Breed-spectrum β-lactamase producerende Enterobacteriaceae bij hond en kat

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Breed-spectrum β-lactamase producerende Enterobacteriaceae bij hond en kat door Robin VAES Promotor: Dr. Ir. Annemieke Smet Medepromotor: Prof. dr. Freddy Haesebrouck Onderzoek in het kader van de Masterproef

2

3 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Breed-spectrum β-lactamase producerende Enterobacteriaceae bij hond en kat door Robin VAES Promotor: Dr. Ir. Annemieke Smet Medepromotor: Prof. dr. Freddy Haesebrouck Onderzoek in het kader van de Masterproef

4 De auteur en de promotoren geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotoren. Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijbehorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur en de promotoren zijn niet verantwoordelijk voor de behandeling en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

5 VOORWOORD Dit onderzoek werd uitgevoerd in het kader van de Masterproef van de opleiding Diergeneeskunde. Vooraleer het onderzoeksverslag aan te vatten had ik graag enkele mensen bedankt voor het mogelijk maken van dit onderzoek. Om te beginnen een bijzonder dankwoord aan mijn promotor Annemieke Smet voor de goede begeleiding. Je maakte me op korte tijd wegwijs binnen de onderzoekswereld. Hierbij stond je steeds klaar om de praktische proeven in goede banen te leiden. Je uitleg en advies hierover lieten dit alles vlot verlopen. Ook wil ik je bedanken voor de vlotte communicatie met snel antwoord op mijn vragen, wat het schrijven van dit onderzoeksverslag vlot deed verlopen. Ook een bijzonder dankwoord aan mijn co-promotor professor Freddy Haesebrouck. Vooreerst bedankt voor het aanbieden van dit onderwerp, en het beschikbaar stellen van je labo als thesis-locatie. Ook wil ik je bedanken voor het geven van richtlijnen en controleren van het werk. Verder wil ik graag iedereen bedanken die meehielp bij het verzamelen van stalen. Hierbij in het bijzonder de diergeneeskundige praktijk die op korte tijd een groot aantal stalen wist te verzamelen. Verder ook een dankwoord aan alle particuliere eigenaars van honden en katten die meewerkten aan dit onderzoek. Ook het dierenasiel dat meewerkte aan dit onderzoek wil ik graag via deze weg bedanken, evenals de UGent voor het bemonsteren van hun proefdieren. Hierbij wil ik me ook graag richten tot Tim Waelbers en Ine Cornelis, voor het helpen met de staalname. Ook Sophie De Bruyckere en Nathalie Van Ryselberghe wil ik graag bedanken om me te helpen met het uitvoeren van praktische proeven. Filip Boyen wil ik graag bedanken voor de wegwijs in het labo en het toezien op de veiligheid binnen deze werkomgeving. En eveneens voor het aanbrengen van documentatie voor mijn literatuurstudie. Ook zeker een speciaal dankwoord aan mijn ouders. In het bijzonder om me de mogelijkheid te geven deze opleiding waarin dit werk kadert te kunnen volgen. Verder wil ik ook graag mijn broer Kristof, en mijn vriendin Marieke bedanken, mijn steun en toeverlaten.

6 INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING LITERATUURSTUDIE INLEIDING ENTEROBACTERIACEAE β-lactam ANTIBIOTICA ANTIMICROBIËLE WERKING CLASSIFICATIE Penicillines Cephalosporines en Cephamycines Overige β-lactam RESISTENTIEMECHANISMEN β-lactamasen EXTENDED SPECTRUM BETA-LACTAMASE (ESBL) TEM SHV CTX-M Overige AMP-C BETA-LACTAMASE (AmpC) Chromosomaal AmpC Plasmide AmpC METALLO BETA-LACTAMASE (MBL) MOBILITEIT VAN RESISTENTIEGENEN VOORKOMEN VAN BREED-SPECTRUM β-lactamase-producerende ENTEROBACTERIACEAE BIJ GEZELSCHAPSDIEREN BIJ DE MENS.. 19

7 ONDERZOEK OBJECTIEVEN MATERIAAL EN METHODEN STALEN Populatie Staalname BEREIDING VAN SELECTIEVE VOEDINGSBODEM CULTIVATIE BACTERIËLE DIFFERENTIATIE Visueel Biochemische testen Kligler test Motility indol ornithine (MIO) test Esculine hydrolyse test S rrna-pcr ANTIBIOGRAM POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Principe Detectie β-lactamase resistentiegenen (bla) en 16S rrna Identificatie breed-spectrum β-lactamase (bla) resistentiegenen Amplificatie 16S rrna gen AGAROSE GEL ELECTROFORESE SEQUENTIE-ANALYSE Principe Bepaling nucleotide sequentie bla genen en 16s rrna RESULTATEN PREVALENTIE COMMENSAAL BREED-SPECTRUM Β-LACTAMASE PRODUCERENDE ENTEROBACTERIACEAE BIJ KAT EN HOND ANTIBIOTICA RESISTENTIE-PROFIEL VAN DE BREED-SPECTRUM β-lactamase PRODUCERENDE ENTEROBACTERIACEAE IDENTIFICATIE BREED-SPECTRUM β-lactamase PRODUCERENDE ENTEROBACTERICEAE DETECTIE EN KARAKTERISATIE bla RESISTENTIEGENEN DISCUSSIE REFERENTIELIJST. 48 BIJLAGEN.. 52

8 SAMENVATTING In deze thesis werd het voorkomen van breed-spectrum β-lactamase producerende Enterobacteriaceae in de darmflora van hond en kat onderzocht. Voor deze studie werden er 230 faecale swabs verzameld van honden (n=158) en katten (n=72). Deze werden genomen van verschillende subklassen: honden van particuliere eigenaars (n=120), asielhonden (n=8), proefhonden (n=30), katten van particuliere eigenaars (n=60) en asielkatten (n=10). De prevalentie van commensaal breed-spectrum β-lactamase producerende Enterobacteriaceae bedroeg 24,68% (39/158) bij de stalen van honden, met de hoogste prevalentie bij de asielhonden (37,50%; 3/8), gevolgd door de proefhonden (36,67%; 11/30). Bij honden van particuliere eigenaars lag de prevalentie op 23,33% (25/120). Bij katten afkomstig van particuliere eigenaars lag de prevalentie op 14,52% (9/62). Bij asielkatten was de prevalentie 0%. Breed-spectrum β-lactamresistentie werd teruggevonden bij Escherichia coli (n=44), Enterobacter hormaechii (n=3), Enterobacter cloacae (n=1), Citrobacter freundii (n=2) en Proteus mirabilis (n=1). In totaal werden 51 breed-spectrum β- lactamase producerende Enterobacteriaceae geïsoleerd (51/230; 22,17%) die verder onderzocht werden. In 3 stalen afkomstig van particuliere honden werden namelijk 2 verschillende isolaten gehaald. Met behulp van agar disk diffusie test werd de antimicrobiële gevoeligheid van de 51 isolaten bestudeerd. Onderstaande tabel geeft een overzicht van de resistentiepercentages van het totaal aantal stalen en de stalen afkomstig van honden en katten afzonderlijk. Antibioticum % Resistentie alle isolaten % Resistentie honden-isolaten % Resistentie katten-isolaten Ampicilline 100,00 100,00 (%) 100,00 (%) Ceftiofur 100,00 100,00 100,00 Amoxicilline-clavulaanzuur 80,39 76,19 100,00 Cefquinome 45,10 50,00 22,22 Doxycycline 33,33 38,10 11,11 Flumequine 9,80 11,90 0,00 Enrofloxacine 13,73 16,67 0,00 Sulfonamiden 52,94 57,14 33,33 Trimethoprim 31,37 33,33 22,22 Nitrofurane 5,88 7,14 0,00 Gentamicine 5,88 7,14 0,00 Neomycine 1,96 2,38 0,00 Amikacyne 0,00 0,00 0,00 Imipenem 0,00 0,00 0,00 Van de 51 isolaten werden er bij 17 isolaten bla genen gedetecteerd die coderen voor een ESBL en bij 27 isolaten bla genen die coderen voor een plasmid gemedieerd AmpC β-lactamase. De twee meest voorkomende breed-spectrum bla genen waren bla CMY-2 (31,37%) en bla CTX-M-138 (17,65%). Een zeer grote diversiteit aan bla genen werd waargenomen. Zo werden bla TEM-52, bla CTX-M-27 en bla ACT-21 elk tweemaal teruggevonden. Bla CMY-100 werd 3 maal aangetoond en volgende genen werden eenmalig teruggevonden: bla CMY-102, bla CMY-103, bla CMY-48, bla CMY-101, bla SHV-1, bla SHV-12, bla ACT- 20, bla CTX- M2, bla CTX-M12 en bla CTX-M15. Ook werden er voor het eerst 7 nieuwe bla genen ontdekt welke een nieuwe naam toegekend kregen, namelijk: bla CTX-M-138, bla CMY-100, bla CMY-101, bla CMY-102, bla CMY-103, bla ACT-20 en bla ACT-21. Tot slot werden er mutaties vastgesteld in de promotorregio van het chromosomaal ampc gen van E. coli, welke verantwoordelijk kunnen zijn voor het AmpC resistentieprofiel bij deze isolaten. Trefwoorden: β-lactamase Resistentie Enterobacteriaceae ESBL AmpC

