QIAsure Methylation-assay Instructies voor gebruik (handleiding)

Maart 2017 QIAsure Methylation-assay Instructies voor gebruik (handleiding) Versie 1 72 Voor gebruik in combinatie met het Rotor-Gene Q MDx 5plex HRMinstrument Voor in-vitrodiagnostisch gebruik 616014 Self-screen B.V., Biothof 15 1, 1098 RX Amsterdam, NEDERLAND R3 1102323NL Sample to Insight

Inhoud Beoogd gebruik... 4 Samenvatting en uitleg... 5 Uitgangspunt van de procedure... 5 Meegeleverde materialen... 7 Inhoud van de kit... 7 Benodigde maar niet meegeleverde materialen... 7 Waarschuwingen en voorzorgsmaatregelen... 9 Veiligheidsinformatie... 9 Algemene voorzorgsmaatregelen... 9 Voorzorgsmaatregelen AssayManager-profiel... 11 Opslag en verwerking reagentia... 11 Opslag en verwerking van monsters... 12 Monstervoorbereiding... 13 Protocol: QIAsure Methylation-assay PCR in het Rotor-Gene Q MDx 5plex HRMinstrument... 15 Interpretatie van de resultaten... 28 Problemen oplossen... 32 Beperkingen... 35 2 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017

Kwaliteitskenmerken... 37 Detectielimiet (LOD)... 37 Lineariteit... 38 Nauwkeurigheid... 38 Stoffen met een verstorende werking... 39 Klinische prestaties... 39 Robuustheid... 42 Referenties... 43 Symbolen... 44 Contactgegevens... 45 Bestelgegevens... 46 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017 3

Beoogd gebruik De QIAsure Methylation-assay is een multiplex real-time methylering-specifieke PCR-assay voor de detectie van promotor-hypermethylering van de genen FAM19A4 en hsa-mir124-2. Monsters die kunnen worden getest met de QIAsure Methylation-assay omvatten bisulfietgeconverteerd DNA geïsoleerd uit monsters die op de volgende wijzen zijn afgenomen: Cervicale monsters verzameld met het digene HC2-hulpmiddel voor DNA-afname (afgenomen door een arts) Cervicale monsters verzameld met behulp van een afnamehulpmiddel in de vorm van een borsteltje/wisser en in PreservCyt -oplossing geplaatst (afgenomen door een arts) Vaginale monsters verzameld met behulp van een hulpmiddel in de vorm van een borsteltje/wisser (zelf afgenomen) Indicaties voor gebruik: 1. Als follow-up-assay voor vrouwen met een positieve test voor humaan papillomavirus (HPV) om de noodzaak voor doorverwijzing voor colposcopie of andere follow-upprocedures vast te stellen. 2. Als follow-up-assay voor vrouwen met PAP-testresultaten met atypische plaveiselcellen van onbepaalde betekenis (ASC-US) om de noodzaak voor doorverwijzing voor colposcopie of andere follow-up-procedures vast te stellen. Dit product is bedoeld voor gebruik door professionele gebruikers, zoals technici en laboranten die zijn opgeleid in procedures voor in-vitrodiagnostiek, moleculaire biologische technieken en het Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-systeem. 4 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017

Samenvatting en uitleg DNA-methylering is een biomedisch proces dat belangrijk is voor de normale ontwikkeling in hogere organismen (1). Het omvat het toevoegen van een methylgroep aan de vijfde positie van de pyrimidinering van de cytosine-nucleotide. Abnormale patronen van DNA-methylering spelen ook een belangrijke rol in carcinogenese. In verschillende menselijke vormen van kanker en kankercellijnen, inclusief baarmoederhalskanker en baarmoederkanker, is promoter hypermethylering van de genen FAM19A4 en/of hsa-mir124-2 gedetecteerd (2 6). Analyse van de gastheercel van promoter hypermethylering detecteert specifiek vormen van kanker en zogenaamde gevorderde CIN-laesies (cervicale intra-epitheliale neoplasie-laesies) die een kankerachtig methyleringsprofiel en een hoog kortetermijnrisico op progressie tot kanker (3, 7, 8) bevatten. De QIAsure-assay maakt de detectie van promoter hypermethylering van de genen FAM19A4 en hsa-mir124-2 mogelijk in bisulfietgeconverteerd DNA geïsoleerd uit cervicale of vaginale monsters met behulp van ACTB als interne kwaliteitscontrole van een monster. Uitgangspunt van de procedure De QIAsure Methylation-assay is een multiplex real-time PCR-assay die de regionen van de gemethyliseerde promoter amplificeert van de tumor-onderdrukkende genen FAM19A4 en hsa-mir124-2 alsook een fragment met niet-specifieke methylering van een referentiegen. De kit bevat 2 buisjes QIAsure-mastermengsel en 2 buisjes QIAsure-kalibrator. Het mastermengsel is bedoeld voor amplificatie van bisulfiet-geconverteerd DNA geprepareerd uit klinische monsters. Het mastermengsel bevat de primers en probes voor de doelgenen en het referentiegen, die dienen als het interne monster voor kwaliteitscontrole. De kalibrator is een gelineariseerd plasmide dat sequenties bevat van de amplicons FAM19A4, hsa-mir124-2 en ACTB. QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017 5

Workflow van procedure Klinisch monster Isolatie nucleïnezuur DNA-materiaal Vaststelling van concentratie van dubbelstrengs DNA Bisulfietbehandeling QIAsure-assays Interpretatie met Rotor-Gene AssayManager Tijdens de runs van de QIAsure-assay op het Rotor-Gene Q MDx-instrument en de Rotor-Gene AssayManager -software worden automatisch gegevensanalyse en -interpretatie uitgevoerd. De CT-waarde (cyclusdrempel) vertegenwoordigt het aantal PCR-cycli noodzakelijk voor de detectie van een fluorescerend signaal groter dan een achtergrondsignaal, dat overeenkomt met het aantal doelmoleculen dat in het monster aanwezig is. Met de QIAsure-assay wordt de CT-waarde berekend als het verschil tussen de CT-waarde van de FAM19A4- of hsa-mir124-2-doelen en de CT-waarde van de referentie (ACTB). Deze CT is een relatieve kwantitatieve waarde voor het promoter-methyleringsniveau van de genen FAM19A4 of hsa-mir124-2. Voor normalisatie wordt de CT-waarde van een kalibratormonster afgetrokken van de CT van de FAM19A4- of hsa-mir124-2-waarden, wat resulteert in een CTwaarde (9). De kalibrator is een gestandaardiseerd plasmide met lage kopieën bevattend DNA-monster met bekend kopienummer voor de drie doelen (d.w.z. FAM19A4, hsa-mir124-2 en ACTB). 6 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017

