De invloed van intestinale helminthen op de gastro-intestinale microflora

Transcriptie

1 De invloed van intestinale helminthen op de gastro-intestinale microflora Tessa Gryp Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Mario Vaneechoutte Begeleider: Piet Cools Vakgroep Klinische Biologie, Microbiologie en Immunologie Academiejaar

2

3 De invloed van intestinale helminthen op de gastro-intestinale microflora Tessa Gryp Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Mario Vaneechoutte Begeleider: Piet Cools Vakgroep Klinische Biologie, Microbiologie en Immunologie Academiejaar

4 De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef. Datum Tessa Gryp Mario Vaneechoutte

5 Voorwoord Van deze gelegenheid zou ik graag gebruik willen maken om enkele mensen te bedanken die bijgedragen hebben met het tot stand brengen van deze masterproef. Als eerste Prof. Dr. Mario Vaneechoutte, mijn promotor, om mij de mogelijkheid te geven om deze masterproef in het LBR uit te voeren, voor de begeleiding, opvolging en het nalezen van deze masterproef. Mijn begeleider, Piet Cools, wil ik van harte bedanken voor zijn advies en hulp bij de praktische proeven, het helpen uitwerken en het nalezen van deze masterproef. Dr. Guido Lopes dos Santos Santiago, Dr. Pieter Deschaght, Leen Van Simaey, Hans Duyvejonck en Maia Merabishvili voor de hulp, het beantwoorden op al mijn vragen en voor de aangename en leuke werksfeer. Prof. Dr. Geert Claeys en medewerkers van het labo bacteriologie P8 voor het bezorgen van klinische stoelgangstalen en het gebruik van de MALDI-TOF. Dr. Venessa Eeckhaut van de vakgroep pathologie, bacteriologie en pluimveeziekten van de Faculteit Diergeneeskunde voor het bezorgen van de F. prausnitzii stam. Mijn klasgenootjes Lisa, Yana, Justien, Laura, Tessa, Sherly, Jelle, Giel en Laurens voor de gezellige lunchpauzes en alle leuke momenten die we samen beleefden. Tot slot mijn ouders, familie en vriend voor hun steun tijdens mijn hele opleiding Bedankt

6 Afkortingen A Adenosine AE Alkalisch-extract ATP Adenosine trifosfaat BLAST Basic local alignment search tool Bp Basenpaar C Cytosine CE Capillaire elektroforese CFU Kolonievormende eenheden COL-S Columbia S Cq Cycle of quantification E Efficiëntie EDTA Ethyleendiaminetetraazijnzuur EtBr Ethidium bromide FISH Fluorescentie in situ hybridisatie ddntp Dideoxyribonucleotide trifosfaat DNA Desoxyribonucleïnezuur dntp Deoxyribonucleotide trifosfaat dsdna Dubbelstrengig DNA G Guanine HCl Waterstofchloride HDAC Histon deacytylase HPLC High performance liquid chromatography HPRT1 Hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1 Ig Immunoglobuline IL Interleukine Kb Kilobasen LBR Laboratory Bacteriology Research LC LightCycler MALDI-TOF Matrix associated laser desorption /ionization-time of flight Max ID Maximum percentage identiteit MP Multipurpose, multifunctioneel

7 NaOH PBS PCR QE qpcr RE rdna RNA rrna SCH SDS ssdna T TAE TCA cycle T h -cellen T m T reg -cellen TSA-S TSB UGent UV UZ WHO Natriumhydroxide Fosfaat gebufferde saline Polymerase kettingreactie Qiagen-extract Kwantitatieve polymerase kettingreactie Roche-extract Ribosomaal DNA Ribonucleïnezuur Ribosomaal ribonucleïnezuur Schaedler Natrium (sodium) dodecylsulfaat Enkelstrengig DNA Thymine Tris base-azijnzuur-edta Citroenzuurcyclus, Krebscyclus T helper cellen Smelttemperatuur Regulatiore T-cellen Trypticase soy agar S Trypticase soy broth Universiteit Gent Ultraviolet Universitair ziekenhuis World Health Organization

8 Inhoudstafel Samenvatting Inleiding Helminthen De intestinale microflora Probleem- en vraagstelling Materialen en methoden Studiepopulatie Klinische stoelgangstalen Bacteriële stammen DNA-extracties DNA-concentratie bepalen (NanoDrop) Moleculaire detectie, identificatie en kwantificatie van bacteriële stammen Polymerase kettingreactie (PCR) Kwantitatieve polymerase kettingreactie (qpcr) Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight (MALDI-TOF) S rrna Gen Sequencing Agarose gelelektroforese Kwantificatie korte vetzuurketens Statistische analyse Resultaten Faecalibacterium prausnitzii qpcr ontwikkeling Bifidobacterium species qpcr ontwikkeling R-gene qpcr validatie Invloed van intestinale helminth infecties op de intestinale microflora Bespreking... 37

9 4.1. qpcr ontwikkeling Invloed van geohelminthen op de intestinale microflora Algemeen besluit Referenties Addendum

10 Samenvatting Samenvatting Helminth infecties zijn een groep van verwaarloosde tropische aandoeningen waarvan de meest voorkomende infecties worden veroorzaakt door de geohelminthen Ascaris lumbricoides (spoelworm), Trichuris trichiura (zweepworm) en Necator americanus/ancylostoma duodenale (mijnworm). Ze komen voor bij meer dan één miljard mensen, voornamelijk kinderen in gebieden met armoede, (sub)tropisch klimaat en slechte hygiëne. Ze verblijven voor meerdere jaren in het gastro-intestinaal stelsel, wat resulteert in een nauwe samenleving met de intestinale microflora van de gastheer. Wij hypothetiseerden dat de aanwezigheid van deze geohelminthen de samenstelling van de intestinale microflora wijzigt. Om dit na te gaan, werden in de stoelgang van 128 Keniaanse vrouwen met bestaande assays de concentratie aan bacteriën en Escherichia coli bepaald en werd een nieuwe assay ontwikkeld voor de kwantificatie van Faecalibacterium prausnitzii. Aan de hand van microscopie en PCR werden geohelminth infecties bepaald en werd de studiepopulatie opgedeeld in een helminth geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde groep. In de helminth geïnfecteerde groep vonden we een niet significante daling van de concentratie aan bacteriën en E. coli, en het percentage F. prausnitzii. Daarnaast werd in dezelfde groep een niet significante stijging van de concentratie aan F. prausnitzii en het percentage E. coli gevonden. De studiepopulatie werd eveneens opgedeeld volgens de aanwezigheid van N. americanus, dat dezelfde resultaten opleverden als bij helminth infecties. Enkel werd een niet significante daling van de concentratie aan F. prausnitzii in de N. americanus positieve groep waargenomen, dat niet significant steeg in de helminth geïnfecteerde groep. Aangezien de belangrijke rol die korte vetzuurketens hebben in de darm, werden de korte vetzuurketens acetaat, butyraat en propionaat gekwantificeerd in de stoelgang. Bij de helminth geïnfecteerde groep werd een niet significant hogere concentratie voor elk van deze korte vetzuurketens gevonden. Bovendien vonden we geen correlatie tussen de concentratie aan F. prausnitzii, beschouwd als een belangrijke butyraat producent, en butyraat. Samenvattend werd in deze studie geen significante wijziging van de intestinale microflora en de concentratie aan korte vetzuurketen productie gevonden bij de helminth geïnfecteerde groep, en vonden we dat F. prausnitzii een minimale tot geen bijdrage levert aan de concentratie aan colon butyraat. Verder onderzoek op een grotere studiepopulatie, en waarin meerdere bacteriële species bestudeerd worden, is aangeraden. 1

11 Inleiding 1. Inleiding 1.1. Helminthen Helminthen zijn multicellulaire parasitaire wormen die opgedeeld kunnen worden in twee fyla. Het eerste fylum is dat van de Nematoda (rondwormen) en bestaat uit de intestinale nematoden (geohelminthen) en de filariale nematoden (draadachtige wormen). Het tweede fylum is dat van de Platyhelminthes (platwormen) en bestaat uit de Trematoda (zuigwormen) en de Cestoda (lintwormen) [1, 2]. Helminth infecties zijn een groep van verwaarloosde tropische aandoeningen [2, 3] waarvan men de laatste jaren het belang heeft ingezien doordat de ziektelast bijna zo groot is als die van malaria en tuberculose [6]. Epidemiologie Meer dan één miljard mensen, voornamelijk kinderen, zijn geïnfecteerd met minstens één, maar vaak met meerdere soorten geohelminthen [1, 2, 4]. De meest voorkomende infecties zijn deze veroorzaakt door de geohelminthen Ascaris lumbricoides (spoelworm), Trichuris trichiura (zweepworm) en Necator americanus/ancylostoma duodenale (mijnworm). De aanwezigheid van geohelminthen is gecorreleerd met armoede, (sub)tropisch klimaat, slechte hygiëne en gebrek aan water [2, 4, 5]. De gebieden met hoogste prevalentie bevinden zich in Centraal-, Oost- en West-Afrika, Zuidoost-Azië en Zuid- Amerika (Figuur 1). Figuur 1: De wereldwijde distributie van geohelminthen bij kinderen (2011) [5] Legende: De wereldwijde prevalentie van geohelminthen bij kinderen (1-14 jaar). 2

12 Inleiding Ziektebeeld Helminthen veroorzaken grote gevolgen voor de gezondheid, zoals ondervoeding, afremming van de groei, intellectuele achterstand, verminderde immuniteit, educatieve beperkingen en verhoogde mortaliteit [1, 2, 4, 5]. De morbiditeit van geohelminth infecties is geassocieerd met de wormlast, dit is het aantal wormen aanwezig in de geïnfecteerde gastheren [2, 4]. Levenscyclus De levenscyclus van geohelminthen (geos = aarde, helminth = worm (Grieks)) verschilt voor elke soort qua wijze van infectie, de migratie en ontwikkeling van de larven en de vestiging van de volwassen wormen in het menselijk lichaam. Dit resulteert in het optreden van verschillende klinische manifestaties [3, 4, 6]. Naast hun complexe levenscyclus hebben geohelminthen gemeenschappelijke kenmerken zoals het proberen te verblijven voor meerdere jaren in het gastro-intestinaal stelsel van de mens [4]. Eveneens repliceert elke soort geohelminth gedeeltelijk in de gastheer omdat de eitjes de gastheer verlaten via de stoelgang. Op deze manier kunnen de eitjes of larven terug door de gastheer opgenomen worden en kunnen ze zich tot volwassen wormen ontwikkelen [4, 5, 7]. Ascaris lumbricoides Besmetting met A. lumbricoides gebeurt door de orale inname van eitjes. De eitjes ontluiken in de dunne darm en migreren vervolgens naar de blindedarm en de proximale dikke darm, waar ze de darmslijmvliezen penetreren. Hierdoor komen ze terecht in de bloedcirculatie en zullen via de lever de longen bereiken. Hier blijven de larven totdat ze in staat zijn om omhoog te migreren via de longbronchi, tot in de trachea en epiglottis, waar ze opgehoest en ingeslikt worden en terug in de dunne darm terechtkomen (Figuur 2). Hier zullen ze zich verder ontwikkelen tot volwassen wormen en zullen de vrouwtjes eitjes leggen (tot 200,000 eitjes per dag). De levensduur van deze geohelminthen is ongeveer één jaar [3, 4]. Trichuris trichiura T. trichiura infecties ontstaan eveneens door het opnemen van eitjes waarvan de vrijgekomen larven naar de blinde darm en proximale dikke darm migreren (Figuur 2). Hier zullen ze zich in het epitheel van de darm vestigen voor ongeveer twaalf weken totdat ze volwassen zijn. Bij ernstige infecties kunnen de wormen ook over de hele dikke darm en rectum voorkomen. Vervolgens zullen de volwassen wormen zich vastzuigen in de mucosa van de darm. De volwassen vrouwtjes leggen 3,000-5,000 eitjes per dag en de levensduur van deze geohelminth is anderhalf tot twee jaar [4]. 3

13 Inleiding Necator americanus en Ancylostoma duodenale N. americanus en A. duodenale zijn verschillende species, maar ze vertonen dezelfde klinische symptomen en aangezien hun eitjes in de stoelgang microscopisch niet te onderscheiden zijn, worden ze samen als mijnworm beschouwd [6]. Besmetting met mijnwormen gebeurt door contact van de huid met larven die aanwezig zijn in warme en vochtige bodems. Vooraleer deze larven de gastheer kunnen binnendringen (infectieus stadium), moeten ze eerst twee keer vervellen. Hierdoor kunnen ze naar het oppervlak van de bodem bewegen en de huid van de gastheer penetreren. Na deze penetratie komen de larven terecht in subcutane venulen en lymfevaten, en via de bloedcirculatie in de pulmonaire capillairen. Na het ophoesten van de larven worden ze ingeslikt en gaan ze naar het bovenste gedeelte van de dunne darm (Figuur 2). Hier ontwikkelen ze zich verder tot volwassen wormen en leggen de vrouwtjes eitjes (N. americanus: 9,000-10,000 eitjes per dag; A. duodenale: 25,000-30,000 eitjes per dag). De levensduur van mijnwormen is vijf tot zeven jaar [4, 6]. Figuur 2: Levenscyclus van de geohelminthen A. lumbricoides, T. trichiura en de mijnwormen N. americanus/a. duodenale Legende: Een vereenvoudigde weergave van de levenscyclus van de geohelminthen Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura en de mijnwormen Necator americanus/ancylostoma duodenale. 4

14 Inleiding Immunologie Ondanks hun verschillende levenscycli en klinische symptomen zullen geohelminthen toch een gelijkaardige gastheer immuunrespons induceren. Omwille van hun multicellulair karakter zullen geohelminthen een immuunrespons opwekken die erop gericht is nevenschade aan de gastheer ten gevolg van de respons te beperken, dit zou immers ook nefast zijn voor de helminth. Deze T helper 2 (T h 2)- en regulatoire T-cel (T reg )- immuunrespons beperkt dus de pathologie waardoor helminthen voor meerdere jaren in het gastro-intestinaal stelsel kunnen verblijven [1,7]. De acute fase van helminth infecties wordt gekenmerkt door een T h 1-dominante immuunreactie en verandert in de chronische fase naar een dominante T h 2-immuunrespons (Figuur 3) [8, 9]. De T h 2-immuunrespons resulteert in de productie van de cytokines interleukine 4 (IL-4), IL-5, IL-13 en immunoglobuline E (IgE) en de mobilisatie en expansie van eosinofielen, basofielen en mastcellen [1, 2, 4, 7]. Na enige tijd zal een T reg - immuunrespons door de geohelminthen opgewekt worden (Figuur 3). T h 2- en T reg - immuunresponsen dempen de T h 1-immuunrespons, wat resulteert in het beperken van de pathologie en tot geohelminth tolerantie [1, 4, 7]. Figuur 3: Het algemeen opgewekte immuunrespons bij helminth infecties [9] Legende: Het algemeen opgewekte immuunrespons bij helminth infecties die opgedeeld kunnen worden in drie fasen. Een eerste fase (acuut) is een T helper 1 (T h 1)-immuunrespons die zowel schade aan de helminth als aan de gastheer zal teweeg brengen. In de tweede fase (chronisch) treedt een T h 2-immuunrespons op en na enige tijd een regulatoire T (T reg )-immuunrespons (fase 3). De T h 2- en T reg -immuunresponsen zullen de T h 1- immuunrespons dempen en zullen op deze manier de pathologie beperken en voor geohelminth tolerantie zorgen De intestinale microflora Het gastro-intestinaal stelsel is de natuurlijke habitat van bacteriën en fungi (schimmels en gisten), die in een natuurlijk evenwicht of symbiose, onderling en met de gastheer, leven. De termen intestinale microbiota en intestinale microflora verwijzen naar het totaal van deze micro-organismen dat in het gastro-intestinaal stelsel aanwezig is [10, 11]. Een niet verstoorde intestinale microflora levert een grote bijdrage tot de gezondheid van de mens [12] 5

15 Inleiding waarbij een onevenwicht in de samenstelling van de intestinale microflora gelinkt is met verschillende aandoeningen [10, 12-14] zoals diarree, inflammatoire darmlijden [10-12, 15], obesitas, diabetes, cardiovasculaire aandoeningen en een verhoogd risico op colonkanker (Figuur 4) [11, 12, 15]. Figuur 4: Positieve en negatieve effecten van de intestinale microflora op de gezondheid van de mens [16] Legende: De positieve en de negatieve effecten van de microbiële producten en activiteiten van de intestinale microflora op de gezondheid. Wanneer de microbiële producten en activiteiten, geassocieerd met ziekte, een grotere invloed hebben dan de positieve effecten, zullen deze positieve effecten onderdrukt worden. Dit resulteert in het optreden van ziektes afhankelijk van de microbiële producten en activiteiten. De microflora is niet homogeen over het hele gastro-intestinaal stelsel. De maag en duodenum bevatten lagere hoeveelheden bacteriën ( kolonievormende eenheden per ml (CFU/ml)) in vergelijking met het aantal in het jejunum ( kolonievormende CFU/ml), ileum ( CFU/ml) en dikke darm ( CFU/ml) [11]. In de dunne darm zijn voornamelijk gramnegatieve aerobe en obligaat anaerobe bacteriën aanwezig terwijl de anaerobe bacteriën de dikke darm sterk bevolken. Het gastro-intestinaal stelsel bevat bacteriële species [10] met als dominante fyla de Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria en Verrucomicrobia (Figuur 5) [15]. 6