9 LITERATUURSTUDIE 1. INLEIDING Antimicrobiële resistentie is een veelbesproken onderwerp in de humane geneeskunde. Ook in de diergeneeskunde wint dit onderwerp steeds meer aan interesse. β-lactam antibiotica zijn niet enkel de meest gebruikte antibiotica, deze klasse van antibiotica is eveneens degene met de meest uitgebreide resistentieontwikkeling. Onderzoek naar het voorkomen van β-lactam resistentie werd jarenlang bestudeerd bij bacteriën van humane oorsprong. Pas vanaf 2000 veschenen ook de eerste onderzoeksresultaten over het voorkomen van β-lactam resistente bacteriën bij dieren. Deze studies beperkten zich meestal tot voedselproducerende dieren, aangezien werd aangenomen dat de overdracht van resistente bacteriën via de voeding een hoog risico zou inhouden voor de volksgezondheid. Het voorkomen van β-lactam resistente bacteriën bij gezelschapsdieren werd veel minder onderzocht. Aangezien ook deze dieren commensale Enterobacteriaceae bezitten, en eveneens bij infectie behandeld kunnen worden met β-lactam antibiotica valt het voorkomen ervan niet te betwisten. Daarnaast is het directe contact met onze huisdieren groter dan vroeger. Het is dan ook niet ondenkbaar dat uitwisseling van commensale en/of pathogene kiemen via direct contact kan voorkomen. De basis van het ontstaan van antimicrobiële resistentie ligt bij de selectiedruk die gecreëerd wordt door een antimicrobiële therapie. Na contact met een antibioticum zullen enkel kiemen overleven die resistent zijn aan het toegediende antibioticum. Resistentie-ontwikkeling is echter niet louter voorbehouden aan therapie-eisende, pathogene kiemen waartegen de therapie werd ingesteld. De toegediende antibiotica bereiken namelijk ook de niet-pathogene, commensale kiemen, welke een minstens even belangrijke rol spelen in de resistentie-ontwikkeling. Het is echter slechts door therapiefalen bij resistente pathogene kiemen dat antimicrobiële resistentie in de praktijk aan het licht komt. Resistente commensalen daarentegen kunnen een succesvolle therapie onopgemerkt overleven en nadien verder vermenigvuldigen. Via het principe van survival of the fittest weet een spontaan ontstane resistentie zich op deze manier binnen een populatie bacteriën te vestigen. Het klinische gevaar van resistentie-ontwikkeling binnen pathogene kiemen is voor de hand liggend. De ontwikkeling ervan binnen commensale kiemen is echter ook niet geheel ongevaarlijk. Nietpathogene kiemen kunnen namelijk in sommige gevallen pathogeen worden. Zo kan Escherichia (E.) coli, een commensale darmbewoner, een infectie veroorzaken indien deze bacterie bijvoorbeeld in de urinewegen terecht komt. Daarnaast kunnen deze commensale bacteriën een belangrijk reservoir vormen voor resistentiegenen die doorgegeven kunnen worden aan pathogene bacteriële species. Aangezien bacteriën vaak niet-species specifiek zijn qua gastheerbezetting is antimicrobiële resistentie van algemeen belang in zowel de humane als de veterinaire geneeskunde. Zowel pathogene als commensale kiemen kunnen namelijk ten gevolge van direct en/of indirect contact tussen verschillende gastheren (mens en dier) uitgewisseld worden. Bacteriën die overgedragen worden van dier naar mens en die ziekte veroorzaken bij de mens, noemt men zoönosen. 2

10 Antimicrobiële resistentie is dan ook een zeer ruim begrip, opgebouwd uit 3 vaste factoren: de bacterie, het resistentiemechanisme en het antibioticum. Dit onderzoek wordt toegespitst op Enterobacteriaceae (de bacterie) welke ongevoelig zijn geworden aan β-lactam antibiotica (het antibioticum) ten gevolge van resistentiegenen (het resistentiemechanisme) die coderen voor β- lactamasen (Figuur 1). N Figuur 1. Voorstelling van het algemeen principe van antimicrobiële resistentie. Enterobacteriaceae (groen) produceren een β-lactamase (rood) dat in staat is het β-lactam antibioticum (blauw) te hydrolyseren. (Naar De Backer, 2010) 3

11 2. ENTEROBACTERIACEAE Bacteriën waarvan het voorkomen van β-lactamresistentie in deze studie werd onderzocht, behoren tot de familie van de Enterobacteriaceae. Deze familie van Gram-negatieve bacteriën omvat 33 genera waarbinnen reeds honderden species gekend zijn. De naam Enterobacteriaceae is afgeleid van hun typische lokalisatie in het darmstelsel (Entero) van mens en dier. De bacteriën van deze familie zijn ook wijdverspreid in de omgeving zoals in de bodem, oppervlaktewater en op planten (Quinn et al., 2006). In tabel 1 wordt een overzicht gegeven van de familie en zijn genera. Hierbij zijn de genera welke meest frequent voorkomen in het darmstelsel van hond en kat aangeduid in het vet. Tabel 1: Overzicht van de verschillende genera binnen de Enterobacteriaceae-familie. De frequentst voorkomende genera bij hond en kat zijn aangeduid in het vet. (Naar Quinn et al., 2006) Familie Enterobacteriaceae Genus Arsenophonus Budvicia Buttiauxella Cedecea Citrobacter Enterobacter Erwinia Escherichia Ewingella Hafnia Klebsiella Kluyvera Koserella Leclercia Leminorella Levinea Moellerella Morganella Obesumbacterium Pantoea Pectobacterium Pragia Proteus Providencia Rahnella Salmonella Serratia Shigella Tatumella Trabulsiella Xenorhabdus Yersinia Yohenella 4

12 Enterobacteriaceae zijn Gram-negatieve bacteriën. Deze bezitten naar antimicrobiële resistentie toe een zeer belangrijk kenmerk: de opbouw van hun celwand (Figuur 2). De celwand is een belangrijke component die de bacteriële cel steun en structuur geeft. De celwand van Gram-negatieve bacteriën heeft een dikte van ca. 0,010 µm en bestaat uit twee lagen. De binnenste laag bestaat uit peptidoglycaan. Deze laag is verantwoordelijk voor de rigide structuur van Gram-negatieve bacteriën. Peptidoglycanen zijn complexe polymeren die opgebouwd zijn uit drie elementen: (1) N- acetylglucosamine en N-acetylmurinezuur disaccharide polymeren, (2) tetrapeptide zijketens die vastzitten op N-acetylmuraminezuur en (3) oligopeptidebruggen die deze zijketens verbinden. Deze polymeren worden gesynthetiseerd in het protoplasma van de bacterie en door middel van penicilline bindende proteïnen (PBPs) (waaronder transpeptidasen, carboxypeptidasen) gecrosslinkt in de celwand. Tussen de plasmamembraan en de buitenste laag van de celwand bevindt zich de periplasmatische ruimte. Hierin worden hydrolytische enzymen gesecreteerd die gesynthetiseerd werden in het protoplasma. De buitenste laag bestaat uit fosfolipiden, lipoproteïnen, proteïnen en lipopolysacchariden (Haesebrouck, 2009; De Backer, 2010) A B C. Figuur 2. Opbouw van de celwand van een Gram-negatieve bacterie. A. De buitenste laag. Opgebouwd uit fosfolipiden (1), lipoproteïnen (2), lipopolysacchariden (3) en porie-proteïnen (4). B. De periplasmatische ruimte. C. De binnenste laag. Opgebouwd uit fosfolipiden (1), peptidoglycaan (5), penicilline bindende proteïnen (6). Peptidoglycaan is opgebouwd uit N-acetylglucosamine (NAG), N- acetylmurinezuur (NAM), tetrapeptide zijketens (groene stippellijn) en oligopeptidebruggen (blauwe stippellijn) en wordt voorgesteld in de uitvergroting. (Naar Haesebrouck, 2009) 5

13 Enterobacteriaceae kunnen opgedeeld worden in 3 grote groepen, naargelang hun pathogeniciteit voor mens en dier (Quinn et al., 2006). 1. Niet-pathogene kiemen. Deze maken louter deel uit van de commensale flora van dieren, en vormen geen gevaar voor hun gastheer. Ongeveer 17 genera van de Enterobacteriaceae behoren tot deze klasse. 2. Opportunistisch pathogene kiemen. In normale omstandigheden behoren deze tot de commensale flora. Onder specifiek gewijzigde condities van de omgeving worden deze kiemen echter pathogeen. Zo wordt bijvoorbeeld de commensale darmbewoner E. coli pathogeen indien hij in het urinair stelsel terecht komt en een urineweginfectie veroorzaakt. De genera die behoren tot deze klasse zijn: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Serratia, Edwardsiella, Citrobacer, Morganella en Shigella. 3. Pathogene kiemen. De aanwezigheid van deze kiemen staat gelijk aan ziekteverschijnselen. Onder andere Salmonella spp., E. coli, en Yersinia species behoren tot deze groep. De E. coli bacteriën die tot deze groep behoren bevatten virulentiefactoren. Dit onderscheidt hen van de opportunistisch pathogene E. coli. 6

14 3. β-lactam ANTIBIOTICA 3.1. ANTIMICROBIËLE WERKING β-lactam antibiotica bezitten een bactericiede eigenschap omdat ze interfereren met de vorming van peptidoglycaan door binding aan PBP s. Deze antibiotica binden met hun β-lactamring, een cyclisch amide dat bestaat uit 3 koolstofatomen en 1 stikstofatoom (Figuur 3) aan PBP s. Elk β-lactam antibioticum bezit een variabele moleculaire structuur, opgebouwd rond deze ring (Haesebrouck, 2009; Prescott J.F., 2000a; De Backer, 2010). De β-lactamring zal binden ter hoogte van de PBPbindingsplaats waardoor deze eiwitten hun functie in de peptidoglycaansynthese niet meer kunnen vervullen. Hierdoor wordt de bacterie beschadigd en zal de osmotische druk in de bacterie verstoord worden. De bacterie verliest zijn bescherming in het hypotoon milieu, zal water opnemen, zwellen en uiteindelijk barsten (Haesebrouck, 2009; De Backer, 2010, Quinn et al., 1994; Prescott J.F., 2000a). Figuur 3. Voorstelling van een β-lactamring. (Naar Prescott J.F., 2000a) 3.2. CLASSIFICATIE Sinds de ontdekking van het eerste β-lactam, penicilline, door Alexander Fleming zijn er binnen deze antibioticumklasse verschillende β-lactam antibiotica beschreven. Penicilline bleek reeds vlug beperkingen te hebben zoals inactivatie door maagzuur en verminderde klinische efficaciteit. Verder onderzoek leidde tot ontdekking van aminopenicillines, welke bestaan uit een thiazolidinering gekoppeld aan een β-lactamring met twee amino groepen (R-NH-) (Prescott, 2000a). Later werden de cephalosporines ontwikkeld welke met hun dihydrothiazinering een nog sterkere antimicrobiële activiteit vertoonden dan de penicillines (Prescott, 2000b; De Backer, 2010). De meest recent ontwikkelde β-lactam antibiotica zijn de carbapenems, oxacephems, penems en monobactams (Prescott, 2000c). 7

15 Penicillines De penicillines zijn de oudste, en klinisch minst effectieve antibiotica binnen de β-lactam antibiotica. Ze zijn opgebouwd uit een centrale 6-Aminopenicillinezuur structuur (Figuur 4), waarbij de aanwezigheid van het zuurradicaal de instabiliteit van het antibioticum bepaalt. Er kan een onderverdeling gemaakt worden in 6 verschillende subgroepen/generaties op basis van hun chronologische introductie in het klinisch gebruik (Prescott, 2000a; De Backer, 2010). 1. Long-acting benzyl penicillinen voor parenteraal gebruik. - Vb: Penicilline-G 2. Benzyl penicillinen voor oraal gebruik. - Vb: Fenoxymethylpenicilline, Feniticilline 3. Isoxazolyl penicillines, werkzaam tegen penicillinase producerende Staphylococcen. - Vb: Flucloxacilline 4. Breed-spectrum penicillines - Vb: Amoxycilline 5. Antipseudomonas penicillines - Vb: Ticarcilline, Piperacilline 6. β-lactamase resistente penicillines - Vb: Cloxacilline 8

16 β-lactamring Zijketen Naam Benzyl penicilline, Penicilline G Phenoxymethyl penicilline, Penicilline V Oxacilline Carbenicilline Methicilline Ampicilline Amoxycilline Figuur 4. Voorstelling van een 6-Aminopenicillinezuur ring (A) en variabele zijketen (B). (Uit Prescott, 2000b) 9

