classificatie van beta-lactamasen volgens de Ambler classificatie en de Bush-Jacoby Medeiros classificatie (Kanj en Kanafani, 2011, p.251). 2.2 Prevalentie Voedselproducerende dieren Gedurende de voorbije jaren is er een sterke stijging van het aantal studies die de aanwezigheid van commensale, breed-spectrum cefalosporine resistente Enterobacteriaceae aantonen bij voedselproducerende dieren. De prevalentie van ESBLs in commensale Enterobacteriaceae kan gaan van 0,2% tot 40,7% (Smet, 2009). Sommige resistentie enzymen komen meer voor in bepaalde landen (zie verspreiding in Europa) en bepaalde enzymen komen meer wijdverspreid voor, zoals TEM- 52 en SHV-12. CTX-M-15 is het meest wijdverspreide enzym onder mensen en is ook reeds gedetecteerd in E. coli geïsoleerd uit vogels en varkens. Naast CTX-M, werd AmpC eveneens beschreven bij de voedselproducerende dieren. De prevalentie van AmpC beta-lactamase resistentie in commensale Enterobacteriaceae varieert tussen de 0,01% en 88,5%, waarbij CMY-2 het meest frequent gedetecteerd wordt. Dit kan te maken hebben met het gebruik van ceftiofur (Haenni et al., 2014) Gezelschapsdieren ESBL- en AmpC beta-lactamase producerende E. coli komen voor bij 7 tot 20% van de gezelschapsdieren, waarbij CTX-M-1 het meest frequent gedetecteerd wordt bij honden en katten. Honden worden voornamelijk behandeld met eerste generatie cefalosporines en amoxicillineclavulaanzuur, wat een mogelijke verklaring is voor het frequent voorkomen van CTX-M-1. Bij zieke dieren varieert de prevalentie van ESBL- en AmpC beta-lactamase producerende E. coli bacteriën van 1,4% tot 19,4%, waarbij CTX-M-1 het meest frequent gedetecteerd wordt. Deze resultaten zijn gelijklopend met deze van de voedselproducerende dieren (Smet, 2009). Het voorkomen van de CTX- M enzym types varieert echter naargelang de geografische regio. Zo is CTX-M-1 dominant in Afrika en Europa, terwijl CTX-M-14 het dominante enzymtype is in Azië en Noord-Amerika en CTX-M-15 in Noord-Amerika, Europa en Afrika (Rubin & Pitout, 2014). Daarnaast werd CMY-2 ook gedetecteerd in gezonde honden uit Italië (Smet, 2009). 11

12 2.2.3 Wilde dieren Slechts enkele studies hebben de prevalentie van BSBLs onderzocht bij wilde dieren. Bij roofvogels en meeuwen werd een prevalentie van ESBLs producerende E. coli beschreven van 19%, waarbij voornamelijk CTX-M-1, CTX-M-14 en TEM-52 gedetecteerd werden. Er werden geen AmpC betalactamasen gevonden. Een mogelijke verklaring voor deze hoge prevalentie zou zijn dat de vogels resistentie verkregen door het eten van afval afkomstig van de mens. Over het algemeen komt CTX-M-1 het meest frequent voor bij zowel voedselproducerende dieren, gezelschapsdieren en wilde dieren (Smet et al.,2009) Verspreiding in Europa In België komen voornamelijk CTX-M-1, -15 en -2 voor bij voedselproducerende dieren en in de voeding (Figuur 3), terwijl in Engeland en Spanje voornamelijk CTX-M-2 en CTX-M-9 teruggevonden worden. Dit in tegenstelling tot humane ziekenhuizen, waar CTX-M-15 het meest frequent gedetecteerd wordt (Livermore et al., 2007). Figuur 3: Weergave van de spreiding van CTX-M beta-lactamase enzymen in Europa (Livermore et al., 2007, p.170). 12

13 Leverstein-van Hall et al. (2011) toonden aan dat 94% van de kippen uit Nederland positief waren voor minstens één ESBL producerende E. coli. Wat de groenten betreft, werd enkel ESBL producerende E. coli gedetecteerd in selderij afkomstig uit Nederland (Randall et al., 2017). Niet enkel de soort CTX-M enzym types, maar eveneens de prevalentie verschilt naargelang het land. Voor kippen uit Nederland bijvoorbeeld zijn 75% van de stammen positief voor CTX-M-1 of TEM-52 (Leverstein-van Hall et al., 2011), terwijl in Duitsland voornamelijk SHV-12, CTX-M-1 en TEM-52 teruggevonden worden en in Spanje voornamelijk SHV (Egea et al., 2012). 2.3 Probleemstelling Co-resistentie De voorbije jaren is de prevalentie van BSBLs producerende bacteriën sterk gestegen (Guenther et al., 2011; Shaikh et al., 2014). Bij de mens worden vooral BSBL producerende Enterobacteriaceae gedetecteerd met een stijgende prevalentie sinds 1990 en eveneens bij dieren sinds Bovendien gaat deze beta-lactam antibiotica resistentie vaak gepaard met resistentie tegen andere antibiotica zoals (fluoro)quinolones (waaronder ciprofloxacine), trimethoprim-sulfamethoxazole en aminoglycosiden (waaronder tobramycine en gentamicine). Bij de fluoroquinolones kan de resistentie veroorzaakt worden door aanwezigheid van plasmide gemedieerde quinolone resistentie (PMQR) genen, welke vaak aangetroffen worden in combinatie met bla genen (Wang et al., 2012; Dobiasova et al., 2013, Tacão et al., 2014). Dit noemt men co-resistentie, co-expressie of co-selectie. Men spreekt van multi-drug resistentie wanneer er drie of meer resistentiegenen voorkomen die coderen voor resistentie tegenover antibiotica waartussen geen kruisresistentie voorkomt. Het plasmide waarop het gen ligt dat codeert voor het CTX-M enzym, draagt bijvoorbeeld vaak andere resistentiegenen met zich mee die coderen voor resistentie tegenover aminoglycosiden, tetracyclines, sulfonamiden en trimethoprim. Daarnaast zijn de meeste bacteriën met CTX-M ook resistent tegen fluoroquinolones (Lahlaoui et al., 2014). Dergelijke multi-drug resistentie tegenover een breed gamma van antibiotica heeft dus vaak problematische gevolgen (Goyanes et al., 2007; Guenther et al., 2011; Balkhed et al., 2013). Op basis van variaties in de sequentie van resistentiegenen, kunnen BSBLs verder onderverdeeld worden in sequentie types (ST). Verschillende ST zijn reeds beschreven bij CTX-M, zoals: ST59, ST393, ST1395, ST354 (CTX-M-14), ST38 (CTX-M-9) en ST648 (CTX-M-15). Bij CTX-M-15 zijn er ook verschillende ST beschreven, zoals: ST648, ST131, STC405, ST90 en CC11. Bij de mens wordt ST131 het meest beschreven bij multi-drug resistente genotypen, vaak in associatie met urinaire infecties en bacteriemie, waarbij co-resistentie opgemerkt wordt tegen carbapenem, fluoroquinolones, trimethoprim-sulfamethoxazole en aminoglycosiden. Bij dieren wordt ST131 slechts weinig beschreven. ST131 wordt geassocieerd met CTX-M-15, maar ook met andere CTX-M types. Aanwezigheid van plasmiden, voornamelijk uit incompatibiliteitsgroep F (IncF), heeft geleid tot een wereldwijde verspreiding van E. coli stammen met ST131 en aldus CTX-M-15. Naast IncF worden er nog andere plasmiden in ST131 en niet-st131 E. coli stammen met CTX-M-15 ESBLs beschreven, zoals IncK, IncX en IncI. STC405 en STC38 (fylogenetische groep D) worden geassocieerd met de verspreiding van respectievelijk CTX-M-15 en CTX-M-9. Studies hebben aangetoond dat het CTX-M type ESBL in commensale E. coli stammen veel voorkomt bij gezonde mensen en kinderen. Er is ook een hoge prevalentie van die stammen bij gezelschapsdieren en in voedsel (Bajaj et al., 2016; D Andrea et al., 2013). Madec et al. (2016) toonden aan dat CTX-M-15 producerende E. coli, aanwezig in runderen, de sequentie types ST10, ST617, ST58, ST69 bezitten (Madec et al., 2016). 13

