VERSLAG SIHON KWALITEITSCONTROLE NAJAAR 2004

Transcriptie

1 VERSLAG SIHON KWALITEITSCONTROLE NAJAAR 2004 Aan de 35e rondzending namen 61 laboratoria deel. In willekeurige volgorde betrof dit de volgende instituten: Sophia en Weezenlanden, Zwolle; UMC, Utrecht; SKION, Den Haag; Streeklab Zeeland, Goes; AMC, A dam; Leyenburg, Den Haag; UMCN St Radboud, Nijmegen; Catharina ZH, Eindhoven; GZG, Den Bosch; ErasmusMC, Immunologie, R'dam; ErasmusMC, DdHK, R dam; Meander mc, Amersfoort; SSDZ, Delft; Albert Schweitzer ZH, Dordrecht; CLB, A dam; Twenteborg ZH, Almelo; St. Lucas, A'dam; AZM, Maastricht; St. Antonius, Nieuwegein; LUMC, Leiden; UZ, Leuven; KCL, Leeuwarden; AZG, Groningen; MS Twente, Enschede; Med. Centr, Alkmaar; VUmc Hematologie, A dam; AvL, A dam; KG Haarlem; CWZ, Nijmegen; Verbeeten Inst, Tilburg; H.Hart, Roeselaare Belgie; AZ. Zust. Barmhartigh., Ronse, Belgie; Maasland ZH, Sittard; Laurentius ZH, Roermond; Cyt. ZH, Deventer; St.Franciscus, Roosendaal; Atrium, Heerlen; St. Joseph ZH, Veldhoven; St. Franciscus, Rotterdam; AZ Middelheim, Antwerpen; AZ Stuivenberg, Antwerpen; Univ. ZH, Antwerpen; Rijnstate ZH, Arnhem; Univ. ZH, Gent; CHU St.Pierre, Brussel; AZ-VUB, Brussel; Amphia, Breda; O.L. Vrouweziekenhuis, Aalst; Virga Jesse, Hasselt; Alg. Sted. Zkh, Aalst; Jolimont, Haine-St. Paul; UCL, Brussel; St. Augustinus, Antwerpen; OLVG, A dam; Slingeland, Doetinchem; Gelre, Apeldoorn; AZ J. Palfijn, Antwerpen; Diakonessenhuis, Utrecht; St. Jan, Brugge; AZ Groeninge. WOORD VOORAF: Dead line v.w.b. terugrapportage: De begeleidende informatie die bij de samples geleverd wordt bevat een dead line voor de inzending van de resultaten. In praktijk wordt deze dead line door een groep deelnemers overschreden. De deelnemers zijn aangemaand m.b.v. en fax. Omdat hierdoor de verwerking van data vertraagd wordt heeft de nomenclatuurcommissie besloten dat deze dead line voortaan strikter gehanteerd zal worden. Door een storing in de fax-apparatuur in Nijmegen is de dead line voor het derde sample niet gehanteerd en zijn betrokken deelnemers, indien nodig, meerdere malen verzocht hun rapportage als nog in te zenden. Beoordeling van de resultaten: Voor de beoordeling van de resultaten van de rondzendingen is het stellen van objectieve criteria noodzakelijk. Dit wordt echter bemoeilijkt door de complexiteit van een uitslag van een immuunfenotypering. Om toch een zo objectief mogelijke beoordeling te geven heeft de nomenclatuurcommissie recent de verschillende onderdelen van de scoring onder de loep genomen. Tevens wordt niet alleen de analyse van de afwijkende populatie(s) beoordeeld maar ook de context van de afwijkende populatie, m.a.w. de evaluatie van de volledige celpopulatie waarin de afwijkende populatie zich bevindt. 1. Rapportageformulier: Omdat immuunfenotypering van leukemieën en lymfomen continu onderhevig is aan verbeteringen en vernieuwingen in zowel aantal en kwaliteit van MoAbs als meer-kleuren fluorescentie is in 2002 een nieuw rapportageformulier ontwikkeld dat beter aansluit bij de huidige immuunfenotyperings technieken van meer (3-4)-kleuren antistofcombinaties en volbloedmonsters. Dit rapportageformulier draagt bij aan een meer eenduidig rapportage (en dus een meer eenduidige beoordeling) van de evaluaties middels deze technieken. Na een fase waarin de deelnemers van de rondzending hebben kunnen wennen aan het nieuwe rapportageformulier (niet volledig invullen had niet direct consequenties voor de beoordeling) zijn nu de meeste items van het rapportageformulier meegenomen in de beoordeling van de analyses. 2. Richtlijn voor de bepaling van de samenstelling van het testmonster:

