Gearchiveerde versie

I-MET-FLVVT-083 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen FLVVT I-MET-FLVVT-083 BEPALING VAN AFLATOXINE B 1, B 2, G 1, G 2 IN DIERENVOEDERS, GRANEN, EN ANDERE BABYVOEDING Versie 03 Datum van toepassing 2012-12-17 Opgesteld door : Jeroen Vancutsem, sectieverantwoordelijke Nazicht door : Sophie De Volder; QAM; 2012-12-07 Goedkeuring vrijgave door : Mandy Lekens; Labomanager; 2012-12-10 Beheer & locatie geldende versie : Bestemmelingen : Trefwoorden : FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem Medewerkers FLVVT Mycotoxines

Herziening door/datum* J. Vancutsem, juli 2007 J. Vancutsem augustus 2008 J. Vancutsem, oktober 2010 J. Vancutsem oktober 2012 Overzicht herziening van het document Reden van herziening Opsteller initiële versie Actualisering (versienummer 01 blijft behouden) Algemene herziening Algemene herziening Tekstdeel / draagwijdte van de herziening Hele tekst Hele tekst Hele tekst * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 25-MET-FLVVT-083 Aflatoxine B1, B2, G1, G2 in noten, granen en afg.prod, B1 in babyvoeding (HPLC) v.03-2/18

INHOUDSTABEL 1 DOEL... 4 2 TOEPASSINGSGEBIED... 4 3 WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN... 4 4 DEFINITIES EN AFKORTINGEN... 5 5 PRINCIPE... 5 6 PRESTATIEKENMERKEN... 5 7 VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN... 5 8 REAGENTIA EN HULPSTOFFEN... 6 9 TOESTELLEN... 9 10 WERKWIJZE... 11 11 KWALITEITSCONTROLE... 17 12 BEREKENING EN RAPPORTERING... 17 13. VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN.... 18 LAB 25-MET-FLVVT-083 Aflatoxine B1, B2, G1, G2 in noten, granen en afg.prod, B1 in babyvoeding (HPLC) v.03-3/18

1 Doel Kwantitatief bepalen van aflatoxine B 1, B 2, G 1 en G 2. 2 Toepassingsgebied Deze analyse-instructie beschrijft de methode voor het bepalen van aflatoxine B 1, B 2, G 1, G 2 in dierenvoeders en voedingsmiddelen met behulp van HPLC. De rapporteringsgrens is: 3 Wettelijke en normatieve documenten Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT. Wijzigingen ten opzichte van de referentiemethode: Babyvoeding: geen Granen en afgeleide producten: Extractie met 80% methanol in plaats van met 70% methanol Specerijen: Extractie met 80% methanol in plaats van met 70% methanol Vijgen: Extractie met 80% methanol in plaats van met 70% methanol Pistachenoten/aardnoten: geen Hazelnoten en andere noten: geen Dierenvoeders: geen Accreditatie Matrix Rapporteringsgrens AFLA B 1 AFLA B 2 AFLA G 1 AFLA G 2 Dierenvoeders 0,0010 mg/kg B NB NB NB Granen en afgeleide producten Noten en afgeleide producten 0,5 µg/kg B B B B 0,5 µg/kg B B B B Babyvoeding 0,05 µg/kg B NVT NVT NVT Specerijen 0,5 µg/kg NB NB NB NB Vijgen 0,5 µg/kg NB NB NB NB LAB 25-MET-FLVVT-083 Aflatoxine B1, B2, G1, G2 in noten, granen en afg.prod, B1 in babyvoeding (HPLC) v.03-4/18

4 Definities en afkortingen Term HPLC B NB DV FLVVT 5 Principe Definitie High Performance Liquid Chromatography Belac accreditatie Niet Belac accreditatie Dierenvoeder Federaal Laboratorium voor Voedselveiligheid Tervuren Aflatoxine wordt uit het monster geëxtraheerd met : Extractiemiddel Methanol/water (80/20 v/v) Methanol/water (80/20 v/v) + n-hexaan Methanol/water (60/40 v/v) Chloroform Matrix Babyvoeding Granen en afgeleide producten Specerijen Vijgen Pistachenoten/aardnoten Hazelnoten en andere noten Dierenvoeders Het extract wordt gefiltreerd en een gedeelte van het filtraat wordt na verdunning met een immunoaffiniteitskolom (SPE voor dierenvoeders) gezuiverd. De uiteindelijke scheiding en bepaling worden uitgevoerd met UHPLC met een reversed phase C18-kolom en fluorescentiedetectie. 6 Prestatiekenmerken De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25- L22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT. De waarden voor de reproduceerbaaheid (RSD R %) zijn terug te vinden in M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx. 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel giftige en kankerverwekkende stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de voorziene maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. LAB 25-MET-FLVVT-083 Aflatoxine B1, B2, G1, G2 in noten, granen en afg.prod, B1 in babyvoeding (HPLC) v.03-5/18

Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT. Mycotoxines zijn uiterst giftige verbindingen. Handelingen dienen in een zuurkast te worden uitgevoerd. Speciale voorzorgsmaatregelen dienen te worden genomen wanneer mycotoxines in vaste vorm zijn, vanwege hun elektrostatische karakter waardoor zij zich gemakkelijk in werkruimten verspreiden. Decontaminatie van het glaswerk en toxinehoudende oplossingen wordt uitgevoerd door gebruik van een javeltablet in de vaatwasser. 8 Reagentia en hulpstoffen 8.1 Reagentia Reagentia Acetonitril (CH 3 CN), HPLC kwaliteit Methanol HPLC kwaliteit Natriumchloride Orthofosforzuur Na 2 HPO 4.2H 2 O KCl KH 2 PO 4 Gedemineraliseerd water Water, UHPLC kwaliteit Chloroform, gestabiliseerd met 0.5 tot 1% (m/m) ethanol Aceton n-hexaan Extractieoplossing voor babyvoeding, granen, specerijen, vijgen, pistachenoten, aardnoten: Methanol/water (80/20 v/v): Meng 800 ml methanol met 200 ml water. Extractieoplossing voor hazelnoten en andere noten: Methanol/water (60/40 v/v): Meng 600 ml methanol met 400 ml water. Oplosmiddel voor gedroogd eluaat: Methanol/water (30/70, v/v): Meng 300 ml methanol met 700 ml water. Elutiemiddel, oplossing 1, aceton/water (98/2, v/v): Meng 980 ml aceton met 20 ml water Elutiemiddel, oplossing 2, water/methanol (80/20, v/v): Meng 800 ml water met 200 ml methanol Elutiemiddel, oplossing 3, water/aceton (85/15, v/v): Labonr. R0026 R0183 R0200 R0232 R0457 R0718 R0719 R1004 R2023 R0104 R0023 R1034 W0617 W0926 W0925 W1150 W1151 W1152 LAB 25-MET-FLVVT-083 Aflatoxine B1, B2, G1, G2 in noten, granen en afg.prod, B1 in babyvoeding (HPLC) v.03-6/18

Meng 850 ml water met 150 ml aceton PBS-buffer W1824 Los op in 1000 ml water: NaCl (R0200) 9 g (± 1g) Na 2 HPO 4.2H 2 O (R0457) 1,2 g (± 0,1g) KH 2 PO 4 (R0719) KCl (R0718) 0,2 g (± 0,05g) 0,2 g (± 0,05g) Stel de ph op 7 met 50% orthofosforzuur (W1837). Controleer de ph met een ph-indicatorstrip. Orthofosforzuur 50 % Meng 500 ml orthofosforzuur (R0232) met 500 ml gedemineraliseerd water. 8.2 Hulpstoffen Celite 545 C18 patroon (Waters SEP PAK) Florisil-patroon (Waters SEP PAK) Immunoaffiniteitskolommen Easi extract aflatoxin (R Biopharm) Vouwfilters S&S Nr. 595 ½ Microfilter: 11 cm Ø 125 mm; 1,5 µm W1837 Glazen kolommen (inwendige doorsnede ongeveer 1 cm, lengte ongeveer 30 cm) voorzien van een Luer uiteinde. Luer nylon kraan, chloroformbestendig Chemisch inerte injectiespuit, 10 ml met Luer verbinding 8.2.1 Standaarden 8.2.1.1 Aflatoxine standaardoplossingen Commerciële standaard van aflatoxine in poedervorm met na reconstitutie een concentratie van 25 µg/ml in acetonitril. De houdbaarheid bedraagt 6 maand na reconstitutie en niet langer dan de vervaldatum vermeld op het certificaat. Bewaar deze oplossingen in de diepvries bij -18 C. Concentratie Nummer standaard Aflatoxine B 1 25 µg/ml S2119 Aflatoxine B 2 25 µg/ml S2120 Aflatoxine G 1 25 µg/ml S2121 Aflatoxine G 2 25 µg/ml S2122 LAB 25-MET-FLVVT-083 Aflatoxine B1, B2, G1, G2 in noten, granen en afg.prod, B1 in babyvoeding (HPLC) v.03-7/18