Meegeleverde materialen Inhoud van de kit QIAsure Methylation Test Catalogusnr. Aantal reacties 72 616014 72 QIAsure Master Mix (2 buisjes) Bruin 630 µl QIAsure Calibrator (2 buisjes) Transparant 25 µl QIAsure Methylation Test Instructions for Use (Engelse handleiding) 1 Benodigde maar niet meegeleverde materialen Draag bij het werken met chemicaliën altijd een geschikte laboratoriumjas, wegwerphandschoenen en een veiligheidsbril. Voor meer informatie raadpleegt u de bijbehorende veiligheidsinformatiebladen (VIB's), verkrijgbaar bij de productleverancier. Verbruiksartikelen en reagentia voor monsterbereiding van zelf afgenomen monsters Hologic PreservCyt -oplossing Verbruiksartikelen en reagentia voor bisulfiet-conversie van geëxtraheerd DNA EZ DNA Methylation Kit (ZYMO Research, catalogusnr. D5001 of catalogusnr. D5002) Verbruiksartikelen van het Rotor-Gene Q MDx-instrument Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (stripbuisjes met dopjes, 0,1 ml; catalogusnr. 981103) Gezuiverd water (bijvoorbeeld van moleculaire biologische klasse, gedestilleerd of gedeïoniseerd) QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017 7

Apparatuur Verstelbare pipetten* bestemd voor PCR (1 10 µl; 10 100 µl) Wegwerphandschoenen Benchtop-centrifuge* met een snelheid van > 10.000 tpm Vortexmixer* Qubit (Thermo Fisher Scientific, catalogusnr. Q33216), NanoDrop 3300 Fluorospectrometer (Thermo Fisher Scientific, catalogusnr. ND-3300) of gelijkwaardig* Instrumenten voor real-time PCR Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System (catalogusnr. 9002033) of Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM instrument (catalogusnr. 9002032) Rotor-Gene AssayManager Core Application softwareversie 1.0.x (waar x gelijk is aan of groter is dan 4) Rotor-Gene AssayManager Epsilon Plug-in geïnstalleerd, versie 1.0.x (waar x gelijk is aan of groter is dan 1) QIAsure-assayprofiel (van bestand AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap) (waar Y gelijk is aan of groter is dan 1) voor toepassing op bisulfiet-geconverteerd DNA verkregen uit door een arts afgenomen cervicale monsters QIAsure-assayprofiel van zelf met een borsteltje afgenomen monster (van bestand AP_QIAsure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap) (waar Y gelijk is aan of groter is dan 0) voor toepassing op bisulfiet-geconverteerd DNA verkregen uit zelf met borsteltje afgenomen vaginale monsters * Zorg ervoor dat instrumenten zijn gecontroleerd en gekalibreerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Rotor-Gene Q 5plex HRM-instrument met een productiedatum van januari 2010 of later. De productiedatum kunt u afleiden uit het serienummer aan de achterzijde van het instrument. Het serienummer heeft de indeling mmjjnnn, waarbij mm de cijfers van de productiemaand aanduidt, jj de laatste twee cijfers van het productiejaar en nnn de unieke instrument-id. 8 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017

Waarschuwingen en voorzorgsmaatregelen Uitsluitend voor in-vitrodiagnostisch gebruik. Veiligheidsinformatie Draag bij het werken met chemicaliën altijd een geschikte laboratoriumjas, wegwerphandschoenen en een veiligheidsbril. Raadpleeg de bijbehorende veiligheidsinformatiebladen (VIB's) voor meer informatie. Deze zijn als handige en compacte PDF beschikbaar op www.qiagen.com/safety. Hier kunt u ook de VIB voor elke QIAGEN -kit en elk onderdeel van de kit vinden, bekijken en afdrukken. QIAsure-mastermengsel: Waarschuwing! Vermoedelijk schadelijk voor vruchtbaarheid of het ongeboren kind. Beschermende handschoenen/ beschermende kleding/oogbescherming/gelaatsbescherming dragen. Bij blootstelling of zorgen: een arts raadplegen. Achter slot bewaren. Inhoud/verpakking afvoeren naar een erkend afvalverwerkingsbedrijf. Algemene voorzorgsmaatregelen Voor het gebruik van PCR-testen zijn goede laboratoriumtechnieken vereist, waaronder onderhoud van de apparatuur, die gelden voor moleculaire biologie en die voldoen aan de geldende regelgeving en relevante normen. QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017 9

Besteed altijd aandacht aan het volgende: Draag beschermende poedervrije wegwerphandschoenen, een laboratoriumjas en oogbescherming bij het hanteren van monsters. Voorkom microbiële contaminatie en nuclease-contaminatie (DNase) van het monster en de kit. DNase kan leiden tot degradatie van het DNA-template. Voorkom contaminatie door achtergebleven DNA of PCR-product, wat kan leiden tot een fout-positief signaal. Gebruik altijd DNase-vrije wegwerppipettips met aerosolbarrières. Reagentia van QIAsure-assay zijn optimaal verdund. Verdun reagentia niet nog meer, want dit kan leiden tot slechtere prestaties. Alle reagentia in de QIAsure Kit zijn uitsluitend bestemd voor gebruik met de andere reagentia in dezelfde kit. U kunt geen enkel reagens van de ene kit vervangen door dezelfde reagens van een andere QIAsure Kit, zelfs niet als de kits van dezelfde partij afkomstig zijn, want dit kan invloed hebben op de prestaties. Raadpleeg de gebruikershandleiding van het Rotor-Gene Q MDx-instrument voor aanvullende waarschuwingen, voorzorgsmaatregelen en procedures. Het hanteren van andere incubatietijden of temperaturen kan leiden tot foutieve of strijdige gegevens. Gebruik geen componenten van de kit waarvan de vervaldatum is verstreken of die onjuist zijn opgeslagen. Minimaliseer de blootstelling van de componenten aan licht: reactiemengsels kunnen als gevolg van deze blootstelling veranderen. Wees uiterst voorzichtig ter voorkoming van contaminatie van de mengsels met de synthetische materialen in de PCR-reagentia. Gooi afval van het monster en de assay weg conform uw lokale veiligheidsprocedures. 10 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017