16 Inleiding Figuur 5: Taxonomie van het intestinaal microbioom [17] Legende: Deze fylogenetische boom geeft de diversiteit van de intestinale microflora weer. Functies De intestinale microflora heeft een beschermende, trofische en metabolische functie [10]. Ten eerste vormt de microflora, met Lactobacillus en Bifidobacterium als belangrijkste genera, een beschermende laag die de invasie en kolonisatie van pathogenen voorkomt door competitie voor nutriënten, secretie van antimicrobiële substanties, die de groei van andere bacteriën inhibeert, en de beperkte plaats voor aanhechting in ecologische niches. De tweede functie is de trofische functie, waarbij de microflora de proliferatie en differentiatie van epitheelcellen beïnvloedt en het immuunsysteem mee ontwikkelt. De epitheelcellen differentiëren door de interactie met de microflora. De interacties tussen de bacteriën, epitheel en lymfocytair weefsel in de darm zorgen voor de ontwikkeling van het lokaal en systemisch immuunsysteem [10, 11]. De derde functie is de metabolische functie en bestaat uit het fermenteren van door de mens niet-verteerbare en niet-geabsorbeerde voedingsbestanddelen en endogene mucus. Deze fermentatie resulteert in de productie van korte vetzuurketens, die door de gastheer opgenomen kunnen worden en die een energiebron zijn voor de bacteriën in het colon [10, 11, 15, 18]. Absorptie van ionen, productie van vitaminen en synthese van aminozuren behoren ook tot de metabolische functie [10]. Korte vetzuurketens Microbiële fermentatie van niet-verteerbare voedselbestanddelen zoals vezels resulteert in de productie van korte vetzuurketens waarvan de belangrijkste acetaat, butyraat en propionaat zijn [18, 24]. Butyraat is een van de belangrijkste korte vetzuurketens en de belangrijkste energiebron voor colonocyten [18-23]. Butyraat wordt zowel passief als actief door de colonocyten opgenomen. 7

17 Inleiding Hiervan wordt 95 % door de colonocyten geoxideerd in ketonlichaampjes die gebruikt worden in de citroenzuurcyclus voor ATP-synthese (Figuur 6) [18, 23]. Een verminderde butyraat productie zal leiden tot een daling van ATP-synthese waardoor autofagie van de colonocyten optreedt [21]. Butyraat heeft eveneens een histon deacytylase (HDAC) inhibitor capaciteit waardoor histonen meer geacetyleerd worden (Figuur 6) [18, 21, 23]. Hierdoor kunnen genen betrokken bij de celcyclus arrest in malignante cellen en downregulatie van inflammatoire cytokine expressie in intestinale mucosa cellen beter afgeschreven worden. Omwille van dit proces heeft butyraat naast het leveren van energie eveneens een antiinflammatoir, antioxidant en anti-carcinogeen effect [22, 23]. Men vond eveneens dat defecten in het butyraat metabolisme betrokken kunnen zijn bij de pathogenese of ernst van colon inflammatoir darmlijden. Dit komt door een verminderde oxidatie van butyraat in de colonocyten terwijl een verminderde productie van butyraat gecorreleerd is met het voorkomen van diarree [23]. Faecalibacterium prausnitzii is een butyraat producerende bacterie, die tot de Clostridium leptum groep (Clostridium cluster IV) behoort. Samen met de C. coccoides groep (Clostridium cluster XIV) vormen ze de meerderheid van het fylum Firmicutes [20, 24, 25] en behoren tot de meest voorkomende butyraat producerende bacteriën in het colon [20, 24]. Figuur 6: De effecten van butyraat op de colonocyten [21] Legende: De korte vetzuurketen butyraat is de belangrijkste energiebron voor colonocyten en wordt verkregen door microbiële fermentatie van niet-verteerbare en niet-geabsorbeerde voedingsvezels. Het opgenomen butyraat zal door de colonocyten geoxideerd worden in ketonlichaampjes, die in de citroenzuurcyclus (TCA cycle) voor Adenosine trifosfaat (ATP)-synthese wordt gebruikt. Eveneens heeft butyraat een histon deacetylase inhibitor effect waardoor histonen minder geacetyleerd zijn. Dit resulteert in het beter afschrijven van genen. 8

18 Inleiding De meest voorkomende korte vetzuurketen in het colon is acetaat [18, 22, 26]. Acetaat kan onmiddellijk opgenomen en gebruikt worden als substraat in de lipogenese en gluconeogenese door de lever [15, 18]. Anderzijds heeft acetaat anti-apoptotische en anti-inflammatoire effecten door de inductie van genexpressie en door het zorgen van een verminderde permeabiliteit van het colon epitheel waardoor opname van toxines, geproduceerd door enteropathogenen, via het epitheel verhinderd wordt. Bepaalde Bifidobacterium sp. zijn acetaat producerende bacteriën [12]. De korte vetzuurketen propionaat is een inhibitor van de cholesterolsynthese in de lever. De rol van deze korte vetzuurketen in het intestinaal metabolisme is echter nog niet volledig gekend [18]. 1.3.Probleem- en vraagstelling Meer dan één miljard mensen, voornamelijk kinderen, zijn geïnfecteerd met minstens één, maar vaak met meerdere soorten geohelminthen [1, 2, 4]. Door hun multicellulair karakter zullen ze een specifieke gastheer immuunrespons opwekken waardoor ze niet uitgeroeid worden, ze hun pathologie beperken en op deze manier voor meerdere jaren in het gastrointestinaal stelsel kunnen verblijven [1, 7]. Dit resulteert in een nauwe samenleving van de geohelminthen en de intestinale microflora van de mens. Wegens deze nauwe samenleving hypothetiseren we dat geohelminthen de intestinale microflora zullen wijzigen [14]. Studies die het effect van enkele intestinale helminthen op de intestinale microflora van muizen [27-29] en varkens [30, 31] onderzocht, ondersteunen deze hypothese. Om de invloed van de geohelminthen op de menselijke intestinale microflora te bestuderen, zal het aantal Faecalibacterium prausnitzii, Bifidobacterium sp. en Escherichia coli in geohelminth geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde stoelgangstalen bepaald worden, waardoor een over- of ondervertegenwoordiging van de bestudeerde bacteriën nagegaan kan worden. Om F. prausnitzii en Bifidobacterium sp. te detecteren en te kwantificeren in de stoelgangstalen wordt voor beiden een kwantitieve polymerase kettingreactie (qpcr) ontwikkeld. Eveneens zullen de korte vetzuurketens gekwantificeerd worden zodat een verband tussen geohelminth infecties, de aanwezigheid van de bepaalde bacteriële species en korte vetzuurketen productie kan nagegaan worden. 9

19 Materialen en Methoden 2. Materialen en methoden 2.1. Studiepopulatie De studiepopulatie bestond uit 128 Keniaanse vrouwen (16-35 jaar) uit Mombasa, Coast Province, Kenia. Deze werden gerekruteerd in het kader van een studie van het European and Developing Countries Clinical Trials Partnership [32]. Alle deelneemsters tekenden een toestemmingsformulier voor deelname aan de studie Klinische stoelgangstalen Bij bezoek aan het hospitaal, werd een steriel recipient overhandigd aan de deelneemsters, samen met een steriele spatel. Na het produceren van het stoelgangstaal, werd deze onmiddellijk naar het bijhorende laboratorium getransporteerd, waar de aanwezigheid van eitjes in de stoelgangstalen met behulp van microscopie (McMethode) [33]) werd nagegaan. Verder werd een 2 ml eppendorfbuisje gevuld met 2 g stoelgang en ingevroren bij -80 C. In vloeibaar stikstof werden de stoelgangstalen opgestuurd naar het Laboratory Bacteriology Research (LBR) in het UZ Gent. Deze stappen werden voorafgaand uitgevoerd en maakten geen deel uit van de masterproef Bacteriële stammen De gebruikte stammen, kweekbodems en groeicondities worden vermeld in Tabel 1 (zie Addendum). Inoculeren van bacteriën In de collecties van het LBR zijn gekende stammen bij -80 C ingevroren. Om deze terug op te kweken, werden ze op de geschikte kweekbodem geïnoculeerd. In Tabel 1 (zie Addendum) staan de stammen vermeld die geïnoculeerd werden op de desbetreffende kweekbodem en groeicondities. Protocol: Neem met een wattenstaafje een kleine hoeveelheid ingevroren stam en inoculeer dit op een kweekbodem. Schrijf op de bodem van de kweekbodem het invriesnummer, datum en initialen op en incubeer volgens voorgeschreven condities. Overenten van bacteriën De kolonies, verkregen door het inoculeren en incuberen van bacteriële stammen, werden overgeënt op een nieuwe kweekbodem indien de cultuur niet zuiver bleek. Deze werden verder gekweekt totdat er een reincultuur verkregen werd. 10

20 Materialen en Methoden Protocol: Pik met een 1 µl entnaald een kolonie op en strijk in alle richtingen over de hele kweekbodem. Schrijf op de bodem van de kweekbodem het invriesnummer, datum en initialen en incubeer volgens voorgeschreven condities. Invriezen van bacteriën Om bacteriën in te vriezen is er Trypticase Soy Broth (TSB) met 20 % glycerol nodig. TSB glycerol is een cryoprotectief invriesmedium dat intracellulaire als extracellulaire bescherming biedt aan de bacteriën tijdens het invriezen. Protocol: Label een 2 ml invriesbuisje en pipetteer er 1 ml TSB glycerol in. Schraap met een 10 µl entnaald alle kolonies van de voedingsbodem. Plaats de 10 µl entnaald loodrecht in het 2 ml invriesbuisje met TSB glycerol en resuspendeer de kolonies in de TSB glycerol. Vries in bij -80 C DNA-extracties Alkalische DNA-extractie Door middel van een alkalische lysebuffer (0.25 % SDS, 0.05 N NaOH) werd DNA uit koloniesreinculturen geëxtraheerd. Het detergent natrium (sodium) dodecylsulfaat (SDS) zorgt voor het breken van de bacteriële celwand terwijl NaOH voor de denaturatie van proteïnen en DNA zorgt. High performance liquid chromatography (HPLC) water werd toegevoegd voor neutralisatie van het extract. Protocol: Pipetteer 20 µl lysebuffer in een 0.6 ml eppendorfbuisje. Pik een kolonie met een 1 µl entnaald op en los deze op in de lysebuffer door de 1 µl entnaald in de lysebuffer rond te draaien. Incubeer 15 min bij 95 C en centrifugeer vervolgens 5 s bij maximale snelheid. Voeg 180 µl HPLC water toe en centrifugeer gedurende 5 min bij 16,000 g. Vries in bij -20 C. Roche kit DNA-extractie (Roche) Roche DNA-extractie werd gebruikt voor het isoleren van nucleïnezuren van reinculturen met als doel het maken van een standaardreeks voor qpcr (zie ). De bacteriële cellen werden door proteïnase K en een chaotropisch zout guanidine HCl gelyseerd. Proteïnase K knipt de vrijgekomen proteïnen en het zout zorgt voor het verzwakken van hydrofobe interacties, het ontvouwen van membranaire proteïnen en voor een verhoogde membranaire permeabiliteit. Voorbehandeling met mutanolysine zorgt voor een betere afbraak van de dikke peptidoglycaan celwand van gram-positieve bacteriën. Door deze processen kwam het bacterieel DNA en andere moleculen vrij. Om het DNA uit het lysaat op te zuiveren, werd een Roche kit gebruikt. De Roche kit bevat kolommen die een silicagel bevatten. Door de aanwezigheid van een chaotropisch zout bond het DNA op de 11

21 Materialen en Methoden silicagel. Het DNA werd door een elutiebuffer geëlueerd en dit geëxtraheerd DNA werd gebruikt om een standaardreeks te maken. Protocol: Pipetteer 200 µl fosfaat gebufferde saline (PBS) in een 1.5 ml eppendorfbuisje. Schraap met een 10 µl entnaald alle kolonies van de plaat af en los deze op in de 200 µl PBS. Pipetteer vervolgens 2 µl mutanolysine (25 U/µl), vortex en incubeer gedurende 15 min bij 37 C. Pipetteer 200 µl bindingbuffer en 40 µl proteinase K, vortex, centrifugeer kort en incubeer gedurende 10 min bij 70 C. Pipetteer 100 µl isopropanol, vortex en centrifugeer kort. Plaats een spin-kolom in een 2 ml collectiebuisje, pipetteer voorzichtig de inhoud van het 1.5 ml eppendorfbuisje in de spin-kolom en centrifugeer gedurende 1 min bij 8,000 g. Plaats de spinkolom in een nieuw 2 ml collectiebuisje en pipetteer 500 µl inhibitor removal buffer en centrifugeer gedurende 1 min bij 8,000 g. Plaats de spin-kolom in een nieuw 2 ml collectiebuisje en pipetteer 500 µl wasbuffer en cetrifugeer gedurende 1 min bij 8,000 g. Herhaal de wasstap. Plaats de spin-kolom in een nieuw 2 ml collectiebuisje en centrifugeer gedurende 10 s bij volle snelheid. Plaats de spin-kolom in een 1.5 ml eppendorfbuisje en pipetteer 200 µl voorverwarmde elutiebuffer (70 C) en laat gedurende 3 min staan. Centrifugeer vervolgens gedurende 1 min bij 8,000 g en vries in bij -20 C. Qiagen DNA mini stool kit (QIAamp DNA Stool Mini Kit, Qiagen) Van de 128 stoelgangstalen uit Mombasa (Kenia) werd ongeveer 0.10 g stoelgang afgewogen waarna DNA geëxtraheerd werd door middel van Qiagen DNA mini stool kit. Het principe berust op DNA binding aan een QIAamp silica-gel membraan. Vooraleer het DNA kan binden, moeten de bacteriën in de stoelgangstalen gelyseerd worden. Hiervoor werden de stoelgangstalen in PBS gehomogeniseerd, opgewarmd en werd mutanolysine, ATL buffer en proteïnase K toegevoegd. Mutanolysine zorgt voor het afbreken van de gram-positieve celwand. Proteïnase K inactiveert DNAsen en helpt bij het afbreken van de celwand door eiwitten te hydrolyseren. Vervolgens werd aan het bekomen lysaat AL buffer toegevoegd zodat eiwitten en polysachariden verwijderd worden. Om het vrijgekomen DNA te laten binden op de silica-gel membraan werd na centrifugatie ethanol aan het supernatans toegevoegd en aangebracht op een QiAamp kolom. Resterende onzuiverheden werden efficiënt verwijderd in twee was stappen met AW1 en AW2 buffers waarna het DNA van de silica-gel membraan geëlueerd kon worden door middel van een AE buffer. Protocol: Weeg 0.10 g stoelgang af en resuspendeer in een 1.5 ml eppendorfbuisje met 200 µl PBS. Verwarm gedurende 10 min bij 95 C. Voeg 4 µl mutanolysine (25 U/µl) toe en incubeer gedurende 15 min bij 37 C. Voeg daarna 180 µl ATL buffer en 20 µl proteïnase K 12

22 Materialen en Methoden toe, vortex, incubeer gedurende 2 uur bij 55 C en vortex nogmaals. Pipetteer 400 µl AL buffer, vortex en incubeer gedurende 10 min bij 70 C. Centrifugeer 30 s bij volle snelheid en breng het supernatans over in een 1.5 ml eppendorfbuisje dat 400 µl ethanol % bevat. Vortex en centrifugeer kort. Plaats een spin-kolom in een 2 ml collectiebuisje, pipetteer voorzichtig 600 µl uit het 1.5 ml eppendorfbuisje in de spin-kolom en centrifugeer gedurende 1 min bij 9,000 g. Plaats de spin-kolom in een nieuw 2 ml collectiebuisje. Pipetteer vervolgens de resterende supernatans uit het 1.5 ml eppendorfbuisje in de spin-kolom. Centrifugeer gedurende 1 min bij 9,000 g. Plaats de spin-kolom in een nieuw 2 ml collectiebuisje en pipetteer 500 µl AW1 buffer in de spin-kolom. Centrifugeer daarna gedurende 1 min bij 9,000 g. Werp de inhoud van het 2 ml collectiebuisje weg. Pipetteer 500 µl AW2 buffer in de spin-kolom. Centrifugeer gedurende 1 min bij 9,000 g en vervolgens 2 min bij volle snelheid. Plaats de kolom in een 1.5 ml eppendorfbuisje en pipetteer vervolgens 200 µl AE buffer. Laat de buffer op de spin-kolom gedurende 1 min, centrifugeer daarna gedurende 1 min bij 6,000 g en vries in bij -20 C DNA-concentratie bepalen (NanoDrop) DNA-concentraties werden door middel van de NanoDrop 1000 bepaald. Dit is een spectrofotometer die in een klein volume van 1-2 µl 5 tot 3000 ng/µl nucleïnezuren kan meten. De spectrofotometer stuurt UV-licht met golflengte van 260 nm door het monster waarna een fotodetector de transmissie meet. Dubbelstrengig DNA (dsdna), enkelstrengig DNA (ssdna), RNA en nucleotiden absorberen maximaal bij 260 nm. Dus hoe meer licht het staal absorbeert, hoe meer nucleïnezuren het staal bevat. De 260/280 ratio geeft de zuiverheid van het DNA weer. Een ratio van 1.8 wordt als zuiver DNA beschouwd. Protocol: Til de arm van de NanoDrop 1000 omhoog en veeg het bovenste en onderste voetstuk met papier en water af. Open de NanoDrop 1000 software en selecteer: Nucleïnezuren. Pipetteer 2 µl water op het onderste voetstuk en breng de arm naar beneden. Klik op OK en til de arm omhoog. Veeg het voetstuk af met papier en water. Pipetteer 2 µl elutiebuffer of HPLC op het onderste voetstuk en breng de arm terug naar beneneden. Klik op Blanco. De waarde moet 0 ng/µl zijn. Til de arm omhoog en veeg terug het voetstuk met papier en water af. Vortex het monster, pipetteer 2 µl monster op het onderste voetstuk en klik op Meten. Herhaal deze meting drie maal voor elk monster dat gemeten moet worden. Klik op Toon report en bereken het gemiddelde van de drie metingen om de DNA-concentratie van het monster te weten. 13