17 Cephalosporines en Cephamycines Deze groep van antibiotica is opgebouwd uit een β-lactamring gekoppeld aan een 6-delige dihydrothiazinering (Figuur 5). Verder bevat deze nucleus 2 variabele zijketens, wat de variabiliteit binnen de groep zeer groot maakt. Een eerste zijketen bevindt zich op positie 7 (R1), en staat voornamelijk in voor de stabiliteit tegen bacteriële β-lactamase enzymen (Prescott, 2000b; De Backer, 2010). Op positie 3 (R2) bevindt zich de tweede zijketen, welke voornamelijk de metabole stabiliteit en farmacokinetische eigenschappen van het antibioticum bepaalt. Door de expansie van de cefalosporines werd een classificatiesysteem geïntroduceerd (Williams, 1987). Dit deelt de Cephalosporines op in 4 generaties. 1. Eerste generatie. - Voornamelijk Gram-positief spectrum - Voorbeelden : Cephacetrile, Cephapirine, Cephaloridine, Cefazoline, Cephadine, Cephalothin, Cefadroxil, Cephradine, Cephalexine, Cephaloglycin. 2. Tweede generatie. - Zowel Gram-positief als Gram-negatief spectrum. - Voorbeelden: Cefaclor, Cefoxitine, Cefotetan, Cefuroxime, Cefamandole. 3. Derde generatie. - Zowel Gram-positief als Gram-negatief spectrum. - Voorbeelden: Cefmenoxime, Cefotaxime, Ceftazidime, Ceftizoxime, Ceftriaxone, Ceftiofur, Latamoxef, Cefetamet, Cefiximine. 4. Vierde generatie. - Zowel Gram-positief als Gram-negatief spectrum. - Voorbeelden: Cefoperazone, Cefsulodine, Cefquinome. Figuur 5. Voorstelling van de Cephalosporine nucleus. R1 (positie 7, aangeduid met zwarte pijl) en R2 (positie 3, aangeduid met grijze pijl) stellen de variabele zijketens voor. (Naar Prescott, 2000b) Cephamycines zijn een klasse van β-lactamantibiotica die sterk gelijken op de cephalosporines. Hun antimicrobiële werking strekt zich echter voornamelijk uit over anaerobe bacteriën, en is in dit opzicht minder van belang binnen deze studie. 10

18 Overige Andere antibiotica die behoren tot de klasse van de β-lactams zijn: β-lactamase-inhibitoren, carbapenamasen en monobactams. De β-lactamase-inhibitoren werden, zoals de naam zegt, ontwikkeld om de werking van bacteriële β-lactamase enzymen te inhiberen. De twee meest gebruikte inhibitoren zijn clavulaanzuur en sulbactam, waarvan de moleculaire structuur wordt weergegeven in figuur 6. Deze antibiotica worden meestal gebruikt in combinatie met andere β-lactam antibiotica, zoals aminopenicillines (Prescott, 2000c). A. B. Figuur 6. Voorstelling van de moleculaire structuur van Clavulaanzuur (A) en Sulbactam (B). (Naar Prescott J.C., 2000c) Carbapenems (Figuur 7) zijn de meest recente β-lactam antibiotica. Ze gelijken sterk op de penicillines, maar door de substitutie van de zwavelgroep (aanwezig in penicilline-structuur) door een koolstofgroep werd er een stabielere structuur bekomen. De meest gekende carbapenem-antibiotica zijn imipenem, meropenem en errtapenem (Prescott, 2000c; De Backer, 2010). Figuur 7. Voorstelling van de moleculaire structuur van een Carbapenem. (Naar Prescott J.C., 2000c) Ook monobactams (Figuur 8) zijn een recent ontwikkelde subklasse van β-lactam antibiotica. Hun opbouw bestaat uit een eenvoudige β-lactamring, zonder thiazolidine ring. Het meest gebruikte monobactam is Aztreonam (Prescott, 2000c; De Backer, 2010). Figuur 8. Voorstelling van de moleculaire structuur van een monobactam. (Naar Prescott, 2000c) 11

19 3.3. β-lactam RESISTENTIEMECHANISMEN Drie verschillende β-lactam resistentiemechanismen werden reeds beschreven bij bacteriën. Een eerste mechanisme dat voornamelijk bij Gram-negatieve bacteriën voorkomt, is een wijziging in de celwandpermeabiliteit te wijten aan een veranderde expressie van porines, of verhoogde actieve efflux. Dit zal ervoor zorgen dat het antibioticum een onvoldoende hoge concentratie bereikt ter hoogte van de PBP s in de periplasmatische ruimte (Figuur 9.1). Een tweede resistentiemechanisme treedt op ter hoogte van de PBP s zelf. Indien er mutaties ontstaan in de genen die coderen voor PBP s ontstaan er proteïnen met een gewijzigde bindingsplaats. Hierdoor zullen de antibiotica moeilijk of niet meer kunnen binden. Dit resistentiemechanisme werd beschreven bij Gram-positieve bacteriën. Een laatste resistentiemechanisme en het meest voorkomende en belangrijkste mechanisme bij Enterobactericeae is de afbraak van het antibioticum, door de productie van bacteriële enzymen: de β- lactamasen (Figuur 9.2). In figuur 9.2 wordt in de uitvergroting voorgesteld hoe deze enzymen het antibioticum inactiveren door de β-lactamring open te breken (Batchelor et al., 2005; Poole, 2004; Massova en Mobashery, 1998; Shah et al., 2004) β-lactam β-lactamase PBP β-lactamase Penicilline Penicillinezuur Figuur 9. Samenvatting van het effect van β-lactam antibiotica tegen Gram-negatieve bacteriën en de resistentieontwikkeling. 1. Gewijzigde celwand constitutie waardoor het β-lactam antibioticum de periplasmatische ruimte niet kan bereiken (resistente bacterie). 2. Penetratie van het β-lactam antibioticum tot periplasmatische ruimte, met aanwezigheid van β-lactamase dat instaat voor de afbraak van het beta-lactam antibioticum (resistente bacterie). De werking van een β-lactamase door het openknippen van de β-lactamring wordt voorgesteld in de uitvergroting. 3. Penetratie van het β-lactam antibioticum tot periplasmatische ruimte, afwezigheid β- lactamase in periplasmatische ruimte. Het antibioticum bindt op de PBPs. (Naar Prescot, 2000a en Smet, 2010) 12

20 4. β-lactamasen Er bestaat een enorme diversiteit aan β-lactamasen. Zo zijn er reeds meer dan 1000 β-lactamasen gekend, en nieuwe β-lactamasen blijven opduiken (Jacoby, 1991; Bradford, 2001; Gupta, 2007; Walsh, 2008; Jacoby, 2009). Genen die coderen voor deze enzymen worden β-lactamase resistentiegenen of bla genen genoemd en kunnen gelegen zijn op het chromosoom of een plasmide. Beta-lactamasen kunnen opgedeeld worden in 2 groepen: beperkt-spectrum β-lactamasen en breedspectrum β-lactamasen (extended-spectrum β-lactamasen (ESBL), ampc β-lactamasen (AmpC), carbapenemasen en metallo β-lactamasen (MBL)). Op basis van de primaire genetische structuur kunnen de β-lactamasen onderverdeeld worden in 4 verschillende klassen: Klasse A: beperkt-spectrum β-lactamasen en ESBLs Klasse B: metallo-β-lactamasen Klasse C: AmpC β-lactamasen Klasse D: OXA β-lactamasen (beperkt-spectrum β-lactamasen, ESBLs en carbapenemasen) Beperkt-spectrum β-lactamasen zijn enkel in staat penicillines te hydrolyseren. ESBLs veroorzaken resistentie tegenover penicillines, cefalosporines en monobactams maar bacteriën die ESBLs produceren blijven gevoelig aan cefamycines, β-lactamase inhibitoren en carbapenems. AmpC β- lactamasen (chromosomaal of op een plasmide gelegen) vertonen net zoals de ESBLs resistentie tegen penicillines, cefalosporines en monobactams maar zijn daarnaast ook resistent tegen cefamycines en resistent of verminderd gevoeligheid tegen β-lactamase inhibitoren. AmpC β- lactamasen geven geen resistentie tegenover carbapenems. Carbapenemasen zijn in staat om carbapenems te hydrolyseren en soms ook andere β-lactams. MBLs zijn in staat alle β-lactams te hydrolyseren met uitzondering van monobactams. 13

21 4.1. EXTENDED-SPECTRUM BETA-LACTAMASE (ESBL) TEM Een eerste familie van ESBLs zijn de TEM β-lactamasen. De genen bla TEM-1 en bla TEM-2, die coderen voor TEM-1 en TEM-2 respectievelijk, liggen aan de oorsprong van deze groep. Genen die coderen voor andere TEM β-lactamasen zijn ontstaan door puntmutaties in bla TEM-1 of bla TEM-2 (Datta en Kontomichalou, 1965). Niet alle TEM enzymen zijn ESBLs. Zo zijn TEM-1, TEM-2 en TEM-13 beperktspectrum β-lactamasen. Een andere klasse van TEM β-lactamasen zijn de Inhibitor Resistant TEM s (IRT s). Zij danken hun naam aan de ongevoeligheid voor β-lactamase inhibitoren. Ook dit zijn geen ESBL s aangezien ze geen resistentie vertonen tegen cefalosporines (Chaibi et al., 1999) SHV De sulfydryl variable enzymen (SHV-enzymen) zijn een tweede belangrijke ESBL familie. Ook deze groep omvat echter enzymen die geen ESBL zijn. Zo is het eerst ontdekte SHV-1 enzyme namelijk enkel in staat penicillines te hydrolyseren. Het SHV-2 enzyme bleek vervolgens wel in staat cefotaxime en in mindere mate ceftazidime te hydrolyseren. Genen die coderen voor andere SHV β- lactamasen zijn ontstaan uit puntmutaties van bla SHV-1 of bla SHV-2 (Paterson en Bonomo, 2005; Gupta, 2007) CTX-M Een derde ESBL familie is de CTX-M groep, met specifieke cefoxitime hydrolyserende eigenschappen. Deze groep is op basis van de CTX-M aminozuursequentie opgedeeld in 5 clusters: CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 en CTX-M-25 (Paterson en Bonomo, 2005; Gupta, 2007) OXA De meeste OXA (hydrolytische activiteit tegen oxacilline) enzymen, met uitzondering van OXA-10, OXA-13 en OXA-19, zijn niet in staat cefalosporines te hydrolyseren en worden bijgevolg ook niet gezien als ESBLs. Andere OXA enzymen, zoals OXA-23 en OXA-58, zijn niet alleen in staat om cefalosporines te hydrolyseren maar ook andere beta-lactams zoals de carbapenems. Deze enzymen hebben een bredere hydrolytische activiteit dan ESBLs en behoren tot de carbapenemasen Overige Verder behoren ook de BES, GES, IBC, PER en SFO β-lactamasen tot de ESBL familie. Deze enzymen komen minder frequent voor en zullen niet verder worden besproken. 14