Voorzorgsmaatregelen AssayManager-profiel Verschillende AssayManager-profielen zijn vereist voor verschillende monstertypen. Zorg ervoor dat het juiste profiel wordt gebruikt voor het te testen monstertype, zoals hieronder aangegeven: QIAsure-assayprofiel van cervicale schraapmonsters QIAsure cervical scrapes Assay Profile (uit bestand AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap) moet worden gebruikt voor tests op bisulfiet-geconverteerd DNA verkregen uit door een arts afgenomen cervicale monsters QIAsure-assayprofiel van zelf met een borsteltje verzamelde monsters QIAsure self-collected brush specimens Assay Profile (uit bestand AP_QIASure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap) moet worden gebruikt voor tests op bisulfiet-geconverteerd DNA verkregen uit zelf met een borsteltje verzamelde vaginale monsters Opslag en verwerking reagentia Verzendcondities De QIAsure Methylation-assay wordt verzonden op droogijs. Als een component van de QIAsure Methylation-assay bij aankomst niet is bevroren, als de buitenverpakking tijdens het vervoer open is geraakt of als de verzending geen pakbon, handleiding of reagentia bevat, neemt u contact op met een van de afdelingen voor technische services van QIAGEN of met de lokale distributeur (zie achterzijde of ga naar www.qiagen.com). Bewaarcondities De QIAsure Methylation-assay moet direct na ontvangst worden opgeslagen bij een temperatuur van -30 C tot -15 C. Gebruik daarvoor een vriezer met een constante temperatuur die is beschermd tegen licht. QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017 11

Stabiliteit Als de QIAsure Methylation-assay wordt bewaard in de gespecificeerde bewaarcondities, is de kit stabiel tot de vervaldatum die staat vermeld op het etiket op de doos. Eenmaal geopend kunnen reagentia in de originele verpakking worden bewaard bij een temperatuur van -30 C tot -15 C. Vermijd herhaald ontdooien en invriezen. Houd een maximum van 3 cycli van invriezen en ontdooien aan. Meng voorzichtig door het buisje 10 keer om te keren en alle buisjes te centrifugeren voordat u deze openmaakt. De vervaldatums van de verschillende reagentia staan vermeld op de etiketten van de afzonderlijke componenten. Bij de juiste bewaarcondities blijven de prestaties van het product tot de vermelde tijd stabiel zolang dezelfde partijen componenten worden gebruikt. Opslag en verwerking van monsters Alle monsters dienen te worden behandeld als potentieel besmettelijk materiaal. Cervicale monsters De QIAsure-kit voor gebruik met monsters van bisulfiet-geconverteerd genomisch DNA verkregen uit cervicale monsters. Gevalideerde hulpmiddelen voor het verzamelen van cervicale monsters (schraapmonsters) zijn de PreservCyt -oplossing voor verzameling en digene-oplossing voor monstertransport (STM, Specimen Transport Medium). Optimale opslagtemperatuur van het klinische monster is 2 8 C bij aankomst in het laboratorium. 12 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017

Onder deze bewaarcondities, zijn monsters in PreservCyt-oplossing voor verzameling tot 3 maanden stabiel voorafgaand aan DNA-extractie. Opmerking: Cervicale monsters in STM kunnen worden verzonden bij 2 30 C voor bezorging de volgende dag aan het testlaboratorium, en kunnen na ontvangst opnieuw worden ingevroren op -20 C. Zelf met borsteltje afgenomen vaginale monsters De QIAsure Methylation-assay is bedoeld voor gebruik met monsters van bisulfiet-geconverteerd genomisch DNA verkregen uit zelf met een borsteltje afgenomen vaginale monsters. Zelf met een borsteltje afgenomen vaginale monsters kunnen droog of in zoutoplossing worden verzameld en verzonden (0,9% vol. NaCl) en bij aankomst in het laboratorium worden bewaard in PreservCyt-oplossing voor verzameling. Monsters in PreservCyt-oplossing voor verzameling kunnen uiterlijk 3 maanden worden bewaard bij 2 8 C of op kamertemperatuur. Monsters van genomisch DNA Nadat genomisch DNA is geëxtraheerd, kunnen DNA-monsters tot 12 maanden worden bewaard en verzonden bij -30 C tot -15 C. Monstervoorbereiding De QIAsure Methylation-assay is gevalideerd voor gebruik met bisulfiet-geconverteerd genomisch DNA verkregen uit cervicale monsters met behulp van de EZ DNA Methylation - kit van ZYMO Research. QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017 13

DNA-extractie Standaard DNA-extractiekits (bijvoorbeeld kits op basis van kolommen en kits op basis van magnetische korrels) zijn compatibel met de QIAsure Methylation-assay. Kwalificering en kwantificatie van DNA Meet de DNA-concentratie voorafgaand aan bisulfiet-conversie van DNA. Geschikte systemen voor het meten van DNA-concentraties zijn Qubit Fluorometer, NanoDrop 3300 Fluorospectrometer (beide van Thermo Fisher Scientific) of gelijkwaardig. Optimale DNA-invoer voor bisulfiet-conversiebereiken van 100 ng tot 2 µg, met 200 ng aanbevolen voor de bisulfiet-conversie. Als DNA-concentratie te laag is voor bisulfietconversie, herhaalt u de DNA-extractie met een hoger invoervolume van het klinische monster of wast u het DNA uit in een lager elutievolume. Bisulfiet-conversie van geëxtraheerd monster-dna De EZ DNA Methylation-kit van ZYMO Research is compatibel met de QIAsure Methylationassay. Opmerking: Overeenkomstig de EZ DNA Methylation-kit, kan de maximale invoer van het DNA-monster niet meer zijn dan 2 µg om een voldoende hoge conversie-efficiëntie te verkrijgen (> 98%). De bisulfiet-conversiereactie moet worden uitgevoerd in een aangewezen gebied afzonderlijk van de locatie waar QIAsure-mastermengsel wordt bewaard en overgebracht om contaminatie van de reagentia te voorkomen. De invoer in de QIAsure-reactie is 2,5 μl van bisulfiet-geconverteerd DNA. Als het interne monster voor kwaliteitscontrole negatief is (d.w.z. ACTB CT-waarden zijn > 26,4), resulteert de monsterbereiding van bisulfiet-geconverteerd DNA in materiaal van onvoldoende kwantiteit en/of kwaliteit en wordt dit als ongeldig gescoord. Herhaal bisulfietconversiereactie met een hogere invoer van monster-dna en/of herhaal DNA-isolatie met een 14 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017