2 De nomenclatuurcommissie heeft richtlijnen opgesteld voor de merkers die nodig zijn voor de bepaling van de verschillende cellijnen die aanwezig zijn in het monster en die verslagen dienen te worden in de rubriek Samenstelling. Er wordt beoordeeld of de samenstelling totaal ±100% is, of de juiste merkers gebruikt zijn, of de percentages van de subpopulaties juist zijn en of de normale en afwijkende populaties juist zijn weergegeven. Bij het laatste punt dient er op gelet te worden dat de afwijkende populatie niet behoort tot de normale cellijnen maar bij de blasten of overige celpopulaties afhankelijk van de afwijking. Immunologische differentiatie altijd T-cellen CD3 of CD5 (evt. + SSC) B-cellen CD19, CD20 of CD22 (evt. +SSC) NK-cellen CD3- /CD16,56+ (evt. +SSC) monocyten CD14+ (evt. +SSC) of CD13,33/SSC rijp myeloid CD13 en/of CD33 en SSC blasten CD34 (evt +CD45 en SSC) indien aanwezig plasmacellen CD38 (evt +CD45 en/of SSC) overigen afhankelijk van fenotype Tabel 1. Nieuwe richtlijn v.w.b. de merkers voor bepaling van de samenstelling. 3. Richtlijn voor de bepaling van de afwijkende celpopulatie(s) in het testmonster: De nomenclatuurcommissie heeft in het verleden richtlijnen opgesteld voor de typering van de verschillende cellijnen en in verschillende differentiatiestadia waarin maligniteiten kunnen voorkomen. Deze richtlijnen zijn door nieuwe ontwikkelingen en de introductie van nieuwe MoAbs gedeeltelijk achterhaald. Het nut en de noodzaak van een aantal MoAbs was discutabel. Daarom zijn nieuwe panels van MoAbs die minimaal toegepast dienen te worden voor het aantonen van bepaalde rijpingsstadia gedefinieerd (tabel 2). Deze panels zijn gebaseerd op de recent ontwikkelde 3-kleurenfluorescentie panels voor rijpe en onrijpe maligniteiten (zie De nieuwe panels zijn bij de beoordeling als leidraad gehanteerd voor de minimaal noodzakelijke MoAbs voor de typering van een bepaalde maligniteit.

3 T-ALL (voorloper) B-ALL AML CD45 CD45 CD45 CD34 CD34 CD34 CD117 CD117 CD117 TdT TdT MPO CyCD3 CD79a CD4 CD1 CD10 CD7 CD2 CD19 CD11b / 11c CD3 CD20 CD13 CD4 CD22 CD14 CD5 CD13 CD15 CD7 CD33 CD16 CD8 Cyu CD19 CD10 SmIgu CD33 HLA-DR CD36 CD56 CD61 / 41 CD235a rijp T-cel rijp B-cel plasmacel CD45 CD45 CD45 TdT CD5 CD19 CyCD3 CD10 CD20 CD1 CD11c CD38 CD2 CD19 CD56 CD3 CD20 CD138 / VS38c CD4 CD22 CyIgkappa CD5 CD23 CyIglambda CD7 CD25 CyIgu CD8 CD38 CyIgdelta CD16 CD103 CyIggamma CD25 FMC7 CyIgalfa CD56 SmIgkappa CD57 SmIglambda TCRalfa-beta SmIgu TCRgamma-delta SmIgdelta HLA-DR SmIggamma SmIgalfa Tabel 2. Minimale panels van MoAbs voor de bepaling van rijpe en onrijpe maldigniteiten.