8.2.1.2 W1212: Aflatoxine kalibratie oplossing Laat voor gebruik de aflatoxine standaardoplossingen (S2119, S2120, S2121, S2122) op kamertemperatuur komen. Breng 8 µl aflatoxine B1 (S2119), 8 µl aflatoxine B2 (S2120), 8 µl aflatoxine G1 (S2121), 8 µl aflatoxine G2 (S2122), in een maatkolf van 50 ml. Voeg oplosmiddel voor gedroogd eluaat (W0925) toe tot aan de maatstreep zodat een oplossing van 4 ng/ml bekomen wordt. 8.2.1.3 W0928: Babyvoeding: Aflatoxine kalibratie oplossing Breng 8 µl aflatoxine B1 (S2119) in een maatkolf van 50 ml Voeg oplosmiddel voor gedroogd eluaat (W0925) toe tot aan de maatstreep zodat een oplossing van 4 ng/ml bekomen wordt (W0714). Breng 5 ml Aflatoxine-spike-oplossing (W1212) in een maatkolf van 50 ml. Voeg oplosmiddel voor gedroogd eluaat (W0925) toe tot aan de maatstreep zodat een oplossing van 0,4 ng/ml bekomen wordt. Bewaar deze oplossing in het donker in de diepvries bij -18 C, gebruik deze niet langer dan 1 maand en niet langer dan de bewaardatum op het certificaat. De piekoppervlakte van de nieuwe kalibratie-oplossing mag maximaal 20 % verschillen van de vorige kalibratie-oplossing die meegenomen wordt binnen dezelfde analysereeks. Indien de waarde niet voldoet wordt de meetreeks verworpen en een nieuwe kalibratie-oplossing bereid. Indien het probleem zich nogmaals voordoet moet getracht worden de oorzaak op te sporen om het probleem te verhelpen. De gegevens worden genoteerd in LAB 25-F45 BEHEER VAN STANDAARDEN MYCOTOXINES. 8.2.1.4 W0932: spike-oplossing aflatoxine 250 ng/ml Laat voor gebruik de standaardoplossingen (S2119, S2120, S2121, S2122) op kamertemperatuur komen. Breng 500 µl aflatoxine B1 (S2119), 500 µl aflatoxine B2 (S2120), 500 µl aflatoxine G1 (S2121), 500 µl aflatoxine G2 (S2122), over in een maatkolf van 50 ml. Voeg oplosmiddel voor gedroogd eluaat (W0925) zodat een oplossing van 250 ng/ml bekomen wordt. De houdbaarheid bedraagt 2 maanden en niet langer dan de bewaardatum op het certificaat. LAB 25-MET-FLVVT-083 Aflatoxine B1, B2, G1, G2 in noten, granen en afg.prod, B1 in babyvoeding (HPLC) v.03-8/18

9 Toestellen 9.1 Algemeen Een overzicht van de gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT. 9.2 Specificaties voor deze methode UHPLC Kolom: Acquity UPLC BEH C18, 1,7 µm + guard kolom Kolomoven: De temperatuur van de kolomoven bedraagt 40 C. Detectorparameters o o Detector: fluorescentie Golflengte: excitatie: 365 nm, emissie: 435 nm Pompparameters o o o Loopsnelheid : 0,2 ml/min Isocratisch Samenstelling: 75% water - 14% acetonitril - 11% methanol Autosampler parameters: Injectievolume 20 µl Voordat een analysereeks gestart wordt, moet voldoende stabilisatietijd voor het systeem in acht genomen worden. De tijd om het systeem te laten stabiliseren bedraagt ongeveer 30 min tot een constante basislijn bekomen wordt. Vervolgens worden de kalibratie-oplossingen geïnjecteerd. Het oppervlak van de injectie van de kalibratie-oplossing van 2 ng/ml wordt genoteerd op LAB 25-F 62 REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART. Hierbij moet een reproduceerbaar piekoppervlak verkregen worden (maximaal 20% afwijking t.a.v. vorige notatie in LAB 25 F 62). chromatografische tekortkoming zijn. Dit wordt visueel gecontroleerd. De standaardpiek moet zonder schouder of gelijksoortige Indien niet voldaan aan deze voorwaarden, worden eerst andere parameters zoals druk, lekkages, temperatuur gecontroleerd en verholpen alvorens over te gaan naar bereiding van nieuwe standaarden. 9.2.1 Controle op de lineariteit Bij elke reeks van analyses worden de 4 standaardoplossingen geïnjecteerd. Met deze punten wordt een kalibratielijn opgesteld. Deze worden geïnjecteerd uit de kalibratie-oplossing (W1212) (babyvoeding: W0928) in volgende volumes (met bijhorende concentraties): LAB 25-MET-FLVVT-083 Aflatoxine B1, B2, G1, G2 in noten, granen en afg.prod, B1 in babyvoeding (HPLC) v.03-9/18