23 Materialen en Methoden 2.6. Moleculaire detectie, identificatie en kwantificatie van bacteriële stammen Polymerase kettingreactie (PCR) PCR is een techniek om DNA exponentieel te amplificeren. Om deze techniek mogelijk te maken, is een mengsel van DNA-template, forward primer, reverse primer, deoxyribonucleotide trifosfaten (dntp s), DNA-polymerase, buffer, monovalente - en divalente kationen nodig. Het volledig proces bestaat uit verschillende fasen. Eerst gebeurt de initialisatiefase waarin de temperatuur verhoogd wordt naar C gedurende ongeveer 30 s. Daarna is er een pre-incubatie fase bij 95 C gedurende 1-15 min, wat resulteert in de activatie van de Taq polymerase. Vervolgens treden cycli op, bestaande uit een denaturatie-, annealing- en extensiefase. In de denaturatiefase gebeurt denaturatie van een dsdna-template in twee ssdna-templates door het verbreken van hydrofobe bindingen tussen complementaire basen. Dit vindt bij een temperatuur van C gedurende s plaats. Vervolgens zakt de temperatuur naar C gedurende s in de annealingfase. Hierdoor kunnen de primers aan hun complementair deel van de ssdna-templates hechten en de Taq polymerase aan de primer-template hybride. De laatste stap van de cyclus is de extensiefase. Gedurende s bij 72 C verlengt de Taq polymerase de primers in de 3 - richting complementair aan de DNA-template. Na het volbrengen van alle cycli treedt de laatste extensiefase op. Deze stap gebeurt bij 72 C gedurende 5 min zodat alle overgebleven ssdna-templates volledig verlengd worden. Primers zijn oligonucleotiden waarvan bij PCR zowel een forward als een reverse primer nodig is. In de annealingfase zal de forward primer zich aan het 5 -einde van de template binden en de reverse primer aan het 3 -einde. Tijdens de PCR-reactie zal het DNA-fragment tussen de primers geamplificeerd worden, omdat de activiteit van de DNA-DNA polymerasen start ter hoogte van de gebonden primer aan de template. Dit resulteert in het verlengen van de primers tijdens de elongatiefase waarbij dsdna ontstaat. Primerkwaliteit controleren Aan de hand van het software programma Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) werd de specificiteit van primers nagegaan. BLAST is een algoritme dat de similariteit tussen nucleotidesequenties gaat vergelijken met een sequentiedatabase om gerelateerde sequenties te vinden. Om de DNA-sequentie van primers te kunnen vergelijken met de DNA-sequentiedatabase werd blastn gebruikt. Eveneens werd gekozen om een megablast uit te voeren, die sequenties met hoge similariteit zoekt [34]. 14

24 Materialen en Methoden Vervolgens werden de primer sequenties bestudeerd in Oligo Analyzer. Dit software programma berekent het moleculair gewicht, lengte, smelttemperatuur en GC-percentage van de primers. Eveneens kunnen secundaire hairpin structuren, en homo- en hetero-dimeren van de primers nagegaan worden [35]. Optimale primers zijn specifiek en hebben een lengte van bp, een GC-percentage van % en een annealingtemperatuur van C waarbij het verschil tussen de forward en reverse primer best 4 C is. Eveneens bevatten ze best geen mismatches tussen de primersequentie en hun complementair deel van de template. Hierbij is belangrijk dat deze mismatches niet aan het 3 -einde van de primer voorkomen en dat er geen T of A nucleotiden aan het 3 -einde aanwezig zijn. Daarnaast moeten herhalingen van vier identieke nucleotiden naast elkaar, secundaire structuren en complementariteit van de primers vermeden worden [36, 37]. Tevens is de ampliconlengte het best bp [36]. Op basis van deze criteria werden de primers besteld. Bestellen en uitverdelen primers en probes Primers werden bij besteld. Van de gelyofiliseerde primers werd een stockoplossing van 100 µm en een werkoplossing van 20 µm gemaakt. Het geschikte volume HPLC om de stockoplossing van 100 µm te verkrijgen, stond vermeld op het bijgeleverde formulier van de primers. Protocol: Pipetteer het geschikte volume HPLC in de 2 ml buisje met gelyofiliseerde primer in het pre-pcr lokaal om de stockoplossing te verkrijgen. Pipetteer vervolgens 20 µl van de stockoplossing in een 0.6 ml eppendorfbuisje met 80 µl HPLC om de werkoplossing te verkrijgen. Vries de stockoplossing en werkoplossing in bij -20 C Kwantitatieve polymerase kettingreactie (qpcr) Het totaal aantal bacteriën, Faecalibacterium prausnitzii en Escherichia coli werden met behulp van qpcr geïdentificeerd en gekwantificeerd. qpcr berust op hetzelfde principe van een gewone PCR-reactie (zie ), maar is in tegenstelling tot de conventionele PCR geen semi-kwantitatieve techniek maar een kwantitatieve techniek. In een qpcr wordt een fluorescent signaal gegenereerd en gemeten dat recht evenredig is met het aantal amplicons bij elke cyclus van een PCR-reactie. Dit fluorescerende signaal wordt verkregen door de incorporatie van SYBR Green in het dsdna dat tijdens elke cyclus gegenereerd wordt. SYBR Green is een fluorescerende molecule die enkel fluoresceert wanneer gebonden in dsdna en niet wanneer vrij in oplossing. Tijdens een PCR-cyclus stijgt het signaal geleidelijk aan doordat SYBR Green intercaleert met het dsdna van de amplicons tijdens de extenstiefase waarna het signaal gedetecteerd wordt. Tijdens de opeenvolgende PCR-cycli 15

25 Materialen en Methoden neemt de hoeveelheid dsdna PCR-producten exponentieel toe en dus ook het SYBR Green fluorescentie signaal. SYBR Green kan echter eveneens intercaleren met niet-specifiek geamplificeerde PCR-producten waardoor een niet-specifiek signaal gemeten kan worden. Om signaalbouw ten gevolge van aspecifieke amplificatie te kunnen uitsluiten, werd een smeltcurve analyse uitgevoerd. In deze post-pcr analyse wordt de temperatuur geleidelijk verhoogd van 40 C tot 95 C waarbij de fluorescentie constant wordt gemeten. Bij lage temperaturen zal veel fluorescentie gemeten worden doordat SYBR Green zich in dsdna bevindt. Tijdens het stijgen van de temperatuur daalt de fluorescentie signaal door het smelten van de dsdna-producten. PCR-producten met verschillende lengtes en bp samenstelling zullen bij een verschillende temperatuur smelten en zullen elk als een verschillende piek waar te nemen zijn in een grafiek met de fluorescentie in functie van de temperatuur. Als enkel specifieke PCR-producten gevormd worden, zal één enkele smeltpiek op de grafiek aangetoond worden, waarvan de temperatuur zal corresponderen met de verwachte smelttemperatuur (op basis van ampliconlengte en GC-inhoud). De efficiëntie (E), lineaire dynamische range en reproduceerbaarheid van een qpcr-reactie worden bepaald door de standaardcurve. De efficiëntie wordt berekend aan de hand van de helling van de standaardcurve: E = 10(-1/helling)-1. In theorie wordt 100 % efficiëntie verkregen wanneer de hoeveelheid amplicons verdubbelen bij elke cyclus. Bij 100 % efficiëntie is E = 2 en de helling = (ofwel het aantal cycli dat nodig is om de targetconcentratie te vertienvoudigen). De efficiëntie kan eveneens nagegaan worden aan de hand van de R 2 -waarde van de standaardreeks. In de praktijk moet de efficiëntie % zijn, de helling tussen en liggen en de R 2 -waarde > 0.99 zijn om van een efficiënte qpcr te kunnen spreken [37]. De samenstelling van de qpcr-mengsels, de gebruikte primers en de cycling condities van de uitgevoerde qpcr s zijn weergegeven in Tabel 2, 3 en 4 (zie Addendum). Protocol: Bewaar de reagentia op ijs tijdens de handelingen. Pipetteer in een 1.5 ml eppendorfbuisje het geschikte volume reactie buffer, forward primer, reverse primer en moleculair water om het PCR-mengsel te verkrijgen in het pre-pcr lokaal (Tabel 2 in Addendum). Pipetteer vervolgens het geschikte volume PCR-mengsel in de gewenste wells van een LightCycler (LC) 480 plaat. Maak in de flowkast de standaard verdunningsreeks (zie verder). Pipetteer de geschikte hoeveelheid DNA-extract of verdunningsreeks in de corresponderende well toe in het lokaal waar DNA-extracten toegevoegd moet worden. Plak de LC 480 plaat af, plaats het in het LC 480 toestel en start de assay. 16

26 Materialen en Methoden Standaardreeks Bij elke qpcr assay wordt een tienvoudige verdunningsreeks van genomisch DNA met gekende concentratie van het species in kwestie meegenomen. De fluorescentie in functie van de kwantificatie cyclus (Cq) waarde levert een standaardcurve, die gebruikt wordt voor het berekenen van de concentratie van de target in een staal. In deze studie werd een standaardreeks verkregen van genomisch bacterieel DNA of alternatief van een met PCR geamplificeerd stuk DNA. Van een gekweekte referentiestam van de soort waarvan men een standaardreeks wil bereiden, werd kolonies opgepikt waarop een Roche kit DNA-extractie werd uitgevoerd. Van dit DNA-extract werd een 1/10 verdunningsreeks gemaakt, die als standaardreeks gebruikt werd. De bacteriële concentratie van de standaardreeks werd berekend aan de hand van de gemeten DNA-concentratie (zie 2.5) en de formule. Protocol: Voer alle handelingen in het pre-pcr lokaal uit. Pipetteer 20 µl van het DNAextract en 180 µl HPLC in een 0.6 ml eppendorfbuisje om een eerste 1/10 verdunning te verkrijgen. Verdun vervolgens op dezelfde manier verder tot een verdunning van minder dan 10 chr/ml. Inhibitie controle in stoelgangstalen Inhibitie in stoelgangextracties kan worden nagegaan door middel van een qpcr interne inhibitie test met jellyfish DNA. Een jellyfish oligonucleotide (aequorine gen) werd toegevoegd aan de DNA-extracten en geamplificeerd met de primers Jelly Fw en Jelly Rv (Tabel 4 in Addendum). Om inhibitie na te gaan, werden de Cq-waarden van het qpcr-product vergeleken met de gemiddelde Cq-waarde van de positieve controles (Jellyfish verdunning zelfde concentratie zonder stoelgang QE). Een hogere Cq-waarde (2 of meer) ten opzichte van positieve controle (zelfde jellyfish oligo in HPLC) werd als inhibitie beschouwd [43]. Indien er inhibitie was, werden de extracten 1/10 verdund en terug op inhibitie getest Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight (MALDI-TOF) De MALDI-TOF methode werd gebruikt voor het snel identificeren van bacteriën. Het is een zachte ionisatie techniek waarvan de analyse gebeurt door massaspectrometrie. Op het bestudeerde monster wordt een matrix aangebracht en dit resulteert in een kristallisatie. De matrix-kristallen, die de analyten bevatten, worden met een UV-laser beschoten. De matrix zal het UV-licht absorberen waardoor het ioniseert. Een deel van deze energie wordt overgedragen aan de analyten waardoor ze loskomen (desorptie) en ioniseren (ionisatie). Vervolgens worden de losgekomen, geïoniseerde ionen gescheiden in een elektrisch veld 17

27 Materialen en Methoden waarvan de Time Of Flight de tijd weergeeft wanneer deze ionen de detector bereiken. Dit is afhankelijk van de massa/lading ratio van het ion. Lichtere ionen zullen dus sneller bewegen en gedetecteerd worden dan zwaardere ionen. Protocol: Pik 1 kolonie op met een 1 µl entnaald en wrijf het open over de spotplaats op een MALDI-TOF plaatje. Vortex de matrix en pipetteer 1 µl op elke aangebrachte kolonie. Voeg in het software programma MBT-Satellite de gegevens van de monsters in. Plaats het MALDI-TOF plaatje in het toestel en open het programma Flex control om de piekenpatronen te bekijken. Pas eventueel de eigenschappen aan of schiet zelf om betere pieken te verkrijgen. Open eveneens het programma Maldi-TOF Biotyper realtime classification om de identificaties te verkrijgen S rrna Gen Sequencing 16S rrna sequencing is een methode waarmee bacteriële soorten kunnen geïdentificeerd worden. De eerste stap is een 16S rdna PCR, waarna een Exosap zuiveringsstap en een cycling sequencing reactie plaatsvindt. De cycling sequentie PCR-producten worden opgezuiverd en worden vervolgens met behulp van de capillaire elektroforese tot op 1 base nauwkeurig gescheiden. 16S rdna PCR Het 16S rrna gen is de 1542 bp lange RNA component van de kleine ribosomale subeenheid (30S) van prokaryoten. Dit gen bevat zowel sterk geconserveerde gebieden als variabele delen, wat het een goede target maakt voor fylogenetische studies. Een 16S rdna PCR-reactie kan een kort fragment van 530 bp of een lang fragment van 1500 bp van het 16S gen amplificeren. In de masterproef werd het lang fragment van 1500 bp geamplificeerd. De samenstelling van het PCR-mengsel, de gebruikte primers en de cycling condities zijn weergegeven in Tabel 2, 3 en 4 (zie Addendum). Protocol: Bewaar de reagentia op ijs tijdens de handelingen. Pipetteer het geschikte volume Faststart PCR master, forward primer, reverse primer en moleculair water in een 1.5 ml eppendorfbuisje in het pre-pcr lokaal (Tabel 2 in Addendum). Centrifugeer kort het PCRmengsel en pipetteer het geschikte volume PCR-mengsel in de gewenste wells van een 96- well plaat. Pipetteer de geschikte hoeveelheid DNA-extract in de corresponderende well in het lokaal waar DNA wordt toegevoegd. Centrifugeer de 96-well plaat gedurende 45 s en selecteer het juiste PCR-programma op de Veriti TM Thermal cycler (Tabel 3 in Addendum). Plaats de 96-well plaat in de Veriti TM Thermal cycler, sluit het deksel en laat het programma 18

28 Materialen en Methoden lopen. Controleer de aanwezigheid en de lengte van het geamplificeerde product met behulp van agarose gelelektroforese (zie 2.7.). Exosap zuivering Omdat resterende primers en dntp s kunnen interfereren met de cycle sequencing reactie, moeten deze verwijderd worden van de PCR producten. Deze zuiveringsmethode gebruikt een exonuclease dat ssdna afbreekt en een alkalische fosfatase dat de dntp s verwijdert. Protocol: Bewaar de reagentia op ijs tijdens de handelingen. Pipetteer per monster 0.05 µl 10 U Exonuclease I, 0.20 µl 1U FastAP TM Thermosensitive alkaline phosphatase en 0.75 µl HPLC water in een 1.5 ml eppendorfbuisje om het PCR-mengsel te maken. Maak altijd 10 % meer PCR-mengsel omdat de reagentia viskeus zijn. Vortex en shortspin het PCR-mengsel. Pipetteer 1 µl PCR-mengsel in de gewenste wells van een 96-well plaat. Pipetteer vervolgens 5 µl 16S rdna PCR-product in de corresponderende wells van de 96-well plaat en sluit het af met strips. Selecteer het programma ExoSap CleanUp in de VeritiTM Thermal cycler. Zet het reactie volume op 10 µl en plaats de 96-well plaat in het toestel. Sluit het deksel en laat het programma lopen. Cycle sequencing Bepaling van de sequentie berust op het Sanger principe. Met deze methode wordt de basensequentie van ssdna bepaald. Hiervoor worden dideoxyribonucleotide trifosfaten (ddntp) toegevoegd, die tijdens de elongatie zullen geïncorporeerd worden. Dit resulteert in het stoppen van de elongatie van de streng. Elke ddntp (ddatp, ddgtp, ddttp en ddctp) draagt een fluorescente molecule met een eigen kleur. De cycle sequencing reactie resulteert in een mengsel van ssdna-strengen met een verschillende lengte elk eindigend op een bepaalde ddntp. De samenstelling van het PCRmengsel, de gebruikte primers en de cycling condities zijn weergegeven in Tabel 2, 3 en 4 (zie Addendum). Protocol: Bewaar de reagentia op ijs tijdens de handelingen. Pipetteer in het pre-pcr lokaal het geschikte volume BigDye v3.1. master mix, BigDye v1.1 v3.1 buffer, primer en moleculair water aan een 1.5 ml eppendorfbuisje om het PCR-mengsel te maken (Tabel 2 in Addendum). Centrifugeer kort het PCR-mengsel en pipetteer 8 µl in de gewenste wells van een 96-well plaat. Pipetteer in het post-pcr lokaal 2 µl van de ExoSap gezuiverde 16S rdna PCR-product in de corresponderende wells van de 96-well plaat. Selecteer het gewenste programma (Tabel 3 in Addendum) en plaats de 96-well plaat in de VeritiTM Thermal cycler. Sluit het deksel en laat het programma lopen. 19