hogere invoer van het cervicale monster om een ACTB CT binnen het geldige bereik te verkrijgen. Bisulfiet-geconverteerd DNA kan tot 24 uur worden bewaard bij 2 C tot 8 C, tot 5 dagen bij -25 C tot -15 C en tot 3 maanden onder -70 C. Herhaaldelijk invriezen en ontdooien van het bisulfiet-geconverteerde DNA moet te allen tijde worden voorkomen. Om toereikende kwaliteit te behouden, mag de cyclus voor invriezen-ontdooien tot 3 keer worden doorlopen. Protocol: QIAsure Methylation-assay PCR in het Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-instrument* Wat u moet weten voor u begint Neem de tijd om bekend te raken met het Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-instrument voordat u het protocol start. Zie de gebruikershandleiding van het instrument (catalogusnr. 9002033 of 9002032). Rotor-Gene AssayManager v1.0 maakt geautomatiseerde interpretatie van de PCRresultaten mogelijk. De run met QIAsure-kit moet worden uitgevoerd op het Rotor-Gene Q MDx-instrument met behulp van de Rotor-Gene AssayManager v1.0. Neem de tijd om bekend te raken met Rotor-Gene AssayManager v1.0 (catalogusnr. 9022739) en Epsilon Plug-In, en zie de gebruikershandleiding voor beide. Voor verschillende monstertypen zijn verschillende Rotor-Gene AssayManager v1.0- assayprofielen vereist. Zorg ervoor dat het juiste profiel wordt gebruikt voor het te testen monstertype, zoals hieronder aangegeven: QIAsure-assayprofiel van cervicale schraapmonsters QIAsure cervical scrapes Assay Profile (uit bestand AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap) moet worden gebruikt * Rotor-Gene Q 5plex HRM-instrument met een productiedatum van januari 2010 of later. De productiedatum kunt u afleiden uit het serienummer aan de achterzijde van het instrument. Het serienummer heeft de indeling mmjjnnn, waarbij mm de cijfers van de productiemaand aanduidt, jj de laatste twee cijfers van het productiejaar en nnn de unieke instrument-id. QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017 15

voor tests op bisulfiet-geconverteerd DNA verkregen uit door een arts afgenomen cervicale monsters QIAsure-assayprofiel van zelf met een borsteltje verzamelde monsters QIAsure self-collected brush specimens Assay Profile (uit bestand AP_QIAsure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap) moet worden gebruikt voor tests op bisulfiet-geconverteerd DNA verkregen uit zelf met een borsteltje verzamelde vaginale monsters Opmerking: Per proef kan slechts één monstertype worden getest. De individuele assayprofielen zijn geoptimaliseerd voor elk monstertype en het is voor klanten van essentieel belang het juiste assayprofiel te selecteren om optimale resultaten te verkrijgen voor elk specifiek monstertype. Wat u moet doen voor u begint Rotor-Gene AssayManager softwareversie v1.0.x (waar x gelijk is aan of groter is dan 4) moet worden geïnstalleerd op de computer die is aangesloten op de Rotor-Gene Q MDx. Voor meer informatie over de installatie van de Rotor-Gene AssayManager v1.0 Core Application-software raadpleegt u de Rotor-Gene AssayManager v1.0 Core Application User Manual (Gebruikershandleiding van de Rotor-Gene AssayManager-basistoepassing v1.0). De QIAsure Methylation-assay vereist een specifieke plug-in met de naam Epsilon Plug-in (versie 1.0.1 of hoger). Deze invoegtoepassing kunt u downloaden via de volgende pagina van de QIAGEN-website: http://www.qiagen.com/shop/automated-solutions/ detection-and-analysis/rotor-gene-assaymanager#resources. Deze invoegtoepassing dient te worden geïnstalleerd op een computer waarop versie 1.0.x van Rotor-Gene AssayManager (waar x gelijk is aan of groter is dan 4) is geïnstalleerd. Voor de QIAsure Methylation-assay moet een run met assay-specifiek profiel worden uitgevoerd met de Rotor-Gene AssayManager v1.0-software. Dit assayprofiel bevat 16 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017

alle parameters die nodig zijn voor het uitvoeren van de cyclus en het analyseren van de proef. Er zijn 2 QIAsure-assayprofielen: 1. Het assayprofiel QIAsure cervical scrapes (QIAsure cervicale schraapmonsters) (uit bestand AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap) komt overeen met door een arts afgenomen cervicale monsters 2. Het assayprofiel QIAsure self-collected brush specimens (QIAsure zelf met een borsteltje verzamelde monsters) (uit bestand AP_QIAsure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap) komt overeen met zelf met een borsteltje verzamelde vaginale monsters. U kunt de profielen downloaden van de website voor QIAsure Methylation-assay: http://www.qiagen.com/shop/assay-technologies/ Complete-Assay-Kits/hpv-testing/qiasure-methylation-test-kit-eu/. Het assayprofiel moet worden geïmporteerd in de Rotor-Gene AssayManager-software. Opmerking: De QIAsure Kit kan alleen worden uitgevoerd als bepaalde configuratieinstellingen worden ingesteld in de Rotor-Gene AssayManager-software v1.0. Voor de veiligheid van het gehele systeem moeten de volgende vereiste configuratieinstellingen worden ingesteld voor de gesloten modus: Material number required (Materiaalnummer vereist) Valid expiry date required (Geldige vervaldatum vereist) Lot number required (Partijnummer vereist) De Epsilon-invoegtoepassing installeren en het assayprofiel importeren Het installeren van de Epsilon-invoegtoepassing en het importeren van het assayprofiel worden beschreven in Rotor-Gene AssayManager Core Application User Manual (Gebruikershandleiding van de Rotor-Gene AssayManager-basistoepassing) en de Epsilon Plug-In User Manual (Gebruikershandleiding van de Epsilon-invoegtoepassing). Download de Epsilon-invoegtoepassing en de nieuwste versie van het QIAsure-assayprofiel van de QIAGEN-website. QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017 17

Start de installatie door te dubbelklikken op het bestand EpsilonPlugin.Installation.msi. Volg de installatie-instructies op het scherm. Voor een gedetailleerde beschrijving van dit proces raadpleegt u het gedeelte Installing plug-ins (Invoegtoepassingen installeren) in de AssayManager Core Application User Manual (Gebruikershandleiding van de AssayManager-basistoepassing). Opmerking: Voor de veiligheid van het gehele systeem selecteert u het tabblad Settings (Instellingen) en schakelt u de selectievakjes Material number required (Materiaalnummer vereist), Valid expiry date required (Geldige vervaldatum vereist) en Lot number required (Partijnummer vereist) in voor de gesloten modus (in het gedeelte Work list [Werklijst]). Als deze niet zijn ingeschakeld, klik u erop om ze in te schakelen. Nadat de invoegtoepassing is geïnstalleerd, moet iemand met administratorrechten voor de Rotor-Gene AssayManager-software het assayprofiel AP_QIAsure_V1_0_Y.iap als volgt importeren: 1. Open de Rotor-Gene AssayManager-software door op het pictogram te klikken. Het venster Rotor-Gene AssayManager wordt geopend (zie afbeelding 1). Afbeelding 1. Aanmeldingsscherm Rotor-Gene AssayManager. 18 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017