14 2.3.2 Verspreiding tussen mens en dier of omgeving en dier Resistente bacteriën kunnen uitgewisseld worden tussen dieren en mensen vanuit de omgeving, bijvoorbeeld via gecontamineerd grondwater of gecontamineerde groenten (Figuur 4). De verspreiding kan eveneens gebeuren door direct of indirect contact tussen dier en mens, vaak door een gebrek aan hygiëne (Literak et al., 2009). Een van de risicofactoren die resistentie in de hand werkt, is het dumpen van niet-gedesinfecteerd afvalwater in zee of andere wateren. Ook afvalwater van ziekenhuizen kan resistente bacteriën en hoge concentraties aan antibioticaresiduen bevatten (tussen 1 en 100 μg/l). Aangezien antibiotica eveneens actief zijn tegen de gastro-intestinale microbiota, kunnen zoönotische en commensale bacteriën resistentie verwerven en deze op hun beurt doorgeven aan andere, pathogene bacteriën. Dit alles zorgt voor een sterke verspreiding van resistentiegenen bij bacteriën van zowel mens als dier. De verspreiding van resistentiegenen kan tegengewerkt worden door een hogere viscositeit van de intestinale mucus, waardoor er een verminderd contact is tussen donor- en receptorcellen en een verminderde motiliteit van E. coli. De viscositeit van de intestinale mucus speelt dus een belangrijke rol in de overdraagbaarheid van plasmiden tussen bacteriën (Licht et al., 1999). Figuur 4: Mogelijke routes van verspreiding van resistente bacteriën tussen mensen, dieren en voedsel (Kirbis en Krizman, 2015, p. 149). Frequent en intensief contact met dieren verhoogt de kans op overdracht van resistentiegenen. Het is beschreven dat de kans op overdracht vanuit voedselproducerende dieren groter is dan vanuit 14

15 gezelschapsdieren (Madec et al., 2016). Daarnaast is er een hogere prevalentie aan resistentiegenen beschreven bij kippen dan bij andere voedselproducerende dieren en zijn er bij kippen reeds AmpC producerende E. coli bacteriën, vooral CMY-2, gedetecteerd. Wanneer kippenvlees echter goed gebakken wordt, worden aanwezige bacteriën afgedood, onafhankelijk of ze nu resistentiegenen bevatten of niet (Randall et al., 2017). Dit laatste is dus belangrijk om de overdracht van resistentie te beperken. Over de aanwezigheid van resistentiegenen in de omgeving is niet zo veel gekend. Walsh en Duffy (2013) hebben resistentie teruggevonden in bacteriën afkomstig uit de bodem van zowel agrarische, stedelijke en ongerepte omgeving. Op deze manier kan de bodem als reservoir dienen voor resistentiegenen. Er werd resistentie en multi-resistentie gedetecteerd tegenover penicilline, streptomycine, cefotaxime, cefalexine, vancomycine en colistine. Meer dan 80% van de stammen vertoonden resistentie tegen 16 van de 23 antibiotica. Eudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Acinetobacter sp., Achromobacter xylosoxidans, Serratia marcescens en Aeromonas sp. vertoonden intrinsieke resistentie tegen beta-lactam antibiotica (waaronder penicilline). Er werd ook resistentie tegen trimethoprim gevonden (Walsh en Duffy, 2013). Daarnaast werden bepaalde resistentiegenen, zoals bla CTX-M, qnra en bla NDM, gedetecteerd in omgevingsbacteriën zoals Kluyvera sp., Shewanella algae en Erythrobacter litoralis (Walsh en Duffy, 2013). Tot op heden zijn er geen BSBLs gedetecteerd in bacteriën op fruit of groenten. Ook in zoo s is de problematiek rond BSBLs reëel. Wanneer bijvoorbeeld BSBLs producerende E. coli aanwezig zijn in een muis die wordt gevoederd aan een zoo dier, kunnen bacteriën in het gastrointestinaal stelsel van dit zoo dier resistentiegenen verwerven via horizontale transfer. Prooidieren hebben immers vaak een accumulatie van resistentiegenen aangezien ze aan de top van de voedselketen staan en prooien eten die zelf ook weer prooien hebben verorberd, die mogelijks al bacteriën met resistentiegenen bevatten. Door direct contact tussen zoo dieren en mensen, voornamelijk met hun verzorgers, kunnen er eveneens resistente kiemen uitgewisseld worden (Smet et al., 2008; Guenther et al., 2011; Wang et al., 2012; Dobiasova et al., 2013). Niet enkel bij dieren, maar ook bij de mens kunnen infecties met BSBLs dramatische gevolgen hebben. Enterotoxigene E. coli (ETEC) en enteropathogene E. coli (EPEC) zijn frequent voorkomende oorzaken van bacteriële gastro-enteritis, voornamelijk in ontwikkelingslanden. Daarnaast veroorzaakt enterohemorrhagische E. coli (EHEC) een bloederige gastro-enteritis wat kan leiden tot mortaliteit, eveneens voornamelijk in ontwikkelingslanden. Extra-intestinale pathogene E. coli (ExPEC) kan infecties veroorzaken van de urinewegen, bloed, cerebrospinaal vocht, respiratoir en peritoneum. Het is dus belangrijk dat de resistentie in E. coli beperkt wordt (Bajaj et al., 2016). 2.4 Preventie Zowel internationale en nationale groepen werden opgericht om het ontstaan en de verspreiding van antimicrobiële resistentie tegen te gaan. Een gekend voorbeeld hiervan is de World Health Organisation (WHO). Deze organisaties voorzien standaarden, handleidingen en trainingen om mensen te sensibiliseren in het gebruik van antimicrobiële middelen (figuur 5). Het Belgisch kenniscentrum Antimicrobial consumption and resistance in animals (AMCRA) geeft in een formularium bijvoorbeeld aan welke antibiotica meest aangewezen zijn voor behandeling van een bepaalde infectie. Surveillance programma s kunnen het gebruik van de verschillende soorten antibiotica in kaart brengen per land. Verschillende adviezen worden gegeven om antibioticaresistentie in te perken. Hygiëne, vooral van de handen, wordt bijvoorbeeld sterk aangeraden en waarbij men best producten op alcoholische basis gebruikt. Daarnaast kunnen een 15

16 goed vaccinatieprogramma en een adequaat bioveiligheidssysteem het gebruik van antibiotica bij dieren verminderen. Zieke dieren moeten in quarantaine gezet worden ter preventie van verspreiding van pathogene agentia en resistentiegenen (Uchil et al., 2014). Rauw vlees dient ook voldoende gekookt of gebakken te worden vooraleer het aan gezelschapsdieren te geven. Figuur 5: Mogelijkheden om antibiotica resistentie tegen te gaan. (Uchil et al., 2014, p. 1). 2.5 Doelstelling Zoo dieren kunnen een reservoir vormen van BSBLs producerende bacteriën voor andere dieren, bezoekers en vooral hun verzorgers. Weinig informatie is echter beschikbaar omtrent de prevalentie van BSBLs bij zoo dieren in België. Hoogstwaarschijnlijk zijn zoo dieren een onderschatte bron van resistentiegenen en/of resistente bacteriën voor mens en andere dieren. Deze studie is dus belangrijk om het voorkomen van BSBLs in kaart te brengen, om zo finaal de verspreiding van BSBLs te minimaliseren. In dit beperkt onderzoek werden BSBLs producerende bacteriën opgespoord in zoo dieren afkomstig uit Pairi Daiza en de Zoo van Antwerpen. Meer specifiek werd hierbij nagegaan of BSBL producerende Enterobacteriaceae aanwezig zijn in de mest. Het voorkomen van resistentie werd nagegaan tegenover volgende beta-lactam antibiotica: ampicilline, amoxicilline-clavulaanzuur, imipenem, cefoxitine, cefalexine, cefquinome en ceftiofur. Om de aanwezigheid van multi-drug resistentie te onderzoeken, werd resistentie tegenover amikacine, nitrofurantoïne, gentamicine, enrofloxacine, trimethoprim, trimethoprim-sulfamethoxazole, neomycine, spectinomycine, doxycycline, tetracycline, streptomycine en florfenicol eveneens nagegaan. Bij mogelijke BSBL producerende Enterobacteriaceae werd finaal nagegaan welke genen aanwezig waren die coderen voor BSBLs. 16

17 3 Materiaal en methodes 3.1 Verzamelen van meststalen De meststalen werden vers verzameld, waarna ze binnen 4u ingevroren werden bij -70 C. Hierbij werd geen informatie verschaft omtrent (voorbije) infecties, antibiotica therapieën, afkomst van de dieren, tijd van aanwezigheid in de zoo en welke voeding ze krijgen. De stalen en diersoort van herkomst zijn weergegeven in Tabel 4. Tabel 4: Lijst van de verzamelde meststalen afkomstig uit zoo dieren. Dierentuin Zoo van Antwerpen Paira Daiza Landzoogdier Aziatische olifant, gemengd staal 2 dieren Siberische tijger Afrikaanse leeuw, gemengd staal 3 dieren Chimpansee, gemengd staal 9 dieren Westelijke gorilla Oostelijke gorilla, gemengd staal 2 dieren Siamangs, gemengd staal 2 dieren Jaguars, gemengd staal 2 dieren Amoerluipaard Brilbeer 1 Brilbeer 2 Brilbeer 3 Dromedaris, gemengd staal 3 dieren Aziatische olifant Afrikaanse olifant Tijger Giraf Reuzenpanda Bonte maki Ringstaart maki Witte neushoorn Hyena Nijlpaard leeuw Tijger Aziatische olifant Neushoorn Orang oetan Sneeuw luipaard Leeuw Afrikaanse olifant Koala Nijlpaard Tasmaanse duivel Miereneter Tapirs Luipaard Marmot 17