22 4.2. AMPC BETA-LACTAMASE (AmpC) Chromosomaal AmpC Chromosomale AmpC β-lactamasen worden geproduceerd door Enterobacteriaceae zoals Citrobacter spp., Serratia spp. en Enterobacter spp. Typisch aan deze enzymen is dat hun genexpressie geinduceerd kan worden (Jacoby, 2009). Het chromosomaal AmpC enzyme van E. coli verschilt van chromosomale AmpC β-lactamasen van andere bacteriën. De expressie is namelijk niet induceerbaar maar constitutief en is afhankelijk van de sterkte van de ampc promoter. Mutaties in de promoter en attenuator regio zorgt voor overexpressie van het ampc gen. Gekende mutaties die leiden tot een overexpressie zijn deze op locatie 32 en 42 (Jaurin et al, 1982; Caroff et al., 1999; Caroff et al., 2000; Forward et al., 2001; Corvec et al., 2003; Peter-Getzlaff et al., 2011). Verder speelt eveneens het aantal nucleotiden tussen 35 en 10 een rol in de expressie van het chromosomale ampc gen (Shaheer et al., 2011) Plasmide AmpC Enterobacteriaceae die geen chromosomale ampc-genen bezitten kunnen wel een ampc gen bezitten op een plasmide. Dit is voornamelijk beschreven voor Klebsiella species, maar ook bij E. coli. De meeste plasmide-gemedieerde AmpC β-lactamasen worden opgedeeld naargelang de resistentie die ze veroorzaken. Voorbeelden zijn de cephamycines (CMY β-lactamasen), cefoxitines (FOX β- lactamasen), moxalactams (MOX β-lactamasen) en latamoxef (LAT β-lactamasen). Enkele AmpC s werden opgedeeld naargelang het type enzyme (ACC β-lactamasen voor Ambler class C) en naargelang de ontdekkingsplaats (MIR β-lactamasen voor Miriam Hospital in Providence) (Pérez- Pérez en Hanson, 2002; Philippon et al., 2002) METALLO BETA-LACTAMASE (MBL) Deze β-lactamasen komen voornamelijk voor bij Pseudomonas en Acinetobacter species. Ze werden ook reeds beschreven bij Enterobacteriaceae van humane oorsprong. Enkele voorbeelden zijn VIM en KPC β-lactamasen (Jacoby, 2006; Walsh 2008). Tot op heden werden MBL-producerende E. coli enkel bij het varken (Fisher et al., 2012) beschreven en nog niet bij andere diersoorten. 15

23 5. MOBILITEIT VAN RESISTENTIEGENEN De bla genen kunnen doorgegeven worden naar andere bacteriën met behulp van mobiele genetische elementen. Voorbeelden hiervan zijn conjugatieve transposons, plasmiden, insertiesequenties (ISs) en faag-gerelateerde elementen. Een bla gen dat geassocieerd is met een insertiesequentie kan zich enkel verplaatsen binnen een bacteriële cel van een plasmide naar een ander plasmide of het chromosoom of van het chromosoom naar een plasmide. Genen die gelegen zijn op een conjugatief plasmide of transposon kunnen overgedragen worden tussen twee bacteriën. 16

24 6. VOORKOMEN VAN BREED-SPECTRUM β-lactamase PRODUCERENDE ENTEROBACTERIACEAE 6.1. BIJ GEZELSCHAPSDIEREN Zowel bij de mens als bij dieren, zijn cefalosporines belangrijke antibiotica in de behandeling van infecties veroorzaakt door Gram-negatieve kiemen. Ze worden zowel in de eerste lijn als in de tweede lijn frequent ingezet. Het toenemend gebruik van β-lactam antibiotica leidt tot resistentieontwikkeling. Hieronder wordt een overzicht gegeven van het voorkomen van breed-spectrum β-lactamaseproducerende Enterobacteriaceae bij gezelschapsdieren. De focus ligt hierbij voornamelijk op isolaten afkomstig van honden en katten. De eerste ontdekking van een β-lactamase producerende E. coli bij gezelschapsdieren werd teruggevonden in een faecesstaal van een laboratoriumhond (Matsumoto et al., 1988). Later werden in Portugal bla ESBL (4,2%) en bla AmpC (19,4%) genen beschreven bij E. coli isolaten afkomstig van zieke honden (Feria et al. (2002)). Een andere Portugese studie detecteerde in 10,4% van de E. coli isolaten afkomstig van gezonde honden bla TEM-52 (in 75% van de positieve isolaten) en bla CTX-M1 (in 25% van de positieve isolaten) (Costa et al., 2004). In een studie van Carattoli et al. (2004) werd in Italië gedurende 3 jaar onderzoek gevoerd naar het voorkomen van breed-spectrum β-lactamasen in E. coli afkomstig van zowel zieke als gezonde honden en katten. In totaal werden 21 breed-spectrum β-lactam resistente E. coli geïsoleerd (4 afkomstig van gezonde honden, 3 van zieke katten en 14 van zieke honden). Het meest voorkomende bla gen dat in deze studie werd teruggevonden was bla CTX-M1. Dit gen werd aangetroffen bij 7,5% van de breed-spectrum β-lactam resistente isolaten afkomstig van gezonde honden, bij 52% van de breed-spectrum β-lactam resistente isolaten afkomstig van zieke honden en bij 10,5% van de de breed-spectrum β-lactam resistente isolaten afkomstig van zieke katten. Ook bla TEM-1 werd frequent waargenomen, vaak in combinatie met bla CTX-M1. Een tweede ESBL-gen dat gedetecteerd werd, was het bla SHV-12 gen. Dit gen werd enkel teruggevonden bij 20% van de isolaten afkomstig van zieke honden. Van de ampc genen werd enkel bla CMY-2 teruggevonden in 5% van de breed-spectrum β-lactam resistente isolaten afkomstig van zowel gezonde als zieke honden. Moreno et al. (2008) vond in Chili CTX-M-1, CTX-M-14 en PER-2-producerende E. coli isolaten in faecale stalen afkomstig van gezonde honden en katten. In Portugal werden dan weer bla CMY-2 en bla CTX-M-15 genen teruggevonden uit E. coli isolaten afkomstig van zieke honden (Pomba et al. (2008)). In Zuid-China onderzochten Sun et al. (2010) 240 E. coli isolaten afkomstig van gezonde en zieke huisdieren, waarvan 40,4% positief bleek voor ESBL-productie. Hierbij werden voornamelijk CTX-M- 14 (n=45) en CTX-M-55 (n=24) gedetecteerd. Verder werden er eveneens CTX-M-27, -15, -64, -65, -24, -3, -9 β-lactamasen aangetoond. 17

25 In de Verenigde Staten werd onderzoek gedaan naar het voorkomen van breed-spectrum β- lactamase-producerende E. coli van honden en katten met urineweginfecties (O Keefe et al., 2010). Hierbij bleek 18,33% van de E. coli isolaten een ESBL (CTX-M-15 (81,8%), CTX-M-14 (9,1%) en SHV-12 (9,1%)) te produceren. Ook de studie van Shaheen et al. (2011) onderzocht het voorkomen van breedspectrum β-lactamase producerende E. coli in honden met een urineweginfectie in de Verenigde Staten. Van de honden werden er 944 E. coli kiemen geïsoleerd, waarvan 3% positief bleek voor ESBL-productie. Volgende bla genen werden teruggevonden (percentage van de resistente E. coli waarbij het gen werd teruggevonden): bla TEM (74%), ba SHV (17%), bla CTX-M1-groep (100%), bla CMY (89%) en bla OXA-10 (30%). Binnen de bla CTX-M1 groep werden volgende genen teruggevonden: bla CTX-M-15 (aanwezig in 78% van alle resistente isolaten), bla CTX-14 (bij 20% van alle resistente isolaten) en bla CTX-M-24.(bij 42% van alle resistente isolaten). De genen die codeerden voor TEM β-lactamasen bleken bla TEM-1 (n=33), bla TEM-33 (n=3), bla TEM-30 (n=1) te zijn. Bovendien werd er in 3 isolaten een nieuw bla TEM-181 gen teruggevonden. Verder werd er in 78% van de positieve isolaten een mutatie teruggevonden in de promotorregio van het chromosomaal ampc gen. Ewers et al. (2010) bestudeerden het voorkomen van het bla CTX-M-15 in stalen van zieke gezelschapsdieren en paarden. CTX-M-15 is een veel voorkomend β-lactamase geproduceerd door multiresistente kiemen in de humane geneeskunde. Het voorkomen van dit enzyme wordt gelinkt aan de multilocus sequentietype O25:H4-ST131, dat gepaard gaat met ciprofloxacine resistentie. Van de 177 stalen bleken er tien een ESBL resistentieprofiel te vertonen (9 honden- en 1 paardenstaal). Hiervan waren 9 stalen in het bezit van een bla CTX-M-15 en 1 in het bezit van een bla SHV-12. De bla CTX-M-15 genen waren gelinkt aan een multilocussequentie type (B2-025b:H4-ST131) die voor >85% overeenstemt met CTX-M-15-producerende bacteriën die reeds werden gedetecteerd bij mensen. Ook in Nederland (Dierikx et al., 2010) gebeurde reeds een grootschalig onderzoek naar het voorkomen van breed-spectrum β-lactamase genen in Enterobacteriaceae afkomstig van zieke huisdieren (hond, kat, paard, schildpad). Hierbij werden verschillende genen geidentificeerd: bla CTX-M-1, -2, -9, -14, -15, bla TEM-52, bla CMY-2, bla CMY-39. Het bla CTX-M-1 kwam hierbij het frequentst voor (26,56% van de isolaten). Recent werd er een studie gedaan naar breed-spectrum β-lactamase producerende Enterobacteriaceae in derde wereld landen (Albrechtova et al., 2012). Hiervoor werden faecesstalen van honden katten en hun eigenaren uitgeplaat op MacConkey Agar gesupplementeerd met 2mg/l cefotaxime. Een prevalentie van 22%, 4% en 17% van breed-spectrum β-lactamase producerende Enterobacteriaceae werd teruggevonden bij honden, katten en mensen, respectievelijk. Verder onderzoek toonde aan dat alle positieve isolaten bla CTX-M-15 en bla OXA-1-like genen bevatten. Dit onderzoek toonde aan dat zelfs in gebieden waar cephalosporinegebruik uitermate beperkt is, er eveneens resistentieontwikkeling kan plaats vinden. In een studie in Tunesië werd onlangs een prevalentie van 17,5% β-lactamase producerende Enterobacteriaceae teruggevonden in faecesstalen afkomstig van gezonde honden en katten (Sallem et al., 2013). Hierbij werden voornamelijk bla CTX-M-1 genen aangetoond. Daarnaast werden eveneens bla TEM-1b, bla TEM-1c, bla TEM-135, bla CMY-2 teruggevonden. 18