concentratie Na elke 6 monsters wordt telkens de referentieoplossing van 2 ng/ml (babyvoeding: 0,2 ng/ml) geïnjecteerd ter controle van het verloop in piekrespons. De piekuitslagen van de referentiestandaard mogen niet meer dan 10% verschil geven in een analysereeks. Indien het verschil groter is, worden de resultaten na de laatste goede standaard verworpen. De kalibratielijn moet recht zijn. De correlatiecoëfficiënt moet minimaal 0,99 bedragen. Als aan deze eisen is voldaan, wordt dadelijk verdergegaan. Zoniet worden eerst de oorzaken van de problemen opgespoord en verholpen. 9.2.2 Verloop van de metingen De metingen worden op volgende wijze uitgevoerd: Kalibratie-oplossing 0,4 ng/ml (babyvoeding: 0,04 ng/ml) Kalibratie-oplossing 1 ng/ml (1) (babyvoeding: 0,1 ng/ml) Kalibratie-oplossing 2 ng/ml (babyvoeding: 0,2 ng/ml) Kalibratie-oplossing 4 ng/ml (babyvoeding: 0,4 ng/ml) Blancomonster Blancomonster + spike 2 µg/kg (babyvoeding: 0,1 µg/kg) Referentieoplossing 2 ng/ml (babyvoeding: 0,2 ng/ml) (± 10 % afwijking op (1)). Zoniet herhaalset. Maximum 6 monsters Referentieoplossing 2 ng/ml (babyvoeding: 0,2 ng/ml) (± 10 % afwijking op (1)). Zoniet herhaalset. injectievolume UPLC Maximum 6 monsters concentratie in de matrix (µg/kg) voor sample amount = 1 concentratie babyvoeding Referentieoplossing 2 ng/ml (babyvoeding: 0,2 ng/ml) (± 10 % afwijking op (1)) Zoniet herhaalset tot vorige referentieoplossing, indien die niet in orde is. conc. in de matrix babyvoeding (µg/kg) voor sample amount = 1 0,4 ng/ml 2 µl 2 0,04 ng/ml (0,02) 1 ng/ml 5 µl 5 0,1 ng/ml 0,05 2 ng/ml 10 µl 10 0,2 ng/ml 0,1 4 ng/ml 20 µl 20 0,4 ng/ml 0,2 LAB 25-MET-FLVVT-083 Aflatoxine B1, B2, G1, G2 in noten, granen en afg.prod, B1 in babyvoeding (HPLC) v.03-10/18

10 Werkwijze 10.1 Extractie en opzuivering voor dierenvoeders 10.1.1 Extractie Weeg 50,0 g (± 0,5 g) van het analysemonster af in een Schottfles Voeg aan het analysemonster 25 g Celite, 250 ml chloroform en 25 ml water toe. Laat gedurende 30 minuten schudden bij ± 250 rpm. Filtreer het extract over een vouwfilter en vang 50 ml van het filtraat op. 10.1.2 Opzuivering De opzuivering dient zonder noemenswaardige onderbrekingen te verlopen. OPGELET! Zorg dat in de onderzoekruimte geen daglicht wordt toegelaten. Dit kan worden bereikt door een van de volgende maatregelen: gordijnen of jaloezieën in combinatie met kunstlicht (TLbuizen zijn aanvaardbaar.) Aflatoxine-bevattende oplossingen moeten zoveel mogelijk beschermd worden tegen licht (donker bewaren, aluminiumfolie bewaren). 10.1.3 Zuivering met Florisil-SEP-PAK 10.1.3.1 Voorbereiding patroon en koppeling aan kolom Sluit aan het korte uiteinde van een Florisil-patroon een kraan aan. Spoel het patroon en verwijder de lucht eruit door met een injectiespuit van 10 ml snel 8 ml chloroform via de kraan door het patroon te leiden. Verbind het lange uiteinde van het patroon met een glazen kolom en leid de overblijvende 2 ml chloroform door het patroon in de kolom. Sluit de kraan en verwijder de injectiespuit. 10.1.3.2 Zuivering Breng het bij 10.1.1 verzamelde filtraat in de kolom en laat het filtraat met behulp van de zwaartekracht door het patroon elueren. Spoel met 5 ml chloroform en vervolgens met 20 ml methanol. Verwerp de eluaten. Voorkom dat het patroon bij deze handelingen droog komt te staan. Elueer de aflatoxines met 40 ml elutiemiddel oplossing 1(W1150) en vang het gehele eluaat op in een rondbodemkolf. Damp het eluaat in aan de rotatievacuümverdamper bij 40-50 C tot geen aceton meer wordt afgedestilleerd. (Op dit punt blijft er ongeveer 0,5 ml vloeistof in de kolf over; proefondervindelijk is gebleken dat verder indampen geen kwaad kan en dat wanneer er 0,5 ml vloeistof over is,er geen noemenswaardige hoeveelheid aceton meer is; acetonresten kunnen leiden tot een verlies aan aflatoxine in het C 18 -patroon.) Voeg aan het residu 1 ml methanol toe, zwenk de kolf rond zodat op de LAB 25-MET-FLVVT-083 Aflatoxine B1, B2, G1, G2 in noten, granen en afg.prod, B1 in babyvoeding (HPLC) v.03-11/18