18 3.2 Detectie en identificatie van ceftiofur-resistente Enterobacteriaceae Van elk staal werd 1 gram afgewogen en overnacht geïncubeerd in 10 ml gebufferd peptone water (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, Verenigde Staten) bij 37 C en 5% CO 2. Daarna werd een swab genomen van deze geïnoculeerde vloeistof en overgeënt op McConkey agarplaten (Sigma-Aldrich), gesupplementeerd met 8 μg/ml ceftiofur (Sigma-Aldrich) (Figuur 6). Op dit medium wordt de groei van niet beta-lactam antibiotica resistente Enterobacteriaceae geremd, terwijl BSBL producerende bacteriën wel kunnen groeien omdat ze resistent zijn tegenover ceftiofur. De ingeënte platen werden opnieuw overnacht geïncubeerd bij 37 C en 5% CO 2. Daarna werden per plaat kolonies met een verschillende morfologie geselecteerd en op een bloedplaat geënt om zo een reincultuur te bekomen. Deze platen werden opnieuw overnacht geïncubeerd bij 37 C en 5% CO 2. De reinculturen werden tot op genus en species niveau geïdentificeerd met behulp van biochemische testen, met name: Kligler, Lysine, MIO (motiliteit, indolvorming, ornithine afbraak) en Esculine gal. Wanneer bij de Kligler test een volledig gele kleur bekomen wordt, wil dit zeggen dat de bacterie zowel glucose als lactose kan vergisten. Zowel E. coli, Citrobacter freundii en Enterobacter hormaechei zijn voorbeelden hiervan. Wanneer de Kligler test volledig rood is, kunnen de bacteriën lactose en glucose niet vergisten, zoals bijvoorbeeld gezien wordt bij Pseudomonas spp. Wanneer bij de Lysine test een paarse kleur gezien wordt, wil dit zeggen dat de bacteriën lysine kunnen decarboxyleren. Wanneer er bij de MIO test groei is ter hoogte van en buiten de entstreep, wil dit zeggen dat de bacteriën beweeglijk zijn en worden ze beschouwd als positief. Na het toevoegen van het Kovac s reagens, kan de kleur roze worden, wat aantoont dat de bacteriën tryptofaan kunnen afbreken tot indol. Dit wordt onder andere gezien bij E. coli bacteriën. Wanneer bij de ornithine test een volledig paarse kleur te zien is, is dit een positief staal en wil dit zeggen dat de bacteriën ornithine kunnen afbreken. Als ze ornithine niet kunnen afbreken, wordt een beige kleur met een paarse rand gezien. Bacteriën die esculine kunnen afbreken, geven een zwarte kleur aan het medium. Dit is een positief staal en wordt bijvoorbeeld gezien bij Klebsiella spp. of Enterobacter spp.. Bij een beige kleur en dus een negatief staal kunnen de kiemen esculine niet afbreken. Dit wordt bijvoorbeeld gezien bij E. coli. Daarnaast werd er een Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight (MALDI-TOF) analyse uitgevoerd van elk isolaat om de species identificatie te bevestigen (Kostrzewa, 2018). 18

19 Figuur 6: Methode om platen te enten met een bacteriële species Antimicrobiële gevoeligheid testen Van elke reincultuur werd een antibiogram aangelegd. Hiervoor werd de Kirby Bauer disk diffusie test gebruikt. Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI) richtlijnen werden gebruikt voor inoculum standaardisatie, medium en incubatie condities, alsook gebruik van een intern controle organisme (E. coli ATCC 25922). Van elke reincultuur werden kolonies met behulp van een entoog gesuspendeerd in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een McFarland van 0.5 werd bekomen (Densimat, Biomérieux, Marcy L Etoile, Frankrijk). Deze geïnoculeerde suspensie werd vervolgens in drievoud uitgeënt (60 draaien tussen elke entrichting) op Mueller-Hinton II agarplaten (Oxoid, Hampsire, Verenigd Koninkrijk). Vervolgens werden antimicrobiële tabletten op de agarplaten gebracht door middel van een dispenser (NCCLS, M7-A5). De reinculturen werden getest voor resistentie tegen betalactam antibiotica (i.e. ampicilline (33 µg), amoxicilline-clavulaanzuur ( µg), imipenem (15 µg), cefoxitine (60 µg), cefalexine (30 µg), cefquinome (30 µg), ceftiofur (30 µg)) om zo de aanwezigheid van ESBL of AmpC aan te tonen. Verder werd ook de gevoeligheid nagegaan voor amikacine (30 µg), nitrofurantoïne (100 µg), gentamicine (40 µg), enrofloxacine (10 µg), trimethoprim (5.2 µg), trimethoprim-sulfamethoxazole ( µg), neomycine (120 µg), spectinomycine (200 µg), doxycycline (30 µg), tetracycline (80 µg), streptomycine (10 µg) en florfenicol (µg) (Neo-sensitabs, Rosco Diagnostica, Taastrup, Denemarken). Daarna werden de platen overnacht geïncubeerd bij 37 C en 5% CO 2. Om onderscheid te kunnen maken tussen resistentie en gevoeligheid, werd de diameter van de groeiremzone gemeten (Figuur 7). Deze afstand werd dan vergeleken met de referentiewaarden van de EUCAST- en CLSI potency NEO-SENSITABS. ESBL producerende bacteriën werden geïdentificeerd wanneer er een synergistisch effect werd opgemerkt tussen breed-spectrum cefalosporines en amoxicilline-clavulaanzuur (Figuur 8). Wanneer dit synergistisch effect niet werd opgemerkt, maar wel resistentie tegen cefoxitine én beta-lactamase inhibitoren (clavulaanzuur) of verminderde gevoeligheid tegen beta-lactamase inhibitoren (clavulaanzuur) én derde generatie cefalosporines, dan wees dit op aanwezigheid van klasse C beta-lactamase en AmpC fenotype. 2 WhQZoKHWduBzUQ_AUICigB&biw=1600&bih=794#imgdii=a4HNJwYwljQ3oM:&imgrc=UFHAyNqTTycELM: ten laatste geconsulteerd op 12/3/

20 Figuur 7: Groeiremzones zijn hier te zien als een opgeklaarde kring rond de antibiotica tabletten. Figuur 8: Synergistisch effect van amoxicilline-clavulaanzuur en cefquinome (vierde generatie cefalosporine) (pijltje). 3.4 PCR Van de reinculturen werd ook DNA bereid. Hiervoor werd 100 µl PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent (Life Technologies, Carlsbad, California) in een epje gebracht waarin een aantal kolonies werden gesuspendeerd. Dit geheel werd daarna enkele seconden in de vortex gebracht en vervolgens 10 min bij 100 C geïncubeerd met behulp van een blokthermostaat. Na een korte afkoelingsperiode werden de epjes gecentrifugeerd, waarna het supernatans, waarin het DNA van de bacteriën zich bevond, werd overgebracht in een nieuw epje. Deze werden daarna bewaard bij -20 C voor later gebruik in de PCR ter identificatie van mogelijks aanwezige resistentiegenen. 20