26 6.2. BIJ DE MENS Het voorkomen van breed-spectrum β-lactamase productie bij Enterobacteriaceae bij de mens wordt sinds 1980 onderzocht. Een grote diversiteit aan β-lactamasen werd reeds aangetoond. Zo beschreven enkele studies bij gezonde mensen het voorkomen van diverse CTX-M-, TEM-, CMY- en SHV-producerende bacteriën in de faecale flora. De meeste studies bestudeerden echter het voorkomen van β-lactam resistentie bij pathogene Enterobacteriaceae. Ook hierbij werd een grote diversiteit aan β-lactamasen teruggevonden. Uit deze studies bleken bla CTX-M-15 en bla CMY-2 de meest voorkomende bla genen te zijn (Smet et al., 2010; Ewers et al., 2012). 19

27 ONDERZOEK 1. OBJECTIEVEN Dit onderzoek werd uitgevoerd om het voorkomen van commensaal breed-spectrum β-lactamaseproducerende Enterobacteriaceae in de darmflora van hond en kat in kaart te brengen. Faecaal materiaal van honden en katten werd hiervoor verzameld. Verschillende groepen (honden en katten van particuliere eigenaars, asielhonden, asielkatten en proefhonden) werden bemonsterd. Na bemonstering werden de stalen uitgeplaat op een selectief groeimedium gesupplementeerd met een breed-spectrum β-lactam antibioticum voor isolatie van breed-spectrum β-lactamase-producerende Enterobacteriaceae. Vervolgens werd er per positief staal en op basis van koloniemorfologie 1 of meerdere kolonies geselecteerd. De isolaten werden tot op speciesniveau geïdentificeerd. Hun antimicrobieel resistentieprofiel werd bepaald en de aanwezige β-lactamase resistentiegenen werden gekarakteriseerd. 20

28 2. MATERIAAL EN METHODEN 2.1. STALEN Populatie De stalen, die voor deze studie verzameld werden, waren faecale swabs van honden en katten. In totaal werden 230 dieren bemonsterd, waarvan 72 katten en 158 honden. Het overgrote merendeel van deze dieren (n=182) werd bemonsterd tijdens een consult in een eerstelijns dierenartsenpraktijk of bij eigenaars thuis (waarvan 62 katten en 120 honden). Verder waren 30 van deze dieren proefhonden, en slechts enkelen waren afkomstig uit een dierenasiel (n=18) (Figuur 10). 4% HOND 1e lijn dierenartsenpraktijk en particulieren 27% HOND Proefdier 52% HOND Asiel 4% KAT 1e lijn dierenartsenpraktijk en particulieren 13% KAT Asiel Figuur 10. Voorstelling van de bemonsterde populatie dieren. Blauw: De meerderheid van de stalen zijn afkomstig van honden (69%). Hiervan is 52% afkomstig van particulieren thuis of uit de eerstelijns dierenartsenpraktijk. 13% van de honden zijn proefhonden, en 3% is afkomstig uit een dierenasiel. Oranje: 31% van de stalen zijn afkomstig van katten. Hiervan zijn 27% afkomstig uit de eerstelijns dierenartsenpraktijk of van particulieren thuis. 4% is afkomstig van katten uit een dierenasiel Staalname Voor de staalname werd gebruik gemaakt van steriele swabs (MEUS S.R.L., Via L. Da Vinci 24/b, Piove di Sacco, ITALY). Deze werden rectaal ingebracht ter verzameling van vers faecaal materiaal. Enkel vers faecesmateriaal, wat nog in het darmkanaal aanwezig is, is representatief voor de bacteriën aanwezig in het dier. Als de uitwerpselen het dier hebben verlaten treedt er namelijk meteen contaminatie op vanuit de omgeving. Eens bemonsterd werd de swab overgebracht in een bijgeleverd steriel opslagcompartiment, waar het werd ingebed in een voedingsbodem. Dit gaat afsterven van de aanwezige kiemen tegen, en maakt langdurige opslag mogelijk. De stalen werden bij een temperatuur van 4 C bewaard tot het moment van uitplaten. 21

29 2.2. BEREIDING VAN SELECTIEVE VOEDINGSBODEM: Voor de bereiding van de voedingsbodem werd gebruik gemaakt van MacCONKEY AGAR (No.3) (OXOID LTD, Wade road, Basingstoke, Hampshire, RG24 8PW, UNITED KINGDOM). Hiervan werd 41,2 gram poeder opgelost in 800 ml gedestileerd water. Na oplossing van het poeder werd het mengsel in de microgolfoven aan het koken gebracht totdat de oplossing een helder uitzicht had. Na autoclaveren werd de fles in een warmwaterbad van 56 C geplaatst. Eens de fles afgekoeld was tot deze temperatuur werd het antibioticum ceftiofur (Excenel 4g, PFIZER, Pleinlaan 17, 1050 Elsene, BELGIE (derde-generatie cefalosporine)) toegevoegd. Hiervoor werd eerst een ceftiofur stockoplossing bereid (1mg/ml). Uit deze stockoplossing werd 3,2 ml toegevoegd aan de 800 ml vloeibare agar om een concentratie van 4 µg/ml ceftiofur te bekomen. Door een licht roerende beweging werd een homogene verdeling van het antibioticum bekomen. Deze oplossing werd onder een afzuigkast uitgegoten in petrischaaltjes. Na afkoelen en stollen van de agar werden de petrischaaltjes in de frigo bewaard bij een temperatuur van 4 C tot op moment van het uitplaten van de stalen CULTIVATIE Aangezien deze studie de prevalentie van breed-spectrum β-lactam resistentie binnen de familie van de Enterobacteriaceae bestudeert werd er gekozen voor een MacConkey agar met 4 µg/ml ceftiofur. De MacConkey agar vormt een ideale voedingsbodem voor Enterobacteriaceae. De ceftiofur aanwezig in deze voedingsbodem zorgt ervoor dat enkel de kiemen die resistent zijn aan cefalosporines en dus een breed-spectrum β-lactam resistentieprofiel vertonen, uitgeselecteerd worden. De bij 4 C bewaarde stalen werden geënt op de MacConkey agarplaten gesupplementeerd met 4µg/ml ceftiofur. De swabs werden in 3 entrichtingen over de agarplaat uitgesmeerd. Vervolgens werden de agarplaten geïncubeerd bij 37 C en na 18 tot 24 uur incubatie geëvalueerd op bacteriële groei. MacConkey agar is namelijk een selectieve agar voor Gram-negatieve bacteriën. De agar is niet 100% selectief voor Enterobacteriaceae. Ook andere Gram-negatieve kiemen, zoals Pseudomonas spp., kunnen hierop groeien. 22

30 2.4. BACTERIËLE DIFFERENTIATIE Visueel Van de kolonies die op de MacConkey agar platen gesupplementeerd met 4µg/ml ceftiofur zijn gegroeid, werd er nagegaan tot welk bacterieel species ze behoorden. Een eerste vorm van differentiatie gebeurde visueel. De bacteriële groei van de meeste Enterobacteriaceae op MacConkey agar heeft namelijk een typisch uitzicht. De kolonies zijn meestal vrij groot (2-3mm), rond en hebben een glazige schijn. Escherichia, Klebsiella, Enterobacter en Citrobacter spp. vertonen op MacConkey agar een typisch mucoïde roos uitzicht. Andere genera zoals Salmonella, Proteus, Serratia, Yersinia en Pseudomonas vertonen een eerder bleke mucoïde koloniegroei. Deze kleurreactie is te wijten aan het al dan niet fermenteren van lactose. MacConkey agar bevat lactose als fermenteerbare suikersubstraat. De kiemen welke in staat zijn lactose te fermenteren zullen door de productie van metabole zuren zorgen voor een ph-daling. Dit zorgt ervoor dat de ph-indicator in de agar roze aankleurt. Bacteriën die niet in staat zijn lactose te fermenteren zullen gebruik maken van de stikstof aanwezig in de energiebron peptone. Dit leidt tot alkaliserende metabolieten die een bleekverkleuring van de ph-indicator tot gevolg hebben (Quinn et al., 2006). Op onderstaande figuur 11 is de groei van enkele bacteriële species op MacConkey agar weergegeven. Figuur 11. Groei van enkele Enterobacteriaceae species op MacConkey agar. (Quinn et al., 2006) Op basis van koloniemorfologie werden er per positief staal 1 of meerdere kolonies geselecteerd en gepurifieerd die daarna biochemisch geïdentificeerd werden. Elk bekomen isolaat werd ook bewaard bij -70 C in een medium bestaande uit 7.5 g glucose, 25 ml Brain Heart Infusion broth en 75 ml steriel geïnactiveerd foetaal kalfserum. 23

31 Biochemische testen Tijdens hun groei zullen verschillende bacteriële species preferentieel bepaalde voedingsstoffen verbruiken. Hierbij zetten de kiemen het substraat om naar bepaalde afvalstoffen. Biochemische testen zijn gebaseerd op het detecteren van deze stoffen. De testen bestaan uit buisjes, gevuld met een voedingssubstraat en een kleurindicator. De bacterie wordt geënt in het buisje en zal zorgen voor een specifieke kleurreactie door het al dan niet vormen van bepaalde afvalproducten. Hieronder wordt elke gebruikte test afzonderlijk toegelicht Kligler test De Kligler test bestaat uit een buisje gevuld met agar. Deze bevat twee carbohydraten (suikers), glucose 0,1% en lactose 1,0%, en de chemische indicator fenolrood, welke de productie van waterstofsulfide aantoont door middel van kleuromslag (Quinn et al., 2006). Initieel bezit het Kligermedium een rode kleur. Deze blijft behouden indien er geen verdere bacteriële groei optreedt, of wanneer de bacteriële groei gepaard gaat met alkalische nevenproducten (ph > 7,3). Wanneer de bacteriële groei door fermentatie van de suikers het medium aanzuurt (ph < 6,8) zal er een geelverkleuring optreden (Figuur 12). Voor de bacteriespecies die van belang waren binnen deze studie wordt in tabel 2 een overzicht gegeven van de verschillende kleurreacties Motility indol ornithine (MIO) test De MIO test bevat een paars medium, wat na incubatie de aanwezigheid van ornithine na bacteriële groei aantoont. Indien de kiem positief blijkt voor ornithine zal de agar volledig paars aankleuren (figuur 12). Negatieve bacteriegroei wordt duidelijk door geelverkleuring (tgv decarboxylatie van ornithine). Door toevoeging van enkele druppels Kovac s reagens (geel reagens) kan de Indoltest uitgevoerd worden. Positieve resultaten tonen een roodverkleuring van het reagens (Quinn et al., 2006). In tabel 2 wordt een overzicht gegeven van de verschillende kleurreacties die werden waargenomen bij de bacteriespecies binnen deze studie. Een laatste eigenschap die wordt nagegaan met behulp van deze test is de beweeglijkheid van de geïnoculeerde kiem. Indien het gaat om een beweeglijke kiem zal er een brede uitgroei zijn doorheen het medium, waardoor er troebeling is. Nietbeweeglijke kiemen tonen een helder medium Esculine hydrolyse test De Esculine hydrolyse test bevat een geel-beige agar welke opgebouwd is uit esculine en galzuren. Enterobacteriaceae zijn in staat esculine te hydroliseren. Het nevenproduct dat hierbij ontstaat interageert met ijzercitraat, de kleurindicator aanwezig in het medium (Quinn et al., 2006). Hierdoor ontstaat een donkerbruine tot zwartverkleuring van het medium, zoals zichtbaar in figuur 12. In tabel 2 wordt een overzicht gegeven van de kleurreacties die worden waargenomen bij de species die van belang waren in dit onderzoek. 24