wand van de kolf aanwezige aflatoxines worden opgelost, voeg 4 ml water toe en meng. Koppel het patroon af en verwijder deze. Spoel de glazen kolom met water en bewaar deze voor de C 18 -zuivering. 10.1.4 Zuivering met C18-SEP-PAK 10.1.4.1 Voorbereiding patroon en koppeling aan kolom Sluit aan het korte uiteinde van een C 18 -patroon een kraan aan. Spoel het patroon en verwijder eventuele lucht door met een spuit 10 ml methanol snel via de kraan door het patroon te leiden (luchtbellen in de patroon zijn zichtbaar als lichtvlekjes tegen een grijze achtergrond). Leid met de spuit 10 ml methanol snel via het lange uiteinde door het patroon. Neem 5 ml water en leid 3 ml via de kraan door het patroon (bij de overgang van methanol naar water oppassen voor de vorming van luchtbellen). Verbind het lange uiteinde van het patroon met een glazen kolom en leid de overblijvende 2 ml water door de patroon in de kolom. Sluit de kraan en verwijder de spuit. 10.1.4.2 Zuivering Breng het bij 10.1.3.2 verzamelde extract kwantitatief over in de kolom, spoel de kolf tweemaal met 5 ml elutiemiddel oplossing 2 (W1151) en laat de vloeistof door middel van de zwaartekracht door de patroon elueren. Voorkom dat de patroon bij deze handelingen droog komt te staan. (Indien zich in de vernauwing van de patroon luchtbellen vormen, wordt de doorstroming gestopt en wordt zachtjes tegen de bovenzijde van de kolom getikt, zodat de bellen verdwijnen, waarna de doorstroming wordt hervat.) Elueer met 25 ml elutiemiddel oplossing 2 (W1151). Verwerp de eluaten. Elueer de aflatoxines met 50 ml elutiemiddel oplossing 2 (W1152) en vang het gehele eluaat op in een maatkolf van 50 ml. Vul aan tot de maatstreep met water en meng: de verkregen monsteroplossing wordt gebruikt voor de chromatografie. OPGELET! Filtreren van het uiteindelijke extract voor de HPLC-stap is meestal niet nodig. Wordt filtreren wel nodig geacht, dan dienen geen cellulosefilters te worden gebruikt, aangezien deze tot een verlies aan aflatoxine kunnen leiden. Teflon filters zijn wel bruikbaar. De sample amount bedraagt 1 indien niet werd afgeweken van deze werkwijze. LAB 25-MET-FLVVT-083 Aflatoxine B1, B2, G1, G2 in noten, granen en afg.prod, B1 in babyvoeding (HPLC) v.03-12/18