21 Polymerase chain reaction (PCR) werd uitgevoerd om genen coderend voor OXA-1, OXA-2, SHV, CTX- M-1, CTX-M-2, CTX-M-9, CMY-2 en TEM te detecteren in het geëxtraheerde DNA. De mix voor de PCR reacties werd aangemaakt met gebruik van 20 µl PCR master mix (2,5 U/reactie Taq DNA polymerase, 1X PCR buffer (Tris-Cl, KCl, (NH 4) 2SO 4, 1,5 mm Mg Cl 2, ph 8.7), 200 µm dntp, Qiagen), 2,4 µl van de forward en reverse primer (10 µm, Eurogentec) (zie tabel 5) en 2 µl DNA in een eindvolume van 40 µl. DNA van E. coli stammen met aanwezigheid van resistentiegenen en HPLC water werden ingesloten, respectievelijk als positieve en negatieve controle. De PCR reactie werd uitgevoerd met het GeneAmp PCR system 9600 (Life Technologies, Carlsbad, California) toestel. Voor TEM, CTX-M-2, CTX-M-1, CTX- M-9 en CMY-2 bestaat het PCR programma uit een opeenvolging van verschillende fases: een initiële activatie stap (94 C gedurende 5 min), gevolgd door 30 cycli elk bestaande uit een denaturatie stap (94 C gedurende 1 min), een annealing stap (55 C gedurende 1 min) en een elongatie stap (72 C gedurende 1 min), waarna een finale elongatie stap uitgevoerd wordt (72 C gedurende 7 min). Voor SHV en OXA werd hetzelfde programma gebruikt, met uitzondering van een annealing temperatuur van 56 C en 62 C, respectievelijk. De geamplificeerde stalen werden verder gevisualiseerd door middel van agarose gelelektroforese. Tabel 5: Sequenties van de primers ter detectie van mogelijke resistentiegenen Resistentiegen Primers Sequentie (5 -> 3 ) TEM OT3 ATG AGT ATT CAA CAT TTC CG OT4 CCA ATG CTT AAT CAG TGA GG CTX-M algemeen MA1 SCS ATG TGC AGY ACC AGT AA MA2 ACY TTA CTG GTR CTG CAC AT CTX-M-1 M13up GGT TAA AAA ATC ACT GCG TC M13low TTG GTG ACG ATT TTA GCC GC CTX-M-2 M25up ATG ATG ACT CAG AGC ATT CG M25low TGG GTT ACG ATT TTC GCC GC CTX-M-9 M9up ATG GTG ACA AAG AGA GTG CA M9low CCC TTC GGC GAT GAT TCT C CMY-2 CF1 ATG ATG AAA AAA TCG TTA TGC CF2 TTG TAG CTT TTC AAG AAT GCG C OXA OXA-1A ATG AAA AAC ACA ATA CAT ATC AAC TTC GC OXA-1B GTG TGT TTA GAA TGG TGA TCG CAT T OXA-2A ACG ATA GTT GTG GCA GAC GAA C OXA-2B ATY CTG TTT GGC GTA TCR ATA TTC SHV OS5 TTA TCT CCC TGT TAG CCA CC OS6 GAT TTG CTG ATT TCG CTC GG 3.5 Gelelektroforese Voor de gelelektroforese werd gebruik gemaakt van een 1,5% agarosegel. Hiervoor werd 3 g Agarose MP (Roche Applied Science, Penzberg, Duitsland) in 200 ml 1x geconcentreerde TBE-buffer gebracht. De 1x geconcentreerde TBE-buffer bevat tris-base, boorzuur en EDTA en werd bekomen door TBE 10X Liquid Concentrate (Amresco, Solon, Ohio) te verdunnen in Aqua Dest. De buffer heeft meerdere functies: tris-base zorgt ervoor dat de ph neutraal blijft gedurende het proces, boorzuur levert de nodige ionen om het elektrisch veld te onderhouden en EDTA capteert calcium en magnesium, deze laatste zijn cofactoren noodzakelijk voor de activiteit van DNA nucleases die DNA kunnen afbreken. De 21

22 agarose werd vervolgens opgelost in de buffer door het mengsel een drietal minuten op te koken. Na afkoeling tot 55 C werd 400 μl GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10000X in DMSO (Biotium, Hayward, California) toegevoegd. Het mengsel werd in een tray gegoten, waarna de kammetjes werden geplaatst. Na 15 tot 20 min werden de kammetjes verwijderd en werd een 0,5x geconcentreerde TBEbuffer oplossing op de gel gebracht. Per uitsparing in de gel werd telkens een 8 μl mengsel gebracht bestaande uit 5 μl PCR product en 3 μl ladingsbuffer (5 ml glycerol, 1 ml cresolrood 10mM, 4 ml Aqua Dest.). Glycerol heeft een hoog moleculair gewicht en zorgt ervoor dat het staal niet naast de uitsparing komt te liggen, maar mooi naar beneden zakt. Het cresolrood kleurt het staal rood aan, waardoor het inbrengen van de stalen vlotter verloopt. In de eerste uitsparing werd 8 μl GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, Ready-to-Use 100 to 3000 bp (Thermo Scientific, Wilmington, Delaware) gebracht, een DNA ladder waarvan het moleculair gewicht van de fragmenten gekend is. Hierbij moet geen ladingsbuffer meer toegevoegd worden, aangezien deze commerciële ladder reeds bromofenolblauw en glycerol bevat. Op deze manier kunnen de fragmenten van de onbekende stalen vergeleken worden met deze ladder, waardoor een indicatie verkregen wordt van de lengte in baseparen van het geamplificeerd staal. Tijdens de gelelektroforese werd een elektrisch veld aangelegd gedurende 75 min (170 Volt en 400 milliampère), waardoor een scheiding ontstaat van DNA fragmenten op basis van het moleculair gewicht. De minst zware fragmenten migreren het snelst doorheen de agarose gel naar de positieve pool, terwijl de zwaardere fragmenten minder ver zullen migreren. Aangezien DNA reeds lineair is en dezelfde hoeveelheid negatieve ladingen bezit per lengte-eenheid (door de fosfaten), hebben beide geen invloed op de snelheid van migratie van DNA. Om het bandenpatroon zichtbaar te maken, werd de gel na 75 min uit de buffer gehaald, afgedept en geplaatst in het toestel PhotoDoc-ItTM Imaging Systems, benchtop 2 UV Transilluminator (UVP, Upland, California), waarbij met behulp van UV-licht het fluorochroom Gelred geëxciteerd werd. Dit fluorochroom bindt specifiek aan dubbelstrengig DNA en bij het belichten van de gel met een golflengte van 302 nanometer (nm), worden de gescheiden DNA fragmenten zichtbaar door uitstraling van licht met een golflengte van 600 nm door het fluorochroom. Aanwezigheid van resistentiegenen bij de stalen werd nagegaan indien een gelijkaardig bandje werd gedetecteerd zoals bij de positieve controles. 3.6 Sequenering Met behulp van de spectrofotometer Nanodrop werd eerst het gehalte aan geamplificeerd DNA bepaald. Daarna werd elk staal verdund met HPLC water tot een eindconcentratie bekomen werd van ng/μl. De gebruikte primers werden eveneens verdund met HPLC water tot 10 pmol/μl. De stalen met een duidelijk bandje en het gebruikte primerpaar werden vervolgens opgestuurd naar Eurofins (Luxemburg) voor sequenering van het geamplificeerde resistentiegenen. De sequenties werden vervolgens geanalyseerd met behulp van Vector NTI. Hiertoe werden de sequenties van elk staal, bekomen door sequenering met zowel de forward als de reverse primer, tot 1 enkele consensus sequentie gealigneerd. De 5 -uiteinden van beide strengen werden weggetrimd, aangezien deze vaak aspecifieke pieken van fluorescentie vertoonden. Er gaat echter geen informatie verloren, aangezien de primersequentie mee ingebouwd werd in het fragment en op die manier het uiteinde vormt van het 3 uiteinde van elke complementaire sdna streng. Vervolgens werden de 2 complementaire strengen met elkaar gealigneerd, waarna deze met elkaar vergeleken werden op aanwezigheid van correcte baseparing, met name of elke A tegenover een T (of omgekeerd) en elke C tegenover een G (of omgekeerd) stond. Bij een mismatch tussen 2 baseparen werd het basepaar geselecteerd met de meest zuivere piek, om aldus tot een volledige match te komen tussen beide strengen. De nucleotidensequenties werden vervolgens vergeleken met sequenties uit de NCBI GenBank gebruik makende van de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) op de website van National Center for Biotechnology Information (NCBI) ( Deze centrale database omvat alle 22

