BVAC/ABCA Workshop 5-6 May 2011, Mol, B. Dirk Van Bockstaele, Ph.D. Global Director Flow Cytometry & Cell Analysis Flow Cytometry: Pitfalls and Artefacts
FCM FCM is very much different from automated lab testing
FCM FCM is very different from automated lab testing Automated testing: Sample Sample entry into dedicated machine Result output into lab information system Client reporting Quick TAT, if not batch tests Laboratory Instrument One patient specimen Result out
Flow Cytometry testing Several flow assays, prep SOP Several tubes per assay Acquired on prepping Flow Cytometer One patient specimen From 1 hour to a whole working day! Raw data (listmode data) on server From 1 to > 20 tubes!
List mode data (raw data)
Flow Cytometry testing: day of specimen arrival Several flow assays, prep SOP Several tubes per assay Acquired on prepping Flow Cytometer One patient specimen From 1 hour to a whole working day! Raw data (listmode data) on server From 1 to > 20 tubes!
Flow Cytometry testing: Analysis of listmode data using dedicated software and assay specific dedicated macro s to obtain the end reportables
Flow Cytometry testing: Expert review and sign off Analysis of listmode data using dedicated software and assay specific dedicated macro s to obtain the end reportables Specimen specific folder with print out of all analysis procedures (different assays) and the resulting reportables
Flow Cytometry testing: Expert review and sign off Analysis of listmode data using dedicated software and assay specific dedicated macro s to obtain the end reportables Specimen specific folder with print out of all analysis procedures (different assays) and the resulting reportables Or return to sender
Flow Cytometry testing: day of specimen arrival Several flow assays, prep SOP Several tubes per assay Acquired on prepping Flow Cytometer One patient specimen From 1 hour to a whole working day! Raw data (listmode data) on server From 1 to > 20 tubes!
Flow cytometrie Relatief uniek instrument in het klinisch laboratorium het enige platform binnen het klinisch onderzoek met een open architectuur en volledig operator modificeerbare instellingen levert geen afgewerkte resultaten aan Noodzaak tot NADENKEN voor, tijdens en na de run!! Een raar onverwacht resultaat is meestal een gevolg van een artefact
Interne kwaliteitsbewaking Preanalytisch Monsterafname, transport en bewaring Staalvoorbereiding Kwaliteitscontrole handelingen Analytisch Validatie van het instrument Validatie van de "test" Postanalytisch Postrun data-interpretatie kwaliteitscontrole handelingen:
Pitfalls Preanalytic Monsterafname, transport en bewaring Aan dode cellen blijft zowat alles plakken Dode cellen plakken aan elkaar: aggregeren niet blindstaren op viabiliteitscriteria grote aberrante subsets kunnen geen gevolg zijn van aanwezigheid van weinig dode cellen Kleine aberrante subsets echter wel
Do not trust perfectly correlated events Perfectly correlating CD34+KDR+ ves are no EPC s Everything perfectly along the diagonal is suspect!
Dead cells are no EPC s
Interne kwaliteitsbewaking Preanalytisch Monsterafname, transport en bewaring Staalvoorbereiding Analytisch Validatie van het instrument Validatie van de "test" Postanalytisch Postrun data-interpretatie
Pitfalls Preanalytic Monsterafname, transport en bewaring Aan dode cellen blijft zowat alles plakken Dode cellen plakken aan elkaar: aggregeren niet blindstaren op viabiliteitscriteria grote aberrante subsets kunnen geen gevolg zijn van aanwezigheid van weinig dode cellen Kleine aberrante subsets echter wel Staalvoorbereiding Kan zeer bewerkelijk zijn Vergissingen zijn menselijk en zullen dus voorkomen
RBC s no null cell blasts Before you tell the clinician that the blasts returned: go and visually check the tube, it might be just RBC s Naive cells after BMT
Interne kwaliteitsbewaking Preanalytisch Monsterafname, transport en bewaring Staalvoorbereiding Analytisch Validatie van het instrument Validatie van de "test" Postanalytisch Postrun data-interpretatie
Pitfalls Analytic Validatie van het instrument Validatie van opt. uitlijning en hydrodynamische focusering Uitlijningspartikels Validatie van de instrumentinstellingen voor immunofenotypering Drempelwaarde- en lichtverstrooiinginstelling: patientenstaal Achtergrondfluorescentie Versterking Fluorescentiecompensaties / spectrale overspraak
Bad trigger threshold no B-cells Before you tell the clinician that a patient has no or few B-cells: go check the trigger threshold R1 R2
Pitfalls Analytic Validatie van het instrument Validatie van opt. uitlijning en hydrodynamische focusering Uitlijningspartikels Validatie van de instrumentinstellingen voor immunofenotypering Drempelwaarde- en lichtverstrooiinginstelling Achtergrondfluorescentie: isotype neg. controle meestal overbodig Versterking Fluorescentiecompensaties / spectrale overspraak