29 Materialen en Methoden Opzuiveren van PCR-product Deze methode wordt toegepast om de ssdna-strengen met de geïncorporeerde 3 -fluorescerende ddntp s op te zuiveren. Door middel van ethanol en natriumacetaat zullen de DNA-strengen neerslaan en de resterende moleculen (dntp s, ddntp s, primer, reactie buffer) zullen in oplossing blijven. Vervolgens zal formamide ervoor zorgen dat het DNA gedenatureerd zal worden bij een temperatuur van 95 C. Protocol: Voer alle handelingen in het post-pcr lokaal uit. Voorverwarm de heating block op 95 C. Maak een oplossing van 95 % ethanol met natriumacetaat door per monster 50 µl 95 % ethanol en 2 µl 3 M natriumacetaat te pipetteren in een 1.5 ml eppendorfbuisje. Pipetteer 52 µl ethanol-natriumacetaat in elke well. Centrifugeer de 96-well plaat gedurende 30 min bij maximale snelheid. Maak een 70 % ethanol oplossing door het geschikte volumes van 95 % ethanol en HPLC water te mengen. Draai en sla de 96-well plaat om op een papiertje totdat alle vloeistof in de wells is verdwenen. Pipetteer in elke well 150 µl 70 % ethanol en centrifugeer gedurende 5 min bij maximale snelheid. Plaats de 96-well plaat gedurende 2 min bij 95 C op de heating block en resuspendeer daarna elk staal met 25 µl gedeïoniseerd formamide. Plaats de 96-well plaat gedurende exact 2 min bij 95 C in de heating block en plaats deze vervolgens gedurende 10 min op ijs. Capillaire elektroforese (CE) voor sequentieanalyse Deze methode werd gebruikt om de sequentie van de opgezuiverde cycle sequencing producten te bepalen. CE is een scheidingstechniek die geladen deeltjes zal scheiden in een capillair onder invloed van een elektrisch veld. Hierdoor zullen DNA-strengen met verschillende lengte op een verschillend tijdstip de detector bereiken. De DNA-strengen met verschillende lengte eindigen allen op een 3 -fluorescerende ddntp. Elke base van de ddntp s komt overeen met een bepaalde golflengte en kleur. Naargelang de lengte van de DNA-streng en gemeten golflengte wordt een base voor een welbepaalde positie toegekend en deze gegevens worden omgezet in pieken gebruikmakend van het software programma Chromas Lite. In het software programma worden deze pieken een chromatogram die de sequentie van het cycle sequencing product zal bepalen. Protocol: Plaats de 96-well plaat op het ABI-16 capillaire elektroforese toestel. 20

30 Materialen en Methoden 2.7. Agarose gelelektroforese Agarose gelelektroforese is een scheidingstechniek van nucleïnezuren op basis van lading en grootte in een elektrisch veld. De agarose gel bestaat uit multipurpose (MP) agarose, Tris base-azijnzuur-edta (TAE) buffer en ethidium bromide (EtBr). Deze samenstelling vormt een poreuze agarose gel waardoor kleinere moleculen sneller zullen diffunderen dan grotere moleculen. DNA en RNA zijn negatief geladen waardoor ze naar de positieve zijde van de gel zullen diffunderen onder invloed van het elektrisch veld. Door de intercalatie van EtBr met DNA kunnen de moleculen in de gel zichtbaar gemaakt worden door belichting van UV-licht. De agarose gel is in een tweemaal TAE buffer verdunning in het elektrisch veld gelegen. Als referentie wordt eveneens een 1 kilobasenpaar (kb) ladder toegevoegd. Protocol: Weeg 1 g MP agarose per 100 ml TAE buffer af in een geschikte maatbeker. Meet in een maatbeker het geschikte volume TAE buffer af en voeg het toe aan de maatbeker met 1 g MP agarose. Verwarm de oplossing de eerste keer op het hoogste vermogen van de microgolf en twee keer op het laagste. Stop wanneer de oplossing borrelt. Voeg vervolgens een magneet toe en laat deze draaien door een magnetische draaier. Meet de temperatuur van de oplossing en pipetteer de juiste hoeveelheid 1 mg/ml EtBr toe bij 55 C is. Giet vervolgens de oplossing in een geschikt bakje met kammetje en laat de gel opstijven. Haal de agarose gel uit het bakje nadat de gel is opgesteven. Breng de gel in de buffer met de slotjes aan de positieve zijde van het elektrisch veld. Pipetteer 6 µl van elke mengsel met fragmenten in een well en pipetteer vervolgens hieraan 1.5 µl 5x sample buffer toe. Pipetteer hiervan 7 µl in een slotje. Pipetteer eveneens 7 µl 1 kb ladder in een slotje. Scheid de fragmenten in een elektrisch veld van 150 V en neem na 20 min een foto. DNA opzuiveren uit gelelektroforese bandjes (Wizard SV Gel Clean-up system, Promega) Protocol: Snij het bandje uit de gel en breng het over naar een 1.5 ml eppendorfbuisje met 120 µl membraan binding buffer. Vortex en incubeer bij 55 C totdat de gel volledig is opgelost. Pipetteer een gelijk volume membraan binding solution. Plaats een spin-kolom in een 2 ml collectiebuisje en pipetteer de geloplossing op de spin-kolom. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min en centrifugeer vervolgens bij 16,000 g gedurende 1 min. Plaats de spin-kolom in een nieuw 2 ml collectiebuisje. Pipetteer 700 µl membrane wash solution en centrifugeer bij 16,000 g gedurende 1 min. Plaats de spin-kolom in een nieuw 2 ml collectiebuisje. Pipetteer 500 µl membraan was buffer en centrifugeer bij 16,000 g gedurende 5 min. Leeg het 2 ml collectiebuisje en centrifugeer gedurende 1 min bij 16,000 g met het deksel van de spin-kolom open. Plaats de spin-kolom op een 1.5 ml eppendorfbuisje 21

31 Materialen en Methoden en pipetteer 50 µl nuclease free water. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min en centrifugeer vervolgens gedurende 1 min bij 16,000 g. Vries in bij -20 C Kwantificatie korte vetzuurketens De korte vetzuurketens acetaat, butyraat, iso-butyraat, valeraat, iso-valeraat, lactaat en propionaat werden gekwantificeerd in de stoelgangstalen met behulp van HPLC uitgevoerd door Yakult (Biotechnologiepark, Gent). Protocol: Voeg 0.1 M fosfaat buffer (ph 5.5) aan het stoelgangstaal toe om een 1/10 suspensie te verkrijgen. Meng 800 µl van de suspensie met 100 µl 10 % perchloorzuur en 100 µl 100 mm crotonzuur. Na overnacht incubatie bij 4 C, centrifugeer de suspensie. Pipetteer de supernatans op een 0.45 µm filter en analyseer het filtraat met de HPLC Statistische analyse De continue veranderlijken (bacteriële concentraties en de concentraties aan korte vetzuurketens) werden beschreven aan de hand van het gemiddelde, de mediaan, het minimum, het maximum en de interkwartiele spreiding. Vergelijkingen tussen groepen werden uitgevoerd met de Mann-Whitney U-test. Hiervoor werd verondersteld dat de continue variabelen niet normaal verdeeld waren. De Spearman (rank) test werd gebruikt om de mate van overeenkomst na te gaan tussen de continue variabelen (concentraties F. prausnitzii, E. coli, butyraat, acetaat en propionaat). Deze correlatiecoëfficiënt, gerapporteerd als de Spearman rho waarde (ρ), is een mate voor de overeenkomst tussen twee continue variabelen. Waarden dichtbij 1 duiden een sterke overeenkomst aan en waarden tegen 0 duiden geen overeenkomst aan. Bevindingen werden significant bevonden indien de p-waarde kleiner dan 0.05 was. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van de SPSS v30 software (Chicago, Illinois). 22

32 Resultaten 3. Resultaten 3.1. Faecalibacterium prausnitzii qpcr ontwikkeling Sequencing van Faecalibacterium prausnitzii stam M21/2 De Faecalibacterium prausnitzii stam M21/2, verkregen van Venessa Eeckhaut (Vakgroep pathologie, bacteriologie en pluimveeziekten, Faculteit Diergeneeskunde, UGent), werd ter controle gesequenced (zie ). Het 16S rrna gen werd geamplificeerd met primers αβ NOT en Ω MB (Tabel 4 in Addendum), en de verkregen sequentie werd vergeleken met een database in het software programma Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) [34]. Er werd een 99 % homologie met F. prausnitzii stam S3L/3 gevonden (Figuur 7). Figuur 7: Homologie van F. prausnitzii stam M21/2 met F. prausnitzii stam S3L/3 F. prausnitzii primers in silico onderzoek Aan de hand van literatuuronderzoek werden verschillende primers gevonden voor de amplificatie van F. prausnitzii. De primers werden vergeleken wat betreft lengte, smelttemperatuur (T m ), GC %, ampliconlengte, amplicon GC % en specificiteit met behulp van BLAST [34] en Oligo Analyzer [35]. De primers werden eveneens geanalyseerd op het voorkomen van hairpins (interne complementariteit), hetero- en homodimeren [35]. De resultaten staan samengevat in Tabel 5 23

33 Resultaten (zie Addendum). Aan de hand van Tabel 5 en de afwezigheid van primerdimeren werd gekozen om de primers Fprau_02 en Fprau_07 te bestellen en verder in deze studie te gebruiken. Bepaling van de F. prausnitzii primers annealingtemperatuur De geschikte annealingtemperatuur van de primers Fprau_02 en Fprau_07 werd gevonden met behulp van een (16S rdna) gradiënt PCR op de F. prausnitzii stam M21/2. Hierbij werden de temperaturen 54 C, 56 C, 58 C, 60 C, 62 C, 64 C, 65 C, 66 C, 67 C, 68 C en 69 C getest (Figuur 8). De amplicons werden gescheiden met behulp van agarose gelelektroforese (1 %). Alle bandjes hadden de verwachte grootte van 141 basenparen (bp). Bij een temperatuur van 65 C werd de sterkste amplificatie verkregen, waardoor 65 C als ideale annealingtemperatuur beschouwd werd (Figuur 8). Figuur 8: Agarose gelelektroforese van de F. prausnitzii 16S rdna gradiënt PCR Legende: A. 2: 54 C, 3: 56 C, 4:1 kb ladder, 5: 58 C, 6: 58 C, 7: 60 C, 8: 60 C; 9: 62 C, 10: 62 C, 11: 64 C en 12: 64 C. B. 4: 1 kb ladder, 5: 64 C, 6: 65 C, 7: 66 C, 8: 67 C, 9: 68 C en 10: 69 C. Aanmaak van een F. prausnitzii standaardreeks De concentratie van het F. prausnitzii PCR product werd met de Nanodrop bepaald als zijnde ng/µl, wat overeenkomt met 1.80 log14 amplicons per ml. Er werd vervolgens een tienvoudige verdunningsreeks van F. prausnitzii 16S rdna PCR product gemaakt. qpcr F. prausnitzii Met de primers Fprau_02 (0.3 µm) en Fprau_07 (0.3 µm) werd een qpcr assay op de standaardreeks uitgevoerd (Figuur 9). De samenstelling van het PCRmengsel en de cycling condities worden vermeld in Tabel 2 en 3 (zie Addendum). Alle standaarden gaven een amplificatiesignaal, behalve standaard -12 en de negatieve controle (Figuur 9A). De efficiëntie van de qpcr assay gaf als parameters E = 1.910, R 2 = 24

34 Resultaten en helling = (Figuur 9B). De standaarden hadden een gemiddelde smelttemperatuur van 85.2 C ( C) (Figuur 9C). Ter controle werden de standaarden verdunning -1 tot en met verdunning -12 gescheiden op gel en verdunning -1 tot en met verdunning -11 vertoonden een bandje met een lengte van 141 bp (Figuur 10). De negatieve controle en verdunning -12 gaven geen bandje (Figuur 10). Figuur 9: De amplificatiecurve (A), standaardcurve (B) en smeltcurve (C) van de F. prausnitzii standaardreeks Figuur 10: Agarose gelelektroforese van de F. prausnitzii standaardreeks Legende: 2: 1 kb ladder, 3: st-2, 4: st-3, 5: st-4, 6: st-5, 7: st-7, 8: st-8, 9: st-9, 10: st-10, 11: st-12, 12: negatieve controle en 13: 1 kb ladder. 25

35 Resultaten Specificiteits assay Om de specificiteit van de F. prausnitzii qpcr na te gaan werden 10 stoelgang Qiagen extracties (QE) meegenomen in een F. prausnitzii assay. Hiervan vertoonden vier QE s amplificatie en de andere QE s en de negatieve controles niet (Figuur 11A). De positieve QE s hadden een gemiddelde smelttemperatuur van 83.8 C ( C) (Figuur 11B). Na scheiden met behulp van agarose gelelektroforese, vertoonden de qpcrproducten van de positieve stalen een bandje met een lengte van ongeveer 140 bp terwijl de andere qpcr-producten en de negatieve controles geen bandje vertoonden (Figuur 12). De bandjes van de agarose gelelektroforese werden gesequenced. Hiervoor werden de bandjes uitgesneden en het DNA gezuiverd met behulp van centrifugatie (zie 2.7.). Deze sequenties hadden een % homologie met F. prausnitzii. Figuur 13 (zie addendum) geeft deze BLAST resultaten weer. Vervolgens werden de positieve qpcr-producten gesequenced. Er werd een % homologie met F. prausnitzii gevonden. De BLAST resultaten zijn weergegeven in Figuur 14 (zie Addendum). Figuur 11: Amplificatiecurve (A) en smeltcurve (B) van de specificiteit assay Figuur 12: Agarose gelelektroforese van de specificiteits assay Legende: 1: 1 kb ladder, 2: M1449, 3: M1482, 4: M1488, 5: M1496, 6: M1512, 7: M1551, 8: M1565, 9: M1567, 10: M1584, 11: M1592, 12: negatieve controle, 13: negatieve controle en 14: 1 kb ladder. 26

36 Resultaten Optimalisatie assay Voor het optimaliseren van de F. prausnitzii assay werden de primerconcentraties 0.3 µm, 0.5 µm en 0.7 µm op tien stoelgang QE s en de F. prausnitzii standaardreeks met verdunning st-3 tot en met verdunning st-9 getest. Door de kwantificatie cycli (Cq) waarden van de verschillende primerconcentraties te vergelijken, samen met het voorkomen van aspecifieke primerdimeerpieken, werd 0.5 µm als optimale primerconcentratie beschouwd. Deze gaf namelijk de meest gevoelige amplificatie, zonder optreden van primerdimeren. Vergelijking van F. prausnitzii stam M21/2 met positieve F. prausnitzii stoelgangstalen De smelttemperatuur van het amplicon van de F. prausnitzii stam bedraagt gemiddeld 85.2 C ( C) terwijl deze van de amplicons van de positieve stalen gemiddeld 83.8 C ( C) is. Dit verschil wordt aangetoond in Figuur 15. Met behulp van het alignment software programma ClustalW2 werd de sequentie van de standaardreeks vergeleken met deze van de stoelgang QE s. Figuur 16 toont een duidelijk verschil van tien basen (10/82) tussen de sequenties van de F. prausnitzii stam M21/2 en die van de stoelgang QE s M1449 en M1496. Figuur 15: Smeltpieken van de F. prausnitzii stam M21/2 (standaardreeks) en de positieve amplicons van de positieve stoelgang stalen Figuur 16: Alignering van de standaardsequentie met de stoelgangstalen sequenties Legende: Faecalibacterium: F. prausnitzii stam M21/2, FprausnitziiMombasa1: M1449, FprausnitziiMombasa2: M