10.2 Extractie en opzuivering voor babyvoeding 10.2.1 Extractie Weeg 50,0 g (± 0,5 g) van het analysemonster af in een Schottfles met 5g (± 0,5 g) NaCl. Voeg 250 ml extractieoplossing (W0617) aan toe. Laat gedurende 30 minuten schudden bij ± 250 rpm Filtreer het mengsel over een vouwfilter en verzamel het filtraat in een beker. 10.2.2 Verdunning van het extract Pipetteer 20 ml van het extract in een maatcilinder van 250 ml. Vul aan tot 160 ml met PBS buffer (W1824) Filtreer over een microfilter en verzamel het filtraat in een beker. Let er op dat de filter niet beschadigd wordt bij het vouwen. Zorg dat het bekomen extract vrijwel helder is. 10.2.3 Opzuivering Laat 80 ml verdund extract volledig door de immunoaffiniteitskolom lopen m.b.v. de zwaartekracht of stel de vacuüm manifold zo in dat het extract met een snelheid van maximum 1 druppel per seconde doorloopt (80 ml is equivalent met 2 g staal) en droog de kolom door er lucht door te persen om de laatste druppels te verwijderen. Let er op dat voor het aanbrengen van nieuwe vloeistof geen lucht aangezogen wordt omdat dit de efficiëntie van de op de kolom aangebrachte antilichamen nadelig beïnvloedt. Koppel daarom eerst de immunoaffiniteitskolom af. Laat 20 ml PBS buffer (W1824) door de kolom lopen met behulp van de zwaartekracht en droog de kolom door er lucht door te persen met de spuit om de laatste druppels te verwijderen of gebruik de vacuüm manifold. Elueer met 750 µl methanol. Verzamel het eluaat in een proefbuis en spoel de kolom 3 keer na via backflushing. Zuig hiervoor het eluaat op en laat het opnieuw door de kolom lopen. Elueer nogmaals met 750 µl methanol. Blaas lucht door de kolom om de laatste druppels methanol te verzamelen. Blaas met behulp van stikstof het eluaat droog in de sample concentrator bij ongeveer 60 C. Los het eluaat op in 1 ml oplosmiddel voor gedroogd eluaat (W0925), stop de proefbuis af met parafilm, vortex gedurende ongeveer 30 seconden en breng de inhoud in een vial. Injecteer 20 µl in de UHPLC De sample amount bedraagt 1 indien niet werd afgeweken van deze werkwijze. LAB 25-MET-FLVVT-083 Aflatoxine B1, B2, G1, G2 in noten, granen en afg.prod, B1 in babyvoeding (HPLC) v.03-13/18

10.3 Extractie en opzuivering voor granen en afgeleide producten, vijgen, specerijen 10.3.1 Extractie Weeg 50,0 g (± 0,5 g) van het analysemonster af in een Schottfles met 5g (± 0,5 g) NaCl. Voeg 250 ml extractieoplossing (W0617) aan toe. Laat gedurende 30 minuten schudden bij ± 250 rpm. Filtreer het mengsel over een vouwfilter en verzamel het filtraat in een beker. 10.3.2 Verdunning van het extract Pipetteer 15 ml van het extract in een maatcilinder van 50 ml. Vul aan met 30 ml PBS buffer (W1824) Filtreer over een microfilter en verzamel het filtraat in een beker. Let er op dat de filter niet beschadigd wordt bij het vouwen. Zorg dat het bekomen extract vrijwel helder is. 10.3.3 Opzuivering Laat 15 ml verdund extract volledig door de immunoaffiniteitskolom lopen m.b.v. de zwaartekracht of stel de vacuüm manifold zo in dat het extract met een snelheid van maximum 1 druppel per seconde doorloopt (15 ml is equivalent met 1 g staal) en droog de kolom door er lucht door te persen om de laatste druppels te verwijderen. Let er op dat voor het aanbrengen van nieuwe vloeistof geen lucht aangezogen wordt omdat dit de efficiëntie van de op de kolom aangebrachte antilichamen nadelig beïnvloedt. Koppel daarom eerst de immunoaffiniteitskolom af. Laat 10 ml PBS buffer (W1824) door de kolom lopen met behulp van de zwaartekracht en droog de kolom door er lucht door te persen met de spuit om de laatste druppels te verwijderen of gebruik de vacuüm manifold. Elueer met 1 ml methanol. Verzamel het eluaat in een proefbuis en spoel de kolom 3 keer na via backflushing. Zuig hiervoor het eluaat op en laat het opnieuw door de kolom lopen. Elueer nogmaals met 500 µl methanol. Blaas lucht door de kolom om de laatste druppels methanol te verzamelen. Elueer met 3,5 ml UHPLC-water. Vortex Injecteer 20 µl in de UHPLC Los het eluaat op in 1 ml oplosmiddel voor gedroogd eluaat (W0925), stop de proefbuis af met parafilm, vortex gedurende ongeveer 30 seconden en breng de inhoud in een vial. Injecteer 20 µl in de UHPLC. De sample amount bedraagt 1 indien niet werd afgeweken van deze werkwijze. LAB 25-MET-FLVVT-083 Aflatoxine B1, B2, G1, G2 in noten, granen en afg.prod, B1 in babyvoeding (HPLC) v.03-14/18