32 Tabel 2. Overzicht van de biochemische testen met de verschillende kleurreacties per species. Bacterie Kligler Motility Indol Ornithine Esculine galzuur hydrolyse E. coli Geel Afwisselend, Indol positief (rood) Beige Pseudomonas spp. Rood Paars Beige Klebsiella spp. Geel Afwisselend Indol positief: K. pneumoniae Indol negatief: K. oxytoca Zwart Onbekende Geel + rode tong Afwisselend Beige of zwart Enterobacteriaceae Indol afwisselend Figuur 12. Weergave van de verschillende kleurreacties per biochemische test. (Naar Himedialabs, 2013a; Himedialabs, 2013b; Himedialabs, 2013c) S rrna-pcr Indien na biochemische identificatie het bacterieel species nog niet kon worden geïdentificeerd werd er gebruik gemaakt van de 16S rrna PCR. De 16S rrna-pcr is gebaseerd op het opsporen van het 16S ribosomaal RNA van de bacterie. De nucleotidesequentie van dit rrna gen bevat hypervariabele regio s. Deze verschillen bij elk bacterieel species in enkele nucleotiden wat toelaat om het species te identificeren. De uitvoering van de 16S rrna PCR wordt verder uitgelegd in

33 2.5. ANTIBIOGRAM Met behulp van de agar disk diffusie test of de Kirby Bauer methode werd van elk isolaat het resistentieprofiel tegen β-lactam antibiotica en andere antimicrobiële agentia bepaald. De resistenties tegenover β-lactam antibiotica zullen een eerste indicatie geven op de aanwezigheid van een ESBL of AmpC β-lactamase (Figuur 13). Het principe van de agar disk diffusie test berust op antibioticumdiffusie vanuit tabletten in een omgevend agarmedium. De bacterie wordt dus blootgesteld aan een continu gradiënt van antibioticumconcentraties, waarbij de concentratie vermindert naarmate de afstand tot het antibioticumreservoir toeneemt. Op deze manier kan een groei-inhibitiezone ontstaan rond het antibioticum. Na overnacht incubatie zullen de groeiremzones rond de antibioticatabletten bekeken worden. Naargelang de kiemen meer of minder gevoelig zijn, zullen er grote of minder grote groeiinhibitie zones te zien zijn of zal er helemaal geen inhibitie zijn. De diameter van de groei-inhibitiezone zal gemeten worden en met behulp van tabellen opgesteld door het Nationaal Comité voor Klinische laboratorium Standaarden (NCCLS) kan de antimicrobiële gevoeligheid van een bacterieel species aan een bepaald antibioticum bepaald worden. Daarenboven zal bij de ESBL-producerende bacteriën een specifiek patroon zichtbaar zijn op antibiogram. Het synergistisch effect dat werkzaam is tussen cefalosporines en amoxicilline-clavulaanzuur komt namelijk tot uiting als een extra opklaringszone tussen beide antibioticaschijfjes (Figuur 13). Figuur 13. Voorbeeld van een antibiogram met het typische ESBL fenotype. Synergie tussen cefalosporines en amoxicilline-clavulaanzuur zichtbaar als een extra opklaringszone tussen beide antibioticaschijfjes (aangeduid met rode pijlen). 26

34 In totaal werden 14 antibiotica (Neo-sensitabs, Rosco Diagnostics, Taasstrup, Denemarken), waaronder 5 bèta-lactam antibiotica getest. Met behulp van een swab werden een aantal kolonies gesuspendeerd in fysiologisch water (0,85% NaCl) tot er een McFarland bereikt werd van 0,5. Vervolgens werd er telkens over een hoek van 60 en in drievoud de suspensie uitgestrijkt over een Mueller-Hinton agarplaat (Oxoid). Met behulp van een dispenser werden de antibioticaschijfjes (Doxycycline 30μg, Imipenem 15μg, Amoxiclline-clavulaanzuur 30μg + 15μg, Ampicilline 33μg, Ceftiofur 30μg, Flumequine 30μg, Cefquinome 30μg, Sulfonamide 240μg, Nitrofurane 200μg, Trimetoprim 5μg, Enrofloxacine 10μg, Gentamicine 10μg, Neomycine 120μg, Amikacine 40μg) aangebracht. De Mueller-Hinton agarplaten werden onder aërobe omstandigheden overnacht geïncubeerd bij 37 C. Na overnacht incubatie werden de zone diameters van de geteste antibiotica afgelezen en met behulp van Tabel 3 werd de gevoeligheid van de kiem bepaald. Tabel 3. Overzicht van de gebruikte antibiotica, de antibioticum-klasse waartoe ze behoren en hun NCCLS referentiewaarden. Antibioticum Klasse Resistente remzone (mm) Intermediaire remzone (mm) Gevoelige remzone (mm) Doxycycline Tetracycline Imipenem Carbapenemase Amoxicilline- Penicilline- β-lactamase inhibitor clavulaanzuur Ampicilline Aminopenicilline Ceftiofur Cephalosprine (3 e generatie) Flumequine Fluoroquinolone (1 e generatie) Cefquinome Fluoroquinolone (4 e generatie) Sulfonamide Sulfonamide Nitrofurane Nitrofurane Trimethoprim Trimethoprim Enrofloxacine Fluoroquinolone (2 e generatie) Gentamicine Aminoglycoside Neomycine Aminoglycoside Amikacine Aminoglycoside

35 2.6. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Principe De polymerase kettingreactie, vaak afgekort tot PCR (van Polymerase Chain Reaction), is een manier om uit zeer kleine hoeveelheden DNA specifiek een of meer DNA fragmenten te vermenigvuldigen (amplificeren) tot er genoeg van is om te analyseren. De reactie bestaat uit 3 fasen: 1. Denaturatie: Gedurende deze fase wordt al het DNA dat als dimeer in de oplossing aanwezig is gesplitst door een verhoogde temperatuur: de dubbele helix valt uit elkaar. 2. Hybridisatie: Het grote, logge, voorbeeld-dna krijgt bij lage temperatuur even de tijd om met de snel mobiele primers in de oplossing te hybridiseren. Het krijgt niet genoeg de tijd om denaturatie ongedaan te maken. 3. Extensie: Het polymerase zet de gebonden primers bij hoge temperatuur om in het gewenste stuk DNA. Na de derde stap bevat de oplossing twee maal zoveel van het gewenste DNA als ervoor. Door de stappen een aantal maal te herhalen, krijgt men een exponentiële groei van de hoeveelheid gewenst DNA. Omdat het polymerase van 5 naar 3 kopieert, wordt dit stukje exponentieel gekopieerd, terwijl ander DNA al bij de derde cyclus niet meer gekopieerd wordt. Hierdoor zijn er na dertig cycli miljarden kopieën van de doelsequentie. Het DNA-polymerase van de bacterie Thermus aquaticus die onder andere in heetwaterbronnen en geisers leeft wordt gebruikt omwille van de thermostabiliteit. Tijdens de PCR-reactie worden namelijk verschillende temperaturen bereikt die polymerasen van gewone kiemen denatureren Detectie β-lactamase resistentiegenen (bla) en 16S rrna Voor het uitvoeren van PCR reacties zal er van elk isolaat genomisch DNA bereid worden. Hiervoor werd 1 kolonie per isolaat in 20 µl lysebuffer gebracht. Vervolgens werden de bacteriële cellen gelyseerd bij 95 C gedurende 5 minuten. Na verhitting werd er 180µl water aan de gelyseerde cellen toegevoegd. Tenslotte werd het celdebris verwijderd door centrifugatie (2 min, rpm). Het genomisch DNA dat in het supernatans aanwezig is, werd gestockeerd bij -20 C Identificatie breed-spectrum β-lactamase (bla) resistentiegenen PCR reacties werden uitgevoerd voor detectie van genen die coderen voor ESBLs (TEM, CTX-M en SHV) en AmpC s (CMY, DHA, FOX, MOX). De PCR-mix bestond uit 12,5 µl BioMix (BioMix, Bioline Reagents Ltd., 16 The Edge Business Centre, Humber Road, LONDON), 1,5 µl van elke primer (10 µm, Integrated DNA Technologies), 7,5 µl water en 2 µl genomisch DNA. Primers specifiek voor deze β-lactamasen zijn weergegeven in Tabel 4. De condities voor het uitvoeren van de verschillende PCRs wordt weergegeven in Tabel 5. Isolaten met een bla CTX-M-type gen werden verder geanalyseerd met primers om een onderscheid te maken tussen bla CTX-M-1, -2 en -9 groepen. Om hyperproductie van het chromosaal ampc gen van E. coli na te gaan werd het gen samen met de promotor en attenuator regio geamplificeerd. 28

36 Amplificatie 16S rrna gen Zoals hoger reeds werd aangehaald kan door middel van het 16S rrna nagegaan worden tot welk bacterieel species het isolaat behoort. De PCR-mix voor de 16S rrna-pcr bestond uit 15 µl BioMix (BioMix, Bioline Reagents Ltd., 16 The Edge Business Centre, Humber Road, LONDON NW2 6EW), 0,3 µl van elke primer (20 µm, Integrated DNA Technologies), 11,4 µl water en 3 µl genomisch DNA. Primers specifiek voor dit 16S rrna zijn αβnot en ωmb (Tabel 4). De condities voor het uitvoeren van de 16S rrna amplificatie staan weergegeven in tabel 5. 29