37 Resultaten 3.2. Bifidobacterium species qpcr ontwikkeling In het onderzoek van Haarman & Knol (2005) werden de primers F_allbif_IS, R_allbif_IS en probe P_allbif_IS gebruikt om de 16S-23S intergenische spacer regio van bifidobacteriën te amplificeren en te detecteren (Tabel 4 in Addendum) [40]. Er werd geopteerd om dezelfde primers en probe te gebruiken voor de ontwikkeling van een qpcr specifiek voor bifidobacteriën op het LightCycler 480 platform. Testen van de specificiteit van de Bifidobacterium sp. primers Aan de hand van een Bifidobacterium sp. testpanel werd de specificiteit van de Bifidobacterium sp. primers nagegaan. Hiervoor werden stammen terug in cultuur gebracht op de geschikte kweekbodems (zie 2.3. en Tabel 1 in Addendum). Identificatie van de bacteriekolonies werd met behulp van MALDI-TOF bevestigd (indien de stam van de LBR collectie enkel tot op genus niveau geïdentificeerd werd) (zie ) en er werd een alkalische extractie uitgevoerd (zie 2.4.). Eveneens werden alkalische extracties (AE) van bifidobacteriën van de LBR collectie gebruikt (waarvan geen stam voorhanden was) om het testpanel te vergroten. De bifidobacteriën gebruikt als testpanel worden vermeld in Tabel 6 (zie Addendum). De primers werden vervolgens op het Bifidobacterium sp. testpanel getest. De PCR-producten werden gescheiden in een 1% agarosegel en vertonen allen een bandje met een lengte van 230 bp (Figuur 17). Bifidobacterium longum in laan 11 toont eveneens een tweede bandje met een lengte van 150 bp (Figuur 17A). De negatieve controles vertonen geen bandje (Figuur 17C). Figuur 17: Agarose gelelektroforese van de specificiteits assay Legende: A. 1: Bifidobacterium dentium VMF0500SRT53, 2: B. dentium VMF0500SRT51, 3: B. dentium VMF16VGOG13, 4: B. dentium VMF16VGOCOL12, 5: B. dentium VMF1634COL21, 6: B. dentium VMF16VGOS21, 7: B. bifidum PA0575, 8: B. bifidum 0_YHBHI_GLS7, 9: B. bifidum 0_YHBHI_GLS9, 10: B. bifidum 0_YHBHI_GLS17, 11: B. longum AEBV1112, 12: B. longum AEBV0150, 13: B. longum H , 14: B. breve VMF0500SVS33 en 15: B. breve VMF07RGOTW11. B. 16: B. breve VMF1900SRM11, 17: B. breve VMF2200SRM11, 18: B. breve VMF2200SRM21, 19: B. breve VMF0500SVS11, 20: B. adolescentis 2YHBHI_GLS21, 21: B. adolescentis 2YHBHI_GLS25, 22: B. adolescentis 2YHBHI_GLS35, 23: B. animalis POS02, 24: B. animalis CHCC5445A en 25: B. breve YHBHITG02. C. 1: B. breve 0_YHBHI_GLS8, 2: negatieve controle, 3: negatieve controle en 4: 1 kb ladder. 28

38 Resultaten Bifidobacterium sp. qpcr Om een Bifidobacterium sp. standaardreeks te verkrijgen werden bifidobacteria stammen (Bifidobacterium longum, B. dentium, B. breve, B. bifidum en B. animalis) uit de LBR collectie terug in cultuur gebracht (zie 2.3. en Tabel 1 in Addendum) waarvan vervolgens een Roche-extract (RE) werd gemaakt (zie ). De concentratie (ng/µl), gemeten met behulp van de Nanodrop 1000, was voor B. longum, B. dentium, B. breve, B. bifidum en B. animalis respectievelijk 63.84, , 93.59, en ng/µl, wat overeenkomt met 2.61 log10, 6.49 log10, 3.97 log10, 3.52 log10 en 3.90 log10 chr/ml. Van deze RE s werd een tienvoudige verdunningsreeks gemaakt om verschillende standaardreeksen te verkrijgen. Eveneens werd van elke standaardreeks de verdunning met concentratie log10 genomen om hiervan een mengsel te maken, waarvan dan ook een tienvoudige verdunningsreeks gemaakt werd. De primers met primerconcentratie 0.5 µm en probe met concentratie 0.1 µm werden in een hydrolyse probe assay getest op tien AE s van Bifidobacterium sp. en de standaardreeksen. Enkel B. adolescentis (BIFADO 2YHBHI_GLS25) en de B. bifidum standaardreeks vertoonden amplificatie (Figuur 18A). De andere negen AE s, de andere standaardreeksen en de negatieve controles waren negatief. Figuur 18: Amplificatiecurve van de Bifidobacterium sp. Assay Om de Bifidobacterium sp. assay te optimaliseren, werd allereerst de annealingtemperatuur van 60 C naar 50 C gebracht. Dit resulteerde in amplificatie van B. adolescentis en de standaardreeksen behalve die van B. longum en B. animalis, maar deze verandering leidde niet tot een optimale Bifidobacterium sp. assay (Figuur 18B). Verdere optimalisatie werd uitgevoerd op B. adolescentis (2YHBHI_GLS25) en B. bifidum standaardreeks. De annealingen elongatietijd werden gewijzigd van respectievelijk 30 s naar 40 s en 1 s naar 10 s. Dit bracht een verlaging van 3 Cq-waarden voor B. adolescentis teweeg en 1 Cq-waarde voor de B. bifidum standaardreeks. Daarna werd de annealingtemperatuur verder verlaagd naar 48 C en dit resulteerde in een verhoging van 2 Cq-waarden voor beiden. Primerconcentratie 0.7 µm werd eveneens getest, maar dit resulteerde in een verlaging van 2 Cq-waarden voor B. 29

39 Resultaten adolescentis en in een verhoging van 3 Cq-waarden voor de B. bifidum standaardreeks. Eveneens werden de primers getest zonder probe in een SYBR Green assay. B. adolescentis en de standaardreeks van B. bifidum vertoonden amplificatie, maar met zeer hoge Cq-waarden. Deze assay werd voorlopig niet verder geoptimaliseerd R-gene qpcr validatie Ter controle van de kwaliteit van de klinische stoelgangstalen werd de Cell Control R-gene testkit (Cell Control r-gene TM kit, Argene, Biomérieux) gebruikt. Dit is een hydrolyse probe assay om het humaan gen hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1 (HPRT1) te amplificeren en te detecteren. Deze kit werd gevalideerd op een verdunningsreeks van een buffycoat RE en drie stoelgang QE s. De standaarden QS1 (10 4 gen kopijen/µl) en standaard QS2 (10 3 gen kopijen /µl) werden bij de testkit geleverd. Volgens de voorgeschreven werkwijze van Argene werden van QS1 en QS2 drie intermediaire standaarden (ST1, ST2 en ST3) gemaakt. Om ST1, ST2 en ST3 te verkrijgen, werd respectievelijk ¾ QS1 en ¼ QS2, ½ QS1 en ½ QS2 en ¼ QS1 en ¾ QS2 in een 0.6 ml eppendorfbuisje gepipetteerd. De buffycoat RE verdunningen, de stoelgang QE s en de standaardreeks (Figuur 19A) vertonen amplificatie. De negatieve controles gaven geen amplificatiesignaal. In deze qpcr werd een efficiëntie van 2.155, helling van en R 2 - waarde van verkregen (Figuur 19B). De samenstelling van het PCR-mengsel en de cycling condities staan vermeld in Tabel 2 en 3 (zie Addendum). Figuur 19A toont aan dat het moeilijk is om met drie intermediaire standaarden een correcte en betrouwbare standaardreeks te maken. Figuur 19: Amplificatiecurve (A) en standaardcurve (B) van de Cell Control R-gene testkit standaardreeks Legende: ST1: ¾ QS1 + ¼ QS2, ST2: ½ QS1 + ½ QS2, ST3: ¼ QS1 + ¾ QS2. 30

40 Resultaten Omdat de door de fabrikant voorgestelde manier van werken i.v.m. het opmaken van een standaardcurve ons niet optimaal leek, werd een betrouwbaardere standaardreeks gemaakt door van standaard QS2 twee opeenvolgende tienvoudige verdunningen QS3 (10 2 /µl) en QS4 (10 1 /µl) te maken. De standaardcurve van QS1, ST1, ST2, ST3, QS2, QS3 en QS4 heeft een efficiëntie van 1.865, een helling van en een R 2 -waarde van 1. De amplificatie en standaardcurve van de standaardreeks is weergegeven in Figuur 20. De verdere R-gene qpcr assays werden met deze standaardreeks uitgevoerd. Figuur 20: Amplificatie curve (A) en standaardcurve (B) van de R-gene standaardreeks Legende: ST1: ¾ QS1 + ¼ QS2, ST2: ½ QS1 + ½ QS2, ST3: ¼ QS1 + ¾ QS Invloed van intestinale helminth infecties op de intestinale microflora Prevalentie van intestinale helminth infecties Intestinale helminth infecties werden nagegaan met behulp van de McMaster methode. Deze methode bestaat eruit door middel van microscopie de aanwezigheid van helminth eitjes in een fecale suspensie aan te tonen [33]. In zeven stoelgangstalen werden eitjes van helminthen gevonden (7/128, 5.47 %). Hiervan waren twee stoelgangstalen positief voor Ascaris lumbricoides (2/128, 1.56 %), één voor Trichuris trichiura (1/128, 0.78 %) en drie voor mijnwormen (3/128, 2.34 %). Eveneens werd in een stoelgangstaal Schistosoma mansoni eitjes gevonden en Hymenolepis nana eitjes in een mijnworm geïnfecteerd stoelgangstaal. Door middel van een PCR met specifieke Necator americanus primers Na58F en Na158R (Tabel 4 in Addendum) werd een moleculaire methode gebruikt voor de detectie van mijnworm. De samenstelling van het PCR-mengsel en de cycling condities van deze N. americanus PCR zijn weergegeven in Tabel 2 en 3 (zie Addendum). Stoelgangstalen werden als positief beschouwd indien het PCR-product een bandje gaf van verwachte lengte na 31

41 Resultaten scheiding op 1% agarose gel. Dit gaf dertien positieve stoelgangstalen voor N. americanus (13/128, %) (Tabel 7). In totaal werden met microscopie en PCR 17 positieve stoelgangstalen voor helminthen gevonden, wat neerkomt op % van de studiepopulatie. Tabel 7: Mijnworm diagnose door middel van microscopie en N. americanus PCR Microscopie N. americanus PCR Positief (%) Negatief Totaal Positief 3 (2.34) 0 (0) 3 (2.34) Negatief 10 (12.8) 0 (0) 125 (97.66) Totaal 13 (10.16) 115 (89.84) 128 (100) Faecalibacterium prausnitzii, Echerichia coli en totaal aantal bacteriën qpcr Met behulp van de ontwikkelde F. prausnitzii qpcr en met reeds bestaande 16S en E. coli qpcr s van het LBR werd de intestinale microflora bestudeerd. De resultaten zijn weergegeven in Tabel 8. PCR inhibitie werd nagegaan door amplificatie van een exogeen toegevoegd gen (jellyfish aequorine gen) en werd gedefinieerd als een verhoging van de Cq waarde 2 in een stoelgangstaal t.o.v. een standaard. Bij acht stoelgangstalen werd inhibitie aangetoond, maar deze werd opgeheven door deze 1/10 te verdunnen. Een gemiddelde concentratie van 4.95 log9 chr/ml (3.22 log log10) voor het totaal aantal bacteriën, een gemiddelde concentratie van 3.16 log8 chr/ml (1.60 log log9) voor E. coli en een gemiddelde concentratie van 4.51 log7 chr/ml (2.66 log log8) voor F. prausnitzii werden in de klinische stoelgangstalen gevonden. Wegens de grote microbiële variatie in de intestinale microflora werden E. coli en F. prausnitzii genormaliseerd t.o.v. het totaal aantal bacteriën. Tabel 8: Overzicht resultaten van de F. prausnitzii, E. coli en totaal aantal bacteriën qpcr Gemiddelde Mediaan Range Minimum Maximum Totaal aantal bacteriën (chr/ml) 4.95 log log log log log10 E. coli (chr/ml) 3.16 log log log log log9 F. prausnitzii (chr/ml) 4.51 log log log log log8 E. coli/bacteriën (%) F. prausnitzii/bacteriën (%) Legende: chr/ml: chromosomen per ml, E. coli/bact.: verhouding van E. coli op totaal aantal bacteriën. 32

42 Resultaten De studiepopulatie werd opgedeeld in enerzijds een helminth geïnfecteerde en nietgeïnfecteerde groep en anderzijds in een N. americanus positieve en negatieve groep. De helminth geïnfecteerde groep omvat alle gedetecteerde helminth infecties zowel met de microscopische methode als met de PCR methode. In de helminth geïnfecteerde en N. americanus positieve groep werden dalingen van het totaal aantal bacteriën waargenomen t.o.v. de niet-geïnfecteerde groepen, neigend naar significantie (respectievelijk p = en p = 0.226). In de helminth geïnfecteerde groep was er een nietsignificante daling van E. coli (p = 0.314) terwijl het percentage E. coli (concentratie E. coli/concentratie bacteriën) een niet significante stijging vertoonde (p = 0.498). Eenzelfde trend werd gevonden in de N. americanus positieve groep waar eveneens een niet significante daling van E. coli gevonden werd (p = 0.551) en een niet significante stijging van het percentage E. coli, telkens t.o.v. de niet-geïnfecteerde groepen (p = 0.510). Een niet significante stijging van F. prausnitzii werd in de helminth geïnfecteerde groep waargenomen (p = 0.598), maar bij het percentage F. prausnitzii (concentratie F. prausnitzii/concentratie bacteriën) werd een niet significante daling (p = 0.582) waargenomen. In de N. americanus geïnfecteerde groep werd een daling van F. prausnitzii met een neiging naar significantie vastgesteld (p = 0.232) en bij het percentage F. prausnitzii een niet significante daling (p = 0.984). Deze resultaten zijn samengevat in Tabel 9 (zie Addendum) en visueel weergegeven in Figuur 21. Eveneens werden correlaties tussen F. prausnitzii, E. coli en totaal aantal bacteriën nagegaan. Enkel een significante correlatie tussen het percentage F. prausnitzii en het percentage E. coli werd aangetoond (p < 0.05) waarbij het percentage F. prausnitzii stabiel blijft t.o.v. het percentage E. coli (Figuur 22). 33

43 Resultaten A B C D Figuur 21: Boxplots van F. prausnitzii, Escherichia coli, totaal aantal bacteriën (A en B), het percentage F. prausnitzii en het percentage E. coli (C en D) op helminth geïnfecteerde en nietgeïnfecteerde groepen en op N. americanus positieve en negatieve groepen Legende: : uitbijter, *: extreme uitbijter, A en B: Y-as logaritmische schaal, C en D: Y-as in promille. Figuur 22: Scatterplot die de correlatie tussen het percentage E. coli en het percentage F. Legende: Y-as en X-as: in promille. prausnitzii weergeeft 34

44 Resultaten Kwantificatie concentraties korte vetzuurketens In een subgroep van 30 deelneemsters werden butyraat, propionaat, lactaat, valeraat, iso-butyraat en acetaat gemeten in stoelgangstalen. De meeste waarden voor lactaat, valeraat en iso-butyraat waren onder de detectielimiet en werden niet meegenomen in de analyse. Een gemiddelde concentratie van 17.9 µmol/ml butyraat (0-41.8), 68.9 µmol/ml acetaat ( ) en 24.0 µmol/ml propionaat ( ) werd gedetecteerd (Tabel 10). Tabel 10: Overzicht resultaten van de korte vetzuurketens butyraat, acetaat en propionaat. Gemiddelde Mediaan Range Minimum. Maximum Butyraat (µmol/ml) Acetaat (µmol/ml) Propionaat (µmol/ml) De helminth geïnfecteerde groep had een niet significante stijging van de drie bestudeerde korte vetzuurketens (butyraat: p = 0.595; acetaat: p = 0.402; propionaat: p = 0.494). Een niet significante stijging van de korte vetzuurketens werd eveneens gevonden in de N. americanus positieve groep (butyraat: p = 0.208; acetaat: p = 0.208; propionaat: p = 0.173) (Tabel 9 in Addendum). Deze resultaten zijn visueel weergegeven in Figuur 23. Eveneens werd de correlatie tussen de korte vetzuurketens nagegaan. Acetaat correleerde significant positief met butyraat (p < 0.05) en eveneens met propionaat (p < 0.05), en er was een significante positieve correlatie tussen butyraat en propionaat (p < 0.05). Deze positieve correlaties zijn weergegeven in Figuur 24. Figuur 23: Boxplots van butyraat, acetaat en propionaat op helminth geïnfecteerde en nietgeïnfecteerde groepen (A) en eveneens op N. americanus positieve en negatieve groepen (B) Legende: Y-as: concentratie met eenheid µmol/ml. 35