23 reeds gekende en gesequeneerde genen van verscheidene organismen, waaronder reeds beschreven bla genen. Na invoer vergelijkt dit algoritme de opgegeven sequentie met elke reeds gekende sequentie en wordt een resultaat weergegeven, waarbij het gen van een bepaald species, waarmee de nog ongekende sequentie de meeste gelijkenis vertoont, bovenaan vermeld wordt. De gegeven E- value dient zo laag mogelijk te zijn, het % coverage en % identity zo hoog mogelijk. De E-value geeft de significantie weer van het resultaat, Query coverage is een maat voor de lengte van een nucleotidensequentie waarvoor een overeenkomstig fragment gedetecteerd werd na BLAST analyse en Maximum identity is een maat voor de exacte overeenkomst na BLAST analyse tussen de nucleotidensequentie van het aangetoonde DNA en een gekende DNA sequentie. Na analyse van deze resultaten kon met grote zekerheid gezegd worden of de resistentiegenen, gedetecteerd met behulp van gelelektroforese, aanwezig zijn in de reinculturen. 4 Resultaten 4.1 Identificatie van de geïsoleerde bacteriën Na incubatie van de stalen op de selectieve McConkey agarplaten, werden er per staal 1 tot 4 verschillende kolonies gedetecteerd. Van elke kolonie werd een reincultuur bekomen. Identificatie tot op species niveau werd succesvol bekomen met behulp van de biochemische testen en MALDI-TOF analyse (Tabel 6). Tabel 6: Identificatie van reinculturen door middel van MALDI-TOF en biochemische testen. De reinculturen zijn afkomstig van meststalen van zoo dieren. Diersoort Staal MALDI-TOF Kligler Lysine MIO Esculine Siberische tijger B E. coli + + M: - I: + O: - - Westelijke gorilla E1 E. coli + + M: - I: + O: - - E2 E. coli + + M: - I: + O: - - E3 E. coli + + M: - I: + O: - - E4 E. coli + + M: - I: + O: - - Oostelijke gorilla F Achromobacter spanius - + M: + I: - O:+ - Amoerluipaard I1 E. coli + + M: - I: + O: - - I2 E. coli + + M: - I: + O: - - Brilbeer 2 K1 E. coli + + M: - I: + O: - - K2 E. coli + + M: - I: + O: - - Brilbeer 3 L1 E. coli + + M: - I: + O: - - L2 E. coli + + M: - I: + O: - - L3 E. coli + + M: - I: + O: - - Dromedaris M Pseudomonas sp. - + M: + I: - O:+ - Aziatische olifant N Pseudomonas sp. - + M: + I: - O:+ - Ringstaart maki T1 E. coli + + M: - I: + O: - - T2 E. coli + + M: - I: + O: - - T3 E. coli + + M: - I: + O: - - Witte neushoorn U1 E. coli + + M: - I: + O: - - U2 E. coli + + M: - I: + O: - - Hyena V1 E. coli + + M: - I: + O: - - V2 E. coli + + M: - I: + O: - - Leeuw X1 E. coli + + M: - I: + O: - - X2 E. coli + + M: - I: + O: - - X3 E. coli + + M: - I: + O: - - Aziatische olifant Z1 Pseudomonas sp. - +/- M: - I: - O:

24 Z2 Pseudomonas sp. - + M: - I: - O: + - Orang oetan β Pseudomonas sp. - + M: + I: - O: +/- - Sneeuw luipaard γ1 Enterococcus faecalis + - M: - I: - O: + + γ2 E. coli + + M: - I: + O: - - Leeuw δ Klebsiella pneumoniae + + M: - I: - O: +/- + Nijlpaard η Pseudomonas sp. - + M: - I: - O: + - Tasmaanse duivel θ Citrobacter freundii + - M: - I: - O: - - Tapirs κ1 E. coli + + M: - I: + O:+ - κ2 E. coli + + M: + I: + O:- - Marmot μ E. coli + + M: - I: - O: - - +: positief resultaat, -: negatief resultaat De resultaten van de MALDI-TOF en biochemische testen toonden aan dat de reinculturen voornamelijk tot de familie van Enterobacteriaceae behoorden (28/36, 77,78%). De meeste kolonies werden geïdentificeerd als E. coli (26/36, 72%). Er werd ook een atypische E. coli gedetecteerd die indol negatief was (staal µ). Daarnaast werd er Klebsiella pneumoniae (staal δ) (1/36, 2,78%) en Citrobacter freundii (staal θ) (1/36, 2,78%) geïsoleerd. Naast Enterobacteriaceae werden ook species behorende tot de familie Pseudomonaceae (6/36, 16,67%), Enterococcus faecalis (1/36, 2,78%) en Achromobacter spanius gedetecteerd (1/36, 2,78%). Tabel 7: Differentiaal tabel voor Gram-negatieve bacteriën (Enterobacteriaceae, oxidase negatief) met behulp van biochemische testen. 3 3 Clinical Veterinary Microbiology, Mosby International Limited,

25 4.2 Antimicrobiële gevoeligheid Alle isolaten waren resistent tegen ampicilline (met uitzondering van het Achromobacter spanius isolaat in staal F (intermediair) en het Enterococcus faecalis isolaat in staal γ1 (gevoelig)), ceftiofur, cefalexine, oxacilline en clindamycine. De meeste isolaten waren gevoelig voor gentamicine (met uitzondering van de E. coli isolaten in stalen T1-3, Enterococcus faecalis in staal γ1 (intrinsieke resistentie) en Pseudomonas spp. in staal β (intermediair), imipenem (met uitzondering van Enterococcus faecalis in staal γ1 (resistent)), en amikacine (met uitzondering van Enterococcus faecalis in staal γ1 (intrinsieke resistentie)). Voor de andere antibiotica (oa. neomycine, fluoroquinolones en tetracyclines) werden gemengde resultaten gedetecteerd (Tabel 9 in de bijlage). In tabel 8 worden de resistentiepercentages en intermediaire percentages weergegeven van de gebruikte antibiotica. De Pseudomonaceae waren in het bijzonder resistent tegen amoxicilline-clavulaanzuur, nitrofurantoïne, florfenicol, trimethoprim en cefoxitine. Tabel 8: Resistentiepercentages en intermediaire percentages van de isolaten behorende tot de Enterobacteriaceae. Antibiotica % Resistentie % intermediair Ampicilline 100 (28/28) - Ceftiofur 100 (28/28) - Cefalexine 100 (28/28) - Oxacilline 100 (28/28) - Amoxicilline-clavulaanzuur 36 (10/28) 4 (1/28) Cefoxitine 18 (5/28) 7 (2/28) Cefquinome 75 (21/28) - Gentamicine 11 (3/28) - Enrofloxacine 18 (5/28) 7 (2/28) Trimethoprim 32 (9/28) - Trimethoprimsulfamethoxazole 75 (21/28) - Neomycine 11 (3/28) 14 (4/28) Doxycycline 57 (16/28) - Tetracycline 57 (16/28) 14 (4/28) Streptomycine 57 (16/28) 36 (10/28) Florfenicol - 25 (7/28) Bij sommige antibiotica werd een synergistisch effect gedetecteerd, vooral tussen amoxicillineclavulaanzuur en cefquinome (Figuur 10). Dit werd ook gedetecteerd tussen amoxicillineclavulaanzuur en ceftiofur (Figuur 9), tussen amoxicilline-clavulaanzuur en cefalexine (Figuur 10) en tussen trimethoprim en sulfamethoxazole (Figuur 11). Wanneer dit synergistisch effect tussen de betalactam antibiotica niet werd opgemerkt, maar wanneer er wel resistentie tegenover zowel cefoxitine én beta-lactamase inhibitoren (clavulaanzuur) of resistentie tegenover beta-lactamase inhibitoren (clavulaanzuur) én derde generatie cefalosporines werd opgemerkt, dan wees dit op aanwezigheid van klasse C beta-lactamase en AmpC fenotype. Dit was het geval voor Pseudomonas spp. in de stalen Z1, Z2, β en η, E. coli isolaten in de stalen γ2, κ1, κ2 en μ, Klebsiella pneumoniae in het staal δ en Citrobobacter freundii in het staal θ. 25

26 Figuur 9: Synergistisch effect tussen amoxicilline-clavulaanzuur en ceftiofur (pijltje). Figuur 10: Synergistisch effect tussen amoxicilline-clavulaanzuur en cefalexine en tussen amoxicillineclavulaanzuur en cefquinome (pijlen). 26

27 Figuur 11: Synergistisch effect tussen trimethoprim en sulfamethoxazole (pijltje). 4.3 PCR en gelelektroforese De resultaten van de gelelektroforese zijn weergegeven in Figuren in de bijlage. Er werden enkel resistentiegenen gevonden bij de stammen behorende tot de Enterobacteriaceae (77,8%). Genen die coderen voor TEM werden gedetecteerd bij 29% (8/28) van de reinculturen (i.e. E. coli isolaten in de stalen E1-4, T1-3 en γ2); voor CTX-M-1 bij 82% (23/28) (i.e. E. coli isolaten in de stalen B, I1-2, K1-2, L1-3, T1-3, U1-2, V1-2, X1-3, γ2, δ, κ1, κ2 en μ); voor SHV en CMY-2 bij 3,5% (1/28) (i.e. Klebsiella pneumoniae in staal δ en Citrobacter freundii in staal θ respectievelijk). Er werden dus meerdere resistentiegenen gedetecteerd bij E. coli isolaten in stalen T1-3 en γ2 en Klebsiella pneumoniae in staal δ. Resistentiegenen die coderen voor OXA-1, OXA-2, CTX-M-2 en CTX-M-9 werden in geen enkel isolaat aangetoond. Bij bepaalde isolaten werden geen resistentiegenen typerend voor BSBLs gedetecteerd, hoewel er wel resistentie tegenover beta-lactam antibiotica aanwezig was. Dit was het geval voor de isolaten in stalen F, M, N, Z1, Z2, β, γ1 en η. Het Achromobacter spanius isolaat uit staal F was bijvoorbeeld resistent tegenover cefoxitine, cefalexine en ceftiofur (Tabel 10 in bijlage). 4.4 Sequenering De concentratie van geamplificeerd DNA bedroeg voor alle stalen ng/μl. Het blasten van de bekomen sequenties bevestigde de aanwezigheid van TEM resistentiegenen bij E. coli isolaten in de stalen E1-4, T1-3 en γ2; CTX-M-1 bij E. coli isolaten in stalen B, I1-2, K1-2, L1-3, T1-3, U1-2, V1-2, X1-3, γ2, κ1, κ2 en μ en Klebsiella pneumoniae in staal δ; SHV bij Klebsiella pneumoniae in het staal δ en CMY-2 bij Citrobacter freundii in het staal θ (Tabel 9). 27