10.4 Extractie en opzuivering voor pistachenoten en aardnoten 10.4.1 Extractie Weeg 50,0 g (± 0,5 g) van het analysemonster af in een Schottfles met 5g (± 0,5 g) NaCl. Voeg 150 ml extractieoplossing (W0617) en 100 ml n-hexaan aan toe. Laat gedurende 30 minuten schudden bij ± 250 rpm.. Filtreer het mengsel over een vouwfilter en verzamel het filtraat in een beker. 10.4.2 Verdunning van het extract Pipetteer 10 ml van het extract in een maatcilinder van 100 ml. Vul aan met 70 ml PBS buffer (W1824) Filtreer over een microfilter en verzamel het filtraat in een beker. Let er op dat de filter niet beschadigd wordt bij het vouwen. Zorg dat het bekomen extract vrijwel helder is. 10.4.3 Opzuivering Laat 40 ml verdund extract volledig door de immunoaffiniteitskolom lopen m.b.v. de zwaartekracht of stel de vacuüm manifold zo in dat het extract met een snelheid van maximum 1 druppel per seconde doorloopt (15 ml is equivalent met 1 g staal) en droog de kolom door er lucht door te persen om de laatste druppels te verwijderen. Let er op dat voor het aanbrengen van nieuwe vloeistof geen lucht aangezogen wordt omdat dit de efficiëntie van de op de kolom aangebrachte antilichamen nadelig beïnvloedt. Koppel daarom eerst de immunoaffiniteitskolom af. Laat 10 ml PBS buffer (W1824) door de kolom lopen met behulp van de zwaartekracht en droog de kolom door er lucht door te persen met de spuit om de laatste druppels te verwijderen of gebruik de vacuüm manifold.. Elueer met 1 ml methanol. Verzamel het eluaat in een proefbuis en spoel de kolom 3 keer na via backflushing. Zuig hiervoor het eluaat op en laat het opnieuw door de kolom lopen. Elueer nogmaals met 500 µl methanol. Blaas lucht door de kolom om de laatste druppels methanol te verzamelen. Voeg 3,5 ml UHPLC-water toe. Vortex Injecteer 20 µl in de UHPLC Los het eluaat op in 1 ml oplosmiddel voor gedroogd eluaat (W0925), stop de proefbuis af met parafilm, vortex gedurende ongeveer 30 seconden en breng de inhoud in een vial. Injecteer 20 µl in de UHPLC. De sample amount bedraagt 1 indien niet werd afgeweken van deze werkwijze. LAB 25-MET-FLVVT-083 Aflatoxine B1, B2, G1, G2 in noten, granen en afg.prod, B1 in babyvoeding (HPLC) v.03-15/18

10.5 Extractie en opzuivering voor hazelnoten en andere noten 10.5.1 Extractie Weeg 50,0 g (± 0,5 g) van het analysemonster af in een Schottfles met 5g (± 0,5 g) NaCl. Voeg 250 ml extractieoplossing (W0926) toe. Laat gedurende 30 minuten schudden bij ± 250 rpm. Filtreer het mengsel over een vouwfilter en verzamel het filtraat in een beker. 10.5.2 Verdunning van het extract Pipetteer 15 ml van het extract in een maatcilinder van 100 ml. Vul aan met 45 ml PBS buffer (W1824) Filtreer over een microfilter en verzamel het filtraat in een beker. Let er op dat de filter niet beschadigd wordt bij het vouwen. Zorg dat het bekomen extract vrijwel helder is. 10.5.3 Opzuivering Laat 20 ml verdund extract volledig door de immunoaffiniteitskolom lopen m.b.v. de zwaartekracht of stel de vacuüm manifold zo in dat het extract met een snelheid van maximum 1 druppel per seconde doorloopt (15 ml is equivalent met 1 g staal) en droog de kolom door er lucht door te persen om de laatste druppels te verwijderen. Let er op dat voor het aanbrengen van nieuwe vloeistof geen lucht aangezogen wordt omdat dit de efficiëntie van de op de kolom aangebrachte antilichamen nadelig beïnvloedt. Koppel daarom eerst de immunoaffiniteitskolom af. Laat 10 ml PBS buffer (W1824) door de kolom lopen met behulp van de zwaartekracht en droog de kolom door er lucht door te persen met de spuit om de laatste druppels te verwijderen of gebruik de vacuüm manifold. Elueer met 1 ml methanol. Verzamel het eluaat in een proefbuis en spoel de kolom 3 keer na via backflushing. Zuig hiervoor het eluaat op en laat het opnieuw door de kolom lopen. Elueer nogmaals met 500 µl methanol. Blaas lucht door de kolom om de laatste druppels methanol te verzamelen. Voeg 3,5 ml UHPLC-water toe. Vortex Injecteer 20 µl in de UHPLC Los het eluaat op in 1 ml oplosmiddel voor gedroogd eluaat (W0925), stop de proefbuis af met parafilm, vortex gedurende ongeveer 30 seconden en breng de inhoud in een vial. Injecteer 20 µl in de UHPLC. De sample amount bedraagt 1 indien niet werd afgeweken van deze werkwijze. LAB 25-MET-FLVVT-083 Aflatoxine B1, B2, G1, G2 in noten, granen en afg.prod, B1 in babyvoeding (HPLC) v.03-16/18