4 4. Scoringssysteem SIHON scoringssys teem Pre-analytisch: A Cellijndefini rende markers en subklassificering volgens SIHON richtlijnen B Onvolledig: subklassificatie ontbreekt (1 of 2 markers ontbreken) C Essenti le markers (meer dan 2) ontbreken Analytisch: A Volledig goede analyse B 1 of 2 markers afwijkend, ook niet relevante markers (</> 20%-grens; TdT: </> 10%-grens) C Meer dan 2 markers afwijkend Noot: Afwijkend t.o.v. deelnemersgroep of t.o.v. andere markers binnen betreffende cellijn: bijv. CD5 t.o.v. CD3 Post-analytisch: A B C Cellijn en subklassificatie zijn juist Cellijn juist, subklassificatie niet volledig Cellijn fout of niet gefundeerde conclusie Tabel 3. SIHON scoringssysteem. Het in 1999 geïntroduceerde scoringssysteem (ref 1 en SIHON bulletin nr. 25 (januari 1999)) omvat de drie fasen van de immuunfenotypering, te weten pre-analytische, analytische en postanalytische fase. Om te komen tot een zo objectief mogelijke scoring worden eenduidige regels toegepast in de pre-analytische en analytische fase. Bij 1 of 2 afwijkingen worden deze fasen met een B beoordeeld en bij meer dan 2 afwijkingen met een C. In de beoordeling van de postanalytische fase is de conclusie alszodanig van belang. Tevens wordt beoordeeld of deze op de juiste gegevens gebaseerd is. Zo kan, als in het geval van bijvoorbeeld een B-NHL de juiste conclusie gegeven is, toch een B gescoord worden als verzuimd is SmIgKappa / SmIg-Lambda mee te nemen in de analyse.

5 METHODIEK VAN BEPALINGEN / SAMENSTELLING VAN DE GEHELE POPULATIE IN HET MONSTER: De volgende analyse data dienen weergegeven te worden op het formulier: 1. De wijze waarop de voorbewerking en methode waarmee de analyses uitgevoerd zijn. Alle deelnemers gebruiken een flowcytometer voor de analyse. Het valt op dat het gebruik van 2- kleuren analyses op zijn retour is. De meeste deelnemers maken gebruik van 3-kleuren flowcytometrische analyses. Echter het aantal deelnemers dat 4- en/of 5-kleuren analyses uitvoert neemt toe. Monsterbewerking Ery-lysis 60 Gradi nt 0 Detectie 100% Flowcytometer met of zonder mikroskoop Evaluatie analyse methode # deelnemers najaar2003 najaar kleuren IF 8 (14%) 4 ( 7%) 2/3 of 1/2/3-kleuren IF 14 (25%) 11 (18%) (2-,)3- en 4-kleuren IF 5 ( 9%) 10 (16%) 3-kleuren IF 18 (32%) 19 (31%) 4-kleuren IF 12 (21%) 12 (20%) 4/5-kleuren IF 1 ( 2%) 5-kleuren IF 4 ( 7%) 2. Omdat een of meerdere afwijkende populaties als deel van de totale populatie herkend en geanalyseerd moeten kunnen worden, is het essentieel dat de samenstelling van de totale populatie in de vorm van een immunologische differentiatie wordt vastgesteld. De deelnemers moeten dan ook naast de analyse van de afwijkende populatie de samenstelling van de gehele populatie, waarin deze afwijkende populatie zich bevindt, weergeven in de vorm van een immunologische differentiatie. Dit betekent dat ook de aanwezige normale subpopulaties gegeven dienen te worden. Voor de deelnemers bleek het regelmatig onduidelijk te zijn in welke rubriek de afwijkende populatie(s) weergegeven dienen te worden. De afwijkende populaties moeten weergegeven worden als overige populatie of, in geval van een onrijpe celpopulatie, als blasten populatie. Hierbij dienen de percentages en de merkers op basis waarvan de subpopulaties (zie tabel 1) bepaald zijn in de analyse gegeven te worden. De samenstelling als ook de wijze waarop deze bepaald is, werd door een aantal deelnemers onvolledig of foutief gerapporteerd, ofschoon het aantal een stuk lager was dan in eerdere rondzendingen. De immunologische dif moet 100% zijn. Een niet of onvolledig weergeven van percentages van subpopulaties als ook sterk afwijkende percentages resulteert in een B-score in respectievelijk de pre-analytische fase en analytische fase van de evaluatie. Het niet geven van merkers of het gebruik van onjuiste (combinatie van) merkers om de cellijn aan te tonen resulteert in een B-score in de pre-analytische fase. Veel fouten werden gemaakt met het weergeven van de afwijkende populaties tezamen met de normale populaties