28 Tabel 9: Resultaat van het blasten van de sequenties van de verschillende stalen. Voor elk staal werd een % query coverage en % gelijkenis bekomen van 100%. Resistentiegen controle TEM E1 - TEM E2 - TEM E3 - TEM E4 - TEM T1 -TEM T2 - TEM T3 - TEM γ 2 - TEM B - CTX-M-1 I1 - CTX-M-1 I2 - CTX-M-1 K1 - CTX-M-1 K2 - CTX-M-1 L1 - CTX-M-1 L2 - CTX-M-1 cluster 3 L3 - CTX-M-1 U1 - CTX-M-1 U2 - CTX-M-1 V1 - CTX-M-1 V2 - CTX-M-1 X1 - CTX-M-1 X2 - CTX-M-1 Dichtste match met BLAST databank E. coli blatem gene for class A extended-spectrum betalactamase TEM-20, complete coding sequence E. coli strain EC627 TEM beta lactamase (blatem-1) gene, complete coding sequence E. coli strain EC627 TEM beta lactamase (blatem-1) gene, complete coding sequence E. coli strain EC627 TEM beta lactamase (blatem-1) gene, complete coding sequence E. coli strain EC627 TEM beta lactamase (blatem-1) gene, complete coding sequence E. coli strain SKGH_33 beta-lactamase (blatem) gene, partial coding sequence E. coli pc15-1a blatem gene for class A broad-spectrum beta-lactamase TEM-1, complete coding sequence E. coli blatem gene for class A beta-lactamase TEM-214, complete coding sequence E. coli strain 212 beta-lactamase TEM (blatem) gene, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence 28

29 X3 - CTX-M-1 γ 2 - CTX-M-1 δ - CTX-M-1 κ 1 - CTX-M-1 κ 2 - CTX-M-1 μ - CTX-M-1 δ - SHV θ - CMY-2 E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence E. coli Ugd59 blactx-m gene for class A extended-spectrum betalactamase CTX-M-138, complete coding sequence Klebsiella pneumoniae blashv gene for class A broad-spectrum betalactamase SHV-32, complete coding sequence E. coli p541 blacmy gene for class C beta-lactamase CMY-13, complete coding sequence 5 Discussie In dit beperkt onderzoek werden BSBL producerende bacteriën (meer bepaald Enterobacteriaceae) gedetecteerd in de faeces van meerdere zoo dieren. Hierbij dient opgemerkt te worden dat in deze studie een milieu met ceftiofur gebruikt werd voor isolatie, wat toelaat om ook minderheidspopulaties van cefalosporine resistente kiemen te detecteren. Het is niet gekend welk percentage van de Enterobacteriaceae in de microbiota van deze dieren resistentie vertoonde. Hoe dan ook, zelfs kleine percentages kunnen belangrijk zijn omdat, bij behandeling van de dieren met een beta-lactam antibioticum, dergelijke kiemen bevoordeeld worden en in sterke mate kunnen uitgescheiden worden. In de huidige studie werd 1 Enterococcus faecalis isolaat bekomen. Enterokokken zijn intrinsiek resistent aan ceftiofur, maar de meeste van deze Gram positieve kiemen, groeien niet op McConkey agar omdat dit milieu kristal violet bevat. Allicht vertoonde dit isolaat resistentie aan deze kleurstof. Het is onduidelijk waarom bij zoveel zoo dieren BSBL producerende Enterobacteriaceae teruggevonden werden. Antibiotica gebruik bij deze dieren of contact met gecontamineerde omgeving, voeding en/of verzorgers zouden eventueel een rol kunnen spelen. Het is ook mogelijk dat de zoo dieren reeds resistente bacteriën herbergden voordat ze naar België werden gebracht. Aangezien de prevalentie en het type resistentiegenen kan variëren per regio, zou dit ook de verspreiding van BSBL producerende bacteriën in ons land kunnen beïnvloeden. In deze studie werden er echter geen data verkregen omtrent behandelingen en land van herkomst. Het zou dus interessant zijn om dit in toekomstige studies na te gaan. Hoewel de prevalentie van multi-resistente Enterobacteriaceae die BSBLs produceren, varieerde tussen onze en andere studies, werd er multi-resistentie gedetecteerd tegenover dezelfde klassen van antibiotica, met name: tetracycline, streptomycine, trimethoprim-sulfamethoxazole en gentamicine (Wang et al., 2012; Dobiasova et al., 2013). Dergelijke multi-resistentie wordt mogelijks veroorzaakt door het gebruik van verscheidene klassen van antibiotica ter behandeling of preventie van ziektes. Ishihara et al. (2012) hebben immers aangetoond dat E. coli bacteriën uit dieren behandeld met verscheidene antibiotica klassen een hogere multi-resistentie graad vertoonden dan dieren die niet behandeld werden met antibiotica. Een andere mogelijkheid is transmissie van BSBL producerende E. 29

30 coli tussen diersoorten onderling. In Tsjechië is het reeds aangetoond dat E. coli afkomstig uit zoo dieren, ook terug gevonden wordt bij pluimvee en mensen in Nederland (Dobiasova et al., 2013). Wang et al. (2012) toonden aan dat multi-resistentie meer voorkomt bij ESBL producerende bacteriën in vergelijking met kiemen die AmpC of MBLs produceren. In dit onderzoek werd er ook meer multiresistentie gezien bij de isolaten die ESBLs produceerden dan bij AmpC positieve isolaten. Volgens Wang et al. (2012) heeft dit te maken met een positieve correlatie tussen aanwezigheid van bla genen en PMQR. Verder onderzoek is echter noodzakelijk om de aanwezigheid van PMQR te bevestigen in onze studie. Over het algemeen werd voornamelijk bla CTX-M-1 gedetecteerd bij BSBLs uit de zoo dieren, wat overeenkomt met de bevindingen in andere studies (Ahmed et al., 2007). Daarnaast werd er in onze en andere studies eveneens bla TEM, bla CMY-2 en bla SHV gedetecteerd (Ahmed et al., 2007; Ishihara et al., 2012; Wang et al., 2012). Mogelijks heeft dit te maken hebben met uitwisseling van dieren tussen verschillende landen of gelijkaardige behandelingen die toegepast worden bij zoo dieren. In vergelijking met onze studie met zoo dieren, wordt een hogere prevalentie van ESBL producerende Enterobacteriaceae beschreven bij voedselproducerende en gezelschapsdieren, namelijk respectievelijk 63,6% en 48,8%. Daarnaast vertonen ESBL producerende bacteriën afkomstig uit voedselproducerende dieren en gezelschapsdieren een hogere graad van multi-resistentie (Haenni et al., 2014; Schmiedel et al., 2014; Gracia et al., 2015). De frequentst gedetecteerde enzymen zijn TEM, SHV, CMY-2 en CTX-M-1, -8, -9, -14 en -15. (Hammerum et al., 2014; Rubin en Pitout, 2014; Schmiedel et al., 2014; Abdallah et al., 2015; Dahms et al., 2015; Rocha-Gracia et al., 2015; Von Salviati et al., 2015; Tekiner en Özpınar, 2016; Wielders et al., 2017), wat gelijkaardig is met onze bevindingen bij zoo dieren. De prevalentie van BSBL producerende Enterobacteriaceae bij wilde dieren is lager dan bij zoo dieren (i.e. 19%) (Smet et al., 2009). Dit kan te maken hebben met afwezigheid van antibiotica behandeling van wilde dieren. De resistentie bij wilde dieren, voornamelijk meeuwen en roofvogels, kan onder andere te wijten zijn aan contact met uitwerpselen van andere dieren. Daarnaast leggen vogels vaak grote afstanden af en kunnen ze in contact met uiteenlopende omgevingsgebieden. 6 Conclusie In dit beperkt onderzoek werd aangetoond dat BSBLs, voornamelijk ESBLs, voorkomen bij Enterobacteriaceae van zoo dieren in België. Hierbij werden resistentiegenen die coderen voor TEM, CTX-M-1, SHV en CMY-2 aangetoond. Het is aangewezen om het voorkomen van antibiotica resistentie bij bacteriën van zoo dieren verder op te volgen. Bovendien dient ook onderzoek opgestart te worden naar factoren die dit voorkomen beïnvloeden. Hierbij kan onder andere gedacht worden aan antibiotica therapie bij zoo dieren en het voederen van deze dieren met voeder dat resistente bacteriën bevat. Het voorkomen van BSBLs bij zoo dieren kan immers een risico vormen voor andere dieren, bezoekers en hun verzorgers. 30