37 Tabel 4. Overzicht van de gebruikte primers ter detectie van β-lactamase resistentiegenen, mutaties in de promotorregio van het chromosomaal ampc gen van E. coli en het 16S rrna. Genklasse Primer Sequentie Lengte Referentie (bp) bla TEM OT3 5 ATG AGT ATT CAA CAT TTC CG Pérez-Pérez en Hanson, 2002 OT4 5 CCA ATG CTT AAT CAG TGA GG 3 bla CMY CF1 5 ATG ATG AAA AAA TCG TTA TGC Pérez-Pérez en Hanson, 2002 CF2 5 TTG CAG CTT TTC AAG AAT GCG C 3 bla SHV OS5 5 TTA TCT CCC TGT TAG CCA CC Pérez-Pérez en Hanson, 2002 OS6 5 GAT TTG CTG ATT TCG CTC GG 3 bla DHA DHAMF 5 AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG T Pérez-Pérez en Hanson, 2002 DHAMR 5 CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC 3 bla CITM CITMF 5 TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA Pérez-Pérez en Hanson, 2002 CITMR 5 TTT CTC CTG AAC GTG GCT GGC 3 bla CTX-M9- groep bla CTX-M1- groep bla CTX-M2- groep M9up 5 ATG GTG ACA AAG AGA GTG CA Eckert et al., 2004 M9low 5 CCC TTC GGC GAT GAT TCT C 3 M13up 5 GGT TAA AAA ATC ACT GCG TC Eckert et al., 2004 M13low 5 TTG GTG ACG ATT TTA GCC GC 3 M25up 5 ATG ATG ACT CAG AGC ATT CG 3 Eckert et al., M25low 5 TGG GTT ACG ATT TTC GCC GC 3 bla FOX FOXMF 5 AAC ATG GGG TAT CAG GGA GAT G Pérez-Pérez en Hanson, 2002 FOXMR 5 CAA AGC GCG TAA CCG GAT TGG 3 bla MOX MOXMF 5 GCT GCT CAA GGA GCA CAG GAT Pérez-Pérez en Hanson, 2002 MOXMR 5 CAC ATT GAC ATA GGT GTG GTG C 3 bla ACC ACCMF 5 AAC AGC CTC AGC AGC CGG TTA Pérez-Pérez en Hanson, 2002 ACCMR 5 TTC GCC GCA ATC ATC CCT AGC 3 bla EBC EBCMF 5 TCG GTA AAG CCG ATG TTG CGG Pérez-Pérez en Hanson, 2002 EBCMR 5 CTT CCA CTG CGG CTG CCA GTT 3 30

38 AmpCpromotor Primer Sequentie Lengte Referentie regio (bp) AmpC- AB1 5 GAT CGT TCT GCC GCT GTG Peter-Getzlaff et al., promotor- regio 2011; Corvec et al., 2002 ampc2 5 GGG CAG CAA ATG TGG AGC AA S rrna αβnot 5 AGT TTG ATC CTG GCT CAG Baele et al., 2001 ωmb 5 TAC CTT GTT ACG ACT TCG TCC 3 31

39 Tabel 5. Overzicht van de gebruikte PCR-programma s voor detectie van bla genen, 16S rrna en mutaties in de promotorregio van het chromosomaal ampc gen. bla TEM / bla CTX M-1, -2, -9 / bla CMY / ampc promotorregio bla SHV bla EBC-MIR bla ACC bla MOX, bla FOX bla DHA 16 S rrna Start Initiële activatie polymerase 5 bij 94 C 5 bij 94 C 5 bij 94 C 5 bij 94 C 5 bij 94 C 5 bij 94 C 5 bij 95 C Replicatie 1 Denaturatie 1 bij 94 C 1 bij 94 C 30 bij 94 C 30 bij 94 C 30 bij 94 C 30 bij 94 C 45 bij 95 C Anealing 1 bij 55 C 1 bij 56 C 30 bij 61 C 30 bij 60 C 30 bij 58 C 30 bij 59 C 2 bij 55 C Elongatie 1 bij 72 C 1 bij 72 C 1 bij 72 C 1 bij 72 C 1 bij 72 C 1 bij 72 C 1 bij 72 C Aantal cycli Replicatie 2 Denaturatie bij 95 C Anealing bij 55 C Elongatie bij 72 C Aantal cycli Finale extensie 10 bij 72 C 10 bij 72 C 7 bij 72 C 7 bij 72 C 7 bij 72 C 7 bij 72 C 7 bij 72 C Koeling bij 4 C bij 4 C bij 4 C bij 4 C bij 4 C bij 4 C bij 15 C 32

40 2.7. AGAROSE GEL ELECTROFORESE Om na te gaan of de bekomen PCR producten positief zijn voor het geteste bla gen, werd er gebruik gemaakt van agarose gel electroforese. De agaroseverbindingen in de gel vormen een microscopisch mazen-netwerk waar de PCR-producten onder electrische spanning door zullen migreren. De concentratie van agarose bepaalt de dichtheid van de gel, en dus de migratiesnelheid. De electrische stroom zorgt er voor dat alle DNA fragmenten naargelang hun basenpaarlengte gescheiden worden doorheen de gel. De minst zware DNA fragmenten zullen het verst migreren doorheen de gel. De visualisatie van het gemigreerde PCR product is mogelijk door toevoeging van een fluorescente merkerstof. Deze bindt aan het DNA, en visualiseert dit door oplichting onder UV-straling (Figuur 14). De gevisualiseerde DNA fragmenten worden in hun basenpaarlengte beoordeeld door vergelijking met een gestandaardiseerd basenpaarmengsel. Deze DNA-ladder wordt gebruikt bij elke electroforese om na te gaan wat de lengte is van het PCR product in de stalen. In Tabel 6 wordt schematisch weergegeven hoe de agarose gel electroforese werd uitgevoerd. Tabel 6. Stap Stappenplan ter uitvoering van agarose gel electroforese. Handeling 1. Bereiding van de agarose gel - 3 gr Agarosepoeder (Agarose MP multipurpose agarose, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, GERMANY) mengen in 200 ml 0,5X TBE-buffer - Opkoken in microgolfoven - Toevoegen 400 μl gelred - Uitgieten in gietvorm, voorzien van ladingsplaatsen voor de stalen - Stollen van de gel gedurende 20 min 2. Aanmaken van de stalen - Gebruik van 96 well-plaat als recipiënt - Als merker werd er 5 μl DNA-ladder (GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, Thermo Fisher Scientific Inc., 81 Wyman Street, Waltham, MA 02454)gebruikt - 5 μl van het PCR-reactiemengsel werd samengevoegd bij 3 μl ladingsbuffer 3. laden van de stalen op de agarosegel - 8 μl staal en 5 µl DNA ladder overbrengen in ladingsplaatsen van de agarose gel 4. Lopen van het electroforeseproces 5. Aflezen van het bekomen bandenpatroon volt gedurende 75 minuten - Onder UV-straling vergelijken van de geamplificeerde DNA fragmenten met de DNA-ladder ter bepaling van de grootte van het geamplificeerde PCR fragment 33

41 ANODE ( - ) L L L L KATHODE ( + ) Figuur 14. Voorbeeld van een agarose gel onder UV-belichting. In de eerste ladingsplaats van elke rij wordt 5 μl DNA-ladder aangebracht (aangeduid met letter L ). In de hierop volgende ladingsplaatsen werd 8 μl van het PCR-reactiemengsel geladen. Per rij wordt zo het geamplificeerde PCR-product van 19 stalen (aangeduid met nummers 1 tot en met 19) getest op de aanwezigheid van een bepaald DNA fragment. Indien op de juiste basenparenhoogte een fluorescente band wordt opgemerkt is het staal positief voor een bepaald DNA fragment dat mbv PCR werd geamplificeerd. Op deze foto zijn staal 1, 2, 7-12, en 19 van rij 1; staal 3-8, 10, 11, 13-15, 17,18 van rij 2; staal 1, 5, 6, 8, 10, 11, 17 van rij 3 en staal 1,3 en 5 van rij 4 positief voor de aanwezigheid van een DNA fragment (271 bp) bestaande uit de promotorregio en de 5 regio van het ampc gen. 34

42 2.8. SEQUENTIE-ANALYSE Principe Bij een DNA-sequentiereactie wordt de genetische code (nucleotidesequentie) van een DNA fragment bepaald. De DNA-sequentiereactie verloopt analoog als een PCR-reactie, maar dan slechts met één primer. Het belangrijke verschil tussen een PCR-reactie en een sequentiereactie is de amplificatie. Bij een PCR-reactie is de amplificatie exponentieel terwijl bij een sequentiereactie de amplificatie lineair is. Om een sequentie-reactie uit te voeren, wordt er gebruik gemaakt van de dideoxymethode. Zowel deoxy- (dntps) als dideoxynucleotiden (ddntps) zijn in het sequentie reactiemengsel aanwezig. De ddntps beschikken over een verschillende chromofore groep, afhankelijk van de base, en dragen op de 2 en 3 van de ribosuiker geen OH-groep. Op die manier kan hieraan geen nucleotide meer gehecht worden door het polymerase. De ketenverlenging stopt dus na het inbouwen van een ddntp. De inbouw van een dntp en een ddntp gebeurt door het polymerase met dezelfde efficiëntie. Hierdoor is de plaats waar de ketenelongatie stopt willekeurig en ontstaan er DNA fragmenten met een verschillende lengte en die eindigen op een ddntp Bepaling nucleotide sequentie bla genen en 16s rrna Van de PCR producten die het gewenste gen bevatten zal de nucleotidesequentie bepaald worden aan de hand van een sequentie-analyse. Voor de uitvoering van de sequentie-analyse werden de PCR-producten samen met hun PCR-primers opgestuurd naar de firma GATC Biotech in Duitsland. De bekomen nucleotidesequentie werd bijgevolg vergeleken met reeds gekende sequenties voor bla en 16s rrna genen die beschikbaar zijn in de BLAST databank (BLAST database: Mutaties in de promoter en attenuator regio van het chromosomaal ampc gen werden bestudeerd en vergeleken met deze van het E. coli K-12 ampc gen. Deze laatste bacterie vertoont geen mutaties in de promotor- en attenuatorregio van het chromosomaal ampc gen. 35

43 Percentage positieve stalen (%) 3. RESULTATEN 3.1. PREVALENTIE COMMENSAAL BREED-SPECTRUM β-lactamase PRODUCERENDE ENTEROBACTERIACEAE BIJ KAT EN HOND Na cultivatie bleek dat 48 van de 230 genomen stalen (72 katten- en 158 hondenstalen) positief waren voor breedspectrum β-lactamase producerende Enterobacteriaceae (20,87%). Hiervan waren 39 stalen afkomstig van honden en 9 van katten. De prevalentie aan breed-spectrum β-lactamase producerende Enterobacteriaceae wordt in figuur 15 weergegeven voor elke afzonderlijke subpopulatie. Deze bleek voor de hondengroep (24,68%; 39/158) tweemaal hoger te zijn dan deze binnen de groep van de katten (12,50%; 9/72). Binnen de hondenpopulatie werd de hoogste prevalentie teruggevonden bij de asielhonden (37,50%; 3/8), gevolgd door de groep van de proefdieren (36,67%; 11/30). Bij de particuliere honden lag de prevalentie wat lager (23,33%; 25/120). Van de stalen afkomstig van particuliere honden werd er van 3 stalen 2 kolonies met verschillende morfologie en dus 3 isolaten extra geselecteerd wat het totaal op 28 isolaten brengt. De 9 isolaten van katten waren allen afkomstig van particuliere dieren (14,52%; 9/62). In totaal werden 51 ceftiofurresistente Enterobacteriaceae (22,17%) geïsoleerd uit de faeces van honden en katten Totaal Particuliere dieren Asieldieren Proefdieren Figuur 15. Prevalentie commensaal breed-spectrum β-lactamase-producerende Enterobacteriaceae, weergegeven per subcategorie. De hondenpopulatie wordt voorgesteld in het blauw, met de totale hondenpopulatie in het donkerblauw en de subcategoriën (particuliere dieren, asieldieren, proefdieren) in het lichtblauw. De totale kattenpopulatie wordt weergegeven in het donkeroranje, de katten afkomstig van particuliere eigenaars in het lichtoranje. Naast de isolaten van Enterobacteriaceae werden er eveneens bacteriën van andere families zoals Pseudomonadaceae teruggevonden. Deze werden echter buiten beschouwing gelaten voor deze studie. 36