45 Resultaten Figuur 24: Scatterplot die de correlatie tussen butyraat, acetaat en propionaat weergeeft. Legende: Y-as en X-as: concentratie in µmol/ml. Relatie tussen intestinale microflora en korte vetzuurketens Aan de hand van de Pearson correlatie werd een verband tussen korte vetzuurketen productie en de bestudeerde bacteriële species nagegaan. E. coli vertoonde een significant negatieve correlatie met acetaat (p < 0.05) en met butyraat (p < 0.05), maar niet met propionaat (p > 0.05) (Figuur 25). Deze negatieve correlatie werd niet significant bevonden bij het percentage E. coli (p > 0.05). Eveneens werd er geen significante correlatie gevonden tussen de korte vetzuurketens, F. prausnitzii en het percentage F. prausnitzii (p > 0.05). Figuur 25: Scatterplots die de correlatie tussen E. coli met acetaat en butyraat aantonen Legende: Y-as: concentratie in µmol/ml, X-as: concentratie in chromosomen per ml. 36

46 Bespreking 4. Bespreking 4.1. qpcr ontwikkeling In het eerste deel van deze masterproef werd voor de moleculaire detectie en kwantificatie van Faecalibacterium prausnitzii en Bifidobacterium sp. in klinische stoelgangstalen een kwantitatieve polymerase kettingreactie (qpcr) ontwikkeld. F. prausnitzii qpcr ontwikkeling Een F. prausnitzii stam M21/2, verkregen van de diergeneeskunde UGent werd gebruikt om de F. prausnitzii qpcr te ontwikkelen. De ontwikkeling van de F. prausnitzii qpcr-assay werd gestart met de vergelijking van verschillende primers, gevonden in de literatuur, met een database van het software programma Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) [34] en Oligo Analyzer [35]. Op basis van de primerlengte, ampliconlengte, GC %, smelttemperatuur (T m ) en het voorkomen van primerdimeren en hairpin structuren werden de primers Fprau_02 en Fprau_07 [41] geselecteerd en verder in deze studie gebruikt. Ter controle werd de F. prausnitzii stam M21/2 gesequenced en vergeleken met een database van BLAST, wat resulteerde in 99 % homologie met F. prausnitzii stam S3L/3. Vervolgens werd de optimale annealingtemperatuur van de F. prausnitzii primers bepaald, want een te lage annealingtemperatuur kan zorgen voor amplificatie van niet specifieke producten terwijl een te hoge annealingtemperatuur de gevoeligheid kan verlagen [37]. Verschillende annealingtemperaturen van de primers werden getest in een gradiënt PCR waarvan de producten werden gescheiden op een gel. Hieruit bleek dat 65 C de sterkste amplificatie gaf en deze temperatuur werd als optimale annealingtemperatuur beschouwd. Hierna werd een tienvoudige verdunningsreeks van het 16S rdna PCR-product van 65 C gemaakt om de standaardreeks te verkrijgen. Amplificatie en detectie van de standaardreeksen gebeurde met een efficiëntie van 1.910, een helling van en een R 2 -waarde van Smeltcurve analyse resulteerde in smeltpieken met een gemiddelde smelttemperatuur van 85.2 C en de bandjes van de standaarden lagen allen op een verwachte hoogte van 141 bp. Uit deze resultaten kan afgeleid worden dat dit een efficiënte F. prausnitzii qpcr-assay was. Vervolgens werd de specificiteit van de primers op tien stoelgang qiagen extracties getest. De amplicons van de vier positieve stalen vertoonden een enkel bandje van 141 bp na scheiding op gel waaruit kan afgeleid worden dat er geen aspecifieke PCR-producten gevormd werden. Sequencing van de qpcr-producten en de qpcr-producten gescheiden op gel met primers Fprau_02 en Fprau_07 resulteerde in sequenties die respectievelijk een % en een 98-37

47 Bespreking 100 % homologie met F. prausnitzii vertoonden. De lagere homologie van de sequenties van de qpcr-producten in de gel kan te wijten zijn door de blootstelling aan UV-licht, nodig voor de visualisatie van de PCR producten na elektroforese, dat DNA afbreekt. Hieruit kan worden besloten dat de primers Fprau_02 en Fprau_07 specifiek zijn voor F. prausnitzii. Voor het optimaliseren van de F. prausnitzii qpcr werden de primerconcentraties 0.3 µm, 0.5 µm en 0.7 µm getest. Hieruit bleek de optimale primerconcentratie 0.5 µm te zijn. Hoge primerconcentraties kunnen leiden tot aspecifieke bindingen doordat de primers beter en sneller op DNA binden bij hogere concentraties. De smeltpieken van de standaardreeks M21/2 hadden een gemiddelde van 85.2 C terwijl deze van de QE s een gemiddelde hadden van 83.8 C. Dit kan mogelijk verklaard worden doordat de stam die gebruikt werd voor de standaardreeks en de stammen die in de stoelgangstalen gedetecteerd werden verschillend zijn. Om dit na te gaan, werden de sequenties van de F. prausnitzii stam M21/2 gealigneerd met de sequenties van de klinische stoelgangstalen. Een verschil van tien basen in een sequentie van 82 basen werd aangetoond, wat de verschillende smelttemperatuur kan verklaren. Deze ontwikkelde F. prausnitzii qpcr-reactie is een specifieke en efficiënte methode voor het moleculair detecteren en kwantificeren van F. prausnitzii. Bifidobacterium sp. qpcr ontwikkeling In de studie van Haarman & Knol (2005) werden de primers F_allbif_IS, R_allbif_IS en probe P_allbif_IS gebruikt om Bifidobacterium sp. te amplificeren en te detecteren [40]. De specificiteit van deze primers werden getest op een Bifidobacterium sp. testpanel. De primers zijn specifiek voor Bifidobacterium sp. doordat alle PCR-producten een enkel bandje met een lengte van 231 bp vertoonden, wat overeenkomt met de verwachte amplicon lengte. Enkel Bifidobacterium longum AEBV1112 had een tweede bandje met een lengte van 150 bp wat kan wijzen op een niet zuiver alkalisch extract of op amplificatie van B. longum met een andere amplicon lengte. Een hydrolyse probe assay op zes verschillende Bifidobacterium sp. (B. adolescentis, B. longum, B. animalis, B. bifidum, B. dentium en B. breve) leidde tot een amplificatie van enkel B. adolescentis en B. bifidum (terwijl met conventionele PCR alles geamplificeerd werd). Er werd geopteerd om de annealingtemperatuur te verlagen van 60 C naar 50 C om meer amplificatie te verkrijgen. Dit resulteerde in amplificatie van B. bifidum, B. adolescentis, B. breve en B. dentium, maar nog steeds niet van B. animalis en B. longum. Eveneens werd de annealingtijd van 30 s naar 40 s gewijzigd en de elongatietijd van 1 s naar 10 s, wat enkel een verlaging van 3 Cq-waarden (gevoeliger) teweeg bracht voor B. adolescentis en 1 Cq-waarde 38

48 Bespreking voor B. bifidum. Daarna werd de annealingtemperatuur verder verlaagd naar 48 C; maar dit resulteerde in een verhoging van 2 Cq-waarden. Een hogere primerconcentratie van 0.7 µm werd getest, wat resulteerde in een verlaging van 2 Cq-waarden voor B. adolescentis en een verhoging van 3 Cq-waarden voor de B. bifidum. De primers werden ook getest zonder de aanwezigheid van de probe in een SYBR Green assay. Er was amplificatie van B. bifidum, maar met zeer hoge Cq-waarden. Uiteindelijk slaagden we er niet in om alle gewenste species te amplificeren en een efficiënte standaardreeks te verkrijgen. De Bifidobacterium sp. qpcr zal nog verder geoptimaliseerd moeten worden, maar dit zal buiten het praktisch werk van deze masterproef vallen. R-gene qpcr validatie Om de kwaliteit van de klinische stoelgangstalen te controleren werden humane cellen in de stoelgangstalen gedetecteerd en gekwantificeerd met behulp van een commerciële qpcr kit (Argene). Deze kit werd eerst op buffycoat DNA extractie verdunningen en drie stoelgang QE s getest. Alle stalen vertoonden amplificatie en de negatieve controles niet. Echter, de door de fabrikant aangeraden standaardreeks, bestond uit twee meegeleverde standaarden QS1 en QS2 (QS2 zijnde een tienvoudige verdunning van QS1), waarmee drie tussenliggende standaarden ST1, ST2 en ST3 dienden gemaakt te worden. Dit leverde echter een erg onbetrouwbare standaardcurve op. Er werd besloten deze richtlijnen niet verder te volgen en een standaardreeks te maken van QS1, QS2 en twee opeenvolgende tienvoudige verdunningen van QS2. Dit resulteerde in een betrouwbaardere standaardcurve met parameters E = 1.865, helling = en R 2 = 1. Deze Cell Control kit werd gevalideerd en gebruikt om humane cellen te detecteren en te kwantificeren in de klinische stoelgangstalen Invloed van geohelminthen op de intestinale microflora Een tweede deel van de masterthesis bestond erin de invloed van geohelminthen op de intestinale microflora na te gaan. Doordat geohelminthen voor meerdere jaren in het gastrointestinaal stelsel verblijven [4], treedt een nauwe samenleving tussen de geohelminthen en de intestinale microflora op [14]. Om de mogelijke invloed van geohelminthen op de samenstelling van de intestinale microflora na te gaan, werden stoelgangstalen verzameld van 128 Keniaanse vrouwen uit Mombasa, een gebied waar de prevalentie 20-50% is voor geohelminthen [47]. De microbiële compositie ervan werd beschreven aan de hand van concentratie aan bacteriën en de concentratie aan en verhouding van E. coli en F. prausnitzii. 39

49 Bespreking Prevalentie van geohelminthen in de studiepopulatie De geohelminth diagnose werd uitgevoerd met behulp van microscopie [33]. Dit resulteerde in zeven positieve stoelgangstalen waarvan één met Trichuris trichiura (1/128, 0.78 %), twee met Ascaris lumbricoides (2/128, 1.56 %) en drie met mijnwormen (3/128, 2.34 %). Voor mijnworm kon er geen onderscheid gemaakt worden tussen Ancylostoma duodenale en Necator americanus omdat hun eitjes microscopisch niet te onderscheiden zijn [6]. Er werd ook geopteerd om N. americanus infecties te detecteren door middel van PCR aangezien de gekende lage gevoeligheid van microscopie [42]. Dertien N. americanus PCR-producten gescheiden op gel vertoonden een bandje met de verwachte lengte (13/128, %), waarvan drie overeenkwamen met de positieve stoelgangstalen gedetecteerd met behulp van microscopie. Aan de hand van PCR werden tien positieve stalen meer gevonden en geen van de microscopisch positieve stalen werd gemist, wat ons doet besluiten dat deze PCR gevoeliger is dan microscopische technieken. In totaal werden met N. americanus PCR en McMaster microscopie zeventien stoelgangstalen positief gevonden voor helminthen (17/128, %). Dit is lager dan de verwachte prevalentie van % [47]. Dit kan mogelijks verklaard worden doordat onze studiepopulatie van vrouwen (16-30 jaar) gerekruteerd werden uit Mombasa, een grootstad aan de kust van Kenia, waar de kans op infectie kleiner is. In de meeste epidemiologische studies bestaat de studiepopulatie uit rurale populaties, voornamelijk kinderen (5-14 jaar), die een hogere wormlast hebben dan volwassenen [5]. Bij ons weten werden nog geen studies gedaan naar het voorkomen van geohelminthen in een Afrikaanse (peri-)urbane bevolkingsgroep. Anderzijds kan de lagere prevalentie mogelijk verklaard worden door de World Health Organization (WHO) interventies die gebaseerd zijn op toediening van effectieve antihelminth medicijnen, die jaarlijks aanbevolen worden in gebieden met een geohelminth prevalentie van % [5]. Door middel van PCR werd enkel naar N. americanus gezocht, maar nog niet naar A. duodenale, T. trichiura en A. lumbricoides. De kans om meer positieve stalen voor deze species te detecteren met behulp van PCR is niet onbestaande en dit zou tot een hogere detectie van geohelminthen in de studiepopulatie kunnen leiden. Invloed van helminthen op intestinale microflora Om de invloed van helminthen op de intestinale microflora na te gaan, werd de studiepopulatie opgedeeld in enerzijds een helminth geïnfecteerde en een niet-geïnfecteerde groep en anderzijds in een N. americanus positieve en negatieve groep. De helminth geïnfecteerde groep omvat alle gedetecteerde 40

50 Bespreking helminth infecties zowel met microscopie als met PCR. We vonden een daling met neiging naar significantie van het totaal aantal bacteriën in de helminth geïnfecteerde (p = 0.112) en N. americanus positieve groep (p = 0.226). Escherichia coli daalde niet significant bij helminth (p = 0.314) en N. americanus infectie (p = 0.551). In de helminth geïnfecteerde groep werd een niet significante stijging van F. prausnitzii waargenomen (p = 0.598) terwijl in de N. americanus positieve groep een daling met neiging naar significantie werd gevonden (p = 0.232). Wanneer E. coli en F. prausnitzii genormaliseerd werden op de concentratie aan bacteriën, bracht dit andere resultaten teweeg in de helminth geïnfecteerde en N. americanus positieve groepen voor beide bacteriële species. Een niet significante stijging van het percentage E. coli (concentratie E. coli/concentratie bacteriën) werd in beide groepen vastgesteld (helminth +: p = 0.498; N. americanus +: p = 0.510) terwijl het percentage F. prausnitzii (concentratie F. prausnitzii/concentratie bacteriën) resulteerde in een niet significante daling in beide geïnfecteerde groepen (helminth +: p = 0.582; N. americanus +: p = 0.984). Walk et al. (2010) vonden een significante wijziging van de intestinale microflora in muizen geïnfecteerd met Heligmosomoides polygyrus, een rondworm aanwezig in de dunne darm van muizen. In deze studie bestudeerde men door middel van 16S rrna gen klonering en sequencing de microflora aan de hand van biopsieën van het ileum en de blindedarm. Men vond een significante stijging in de abundantie van de familie Lactobacillaceae in het ileum. De bacteriële abundantie steeg eveneens significant in het ileum, maar niet in de blindedarm waaruit men afleidde dat het aantal bacteriën stijgt op de plaats van infectie [29]. Dit komt niet overeen met onze resultaten die een niet significante daling van de concentratie aan bacteriën bij helminth infecties aantoont. In de studie van Walk et al. (2010) werd de microflora van het ileum en de blindedarm geanalyseerd door middel van biopsieën, wat echter niet toe te passen is in humane studies. In onze studie werd de bacteriële compositie beschreven van stoelgangstalen, wat de gehele intestinale microflora omvat. Nobre en medewerkers (2004) toonden eveneens een significante stijging van het totaal aantal bacteriën in ileum en colon van geïnfecteerde muizen met Angyostrongylus costaricensis aan. In deze studie werden bacteriële species in ileum en colon nagegaan aan de hand van aerobe en anaerobe kweek. Dit resulteerde voornamelijk in een stijging van lactobacillen en Streptococcus spp. in het ileum terwijl in het colon voornamelijk de anaerobe bacteriën van de Bifidobacterium spp., Bacteroides spp. en Veilonella spp. stegen in de geïnfecteerde groep. Bij infectie werd een daling van de anaerobe Peptostreptococcus spp. in ileum en colon 41

51 Bespreking gevonden terwijl Streptococcus spp., Eubacterirum spp. en Fusobacterium spp. in het colon vastgesteld werden en voordien niet [27]. In onze studie werd een niet significante daling gevonden van het percentage F. prausnitzii en van de totale concentratie aan bacteriën. In de studie van Nobre et al. (2004) en in onze studie werden echter twee verschillende methoden gebruikt, namelijk kweek en qpcr. Nobre et al. (2004) vonden een stijging van concentratie aan E. coli in het colon van geïnfecteerde muizen met Angyostrongylus costaricensis [27]. Ondanks de verschillende gebruikte methoden is er een overeenkomst met onze resultaten die een niet significante stijging van het percentage E. coli aantoonden in de helminth geïnfecteerde groep. Structurele componenten van E. coli zijn essentieel bevonden voor de ontluiking van Trichuris muris eitjes (verwant van T. trichiura) in vitro [28]. We kunnen speculeren dat de gevonden niet significante stijging van het percentage E. coli een gevolg is van de noodzaak aan E. coli voor het ontluiken van de helminth eitjes. Om dit met zekerheid te kunnen vaststellen is verder onderzoek nodig. Li en medewerkers (2002) onderzochten de infectie van de helminth Trichuris suis (verwant van T. trichiura) bij varkens met behulp van 16S rrna gen gebaseerde pyrosequencing. Hierbij vonden ze een significante wijziging van de abundantie van ~13 % van de genera bij infectie [30]. Wu et al. (2012) bestudeerde eveneens T. suis infecties bij varkens met behulp van pyrosequencing. Men vond ook een significante abundantie wijziging van ~13 % van de genera bij infectie. Er werd echter geen significante wijziging van het percentage F. prausnitzii gevonden [31]. Hoewel verschillende methoden gebruikt werden, werd een dezelfde trend gevonden in onze resultaten, die een niet significant verschil van het percentage F. prausnitzii tussen de helminth geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde groepen aantonen. In onze studie resulteerden de helminth infecties in een niet significante wijziging van de intestinale microflora. Er is echter toch een duidelijk verschil aan te tonen tussen helminth geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde groepen. Doordat enkel met PCR naar N. americanus infecties in de klinische stoelgangstalen werd gezocht, kan de aanwezigheid van A. duodenale, T. trichiura, A. lumbricoides of andere helminth species in de helminth niet-geïnfecteerde groep niet uitgesloten worden. De meeste studies die de interactie tussen helminthen en de intestinale microflora bestuderen, maken gebruik van pyrosequencing [30, 31]. Een voordeel van pyrosequencing is dat men 42