31 7 Referentielijst Abdallah, H.M., Reuland, E.A., Wintermans, B.B., Al Naiemi, N., Koek, A., Abdelwahab, A.M., Ammar, A.M., Mohamed, A.A., Vandenbroucke-Grauls, C.M.J.E., Extended-spectrum betalactamases and/or carbapenemases-producing Enterobacteriaceae isolated from retail chicken meat in Zagazig, Egypt. PLoS ONE 10, 1 8. Ahmed, A.M., Motoi, Y., Sato, M., Maruyama, A., Watanabe, H., Fukumoto, Y., Shimamoto, T., Zoo animals as reservoirs of gram-negative bacteria harboring integrons and antimicrobial resistance genes. Applied and Environmental Microbiology 73, Bajaj, P., Singh, N.S., Virdi, J.S., Escherichia coli beta-lactamases: what really matters. Frontiers in Microbiology 7, Balkhed, A.O., Tärnberg, M., Monstein, H., Hällgren, A., Hanberger, H., Nilsson, L.E., High frequency of co-resistance in CTX-M-producing Escherichia coli to non-beta-lactam antibiotics, with the exceptions of amikacin, nitrofurantoin, colistin, tigecycline, and fosfomycin, in a county of Sweden. Scandinavian Journal of Infectious Diseases 45, Bortolami, A., Verin, R., Chantrey, J., Corrò, M., Ashpole, I., Lopez, J., Timofte, D., Characterization of livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus CC398 and mecc-positive CC130 from zoo animals in the United Kingdom. Microbial Drug Resistance 23, Bush, K., Jacoby, G.A., Updated functional classification of beta-lactamases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 54, Carneiro, C., Araújo, C., Gonçalves, A., Vinué, L., Somalo, S., Ruiz, E., Uliyakina, I., Rodrigues, J., Igrejas, G., Poeta, P., et al., Detection of CTX-M-14 and TEM-52 extended-spectrum betalactamases in fecal Escherichia coli isolates of captive ostrich in Portugal. Foodborne Pathogens and Disease 7, Dahms, C., Hubner, N.O., Kossow, A., Mellmann, A., Dittmann, K., Kramer, A., Occurrence of ESBL-producing Escherichia coli in livestock and farm workers in Mecklenburg-Western Pomerania, Germany. PLOS ONE 10, D Andrea, M.M., Arena, F., Pallecchi, L., Rossolini, G.M., CTX-M-type beta-lactamases: a successful story of antibiotic resistance. International Journal of Medical Microbiology 303, Dobiasova, H., Dolejska, M., Jamborova, I., Brhelova, E., Blazkova, L., Papousek, I., Kozlova M., Klimes, J., Cizek, A., Literak, I., Extended spectrum beta-lactamase and fluoroquinolone resistance genes and plasmids among Escherichia coli isolates from zoo animals, Czech Republic. FEMS microbiology ecology 85, Egea, P., López-Cerero, L., Torres, E., Gómez-Sánchez Mdel, C., Serrano, L., Navarro Sánchez-Ortiz, M.D., Rodriguez-Baño, J., Pascual, A., Increased raw poultry meat colonization by extended spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli in the south of Spain. International Journal of Food Microbiology 159, Goyanes, M.J., Cercenado, E., Insa, R., Morente, A., Alcalá, Bouza, E., High rates of antimicrobial co-resistance among Enterobacteriaceae: comparative analysis between clinical isolates resistant 31

32 and susceptible to third-generation cephalosporins. Revista Espanola De Quimioterapia 20, Guenther, S., Ewers, C., Wieler, L.H., Extended-spectrum beta-lactamases producing E. coli in wildlife, yet another form of environmental pollution? Frontiers in Microbiology 19, 246. Haenni, M., Châtre, P., Métayer, V., Bour, M., Signol, E., Madec, J.Y., Gay, E., Comparative prevalence and characterization of ESBL-producing Enterobacteriaceae in dominant versus subdominant enteric flora in veal calves at slaughterhouse, France. Veterinary Microbiology 171, Hammerum, A.M., Larsen, J., Andersen, V.D., Lester, C. H., Skytte, T.S.S., Hansen, F., Olsen, S.S., Mordhorst, H., Skov, R. L., Aarestrup, F.M., et al., Characterization of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Escherichia coli obtained from Danish pigs, pig farmers and their families from farms with high or no consumption of third- or fourth-generation cephalosporins. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 69, Hassan, M.I., Alkharsah, K.R., Alzahrani, A.J., Obeid, O.E., Khamis, A.H., Diab, A., Detection of extended spectrum beta-lactamases-producing isolates and effect of AmpC overlapping. Journal of Infection in Developing Countries 7, Huijbers, P.M.C., Graat, E.A.M., van Hoeck, A.H.A.M., Veenman, C., de Jong, M.C.M., van Duijkeren, E., Transmission dynamics of extended-spectrum beta-lactamase and AmpC beta-lactamase producing Escherichia coli in a broiler flock without antibiotic use. Preventive Veterinary Medicine 131, Ishihara, K., Hosokawa, Y., Makita, K., Noda, J., Ueno, H., Muramatsu, Y., Ueno, H., Mukai, T., Yamamoto, H., Ito, M., et al., Factors associated with antimicrobial-resistant Escherichia coli in zoo animals. Research in Veterinary Science 93, Janatova, M., Albrechtova, K., Petrzelkova, K.J., Dolejska, M., Papousek, I., Masarikova, M., Cizek, A., Todd, A., Shutt, K., Kalousova, B., et al., Antimicrobial-resistant Enterobacteriaceae from humans and wildlife in Dzanga-Sangha Protected Area, Central African Republic. Veterinary Microbiology 171, Kanj, S.S., Kanafani, Z.A., Current concepts in antimicrobial therapy against resistant Gram- Negative organisms: extended-spectrum beta-lactamase producing Enterobacteriaceae, carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, and multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa. Majo Clinic Proceedings 86, Kirbis, A., Krizman, M., Spread of antibiotic resistant bacteria from food of animal origin to humans and vice versa. Procedia Food Science 5, Kostrzewa, M., Application of the MALDI Biotyper to clinical microbiology: progress and potential. Expert Review of Proteomics 15, Lahlaoui, H., Ben Haj Khalifa, A., Ben Moussa, M., Epidemiology of Enterobacteriaceae producing CTX-M type extended spectrum beta-lactamase (ESBL). Medecine et Maladies Infectieuses 44, Leverstein-van Hall, M.A., Dierikx, C.M., Cohen Stuart, J., Voets, G.M., van den Munckhof, M.P., van Essen-Zandbergen, A., Platteel, T., Fluit, A.C., van de Sande-Bruinsma, N., Scharinga, J., et al., Dutch patients, retail chicken meat and poultry share the same ESBL genes, plasmids and 32

33 strains. Clinical Microbiology and Infection 17, Licht, T.R., Christensen, B.B., Krogfelt, K. A., Molin, S., Plasmid transfer in the animal intestine and other dynamical bacterial populations: the role of community structure and environment. Microbiology 145, Literak, I., Dolejska, M., Radimersky, T., Klimes, J., Friedman, M., Aerestrup, F.M., Hasman, H., Cizek, A., Antimicrobial-resistant faecal Escherichia coli in wild mammals in central Europe: multiresistant Escherichia coli producing extended-spectrum beta-lactamases in wild boars. Journal of Applied Microbiology 108, Livermore, D.M., Canton, R., Gniadkowski, M., Nordmann, P., Rossolini, G.M., Arlet, G., Ayala, J., Coque, T. M., Kern-Zdanowicz, I., Luzzaro, F., et al., CTX-M: Changing the face of ESBLs in Europe. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 59, Madec, J.Y., Haenni, M., Nordmann, P., Poirel, L., Extended-spectrum beta-lactamase/ampcand carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in animals: A threat for humans? Clinical Microbiology and Infection 23, Marchant, P., Hidalgo-Hermoso, E., Espinoza, K., & Retamal, P., Salmonella enterica. FEMS Microbiology Letters 17, Olorunniji, F.J., McPherson, A.L., Stark, W.M., Control of serine integrase recombination directionality by fusion with the directionality factor. Nucleic Acids Research 45, Pérez-Pérez, F.J., Hanson, N.D., Detection of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR. Journal Clinical Microbiology 40, Randall, L.P., Lodge, M.P., Elviss, N.C., Lemma, F.L., Hopkins, K.L., Teale, C.J., Woodford, N., Evaluation of meat, fruit and vegetables from retail stores in five United Kingdom regions as sources of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing and carbapenem-resistant Escherichia coli. International Journal of Food Microbiology 241, Rocha-Gracia, R.C., Cortés-Cortés, G., Lozano-Zarain, P., Bello, F., Martínez-Laguna, Y., Torres, C., Faecal Escherichia coli isolates from healthy dogs harbour CTX-M-15 and CMY-2 β-lactamases. Veterinary Journal 203, Rubin, J.E., & Pitout, J.D.D., Extended-spectrum beta-lactamase, carbapenemase and AmpC producing Enterobacteriaceae in companion animals. Veterinary Microbiology 170, Rubtsova, M.Y., Ulyashova, M.M., Bachmann, T.T., Schmid, R.D., Egorov, A.M., Multiparametric determination of genes and their point mutations for identification of beta-lactamases. Biochemistry 75, Rudresh, S.M., Nagarathnamma, T., Extended spectrum beta-lactamase producing Enterobacteriaceae and antibiotic co-resistance. Indian Journal of Medicine Research 133, Saini, A., Bansal, R., Insights on the structural characteristics of NDM-1: The journey so far. Advances in Biological Chemistry 2, Schaufler, K., Semmler, T., Wieler, L.H., Wöhrmann, M., Baddam, R., Ahmed, N., Müller, K., Kola, A., Fruth, A., Ewers, C., et al., Clonal spread and interspecies transmission of clinically relevant ESBL-producing Escherichia coli of ST410-another successful pandemic clone? FEMS Microbiology 33