2. Meld u aan bij Rotor-Gene AssayManager met uw gebruikers-id en wachtwoord. Wijzig de modus Closed (Gesloten) niet. Klik op OK. Het scherm Rotor-Gene AssayManager wordt geopend (zie hieronder). 7 1 3 4 5 6 2 1 Tabblad Set-up (Instellingen). Met dit tabblad kunnen werklijsten worden beheerd en toegepast. 2 Door Show only work lists never applied before (Geef alleen niet eerder toegepaste werklijsten weer) aan te vinken, worden uitsluitend nieuwe werklijsten weergegeven. 3 Tabblad Approval (Goedkeuring). Met dit tabblad kunt u voorgaande proeven (runs) vinden. 4 Tabblad Archive (Archief). Met dit tabblad kunt u oude proeven (runs) vinden die reeds zijn goedgekeurd. 3. Selecteer de configuratieomgeving. 5 Tabblad Service. Op dit tabblad wordt een rapport weergegeven van een audittrail van elk bestand dat door de software wordt gegenereerd. 6 Tabblad Configuration (Configuratie). Hiermee kunnen alle softwareparameters worden geconfigureerd. 7 Pictogrammen Rotor-Gene Q MDx. Niet verbonden Verbonden 4. Selecteer het tabblad Assay Profiles (Assayprofielen). 5. Klik op Import (Importeren). QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017 19

6. Selecteer het assayprofiel AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap voor cervicale monsters en/of het assayprofiel AP_QIAsure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap om in de dialoog te importeren en klik op Open (Openen). 7. Zodra het assayprofiel is geïmporteerd, kan het worden gebruikt in de omgeving Setup (Instellen). Opmerking: Het is niet mogelijk twee keer dezelfde versie van een assayprofiel te importeren. Monsterverwerking met Rotor-Gene Q MDx-instrumenten met rotor voor 72 buisjes Tot 70 bisulfiet-geconverteerde DNA-monsters kunnen in dezelfde run (proef) worden getest, naast een kalibrator en templateloze controle. Het schema in tabel 1 biedt een voorbeeld van het laadblok of de rotorinstelling voor een run met de QIAsure Methylation-assay. De getallen geven de posities in het laadblok en de uiteindelijke rotorpositie aan. 20 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017

Tabel 1. Instelling van plaat en rotor voor een run met de QIAsure-kit op een Rotor-Gene Q MDx-instrument Strip Buispositie Monsternaam Strip Buispositie Monsternaam Strip Buispositie Monsternaam 1 1 Kalibrator 7 25 Monster 23 13 49 Monster 47 2 NTC 26 Monster 24 50 Monster 48 3 Monster 1 27 Monster 25 51 Monster 49 4 Monster 2 28 Monster 26 52 Monster 50 2 5 Monster 3 8 29 Monster 27 14 53 Monster 51 6 Monster 4 30 Monster 28 54 Monster 52 7 Monster 5 31 Monster 29 55 Monster 53 8 Monster 6 32 Monster 30 56 Monster 54 3 9 Monster 7 9 33 Monster 31 15 57 Monster 55 10 Monster 8 34 Monster 32 58 Monster 56 11 Monster 9 35 Monster 33 59 Monster 57 12 Monster 10 36 Monster 34 60 Monster 58 4 13 Monster 11 10 37 Monster 35 16 61 Monster 59 14 Monster 12 38 Monster 36 62 Monster 60 15 Monster 13 39 Monster 37 63 Monster 61 16 Monster 14 40 Monster 38 64 Monster 62 5 17 Monster 15 11 41 Monster 39 17 65 Monster 63 18 Monster 16 42 Monster 40 66 Monster 64 19 Monster 17 43 Monster 41 67 Monster 65 20 Monster 18 44 Monster 42 68 Monster 66 6 21 Monster 19 12 45 Monster 43 18 69 Monster 67 22 Monster 20 46 Monster 44 70 Monster 68 23 Monster 21 47 Monster 45 71 Monster 69 24 Monster 22 48 Monster 46 72 Monster 70 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017 21

Buisjes moeten zoals aangegeven in tabel 1 in de rotor worden geplaatst. De geautomatiseerde analyse die in het assayprofiel is ingesteld, is gebaseerd op deze organisatie. Als een andere indeling wordt gebruikt, zullen afwijkende resultaten het gevolg zijn. Opmerking: Vul alle resterende posities met lege buisjes. PCR met Rotor-Gene Q MDx-instrumenten met rotor voor 72 buisjes 1. Maak als volgt een werklijst voor het monster dat u wilt verwerken: Schakel het Rotor-Gene Q MDx-instrument in. Open de Rotor-Gene AssayManager-software en meld u aan als gebruiker met de operatorrol in de gesloten modus. Klik op New work list (Nieuwe werklijst) in het werklijstoverzicht (in de omgeving Setup [Instellen]). Selecteer het QIAsure assay profile (QIAsure-assayprofiel) uit de lijst met beschikbare assayprofielen. Opmerking: Het assayprofiel AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap komt overeen met cervicale monsters; het assayprofiel AP_QIAsure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap komt overeen met zelf met een borsteltje verzamelde vaginale monsters. Opmerking: Per proef kan slechts één monstertype worden getest. Klik op Move (Verplaatsen) om het geselecteerde assayprofiel te verplaatsen naar de lijst Selected assay profiles (Geselecteerde assayprofielen). Het assayprofiel wordt nu weergegeven in de lijst Selected assay profiles (Geselecteerde assayprofielen). Geef het aantal monsters op in het daarvoor bestemde veld. Voer de volgende informatie over de QIAsure-kit in, die u vindt op het deksel van de doos. Materiaalnummer: 1102417 Geldige vervaldatum met de notatie JJJJ-MM-DD 22 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017

Partijnummer Selecteer de stap Samples (Monsters). Een lijst met monsterdetails wordt weergegeven op het scherm AssayManager. Deze lijst staat voor de verwachte indeling van de rotor. Geef de monster-id's op in deze lijst. Voer eventueel ook extra informatie en opmerkingen over de monsters in. Selecteer de stap Properties (Eigenschappen) en voer een naam voor de werklijst in (afbeelding 2). Afbeelding 2. Eigenschappen. Selecteer het selectievakje is applicable (Van toepassing) en klik op Apply (Toepassen). Sla de werklijst op. U kunt de werklijst afdrukken als hulpmiddel bij het voorbereiden en instellen van de PCR. Als u de werklijst wilt afdrukken, klikt u op Print work list (Werklijst afdrukken). De monsterdetails maken deel uit van deze werklijst. Opmerking: De werklijst kan worden gemaakt nadat de run op het instrument is ingesteld, of de werklijst kan worden opgeslagen voordat de monsters aan het instrument worden toegevoegd. 2. Stel de QIAsure-run in. Om het risico op contaminatie van PCR-reactie te minimaliseren, wordt het sterk aanbevolen een PCR-kast met mogelijkheid voor UV-bestraling te gebruiken. QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017 23