6 waardoor niet getoond werd dat men de normale populatie herkend had. Fouten in de immunologische differentiatie zijn echter nooit de oorzaak van een C-score in de (pre-) analytische fase. Tabel 4: De in de drie cases foutief gebruikte merkers: T B NK Mono Plamacel CD2 CD45 CD16 en/of 56 CD45 Opmerking: bijna alle deelnemers hebben in deze rondzending de juiste MoAbs gebruikt 3. De cellijn waarin de afwijkende populatie zich bevindt als ook het percentage afwijkende cellen dienen gegeven te worden. Het vermelden van de gating procedure is niet beoordeeld en hangt af van de toegepaste evaluatiemethode. Geen of foutieve cellijn en sterk afwijkend percentage van de afwijkende cellen resulteren in een B-score in de analytische fase. Wanneer het percentage afwijkende cellen gelijk is aan het percentage van rijpe cellen in de betreffende cellijn dan is de normale populatie niet gevonden. Dit resulteert in een B-score in de analytische fase. 4. Vervolgens moet de afwijkende populatie gekarakteriseerd worden door middel van alle voor de afwijking belangrijke merkers als ook de mate van expressie. Hierbij dienen de SIHON MoAb panels (zie tabel 2) als richtlijn. De analyse dient binnen de afwijkende populatie (=100%) uitgevoerd te worden. De afwijkende of niet vermelde expressiepatronen zijn niet beoordeeld vanwege de invloeden van de gebruikte flowcytometer, de MoAb en het fluorochroom. De richtlijnen hiervoor zullen nog door de nomenclatuurcommissie opgesteld worden. Wanneer een bepaalde merker niet is meegenomen in de analyse van de afwijkende celpopulatie, wordt dit, onafhankelijk van de toepassing in de samenstelling, als fout aangemerkt in de pre-analytische fase. Het ontbreken van 1 of 2 merkers resulteert in een B- score, meer dan 2 in een C-score. Afwijkingen in de percentages van positieve cellen worden beoordeeld t.o.v. de mediaan van de deelnemersgroep (>2x SD). 5. De analyse dient gevolgd te worden door een korte en eenduidige conclusie al dan niet vergezeld van een bondige omschrijving van bevindingen. Vaak blijkt de binnen de SIHON afgesproken nomenclatuur niet juist gehanteerd te worden. Voor de evaluatie van de rondzending is het van belang dat de deelnemers altijd de korte conclusie geven. Deze wordt namelijk ter beoordeling aan de nomenclatuurcommissie voorgelegd en in de evaluatie overzichten van de rondzending vermeld; uitgebreide tekst is moeilijk te verwerken in een databank. De conclusie wordt beoordeeld op de juistheid van cellijn, differentiatiestadium en fundering van de conclusie in de analyse (zie tabel 3). Conclusie: In het algemeen blijken de meeste deelnemers het formulier op de juiste wijze in te vullen en blijven grote problemen uit. Echter het interpreteren van de handleiding voor het invullen van de gegevens over de afwijkende populatie leidt tot discussie: Volgens de richtlijn moet het percentage positieve cellen gerapporteerd worden als er voor een bepaalde merker sprake is van een bimodale verdeling (lees: deels positieve populatie). Een volledig positieve populatie, ook wanneer de fluorescentie expressie zwak is, dient weergegeven te worden met een +, een negatieve populatie met een -. Verwarring kan ontstaan bij een gating waardoor een populatie die volledig positief is maar met een zwakke expressie, doorsneden wordt, wat resulteert in een percentage van minder dan 100%. Dit is onjuist.