34 Ecology 92, doi: /femsec/fiv155. Schmiedel, J., Falgenhauer, L., Domann, E., Bauerfeind, R., Prenger-Berninghoff, E., Imirzalioglu, C., Chakraborty, T., Multiresistant extended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae from humans, companion animals and horses in central Hesse, Germany. BMC Microbiology 14, Shaikh, S., Fatima, J., Shakil, S., Rizvi, S.M.D., Kamal, M.A., Antibiotic resistance and extended spectrum beta-lactamases: Types, epidemiology and treatment. Saudi Journal of Biological Sciences 22, Smet, A., Martel, A., Persoons, D., Dewulf, J., Heyndrickx, M., Catry, B., Herman, L., Haesebrouck, F., Butaye, P., Diversity of extended-spectrum beta-lactamases and class C beta-lactamases among cloacal Escherichia coli isolates in Belgian broiler farms. Antimicrobial agents and chemotherapy 4, Smet, A., Broad-spectrum beta-lactamases among Enterobacteriaceae of animal origin: molecular aspects, mobility and impact on public health. Doctoraat, Doctor of Veterinary Medicine in de diergeneeskunde, Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent, België. Smet, A., Martel, A., Persoons, D., Dewulf, J., Heyndrickx, M., Claeys, G., Lontie, M., Van Meensel, B., Herman, L., Haesebrouck, F., et al., Characterization of extended-spectrum betalactamases produced by Escherichia coli isolated from hospitalized and nonhospitalized patients: emergence of CTX-M-15-producing strains causing urinary tract infections. Microbial Drug Resistance 16, Smet, A., Martel, A., Persoons, D., Dewulf, J., Heyndrickx, M., Herman, L., Haesebrouck, F., Butaye, P., Broad-spectrum beta-lactamases among Enterobacteriaceae of animal origin: molecular aspects, mobility and impact on public health. FEMS Microbiology Reviews 34, Tacão, M., Moura, A., Correia, A., Henriques, I., Co-resistance to different classes of antibiotics among ESBL-producers from aquatic systems. Water research 48, Tekiner, İ. H., & Özpınar, H., Occurrence and characteristics of extended spectrum betalactamases-producing Enterobacteriaceae from foods of animal origin. Brazilian Journal of Microbiology 47, Uchil, R.R., Kohli, G.S., Katekhaye, V.M., Swami, O.C., Strategies to combat antimicrobial resistance. Journal of Clinical and Diagnostic Research, 8(7), Vaidya, V.K., Horizontal transfer of antimicrobial resistance by extended spectrum betalactamase producing Enterobacteriaceae. Journal of Laboratory Physicians 3, Von Salviati, C., Laube, H., Guerra, B., Roesler, U., Friese, A., Emission of ESBL/AmpC-producing Escherichia coli from pig fattening farms to surrounding areas. Veterinary Microbiology 175, Walsh, F., & Duffy, B., The Culturable Soil Antibiotic Resistome: A community of multi-drug resistant bacteria. PLoS ONE 8, doi.org/ /journal.pone Wang, Y., He, T., Han, J., Wang, J., Foley, S.L., Yang, G., Wan, S., Shen, J., Wu, C., Prevalence of ESBLs and PMQR genes in fecal Escherichia coli isolated from the non-human primates in six zoos in China. Veterinary Microbiology 159,

35 Wielders, C.C.H., van Hoek, A.H.A.M., Hengeveld, P.D., Veenman, C., Dierikx, C.M., Zomer, T.P., Smit, L.A.M., van der Hoek, W., Heederik, D.J., de Greeff, S.C., et al., Extended-spectrum betalactamase- and pampc-producing Enterobacteriaceae among the general population in a livestock-dense area. Clinical Microbiology and Infection 23, doi 120.e1-120.e8. 35

36 8 Bijlagen Figuur 12: Agarose gelelektroforese waarbij de geamplificeerde OXA-1 (bovenste twee rijen) en OXA-2 (onderste twee rijen) gen fragmenten, na PCR, gescheiden werden. De volgorde op de gel is als volgt: ladder, positieve controle met het gen voor resistentie, eigen stalen (B, D1, E1-4, I1-2, K1-2, L1-3, T1-3, U1-2, V1-2, X1-3, F, M, N) en de negatieve controle. Enkel de positieve controle van OXA-1 is positief. Figuur 13: Agarose gelelektroforese waarbij de geamplificeerde SHV gen fragmenten, na PCR, gescheiden werden. De volgorde op de gel is als volgt: ladder, positieve controle met het gen voor resistentie, eigen stalen (B, D1, E1-4, I1-2, K1-2, L1-3, T1-3, U1-2, V1-2, X1-3, F, M, N) en negatieve controle. Geen enkel staal is positief. 36

37 Figuur 14: Agarose gelelektroforese waarbij de geamplificeerde CTX-M-1 (bovenste twee rijen) en CTX- M-2 (onderste twee rijen) gen fragmenten, na PCR, gescheiden werden. De volgorde op de gel is als volgt: ladder, positieve controle met het gen voor resistentie, eigen stalen (B, D1, E1-4, I1-2, K1-2, L1-3, T1-3, U1-2, V1-2, X1-3, F, M, N) en negatieve controle. Bij CTX-M-1 zijn de stalen B, I1-2, K1-2, L1-3, T1-3, U1-2, V1-2, X1-3 en de controle positief. Bij CTX-M-2 is enkel de controle positief. 37

38 Figuur 15: Agarose gelelektroforese waarbij de geamplificeerde CTX-M-9 (bovenste twee rijen) en CMY- 2 (onderste twee rijen) gen fragmenten, na PCR, gescheiden werden. De volgorde op de gel is als volgt: ladder, positieve controle met het gen voor resistentie, eigen stalen (B, D1, E1-4, I1-2, K1-2, L1-3, T1-3, U1-2, V1-2, X1-3, F, M, N) en negatieve controle. Enkel de controle van CTX-M-9 is positief. Figuur 16: Agarose gelelektroforese waarbij de geamplificeerde TEM gen fragmenten, na PCR, gescheiden werden. De volgorde op de gel is als volgt: ladder, positieve controle met het gen voor resistentie, eigen stalen (B, D1, E1-4, I1-2, K1-2, L1-3, T1-3, U1-2, V1-2, X1-3, F, M, N) en negatieve controle. De stalen E1-4 en T1-3 en de controle zijn positief. 38

39 Figuur 17: Agarose gelelektroforese waarbij de geamplificeerde TEM (eerste rij), CTX-M (laatste rij), CTX-M-1 (tweede rij) en -2 (derde rij) gen fragmenten, na PCR, gescheiden werden. De volgorde op de gel is als volgt: ladder, Z1, Z2, β, γ1, γ2, δ, η, θ, κ1, κ2, μ, positieve controle en negatieve controle. Bij TEM is staal γ2 positief. Bij CTX-M-1 zijn de stalen γ2, δ, κ1, κ2 en μ positief. Figuur 18: Agarose gelelektroforese waarbij de geamplificeerde SHV (eerste rij), OXA-1 (tweede rij), OXA-2 (derde rij) en CMY (laatste rij) gen fragmenten, na PCR, gescheiden werden. De volgorde op de gel is als volgt: ladder, Z1, Z2, β, γ1, γ2, δ, η, θ, κ1, κ2, μ, positieve controle en negatieve controle. Bij SHV is staal δ positief. Bij CMY is staal θ positief. 39