Het overbrengen van het QIAsure-mastermengsel moet worden uitgevoerd in een gebied dat is afgezonderd van het gebied waar bisulfiet-conversiereactie voor DNA wordt uitgevoerd. Reinig het gedeelte van de tafel waar u werkt, de pipetten en het buisjesrek voorafgaand aan gebruik met een DNA-degraderende oplossing om template- of nuclease-contaminatie te voorkomen. Opmerking: Verwissel tips tussen elk buisje om niet-specifieke contaminatie van de template of het reactiemengsel te voorkomen en zodoende fout-positieve resultaten te voorkomen. Ontdooi het QIAsure-mastermengsel en de QIAsure-kalibrator volledig, en bescherm het QIAsure-mastermengsel zoveel mogelijk tegen licht. Opmerking: Ontdooi niet langer dan 30 minuten om degradatie van het materiaal te voorkomen. Meng voorzichtig door 10 keer om te keren en vervolgens kort te centrifugeren voorafgaand aan gebruik. Breng 17,5 µl kant-en-klaar QIAsure-mastermengsel over in de geschikte stripbuisjes. Instelling van de reactie kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Plaats het QIAsure-mastermengsel terug in de vriezer om mogelijke degradatie van het materiaal te voorkomen. Verplaats buisjes naar een afgezonderd gebied om de assaycontroles en bisulfietgeconverteerde monsters over te brengen. Voeg 2,5 µl water toe aan no template control (NTC) (templateloze controle) in positie 2 (zie tabel 1 hierboven). Meng door de pipet voorzichtig op en neer te bewegen. Voeg 2,5 µl QIAsure-kalibrator toe aan positie 1 (zie tabel 1 hierboven). Meng voorzichtig door de pipet op en neer te bewegen en sluit het buisje af met een dop. Voeg 2,5 µl bisulfiet-geconverteerd DNA toe aan het overeenkomstige buisje. Meng door de pipet voorzichtig op en neer te bewegen. 24 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017

Sluit de buisjes af met een dop nadat een set van 4 buisjes is gevuld. Opmerking: De PCR-buisjes kunnen tot 30 minuten bij 2 8 C in het donker worden bewaard tussen het pipetteren van monsters naar de PCR-buisjes en het begin van de proef op de machine. Plaats de QIAsure-kalibrator terug in de vriezer om mogelijke degradatie van het materiaal te voorkomen. Opmerking: Verwissel tips tussen elk buisje om niet-specifieke contaminatie van de template of het reactiemengsel te voorkomen en zodoende fout-positieve resultaten te voorkomen. 3. Bereid de Rotor-Gene Q MDx voor en start als volgt een run (proef): Plaats een rotor met 72 putjes op de rotorhouder. Vul de rotor met stripbuisjes conform de toegewezen posities. Start daarbij bij positie 1, zoals staat aangeduid in tabel 1 (pagina 21). In alle ongebruikte posities dienen lege stripbuisjes met dop te worden geplaatst. Opmerking: Zorg ervoor dat het eerste buisje op positie 1 wordt geplaatst en dat de stripbuisjes in de juiste richting worden geplaatst op de posities die in tabel 1 (pagina 21) worden weergegeven. Maak de vergrendelingsring vast. Plaats de rotor en vergrendelingsring in het Rotor-Gene Q MDx-instrument en sluit het deksel van het instrument. Selecteer in de Rotor-Gene AssayManager-software v1.0 de desbetreffende werklijst in het werklijstoverzicht en klik op Apply (Toepassen); als de werklijst nog open is, kunt u direct op Apply (Toepassen) klikken. Opmerking: Als de werklijst voor de run niet is gemaakt, meldt u zich aan bij Rotor-Gene AssayManager v1.0 en volgt u stap 1 voordat u verder gaat. Voer een naam in voor de run (proef). Selecteer in het gedeelte Cycler selection (Cycler selecteren) de cyclus die u wilt gebruiken. QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017 25

Controleer of de vergrendelingsring correct is bevestigd en bevestig op het scherm dat de vergrendelingsring is bevestigd. Klik op Start experiment (Proef starten). 4. De run voor QIAsure Methylation-assay moet worden gestart. 5. Zodra de run is voltooid, klikt u op Finish run (Run beëindigen). 6. Geef de run vrij en keur deze goed. Een gebruiker die is ingelogd met de rol Approver (Goedkeurder), kan klikken op Release and go to approval (Vrijgeven en naar goedkeuring gaan). Een gebruiker die is ingelogd met de rol Operator, kan klikken op Release (Vrijgeven). 7. Geef de resultaten vrij. Als op Release and go to approval (Vrijgeven en naar goedkeuring gaan) is geklikt, worden de resultaten van de proef weergegeven. Als op Release (Vrijgeven) is geklikt door een gebruiker met een operatorrol, dient iemand met de rol Approver (Goedkeurder) zich aan te melden en de omgeving Approval (Goedkeuring) te selecteren. Filter op de assay die moet worden goedgekeurd door de filteropties te selecteren en op Apply (Toepassen) te klikken. Controleer de resultaten en keur de resultaten voor elk testmonster goed. In het tabblad Results (Resultaten), scrolt u naar het monster dat moet worden goedgekeurd. Elk monsterresultaat dat moet worden goedgekeurd, is voorzien van drie keuzerondjes aan het einde van de toegewezen rij. Selecteer accept (Accepteren) of reject (Afwijzen) voor het resultaat van een monster. Opmerking: Een resultaat dat door Rotor-Gene AssayManager automatisch is ingesteld als INVALID (Ongeldig), kan niet meer worden geconverteerd tot een geldig resultaat, zelfs niet wanneer het resultaat is afgekeurd. Optioneel: Voer in de kolom Sample comment (Opmerking proef) een opmerking in. Klik op Release/Report data (Gegevens vrijgeven/rapporteren). 26 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017

Klik op OK. Het rapport wordt gegenereerd in PDF-indeling en wordt automatisch opgeslagen in de vooraf gedefinieerde map. Standaard is het pad van de map: QIAGEN > Rotor-Gene AssayManager > Export > Reports Opmerking: Dit pad en de map kunt u wijzigen in de omgeving Configuration (Configuratie). Ga naar het tabblad Archive (Archief) om het.rex-bestand te exporteren, overeenkomstig de onbewerkte gegevens. Zoek uw proef met behulp van de filteropties en klik op show assays (Assay weergeven). Klik vervolgens op Export.rex file (.rex-bestand exporteren) en sla dit bestand op door op OK te klikken. De software slaat automatisch het.rexbestand op in de volgende vooraf gedefinieerde map: QIAGEN > Rotor-Gene AssayManager > Export > Experiments Opmerking: Dit pad en deze folder kunnen worden gewijzigd in het tabblad Specify the.rex file export destination (De exportbestemming van het.rex-bestand specificeren). Opmerking: Voor het oplossen van problemen is een ondersteuningspakket van de run vereist. U kunt een ondersteuningspakket genereren in de omgeving Approval (Goedkeuring) of Archive (Archiveren). Zie de Rotor-Gene AssayManager Core Application User Manual (Gebruikershandleiding van de Rotor-Gene AssayManagerbasistoepassing), Troubleshooting (Probleemoplossing), Creating a support package (Een ondersteuningspakket maken) op https://www.qiagen.com/shop/automatedsolutions/detection-and-analysis/rotor-gene-assaymanager#resources. Daarnaast kan de audittrail vanaf het moment van het voorval ± 1 dag handig zijn. De audittrail kunt u downloaden in de serviceomgeving (zie de Rotor-Gene AssayManager Core Application User Manual [Gebruikershandleiding van de Rotor-Gene AssayManagerbasistoepassing]). 8. Maak het Rotor-Gene Q MDx-instrument weer leeg en gooi de stripbuisjes weg conform de lokale veiligheidsvoorschriften. QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017 27