52 Bespreking met één studie een idee kan krijgen over de bacteriële diversiteit, en welke taxa over- en ondervertegenwoordigd zijn. Nadeel is dat men vaak niet tot op species niveau kan identificeren waardoor belangrijke informatie gemist kan worden. In onze studie werden slechts enkele bacteriële species op species niveau gedetecteerd met behulp van qpcr. Wijziging van de intestinale microflora kunnen te wijten zijn aan de secretie van helminth afgeleide moleculen die een invloed hebben op de gastheer immuunrespons [4, 13]. Ook directe schade aan de mucosa door innesteling van de eitjes, migratie van de larven en vasthechting van de volwassen wormen kunnen gunstige locaties gecreëerd worden, wat kan leiden tot een hechtingplaats voor bacteriën en het vergemakkelijken van replicatie [27]. Deze hypothese wordt ondersteund door de studie van Li et al. (2012) waarbij T. suis infecties in varkens resulteerde in een significant verhoogd percentage Mucispirillum bacteriën. Men suggereert dat deze stijging een gevolg is van de mucosale schade door T. suis, die zich voedt met mucopolysacchariden en mucoproteïnen, en op deze manier de bacteriële compositie wijzigt ten voordele van de Mucispirillum bacteriën [30]. We kunnen hypothetiseren dat de niet significante stijging van het percentage E. coli in onze studie hierdoor verklaard kan worden. Bij T. suis infecties constateerde men oleïnezuur in de proximale dikke darm van varkens wat aangeeft dat T. suis infecties wijzigingen in het vetmetabolisme kunnen induceren. Dit wordt mogelijks verkregen door de microbiële compositie te veranderen. Daarnaast bevat oleïnezuur antibacteriële eigenschappen die zullen bijdragen tot de microbiële compositie verandering [30, 31]. Indien oleïnezuur gestegen is in het colon van onze studiepopulatie, kunnen we suggereren dat de niet significante reductie van de concentratie aan bacteriën en het percentage F. prausnitzii hiervan een gevolg kunnen zijn. Volwassen mijnwormen hechten zich vast met hun mondhaken in de mucosa en submucosa van de dunne darm, wat zorgt voor verlies van grote hoeveelheden intestinaal bloed met het optreden van anemie en ijzerdeficiëntie tot gevolg [4, 6]. Dit kan voor een verandering van de omgeving van de intestinale microflora zorgen, want ijzer is een erg belangrijk nutriënt voor bepaalde bacteriën. Dit werd aangetoond in een studie die het effect van ijzer toediening op de intestinale microflora bij kinderen bestudeerde. Men vond een daling van de gunstige darmbacteriën (lactobacillen) en een stijging van meer ijzerafhankelijke enterobacteriën [48]. We kunnen vaststellen dat helminth en N. americanus infecties de intestinale microflora van de mens wijzigen. De effectieve mechanismen tot deze microbiële compositie verandering is echter nog niet geweten waardoor verder onderzoek nodig is. 43

53 Bespreking F. prausnitzii en E. coli en bacteriële abundantie De algemene abundantie van F. prausnitzii, E. coli en het totaal aantal bacteriën in onze Keniaanse studiepopulatie werd ook onderzocht. De gemiddelde bacteriële concentratie bedroeg 4.95 log10 bacteriën per gram stoelgang. E. coli werd met een gemiddelde concentratie van 3.16 log9 bacteriën per gram stoelgang gedetecteerd, dit is 13.8 % van alle bacteriën. F. prausnitzii werd in onze studie teruggevonden met een gemiddelde concentratie van 4.51 log8 bacteriën per gram stoelgang en een gemiddeld percentage van 6.3 % van de bacteriën. Schwiertz en medewerkers (2010) bepaalden met behulp van 16S rrna qpcr de bacteriële concentratie in feces van kinderen [25]. Sokol en medewerkers (2008) bepaalden met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) de bacteriële concentratie in slijmvlies biopsieën van gezonde patiënten en met de ziekte van Crohn [49]. Beide groepen vonden een bacteriële concentratie van een grootte-orde log10 bacteriën per gram stoelgang, wat in de lijn ligt van onze gevonden waarden voor de concentratie aan bacteriën. Sokol et al. (2009) bestudeerden de bacteriële concentratie in feces van patiënten met inflammatoir darmlijden met behulp van 16S rrna qpcr. Ze vonden een bacteriële concentratie van log11 bacteriën per gram stoelgang in de gezonde groep, wat één grootte-orde hoger is in vergelijking met onze resultaten [41]. Benus en medewerkers (2010), in een onderzoek naar de interactie tussen F. prausnitzii en vezels in de voeding, kwantificeerden bacteriële species in feces met behulp van FISH. Men detecteerde eveneens bacteriën met een concentratie van grootte-orde log11 [20]. Schwiertz en medewerkers (2010) vonden een mediane E. coli concentratie van grootte-orde van log5 per gram stoelgang, drie grootte-ordes lager in vergelijking met onze resultaten [25]. De studies van Sokol en medewerkers (2008, 2009) vonden respectievelijk een E. coli concentratie van grootte-orde log5 en log7 per gram stoelgang [41, 49]. In onze studie, waarin een gemiddelde concentratie aan E. coli van 3.16 log9 bacteriën per gram stoelgang vastgesteld werd, werd een hogere concentratie aan E. coli waargenomen in vergelijking met de studies van Schwiertz et al. (2010) [25] en Sokol et al. (2008, 2009) [41, 49]. Rintillä et al. (2004) ontwikkelden 16S rrna qpcr s voor het kwantificeren en detecteren van bacteriële species in feces. In deze studie werd een gemiddelde concentratie aan F. prausnitzii met grootte-orde log8 bacteriën per gram stoelgang gemeten [50]. Met eenzelfde methode, maar verschillende primers, werd in onze studie dezelfde grootte-orde log8 verkregen. Benus en medewerkers (2010) vonden een gemiddelde concentratie van log8 log10 per gram stoelgang, een percentage van 2.5 tot 17% van de bacteriën [20]. Wij vonden 44

54 Bespreking een 6.3 % percentage van F. prausnitzii, dat in de spreiding van hun studie ligt. In deze studie werd echter wel een hogere F. prausnitzii concentratie gemeten in vergelijking met de F. prausnitzii concentratie van 4.51 log8 bacteriën per gram stoelgang uit onze studie. De studie van Sokol et al. (2008) die eveneens F. prausnitzii kwantificeren met 16S rrna qpcr vonden een concentratie van log6 gram per stoelgang, dat twee grootte-orde lager ligt dan onze resultaten [49]. Hogere F. prausnitzii concentraties in vergelijking met onze resultaten werden in de studie van Schwiertz et al. (2010), grootte-orde log9 per gram stoelgang [25], en Sokol et al. (2009), grootte-orde log10 per gram stoelgang, gevonden [41]. Schwiertz et al. (2010) vonden een reductie van de concentratie F. prausnitzii bij patiënten met inflammatoir darmlijden terwijl de concentratie aan E. coli steeg [25]. Dit komt overeen met de bevindingen in de helminth geïnfecteerde groep in onze studie waarin het percentage F. prausnitzii niet significant daalde en het percentage E. coli niet significant steeg. Volgens de resultaten van het onderzoek van Schwiertz et al. (2010) kan gespeculeerd worden dat helminth infecties leiden tot een intestinale microflora die predisponerend is voor inflammatoir darmlijden. Geohelminthen en korte vetzuurketens Wegens het belang van korte vetzuurketens in het colon [51] werd de invloed van geohelminthen op de productie van korte vetzuurketens nagegaan. Korte vetzuurketens in het colon worden voornamelijk geproduceerd door microbiële fermentatie van vezels [10, 18, 20], met als belangrijkste korte vetzuurketens acetaat, propionaat en butyraat [18, 24]. De korte vetzuurketens in feces werden gekwantificeerd in een subgroep van 30 vrouwen, die eveneens opgedeeld werd in een helminth geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde groep en in een N. americanus positieve en negatieve groep. We vonden dat helminth infecties leidden tot een niet significante stijging van de korte vetzuurketens (butyraat: p = 0.595; acetaat: p = 0.402; propionaat: p = 0.494). Wanneer gefocust werd op N. americanus infecties, vonden we een stijging met neiging tot significantie van de korte vetzuurketens (butyraat: p = 0.208; acetaat: p = 0.208; propionaat: p = 0.173). De verhoogde aanwezigheid van de korte vetzuurketens acetaat, butyraat en propionaat kan te wijten zijn aan een kortere transitietijd van het voedsel waardoor de kortere vetzuurketens niet voldoende worden opgenomen door de colonocyten en de perifere weefsels [18]. Deze kortere 45

55 Bespreking transitietijd kan een gevolg zijn van een verhoogde mucusproductie ten gevolge van het uitdrijvingsmechanisme tegen helminthen [7]. De verhoogde aanwezigheid van korte vetzuurketens kan eveneens verklaard worden door een verhoogd aantal korte vetzuurketen producerende bacteriën [18] door de microbiële compositieverandering ten gevolge van helminth infecties. Tielens et al. (2010) toonden aan dat sommige helminthen acetaat produceren als eindproduct van hun energiemetabolisme [52]. Dit kan de stijging van acetaat verklaren in de helminth geïnfecteerde groep. Wegens de positieve correlatie tussen acetaat, butyraat en propionaat (zie verder) kan de stijging van butyraat en propionaat met acetaat mogelijk verklaard worden. Een in vitro studie toont aan dat butyraat anti-carcinogene effecten heeft en mogelijks bescherming biedt tegen colonkanker [22]. Wegens de niet significante stijging van butyraat in de helminth geïnfecteerde groep kan gehypothetiseerd worden dat helminth infecties eveneens een beschermend effect kunnen hebben op colonkanker. Korte vetzuurketens acetaat, butyraat en propionaat In de subgroep vonden we een gemiddelde fecale concentratie van 68.9 µmol/ml acetaat, 17.9 µmol/ml butyraat en 24.0 µmol/ml propionaat. Acetaat is de meest voorkomende korte vetzuurketen in het colon [18, 22, 26] en komt voor met een molaire ratio van 60:20:20 met butyraat en propionaat [18], wat overeenkomt met onze resultaten (molaire ratio 62.2/16.2/21.7). We vonden verder een significant positieve correlatie tussen acetaat en butyraat in onze studie (p < 0.05). Eveneens werd een significant positieve correlatie van beide korte vetzuurketens met propionaat gevonden (acetaat: p < 0.05; butyraat: p < 0.05), wat bij ons weten in nog geen enkele andere studie vermeld werd. Intestinale microflora en korte vetzuurketens De relatie tussen de intestinale microflora en de korte vetzuurketens werd nagegaan. Zowel F. prausnitzii [49] als butyraat [18, 22, 53] worden in verband gebracht met een gezonde colon, maar studies die nagaan of F. prausnitzii beschreven als een belangrijke butyraat producent significant bijdraagt aan de hoeveelheid butyraat in het colon, werden bij ons weten nog niet uitgevoerd. Wij vonden geen significante correlatie tussen de korte vetzuurketens en de concentratie aan F. prausnitzii of het percentage F. prausnitzii (p > 0.05), waaruit we besluiten dat F. prausnitzii niet op significante wijze bijdraagt aan de butyraat hoeveelheden in het colon. 46

56 Bespreking Door sommige auteurs werd echter zonder bewijs aangenomen dat er een positieve correlatie is tussen F. prausnitzii en butyraat [54]. In de studie van Benus et al. (2010) werd een probe gebruikt, specifiek voor een F. prausnitzii groep (F. prausnitzii samen met nauwverwanten), in FISH experimenten. Hier werd een positieve correlatie gevonden tussen deze F. prausnitzii groep en de verhouding butyraat/totale vetzuren [20]. Naast F. prausnitzii zijn nog andere belangrijke butyraat producerende bacteriën aanwezig in het colon, zoals Roseburia spp. [20, 53]. Dit kan een verklaring geven waarom in onze studie geen correlatie te vinden is tussen F. prausnitzii en butyraat. We vonden een significant negatieve correlatie tussen de fecale concentratie aan E. coli met acetaat (p < 0.05) en butyraat (p < 0.05), maar niet met propionaat (p > 0.05). Deze negatieve correlatie werd niet significant gevonden bij het percentage E. coli (p > 0.05) Algemeen besluit Samenvattend werd in deze studie geen significante wijziging van de intestinale microflora en de concentratie aan korte vetzuurketens productie gevonden bij de helminth geïnfecteerde groep, en vonden we dat F. prausnitzii een minimale tot geen bijdrage levert aan de concentratie aan colon butyraat. Verder onderzoek op een grotere studiepopulatie, en waarin meerdere bacteriële species bestudeerd worden, is aangeraden. 47

57 Referenties 5. Referenties [1] van Riet E, Hartgers FC, Yazdanbakhsh M Chronic helminth infections induce immunomodulation: consequences and mechanisms. Immunobiology. 212: [2] Hotez PJ, Brindley PJ, Bethony JM, King CH, Pearce EJ, Jacobson J Helminth infections: the great neglected tropical diseases. J Clin Invest. 118: [3] Dold C, Holland CV Ascaris and ascariasis. Microbes Infect. 13: [4] Bethony J, Brooker S, Albonico M, Geiger SM, Loukas A, Diemert D, Hotez PJ Soiltransmitted helminth infections: ascariasis, trichuriasis, and hookworm. Lancet. 367: [5] WHO: [6] Hotez PJ, Brooker S, Bethony JM, Bottazzi ME, Loukas A, Xiao S Hookworm infection. N Engl J Med. 351: [7] Allen JE, Maizels RM Diversity and dialogue in immunity to helminths. Nat Rev Immunol. 11: [8] Cooper PJ Can intestinal helminth infections (geohelminths) affect the development and expression of asthma and allergic disease? Clin Exp Immunol. 128: [9] Pearce EJ, MacDonald AS The immunobiology of schistosomiasis. Nat Rev Immunol. 2: [10] Guarner F Enteric flora in health and disease. Dig Dis. 73 Suppl 1:5-12. [11] Iannitti T, Palmieri B Therapeutical use of probiotic formulations in clinical practice. Clin Nutr. 29: [12] Fukuda S, Toh H, Taylor TD, Ohno H, Hattori M Acetate-producing bifidobacteria protect the host from enteropathogenic infection via carbohydrate transporters. Gut Microbes. 3: [13] Bancroft AJ, Hayes KS, Grencis RK Life on the edge: the balance between macrofauna, microflora and host immunity. Trends Parasitol. 28:93-8. [14] Berrilli F, Di Cave D, Cavallero S, D'Amelio S Interactions between parasites and microbial communities in the human gut. Front Cell Infect Microbiol. 2:141. [15] Tremaroli V, Bäckhed F Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489: [16] Flint HJ, Scott KP, Louis P, Duncan SH The role of the gut microbiota in nutrition and health. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9: [17] Holistic primary care: strategies-for-establishing-a-healthy-gut-microbiome. [18] Wong JM, de Souza R, Kendall CW, Emam A, Jenkins DJ Colonic health: fermentation and short chain fatty acids. J Clin Gastroenterol. 40: [19] Barcenilla A, Pryde SE, Martin JC, Duncan SH, Stewart CS, Henderson C, Flint HJ Phylogenetic relationships of butyrate-producing bacteria from the human gut. Appl Environ Microbiol. 66: [20] Benus RF, van der Werf TS, Welling GW, Judd PA, Taylor MA, Harmsen HJ, Whelan K Association between Faecalibacterium prausnitzii and dietary fibre in colonic fermentation in healthy human subjects. Br J Nutr. 104: [21] Dumas ME The Microbial-mammalian metabolic axis: beyond simple metabolism. Cell Metab. 13: [22] Fung KY, Cosgrove L, Lockett T, Head R, Topping DL A review of the potential mechanisms for the lowering of colorectal oncogenesis by butyrate. Br J Nutr. 108: [23] Leonel AJ, Alvarez-Leite JI Butyrate: implications for intestinal function. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 15: [24] Duncan SH, Louis P, Flint HJ Cultivable bacterial diversity from the human colon. Lett Appl Microbiol. 44: [25] Schwiertz A, Jacobi M, Frick JS, Richter M, Rusch K, Kohler H Microbiota in Pediatric Inflammatory Bowel Disease. J Pediatr. 157: [26] Balamurugan R, Rajendiran E, George S, Samuel GV, Ramakrishna BS Real-time polymerase chain reaction quantification of specific butyrate-producing bacteria, Desulfovibrio and 48