44 3.2. ANTIBIOTICA RESISTENTIE-PROFIEL VAN DE BREED-SPECTRUM β-lactamase PRODUCERENDE ENTEROBACTERIACEAE Alle isolaten (n=51) vertoonden resistentie tegen Ceftiofur en Ampicilline op agar disk diffusie test (Figuur 16). Voor Amoxicilline-Clavulaanzuur werd een resistentie van 80,39% waargenomen. Van de 42 honden-isolaten waren er 32 resistent (76,19%). De katten-isolaten waren alle 9 resistent. Vijfenveertig procent van alle isolaten (21 en 2 isolaten van hond en kat, respectievelijk) waren resistent aan Cefquinome. Eén derde van de honden-isolaten was resistent aan Doxycycline, terwijl slechts 1 isolaat van een kat resistent was voor Doxycycline. Voor Flumequine en Enrofloxacine werd er geen resistentie teruggevonden binnen de katten-isolaten. Van de honden-isolaten waren er 5 resistent aan Flumequine en 7 resistent aan Enrofloxacine. Zevenentwintig isolaten (waarvan 24 en 3 isolaten van honden en katten, respectievelijk) vertoonden resistentie aan Sulfonamide, 16 (waarvan 14 en 2 isolaten van honden en katten, respectievelijk) aan Trimethoprim. Er werd zowel voor Sulfonamide als voor Trimethoprim meer resistentie teruggevonden binnen de hondenpopulatie dan in de kattenpopulatie. Voor Neomycine, Gentamicine en Nitrofurane lag de resistentie lager dan 10%. Voor deze antibiotica werd er binnen de isolaten van katten geen enkele resistentie teruggevonden. Geen enkel isolaat was resistent aan Amikacine en Imipenem. In figuur 17 wordt een voorstelling gemaakt van de resistenties die werden waargenomen binnen elke hondensubpopulatie. Voor elke subpopulatie werd er 100% resistentie waargenomen voor Ceftiofur en Ampicilline. Ook voor Amoxicilline-Clavulaanzuur werd er 100% resistentie gevonden voor isolaten afkomstig van asielhonden. Voor isolaten afkomstig van proefhonden en particuliere honden lag het resistentiepercentage tussen de 60 en 70%. Voor Cefquinome werd er binnen de isolaten afkomstig van proefhonden bijna tweemaal meer resistentie gevonden dan deze afkomstig van particuliere dieren. Eén derde van de isolaten van de particuliere honden en asielhonden was resistent aan Doxycyline terwijl de helft van de isolaten afkomstig van proefhonden resistent was aan dit antibioticum. Enkel binnen de isolaten afkomstig van particuliere honden en proefhonden werd er resistentie tegen Flumequine en Enrofloxacine waargenomen. Meer dan de helft van de isolaten afkomstig van particuliere honden en proefhonden waren resistent aan Sulfonamiden terwijl slechts één derde van de isolaten van de proefhonden hiertegen resistent waren. Voor Trimethoprim en Nitrofurane werd er enkel resistentie teruggevonden in de isolaten van proefhonden en particuliere honden. Resistentie tegen Gentamicine en Neomycine werd enkel teruggevonden bij de isolaten afkomstig van proefhonden. De resultaten van de agar disk diffusietest worden in bijlage 1 voor elk resistent isolaat weergegeven. 37

45 Percentage resitentie (%) Totaal Hond Kat Figuur 16. Percentage van isolaten dat resistent is, weergegeven per antibioticum. 38

46 Percentage resistentie (%) Particuliere honden Asielhonden Proefhonden Figuur 17. Percentage van isolaten binnen de honden subpopulaties dat resistent is, weergegeven per antibioticum. 39

47 3.3. IDENTIFICATIE BREED-SPECTRUM β-lactamase PRODUCERENDE ENTEROBACTERICEAE Het overgrote merendeel van de β-lactamase producerende Enterobacteriaceae bleken na identificatie E. coli te zijn (44 isolaten). Daarnaast werden nog een aantal andere β-lactamase producerende bacteriën teruggevonden: Enterobacter spp. (4 isolaten waarvan 3 Enterobacter hormaechii en 1 Enterobacter cloacae), 2 Citrobacter freundii en 1 Proteus mirabilis. De procentuele verdeling van de waargenomen species wordt weergegeven in onderstaand diagram (Figuur 18). 2% 2% 6% 4% E. coli Enterobacter hormaechi Citrobacter freundii Enterobacter cloacae 86% Proteus mirabilis Figuur 18. Voorstelling van de verdeling van de waargenomen species. 40

48 3.4. DETECTIE EN KARAKTERISATIE bla RESISTENTIEGENEN Bij de 51 Enterobactericeae isolaten geïsoleerd uit faecale swabs van honden en katten was breedspectrum β-lactam resistentie te wijten aan de aanwezigheid van genen die coderen voor verschillende β-lactamase families: TEM, SHV, CTX-M, CMY en ACT. Van de 51 isolaten werden er bij 17 isolaten bla genen gedetecteerd die coderen voor een ESBL (Figuur 19) en bij 27 isolaten bla genen die coderen voor een plasmid-gemedieerd AmpC β-lactamase (Figuur 20). In tabel 6 wordt per diersoort, en per subgroep weergegeven welke bla resistentiegenen (genen die coderen voor ESBL of ampc β-lactamase) er teruggevonden werden. Per gen wordt ook het aantal isolaten die het desbetreffende gen bevatten weergegeven. Uit figuur 19 en 20 en tabel 6 kon een hoge diversiteit aan bla ESBL en bla AmpC genen worden vastgesteld. Isolaten met een bla CTX-M-type gen werden verder geanalyseerd om een onderscheid te maken tussen de bla CTX-M-1, -2 en -9 groepen. Binnen de bla CTX-M-1 groep werden bla CTX-M-15 en bla CTX-M-138 teruggevonden. De bla CTX-M-2 en bla CTX-M-14 genen waren de enige bla genen die behoorden tot de bla CTX-M-2 groep en bla CTX-M-9 groep, respectievelijk. De twee meest voorkomende bla genen waren bla CMY-2 (31,37%) en bla CTX-M-138 (17,65%). Verder werd een zeer grote diversiteit aan bla genen waargenomen. Zo werden bla TEM-52, bla CTX-M-27 en bla ACT-21 elk tweemaal teruggevonden. bla CMY-100 werd 3 maal aangetoond en volgende genen werden eenmalig teruggevonden: bla CMY-102, bla CMY-103, bla CMY-48, bla CMY-101, bla SHV-1, bla SHV-12, bla ACT- 20, bla CTX-M2, bla CTX-M12 en bla CTX-M15. Binnen deze diverse populatie bla genen werden ook voor het eerst 7 nieuwe bla genen ontdekt. De aminozuursequentie werd opgestuurd naar Prof. dr. Karen Bush (Molecular & Cellular Biochemistry Jordan Hall A311 Indiana University, USA) die een nieuwe naam toekende aan deze genen nl: bla CTX- M-138, bla CMY-100, bla CMY-101, bla CMY-102, bla CMY-103, bla ACT-20 en bla ACT-21. Bij 10 isolaten werd er ook een beperkt-spectrum bla gen gedetecteerd. Bij 7 isolaten werd zo n gen teruggevonden in combinatie met een gen dat codeert voor een ESBL of AmpC. Bij 9 isolaten werd een bla TEM-1 gen teruggevonden en bij 1 isolaat een bla SHV-1. Voor 4 E. coli isolaten (isolaatnummer: 30, 55, 65, 196; Tabel 6) werd er geen plasmide gemedieerd ampc gen teruggevonden. Het AmpC fenotype van deze isolaten was te wijten aan overexpressie van het chromosomaal ampc gen. Bij deze isolaten werd door mutaties in de promotor- en attenuatorregio een sterke promotor teruggevonden (Tabel 7). Ook bij andere E. coli isolaten werden mutaties in de promotor- en attenuatorregio gedetecteerd die het AmpC fenotype kunnen verklaren zoals volgende mutaties: -88 (C T), -82 (A G), -18 (G A), -1 (C T), +58 (C T). Dergelijke mutaties verklaren de resistentie tegen Amoxicilline-Clavulaanzuur bij isolaten waarbij enkel een esbl gen werd teruggevonden. Bij isolaten met een plasmide gemedieerd ampc gen zou het effect van deze mutaties gemaskeerd kunnen worden omdat het AmpC fenotype reeds werd toegeschreven aan de aanwezigheid van een bla CMY gen. Mutaties zoals +37 (G T), +70 (C T) en -28 (G A), +57 (C G) zijn waarschijnlijk onbelangrijk. Isolaten met een ESBL fenotype en met dergelijk mutaties in de promotor en attenuator regio van het chromosomaal ampc gen gaven geen enkele indicatie op aanwezigheid van een extra AmpC fenotype. 41

49 Tenslotte werden er bij 4 andere isolaten geen ampc gen (plasmide gemedieerd of mutaties in de promotor/attenuator regio van het chromosomaal ampc gen) noch een esbl gen teruggevonden. Het breed-spectrum β-lactam resistentiemechanisme is voor deze isolaten tot op heden nog niet gekend. Ofwel produceren deze isolaten een ander β-lactamase waar in dit onderzoek niet naar gezocht werd ofwel is een ander resistentiemechanisme, zoals veranderingen in de celwand door bv. verlies van poriën, hiervoor verantwoorlijk. Dit dient nog nader onderzocht te worden. Bijlage 2 geeft een overzicht van alle bla ESBL - en bla AmpC - genen die werden teruggevonden per isolaat. De mutaties in de AmpC-promotorregio worden weergegeven in de tabel van bijlage 3. CTX-M27 12% CTX-M138 53% TEM-52 11% SHV-12 6% CTX-M2 6% CTX-M14 6% CTX-M15 6% Figuur 19. Weergave van de bla ESBL resistentiegenen. Van de bla ESBL genen (n=17) wordt elk gen procentueel weergegeven. CMY-101 3% ACT-20 4% CMY-48 4% CMY-103 4% CMY-102 4% CMY % ACT-21 7% CMY-2 63% Figuur 20. Weergave van de bla ampc genen. Van de bla ampc genen (n=27) wordt elk gen procentueel weergegeven. 42