Interpretatie van de resultaten De analyse is volledig geautomatiseerd. Rotor-Gene AssayManager v1.0 analyseert eerst amplificatiecurves en verklaart mogelijk nietovereenstemmende curves ongeldig, afhankelijk van de vorm en ruisamplitude. Als dit het geval is, wordt de ongeldige curve gemarkeerd (zie Tabel 2). Rotor-Gene AssayManager v1.0 analyseert vervolgens de cs volgt importeren: Kalibrator NTC Opmerking: Het rapport dat aan het eind van de run wordt gegenereerd, toont de resultaten die zijn verkregen met runcontroles. Voor ongeldige gegevens staan waarschuwingen die de ongeldigheid laten zien. Als alle controles in de run overeenstemmen, analyseert Rotor-Gene AssayManager de onbekende monsters. Tabel 2 toont de waarschuwingen voor ongeldige monsters die kunnen worden toegekend aan een afzonderlijk buisje tijdens de analyse door Rotor-Gene AssayManager v1.0. Bij elke waarschuwing staat een uitleg. 28 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017

Tabel 2. Waarschuwingen voor ongeldige monsters met beschrijving van de termen QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017 29

Waarschuwing Gedrag Beschrijving ABOVE_ACCEPTED_RANGE Ongeldig De doelwaarde is hoger dan het gedefinieerde bereik. Het kan CT, eindpunt-fluorescentie, een concentratie of een berekende waarde zijn, bijvoorbeeld gemiddelde CT of CT. ASSAY_INVALID Ongeldig De assay is ongeldig omdat minstens één externe controle ongeldig is. BELOW_ACCEPTED_RANGE Ongeldig De doelwaarde is lager dan het gedefinieerde bereik. Het kan CT, eindpunt-fluorescentie, een concentratie of een berekende waarde zijn, bijvoorbeeld gemiddelde CT of CT. CONSECUTIVE_FAULT Ongeldig Een doel dat voor de berekening voor dit doel is gebruikt, is ongeldig. CURVE_SHAPE_ANOMALY Ongeldig De amplificatiecurve met onbewerkte gegevens heeft een vorm die afwijkt van het normale gedrag van deze assay. Er is een grote kans dat er sprake is van incorrecte resultaten of incorrecte interpretatie van resultaten. FLAT_BUMP Ongeldig De amplificatiecurve met onbewerkte gegevens heeft de vorm van een platte bobbel die afwijkt van het normale gedrag van deze assay. Er is een grote kans dat er sprake is van incorrecte resultaten of incorrecte interpretatie van resultaten (zoals een onjuist vastgestelde CT-waarde). IN_ACCEPTED_RANGE Geldig NTC toont waarden voor CT-signaal hoger dan 36 voor doel-actb. INVALID_CALCULATION Ongeldig Berekening voor dit doel mislukt. MULTIPLE_THRESHOLD_CROSSING Ongeldig De amplificatiecurve overschrijdt meer dan eens de drempelwaarde. Er kan geen duidelijke CT worden vastgesteld. NO_BASELINE Ongeldig Geen startwaarde voor het eerste basisniveau gevonden. NO_CT_DETECTED Variabele Geen CT gedetecteerd voor dit doel. NO_VALUE Ongeldig Voor het doel is geen waarde opgegeven, maar het heeft naar verwachting wel een waarde. Deze waarde hoeft zich niet binnen een bepaald bereik te bevinden. Het kan CT, eindpunt-fluorescentie, een concentratie of een berekende waarde zijn, bijvoorbeeld gemiddelde CT of CT. 30 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017

NORM_FACTOR_ALTERATION Waarschuwing Deviatie tijdens de normalisatieprocedure. De amplificatiecurve wordt weergegeven met standaard normalisatie; de juistheid van resultaten moeten handmatig worden gecontroleerd. OTHER_TARGET_INVALID Ongeldig Een ander doel voor hetzelfde monster is ongeldig. SATURATION Ongeldig De fluorescentie van onbewerkte gegevens raakt sterk verzadigd voor het buigpunt van de amplificatiecurve. SATURATION_IN_PLATEAU Waarschuwing De fluorescentie van onbewerkte gegevens raakt verzadigd in de plateaufase van de amplificatiecurve. SPIKE Waarschuwing Er is in de fluorescentie van onbewerkte gegevens een piek gedetecteerd in de amplificatiecurve, maar buiten de regio waar de CT is bepaald. SPIKE_CLOSE_TO_CT Ongeldig Er is in de amplificatiecurve een piek gedetecteerd dicht bij de CT. STEEP_BASELINE Ongeldig Er is in de amplificatiecurve een snelle stijging in het basisniveau gedetecteerd voor de fluorescentie van onbewerkte gegevens. STRONG_BASELINE_DIP Ongeldig Er is in de amplificatiecurve een sterke daling in het basisniveau gedetecteerd voor de fluorescentie van onbewerkte gegevens. STRONG_NOISE Ongeldig Er is sterke ruis gedetecteerd buiten de groeifase van de amplificatiecurve. STRONG_NOISE_IN_GROWTH_PHASE Ongeldig Er is sterke ruis gedetecteerd in de groeifase (exponentiële fase) van de amplificatiecurve. UNCERTAIN Variabele Resultaten van de AUDAS (Automatic data scan [Automatische gegevensscan]) zijn in strijd met resultaten van de kernanalyse. Een eenduidige automatische beoordeling van geldigheid van gegevens is niet mogelijk. UNEXPECTED_CT_DETECTED Variabele Een CT-waarde is gedetecteerd voor een doel dat niet moet amplificeren. UNEXPECTED_VALUE Ongeldig Voor het doel is een waarde opgegeven, maar het is geen verwachte waarde. Het kan CT, eindpuntfluorescentie, een concentratie of een berekende waarde zijn, bijvoorbeeld gemiddelde CT of CT. QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017 31