11 Kwaliteitscontrole Bij iedere set analysen wordt een blancomonster meegenomen volgens de methode. Het resultaat van het blancomonster mag niet hoger zijn dan de rapporteringsgrens. Indien een piek waargenomen wordt, wordt de gehele meetreeks verworpen. Bij iedere set analysen wordt een blancomonster gespiked met 2 µg/kg AFLA. Het terugvindingspercentage moet meer dan 70 % en minder dan 110 % van de werkelijke waarde zijn. Dit wordt genoteerd op een controlekaart waarbij moet voldaan zijn aan LAB 25-I 22 CONTROLEKAARTEN. Indien het terugvindingspercentage niet voldoet wordt de reeks verworpen. De spiking gebeurt door toevoeging van 400 µl aflatoxine spikeoplossing (W0932) (20 µl W0714 voor babyvoeding) aan 50 g blanco monster. Laat het solvent uitdampen gedurende ten minste 30 minuten. De piekidentificatie gebeurt bij iedere reeks van analyses door vergelijking van de retentietijden van het monster met deze van de referentieoplossing. De retentietijd van de aflatoxines in elk chromatogram mag 5 % afwijken t.o.v. de retentietijd van de referentieoplossing van 2 ng/ml (0,2 ng/ml voor babyvoeding). Indien de retentietijd niet voldoet, worden de resultaten na de laatste goede standaard verworpen. De retentietijd staat vermeld op het chromatogram. Naast de piekidentificatie is de identiteit van het molecule gegarandeerd door de specificiteit van de methode. De fluorescentiedetectie gebeurt op een voor het molecule specifieke excitatiegolflengte en emissiegolflengte. Daarnaast zijn de antilichamen van de immunoaffiniteitskolommen specifiek. 12 Berekening en rapportering De berekening van de concentratie wordt uitgevoerd op de kalibratiecurve. Een positieve vaststelling dient door het sectiehoofd of plaatsvervanger aantoonbaar geparafeerd te worden op de ruwe data. Het analytische resultaat wordt geregistreerd met correctie op basis van de terugvinding en wordt uitgedrukt in µg/kg, behalve voor dierenvoeders waar het uitgedrukt wordt in mg/kg. Voor monsters met een concentratie > LOQ moet de meetonzekerheid vermeld worden bij het analyseresultaat. Diervoeders: Indien bij diervoeders de waarde > 50% van de norm, dient de analyse opnieuw uitgevoerd te worden. Het in het analyserapport vermelde resultaat is de gemiddelde waarde uit ten minste twee, op aparte porties van het monster uitgevoerde bepalingen. Neem als resultaat het gemiddelde van de 2 resultaten, die voldoen aan de reproduceerbaarheid (= 2,8 s R ) van de methode. Indien geen enkel LAB 25-MET-FLVVT-083 Aflatoxine B1, B2, G1, G2 in noten, granen en afg.prod, B1 in babyvoeding (HPLC) v.03-17/18

resultaat voldoet aan de reproduceerbaarheid van de methode, vermeld het gemiddelde van de 3 resultaten, gevolgd door de 3 resultaten. Voedinsgmiddelen: De maximumgehalten aan aflatoxinen die bij Verordening (EG) Nr. 1881/2006 zijn vastgesteld, gelden voor het eetbare gedeelte. 13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 25-F 62 LAB 25-F 45 LAB 25-I 22 LAB 25-L 21 LAB 25-L 18 LAB 25-L 21 LAB 25-L 22 LAB 25-P 07 REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART BEHEER VAN STANDAARDEN - MYCOTOXINES CONTROLEKAARTEN APPARATUUR GEBRUIKT BIJ ANALYSES FLVVT OVERZICHT WETGEVING FLVVT APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT LAB 25-MET-FLVVT-083 Aflatoxine B1, B2, G1, G2 in noten, granen en afg.prod, B1 in babyvoeding (HPLC) v.03-18/18