7 CASESBESPREKING: Score-systeem en resultaatoverzichten: Van de 61 deelnemers hebben respectievelijk 61, 60 en 59 (waarvan 1 te laat) de achtereenvolgende deelrondzendingen teruggerapporteerd. De analyses van de drie cases werden na compilatie in een spreadsheet en evaluatie beoordeeld door de nomenclatuurcommissie (NCcie)-leden aan de hand van het SIHON-scoringsysteem (de ABC-tjes ; ref. 1 en tabel 3). De score van deze drie fasen van ieder testmonster is tot stand gekomen door het middelen van de beoordeling van telkens 4 panelleden van de NC-cie (E. van Wering, E. van Lochem, E. van der Schoot, H. Adriaansen, J. Philippe en F. Preijers). Echter door de complexiteit van de immunofenotypering en de beperkte klinische gegevens omtrent de casus, zal deze beoordeling, ondanks de nieuwe aanpak, nooit volledig eenduidig kunnen zijn. De uiteindelijke uitslag komt tot stand door afstemming en middeling van de resultaten van de individuele NC-cie-leden in een plenaire vergadering. Daarnaast vindt naar aanleiding van de discussie tijdens de nabespreking in de SIHON-vergadering, waarin de leden de mogelijkheid krijgen de beoordeling te bekritiseren, een heroverweging plaats. Naar aanleiding van deze discussie zijn de resultaatoverzichten, zoals gepresenteerd tijdens de SIHON-vergadering van 23 november 2004, bijgesteld. Tevens zijn enkele foutief ingevoerde getallen gecorrigeerd. Omdat de complete set van rapportage data veel groter is dan de gepresenteerde gegevens, kan het voorkomen dat een lagere score is verkregen dan uit de data sheets volgt doordat een foutieve analyse aanwezig is in de volledige set van data maar niet in de getoonde terugrapportage. Introductie Achtereenvolgens werden drie verse ongestabiliseerde bloedmonsters rondgestuurd. De eerste patiënt (vrouw, 36 jaar) was sinds enkele maanden ernstig vermoeid, had een submandibulaire lymfklierzwelling en was bekend met een HTLV-I infectie. In de morfologische differentiatie werden 23% neutrofielen, 4% monocyten en 66% lymfocyten aangetroffen. De vraagstelling was is er sprake van progressie naar een T-NHL. Deze patiënt bleek een ATLL te hebben, een diagnose die niet vreemd is bij een HTLV-I infectie. Van de deelnemers gaf dan ook 87% de juiste diagnose. De vraagstelling kon enigszins verwarrend zijn omdat een ATLL geen progressie kent naar een T-NHL. De tweede patiënt (vrouw, 38 jaar) had sinds enige tijd een toenemende vermoeidheid. Bij controle bleek zij een leukocytose, een thrombopenie als ook een anemie te hebben. De leukocyten waren verhoogd (30,4x10 9 /L), met 13% segmentkernigen, 83% lymfocyten en 14% LUC. Gevraagd werd de leukocytose te analyseren. De meeste deelnemers (74%) konden de pro-b-all vaststellen. Daarnaast vond 1 deelnemer een afwijkende myeloide voorloper populatie. De aanwezigheid is overtuigend bewezen aan de hand van de geleverde FCM-plots. Echter omdat alle overige deelnemers deze populatie niet gevonden hebben is deze niet bij de beoordeling betrokken. Het derde bloedmonster was afkomstig van een vrouw (52 jaar) die sinds 4 1/2 jaar een vergrote lymfklier in de hals had, die door de PA als kleincellig lymfocytair lymfoom beoordeeld werd. Verder had zij geen klachten. Het aantal leukocyten was 6,0x10 9 /L, thrombocyten 230x10 9 /L met 44% neutrofielen, 42% lymfocyten en 5% LUC. De vraagstelling was stadiëring van het lymfoom. De patiënte bleek een kleine populatie B-NHL in haar bloed te hebben. Deze diagnose was aanleiding van discussie omtrent de vraag of de conclusie B-CLL/SLL juist is.

8 Samenvatting: SCORING IN NAJAAR 2004 Casus 1 Casus 2 Casus 3 PRE ANA POST PRE ANA POST PRE ANA POST A B C %A 39% 52% 87% 34% 36% 74% 44% 44% 46% %B 39% 41% 10% 48% 52% 11% 28% 44% 36% %C 21% 7% 3% 16% 10% 13% 25% 8% 15% Namens de nomenclatuurcommissie van de SIHON, Dr. Frank Preijers, St Radboud Universitair Medisch Centrum, Nijmegen, Januari 2005 Referenties: 1. Kluin-Nelemans JC, van Wering ER, van der Schoot CE, Adriaansen HJ, van t Veer MB, van Dongen JJM and Gratama JW on behalf of the Dutch Co-operative Study Group on Immunophenotyping of Haematological Malignancies (SIHON). SIHONSCORE: a scoring system for external quality control of leukaemia/lymphoma immunophenotyping measuring all analytical phases of laboratory performance. Br. J. Haemaol. 2001: 112, WHO Classification of Tumours: Pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. Ed by Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW. IARC Press, Lyon SIHON bulletin nummer Bene MC, Bernier M, Casasnovas RO, Castoldi G, Knapp W, Lanza F, Ludwig WD, Matutes E, Orfao A, Sperling C, van t Veer MB. The reliability and specificity of c-kit for the diagnosis of acute myeloid leukemias and undifferentiated leukemias. Blood 1998: 92,