UPSTREAM Variabele De monsterstatus is op ongeldig of onduidelijk ingesteld tijdens een stroomopwaarts proces (bijvoorbeeld van QIAsymphony). Opmerking: Voor doelen die zijn gemarkeerd als onduidelijk, wordt het gedrag van de Rotor-Gene AssayManager gedefinieerd in Configuration (Configuratie) in de AssayManager-software. Markeringen voor Invalid (Ongeldig) voor stroomopwaartse processen resulteren altijd in een ongeldig bijbehorend monster in de Rotor-Gene AssayManager. WAVY_BASE_FLUORESCENCE Ongeldig Er is in de amplificatiecurve een golving in het basisniveau gedetecteerd voor de fluorescentie van onbewerkte gegevens. Als alle controles in de run geldig zijn, analyseert Rotor-Gene AssayManager v1.0 de onbekende monsters. Om het resultaat te kunnen interpreteren, moet een minimale hoeveelheid bisulfiet-geconverteerd DNA in het monster aanwezig zijn. Dit wordt aangeduid met de CT-waarde van het housekeeping -gen ACTB die groter moet zijn dan 26,4 voor een monster om te kunnen worden gevalideerd door de Rotor-Gene AssayManager. De CT-waarden voor FAM19A4 en hsa-mir124-2 worden vervolgens berekend en het resultaat wordt gegeven. Als een CT-waarde zich onder het afkappunt bevindt, wordt het doel Hypermethylation positive (Hypermethylering positief) gescoord. Opmerking: Gedeeltelijke of lage methyleringsniveaus zijn een natuurlijk fenomeen dat, in tegenstelling tot hypermethyleringsniveaus, niet direct verband houdt met de ontwikkeling van kanker. Een monster wordt als Hypermethylation positive (Hypermethylering positief) beschouwd wanneer ten minste een van de doelen Hypermethylation positive (Hypermethylering positief) is gescoord. Problemen oplossen Dit gedeelte kan nuttig zijn bij het oplossen van problemen. Raadpleeg voor meer informatie ook de lijst met veelgestelde vragen op ons centrum voor technische ondersteuning: 32 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017

www.qiagen.com/faq/faqlist.aspx. De wetenschappers van de afdeling technische services van QIAGEN beantwoorden graag uw vragen over de informatie of protocollen in deze handleiding of over de monster- en assaytechnologieën (zie de achterzijde voor contactgegevens of ga naar www.qiagen.com). Voor informatie over het oplossen van problemen met betrekking tot de Rotor-Gene AssayManager, raadpleegt u de Rotor-Gene AssayManager Core Application User Manual (Gebruikershandleiding van de AssayManager-basistoepassing). Algemene hantering Opmerkingen en suggesties DNA-concentratie van monster te laag voor bisulfiet-conversie Controleer DNA-extract Herhaal DNA-extractie met sterker geconcentreerd klinisch monster Monster is ongeldig gescoord: de amplificatie van ACTB is te laag of niet aanwezig a) Pipetteerfout of reagentia vergeten b) Controleer het DNAconcentraat c) Controleer de bisulfietconversie-elutie Controleer het pipetteerschema en de instellingen van de reactie. Herhaal de PCR-run. Verhoog de DNA-invoer voor bisulfiet-conversie tot het maximum. De prestaties van bisulfietconversiereactie zijn optimaal voor DNA-invoer van 100 ng tot 2 µg Herhaal bisulfiet-conversie. Indien noodzakelijk kan een hogere DNA-invoer worden gebruikt. Monster is ongeldig gescoord: De doelen FAM19A4 en/of hsa-mir124-2 zijn ongeldig Onvoldoende vermenging Meng het monster en het reactiemengsel met behulp van pipetteren (ongeveer 10 keer per buisje). Herhaal monster. Positieve controle is ongeldig gescoord: de amplificatie is voor een of meerdere doelen te laag of niet aanwezig a) Pipetteerfout of reagentia vergeten Controleer het pipetteerschema en de instellingen van de reactie. Herhaal de PCR-run. QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017 33

Opmerkingen en suggesties b) Gedeeltelijke degradatie Inhoud van kit bewaren bij -15 C tot -30 C. Beperk herhaaldelijk invriezen en ontdooien tot maximaal 3 cycli. c) Gedeeltelijke degradatie van PCR-reagentia Bewaar de inhoud van de kit bij een temperatuur van -15 tot -30 C en bescherm de reactiemengsels tegen licht. Vermijd herhaald ontdooien en invriezen. d) Stripbuisje omgekeerd Controleer het pipetteerschema en de instellingen van de reactie. e) Vervaldatum Controleer de vervaldatum van de gebruikte kit. f) Vertraging tussen het pipetteren van monsters en het begin van de run Mengsels van PCR-reactie kunnen 30 minuten in het donker bij 2 8 C worden bewaard tussen het overbrengen van monsters in de PCR-reacties en het starten van de run op de machine. Templateloze controle (NTC) is ongeldig a) Pipetteerfout Controleer het pipetteerschema en de instellingen van de reactie. Herhaal de PCR-run. b) Kruiscontaminatie Vervang alle kritieke reagentia. Hanteer monsters, componenten van kits en verbruiksartikelen altijd conform algemeen geaccepteerde methoden ter voorkoming van contaminatie door achtergebleven materiaal. c) Contaminatie van reagentia Vervang alle kritieke reagentia. Hanteer monsters, componenten van kits en verbruiksartikelen altijd conform algemeen geaccepteerde methoden ter voorkoming van contaminatie door achtergebleven materiaal. d) Stripbuisje omgekeerd Controleer het pipetteerschema en de instellingen van de reactie. 34 QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017

e) Vertraging tussen het pipetteren van monsters en het begin van de run Opmerkingen en suggesties Mengsels van PCR-reactie kunnen 30 minuten in het donker bij 2 8 C worden bewaard tussen het overbrengen van monsters in de PCR-reacties en het starten van de run op de machine. f) Degradatie van probe Bescherm reactiemengsels tegen licht. Controleer de fluorescentiecurve op fout-positieven. Geen of zwakke signalen in monster, maar de controle wordt normaal verwerkt a) Remmende effecten Controleer altijd of er zich geen resten van de buffer op de filter bevinden na centrifugeren tijdens bisulfiet-conversie. Herhaal bisulfiet-conversie. b) Pipetteerfout Controleer het pipetteerschema en de instellingen van de reactie. Herhaal de PCR-run. Als het probleem zich blijft voordoen, neemt u contact op met de technische services van QIAGEN. Beperkingen Reagentia van de QIAsure Methylation-assay mogen alleen worden gebruikt voor in-vitrodiagnostiek. Voor het gebruik van PCR-testen zijn goede laboratoriumtechnieken vereist, waaronder onderhoud van de apparatuur, die gelden voor moleculaire biologie en die voldoen aan de geldende regelgeving en relevante normen. De reagentia en instructies in deze kit zijn gevalideerd voor optimale prestaties. QIAsure Methylation-assay instructies voor gebruik (handleiding) 03/2017 35