58 Referenties Enterococcus faecalis in the feces of patients with colorectal cancer. J Gastroenterol Hepatol. 23: [27] Nobre V, Serufo JC, Carvalho Odos S, Mendonça CL, Santos SG, Mota EM, Gomes D, Braga E, Antunes CM, Lenzi HL, Lambertucci JR Alteration in the endogenous intestinal flora of Swiss Webster mice by experimental Angiostrongylus costaricensis infection. Mem Inst Oswaldo Cruz. 99: [28] Hayes KS, Bancroft AJ, Goldrick M, Portsmouth C, Roberts IS, Grencis RK Exploitation of the intestinal microflora by the parasitic nematode Trichuris muris. Science. 328: [29] Walk ST, Blum AM, Ewing SA, Weinstock JV, Young VB Alteration of the murine gut microbiota during infection with the parasitic helminth Heligmosomoides polygyrus. Inflamm Bowel Dis. 16: [30] Li RW, Wu S, Li W, Navarro K, Couch RD, Hill D, Urban JF Jr Alterations in the porcine colon microbiota induced by the gastrointestinal nematode Trichuris suis. Infect Immun. 80: [31] Wu S, Li RW, Li W, Beshah E, Dawson HD, Urban JF Jr Worm burden-dependent disruption of the porcine colon microbiota by Trichuris suis infection. PLoS One. 7:e [32] EDCTP: how_project&tx_viprojects_pi1%5bid%5d=93. [33] Levecke B, Behnke JM, Ajjampur SS, Albonico M, Ame SM, Charlier J, Geiger SM, Hoa NT, Kamwa Ngassam RI, Kotze AC, McCarthy JS, Montresor A, Periago MV, Roy S, Tchuem Tchuenté LA, Thach DT, Vercruysse J A comparison of the sensitivity and fecal egg counts of the McMaster egg counting and Kato-Katz thick smear methods for soil-transmitted helminths. PLoS Negl Trop Dis. 5:e1201. [34] BLAST: [35] Oligo Analyzer: [36] qpcr guide Eurogentec: [37] Bio-Rad qpcr: [38] Vaneechoutte M, Claeys G, Steyaert S, De Baere T, Peleman R, Verschraegen G Isolation of Moraxella canis from an ulcerated metastatic lymph node. J Clin Microbiol. 38: [39] Chern EC, Siefring S, Paar J, Doolittle M, Haugland RA Comparison of quantitative PCR assays for Escherichia coli targeting ribosomal RNA and single copy genes. Lett Appl Microbiol. 52: [40] Haarman M, Knol J Quantitative real-time PCR assays to identify and quantify fecal Bifidobacterium species in infants receiving a prebiotic infant formula. Appl Environ Microbiol. 71: [41] Sokol H, Seksik P, Furet JP, Firmesse O, Nion-Larmurier I, Beaugerie L, Cosnes J, Corthier G, Marteau P, Doré J Low counts of Faecalibacterium prausnitzii in colitis microbiota. Inflamm Bowel Dis. 15: [42] Verweij JJ, Brienen EA, Ziem J, Yelifari L, Polderman AM, Van Lieshout L Simultaneous detection and quantification of Ancylostoma duodenale, Necator americanus, and Oesophagostomum bifurcum in fecal samples using multiplex real-time PCR. Am J Trop Med Hyg. 77: [43] Khot PD, Ko DL, Hackman RC, Fredricks DN Development and optimization of quantitative PCR for the diagnosis of invasive aspergillosis with bronchoalveolar lavage fluid. BMC Infect Dis. 8:73. [44] Wang R, CAO W, Cerniglia CE PCR Detection and Quantitation of Predominant Anaerobic Bacteria in Human and Animal Fecal Samples. Appl. Environ. Microbiol. 62: [45] Lyra A, Forssten S, Rolny R, Wettergren Y, Lahtinen SJ, Salli K, Cedgard L, Odin E, Gustavsson B, Ouwehand AC Comparison of bacterial quantities in left and right colon biopsies and faeces. World J Gastroenterol. 18: [46] Bartosch S, Fite A, Macfarlane GT, McMurdo ME Characterization of bacterial communities in feces from healthy elderly volunteers and hospitalized elderly patients by using realtime PCR and effects of antibiotic treatment on the fecal microbiota. Appl Environ Microbiol. 70:

59 Referenties [47] Pullan RL, Gething PW, Smith JL, Mwandawiro CS, Sturrock HJ, Gitonga CW, Hay SI, Brooker S Spatial modelling of soil-transmitted helminth infections in Kenya: a disease control planning tool. PLoS Negl Trop Dis. 5:e958. [48] Zimmermann MB, Chassard C, Rohner F, N'goran EK, Nindjin C, Dostal A, Utzinger J, Ghattas H, Lacroix C, Hurrell RF The effects of iron fortification on the gut microbiota in African children: a randomized controlled trial in Cote d'ivoire. Am J Clin Nutr. 92: [49] Sokol H, Pigneur B, Watterlot L, Lakhdari O, Bermúdez-Humarán LG, Gratadoux JJ, Blugeon S, Bridonneau C, Furet JP, Corthier G, et al Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 105: [50] Rinttilä T, Kassinen A, Malinen E, Krogius L, Palva A Development of an extensive set of 16S rdna-targeted primers for quantification of pathogenic and indigenous bacteria in faecal samples by real-time PCR. J Appl Microbiol. 97: [51] Topping DL, Clifton PM Short-chain fatty acids and human colonic function: roles of resistant starch and nonstarch polysaccharides. Physiol Rev. 81: [52] Tielens AG, van Grinsven KW, Henze K, van Hellemond JJ, Martin W Acetate formation in the energy metabolism of parasitic helminths and protists. Int J Parasitol. 40: [53] Pryde SE, Duncan SH, Hold GL, Stewart CS, Flint HJ The microbiology of butyrate formation in the human colon. FEMS Microbiol Lett. 217: [54] Fujimoto T, Imaeda H, Takahashi K, Kasumi E, Bamba S, Fujiyama Y, Andoh A Decreased abundance of Faecalibacterium prausnitzii in the gut microbiota of Crohn's disease. J Gastroenterol Hepatol. 28:

60 Addendum Addendum Tabel 1: Gebruikte bacteriële stammen met hun kweekbodems en groeicondities Species Stamnummer Kweekbodem Conditie Temperatuur ( C) Bifidobacterium COL-S Anaeroob 37 POS02 animalis TSA-S Anaeroob 37 B. animalis CHCC5445A SCH Anaeroob 37 B. bifidum PA0575 PB2003/035-T3- TSA-S Anaeroob 37 1 B. breve VMF0500SVS33 SCH Anaeroob 37 TSA-S Anaeroob 37 B. breve YHBHITG02 TSA-S Anaeroob 37 B. dentium VMF0500SRT53 TSA-S Anaeroob 37 B. longum AEBV1112 COL-S Anaeroob 37 TSA-S Anaeroob 37 B. longum AEBV0150 FB050-01AE TSA-S Anaeroob 37 B. sp. H TSA-S Anaeroob 37 Legende: COL-S: Columbia S, SCH: Schaedler en TSA-S: Tryptic soy agar S. i

61 Addendum Tabel 2: Reactie-mengsels uitgerekend per reactie Methode 16S rdna PCR Cycle sequencing inhibitie Jellyfish qpcr Mastermix (µl) 10.0 Faststart PCR master 1.0 BigDye v3.1 mastermix 5.0 SYBR Green mastermix Primer 1 (µl) 0.2 αβ NOT (20 µm) 1.6 αβ NOT (2 µm) of 1.6 Ω MB (2 µm) 0.4 Jelly Fw (10 µm) Primer 2 (µl) 0.2 Ω MB (20 µm) Probe (µl) / / 0.4 Jelly Rv (10 µm) Reactiebuffer (µl) Mol. Water (µl) DNAextract (µl) Reactievolume (µl) / / JD oligo verd BigDye v1.1 v3.1 buffer Toestel Veriti TM Thermal cycler Veriti TM Thermal cycler / LC480 R-gene qpcr 8.0 µl Cc1 amplification premix LC480 Totaal aantal bacteriën qpcr 5.0 SYBR Green mastermix 0.25 pd (20 µm) 0.25 γ* (20 µm) / / LC480 Faecalibacterium prausnitzii qpcr Escherichia coli qpcr Bifidobacterium sp. qpcr Necator americanus PCR 5.0 SYBR Green mastermix 5.0 SYBR Green mastermix 5.0 LC480 Probe Mastermix 10.0 Faststart PCR master 0.25 Fprau_02 (20 µm) 0.15 Ecoli_FW (20 µm) 0.25 F_allbif_IS (20 µm) 0.2 Na58F (20 µm) 0.25 Fprau_07 (20 µm) 0.15 Ecoli_RV (20 µm) 0.25 R_allbif_IS (20 µm) 0.2 Na158R (20 µm) / / LC480 / / LC P_allbif_IS (20 µm) / LC480 / / Legende: Mol. Water: Moleculair water, JD oligo verd. -8: Jellyfish DNA oligo verdunning -8 met een concentratie van 6.02 log5 chr/ml, LC 480: LightCycler 480. Veriti TM Thermal cycler ii

62 Addendum Tabel 3: Cycling condities van de uitgevoerde reacties Methode Pre-incubatie Amplificatie Finale extensie Smeltcurve Afkoeling C 3x 2 50 C 16S rdna PCR 5 95 C 1 72 C C 5 72 C / Eindig 4 C 30x 1 50 C 1 72 C C 3x 2 X C 16S rdna gradiënt 1 72 C 5 95 C PCR C 5 72 C / Eindig 4 C 30x 1 X C 1 72 C C Cycle sequencing / 30x 5 50 C / / 10 C Inhibitie qpcr Jellyfish 1 95 C qpcr Rgene C qpcr Totaal aantal bacteriën 5 95 C 4 60 C C 40x C C C 45x C C C 45x C C / C 1 55 C Continu 95 C C / / C / 5 95 C 1 65 C Continu 99 C C qpcr F. prausnitzii C C 40x C C / 5 95 C 1 65 C Continu 97 C C iii

63 Addendum Methode Pre-incubatie Amplificatie Finale extensie Smeltcurve Afkoeling 50x C qpcr E. coli C 1 60 C / C qpcr Bifidobacterium sp C PCR mijnworm 5 95 C C 45x C C C 3x 2 63 C 1 72 C C 30x 1 63 C 1 72 C Legende: X C: stijgende temperaturen om de annealingtemperatuur te kunnen bepalen C 1 65 C Continu 97 C / / C 5 72 C / Eindig 4 C iv

64 Addendum Tabel 4: Gebruikte primers met basenpaar lengte, smelttemperatuur, GC %, sequentie en target sequentie Primer Lengte GC % Sequentie (5 3 ) Target sequentie Ref. (bp) ( C) αβ NOT AGT TTG ATC CTG GCT CAG 16S rrna [38] Ω MB TAC CTT GTT ACG ACT TCG TCC CA 16S rrna [38] pd GTA TTA CCG CGG CTG CTG 16S rrna [38] γ* CTC CTA CGG GAG GCA GCA GT 16S rrna [38] Ecoli_Fw CAA CGA ACT GAA CTG GCA GA Beta-glucuronidase [39] Ecoli_Rv CAT TAC GCT GCG ATG GAT Beta-glucuronidase [39] F_allbif_IS GGG ATG CTG GTG TGG AAG AGA 16S-23S intergenische spacer regio [40] R_allbif_IS TGC TCG CGT CCA CTA TCC AGT 16S-23S intergenische spacer regio [40] P_allbif_IS TCA AAC CAC CAC GCG CCA 16S-23S intergenische spacer regio [40] Fprau_ GAG CCT CAG CGT CAG TTG GT 16S rrna [41] Fprau_ CCA TGA ATT GCC TTC AAA ACT GTT 16S rrna [41] Na58F CTG TTT GTC GAA CGG TAC TTG C Internal transcribed spacer 2 [42] Na158R ATA ACA GCG TGC ACA TGT TGC Internal transcribed spacer 2 [42] Jelly Fw GCC TGG TGC AAA AAT TGC TTA TC Aequorin [43] Jelly Rv CTA AGA CAA GTG TGT TTA TGG TAT TG Aequorin [43] Legende: bp: basenpaar, T 1 m : smelttemperatuur berekent volgens Wallace-Ikatura formule T m = 2 x (A+T) + 4 x (G+C), GC %: percentage van het aantal guanine en cytosine ten opzichte van het totaal aantal basen. T m 1 v

65 Addendum Tabel 5: Overzicht van de geteste F. prausnitzii primers Primers Fprau_02 Fprau_07 FPR-1 FPR-2 Fw Rv PrausF480 PrausR631 Fprau223F Fprau420R Fw Rv Lengte (bp) T m 1 ( C) GC % Sequentie (5 3 ) GAG CCT CAG CGT CAG TTG GT CCA TGA ATT GCC TTC AAA ACT GTT AGA TGG CCT CGC GTC CGA CCG AAG ACC TTC TTC CTC C CCC TTC AGT GCC GCA GT GTC GCA GGA TGT CAA GAC CAG CAG CCG CGG TAA A CTA CCT CTG CAC TAC TCA AGA AA GAT GGC CTC GCG TCC GAT TAG CCG AAG ACC TTC TTC CTC C GGA GGA TTG ACC CCT TCA GT CTG GTC CCG AAG AAA CAC AT Amplicon -lengte (bp) Amplicon GC % Max ID Primerdimeren en/of hairpin structuren Heterodimeer, elke primer een hairpin en Fprau_07 een homodimeer FPR-1 twee homodimeren en FPR-2 twee hairpins Fw een homodimeer en Rv een homodimeer en een hairpin Heterodimeer, elke primer een homodimeer Fprau223F een hairpin en homodimeer en Fprau420R twee hairpins Twee heterodimeren, Fw drie hairpins en een homodimeer en Rv een hairpin Legende: bp: basenpaar, T m 1 : smelttemperatuur berekent volgens Wallace-Ikatura formule T m = 2 x (A+T) + 4 x (G+C), GC %: percentage van het aantal guanine en cytosine ten opzichte van het totaal aantal basen, Max ID: maximum percentage identiteit. Ref. [41] [44] [45] [25] [46] [26] vi

66 Addendum Tabel 6: Bifidobacterium sp. testpanel Species Stamnummer MALDI-TOF ID MALDI-TOF score Bifidobacterium 2YHBHI_GLS21 / / adolescentis B. adolescentis 2YHBHI_GLS25 / / B. adolescentis 3YHBHI_GLS35 / / B. animalis POS02 B. animalis B. animalis CHCC5445A B. animalis B. bifidum PA0575 B. bifidum PB2003/035-T3-1 B. bifidum 0_YHBHI_GLS7 / / B. bifidum 0_YHBHI_GLS9 / / B. bifidum 0_YHBHI_GLS17 / / B. breve VMF0500SVS33 B. breve B. breve VMF07RGOTW11 / / B. breve VMF1900SRM11 / / B. breve VMF2200SRM11 / / B. breve VMF2200SRM21 / / B. breve VMF0500SVS11 / / B. breve YHBHITG02 B. breve B. breve 0_YHBHI_GLS8 / / B. dentium VMF0500SRT53 B. dentium B. dentium VMF0500SRT51 / / B. dentium VMF16VGOG13 / / B. dentium VMF16VGOCOL12 / / B. dentium VMF1634COL21 / / B. dentium VMF16VGOS21 / / B. longum AEBV1112 B. longum B. longum AEBV0150 B. longum FB050-01AE B. sp. H B. longum Legende: /: geen MALDI-TOF identificatie en score omdat dit een alkalische extractie van de LBR collectie is. vii

67 Addendum Tabel 9: F. prausnitzii, E. coli en bacteriële concentraties en korte vetzuurketenconcentraties in helminth positief en negatieve groep Helminth negatief Helminth positief Gemiddelde Range Minimum Maximum Gemiddelde Range Minimum Maximum U p Tot. bact. (chr/ml) 5.20 log log log log log log log log F. prau (chr/ml) 4.07 log log log log log log log log F. prau/tot. bact (%) E. coli 3.48 log log9 1.6 log log log8 5.7 log log log (chr/ml) E. coli/tot. bact (%) Butyraat (µmol/ml) Acetaat (µmol/ml) Propionaat (µmol/ml) N. americanus negatief N. americanus positief Gemiddelde Range Minimum Maximum Gemiddelde Range Minimum Maximum U p Tot. bact. (chr/ml) 5.17 log log log log log log log log F. prau (chr/ml) 4.84 log log log log log log log log F. prau/tot. bact (%) E. coli (chr/ml) 3.39 log log log log log log log log E. coli/tot. bact (%) Butyraat (µmol/ml) Acetaat (µmol/ml) Propionaat (µmol/ml) Legende: U: Mann-Whitney U waarde, p: significant als p < 0.05, chr/ml: chromosomen per ml, Tot. bact.: Totaal aantal bacteriën. viii

68 Addendum Figuur 13: Sequenties van de bandjes van de agarose gelelektroforese M1449 (A), M1496 (B), M1567 (C) en M1592 (D) vergeleken in BLAST A. B. C. D. ix

69 Addendum Figuur 14: Sequenties van de qpcr-producten M1449 (A), M1496 (B), M1567 (C) en M1592 (D) vergeleken in BLAST A. B. C. D. x