Isotype matched negative controls Throw out isotype matched negative controls A mab is MONO clonal and thus can not be compared against any other ab Negativity should be checked within the run on cell populations that do not express the a-gen Or Use FMO controls (multicolor FCM / broadening of background by compensation procedures) Except for cytoplasmic staining Lower S/N ratio
Histogram 1 CD3+ gated Set RA+/- based on this neg. population Set RO+/- based on this neg. population Histogram 10 Histogram 12 Bo2om biparametric: CD4 or CD8 gated Lymph gated Arrows: Make sure you set the boxes in the biparametric 3, 4, 5 based on these quadstat readings along the axis from biparametric 12 This biparametric 12 allows for correct seang of RO+/- and RA+/- Histogram 3 Histogram 4 Histogram 5
Pitfalls Analytic Validatie van het instrument Validatie van opt. uitlijning en hydrodynamische focusering Uitlijningspartikels Validatie van de instrumentinstellingen voor immunofenotypering Drempelwaarde- en lichtverstrooiinginstelling Achtergrondfluorescentie Versterking (analoge) logaritmische versterkers zijn soms verre van perfect! pareltjes met gekende verschillende fl. intensiteitsniveaus Fluorescentiecompensaties / spectrale overspraak
Logarithmic amplifiers (signal out) = c. (signal in) a log (signal out) = a. log (signal in) + log(c) y = ax + b
(signaal uit) = c. (signaal in) a y = 0,984.x - 1,1942 R 2 = 0,9997 Slope: 1: dynamic range logamp = 4 decades >1: dyn. range logamp < 4 decades <1: dyn. range logamp > 4 decades Logoffset: 1.21 Dynamic range: 4.06 decades = -b/a = [-log(c)]/a
Amplification Hallo!... Er worden geen logaritmische versterkers meer gebruikt in de nieuwe generatie apparatuur!!
Analoog naar Digitaal Conversie (ADC) resolutie Bit data 2 1 4 2 8 3 16 4 32 5 64 6 128 7 256 8 512 9 1024 10 2048 11 4096 12 8192 13 16384 14 32768 15 65536 16 131072 17 262144 18 524288 19 1048576 20 Nieuwe mogelijkheden: Lineair versterkt signaal, Met hoge resolutie gedigitaliseerd Logaritmische conversie via software / opzoektabellen
Amplification: calibration beads Hallo!... Er worden geen logaritmische versterkers meer gebruikt!! En lineaire versterkers zijn quasi perfect.
Amplification: calibration beads Hallo!... Er worden geen logaritmische versterkers meer gebruikt!! En lineaire versterkers zijn quasi perfect. M.a.w.: de calibrator wordt gecontroleerd!
(signal out) = c. (signal in) a y = 0,984.x - 1,1942 R 2 = 0,9997 Detection threshold: 1.51 or 10 1.51 = 33 PC5 molecules
Relevance of different intensities calibration beads Hallo!... Er worden geen logaritmische versterkers meer gebruikt!! En lineaire versterkers zijn quasi perfect. M.a.w.: de calibrator wordt gecontroleerd! Wie calibreert er de calibrator???? Not relevant anymore for checking the amplifiers Only relevant for reporting of instrument sensitivity, logoffset and dynamic range And when reporting fluorescence intensities: Conversion of MFI into MESF
Instrument independent quantification 1 7.80E+03 354.00 2 3.61E+04 521.00 3 9.62E+04 632.00 4 2.97E+05 761.00 Voltage = 681 Slope = 0.003884 Inter. = 2.524388 Rsq = 0.9998 Decades = 3.97 Zero Value = 334 Max Value = 3145808 Avg % Resid = 1.6% Coef Resp = 64.4
Analytisch Validatie van het instrument Validatie van opt. uitlijning en hydrodynamische focusering Uitlijningspartikels Validatie van de instrumentinstellingen voor immuno- fenotypering Drempelwaarde- en lichtverstrooiinginstelling: patientenstaal Achtergrondfluorescentie Versterking Fluorescentiecompensaties / spectrale overspraak Kwaliteitscontrole handelingen ivm instrumentkalibratie Instrumentinstellingen zijn robuust Borging instrumentinstellingen: wekelijkse controle met testpartikels Borging compensatieinstellingen: occasionele controle met patientenstalen
Fl. compensation: pitfalls Increased background fluorescence when opt. path compensated for, exhibits strong fluorescence. Nl. Expression on B-cells Low background on T-cells aggregates Tube 1 2 3 4 5 100827052 Tube 5 exhibits normal CD19 profile How come tube 5 looks normal, whereas other tubes exhibit high background?? compensation artefact (FL3-% FL4)
Nl. Expression on B-cells Low background on T-cells aggregates
Req 100827046, changed instr/ seangs, slightly overcompensated: much be2er disnncnon between background and CD19+ lymphocytes Req 100827046, standard instr/ seangs, slightly undercompensated: no disnncnon between background and CD19+ lymphocytes
Pitfalls Analytic Validatie van het instrument Validatie van opt. uitlijning en hydrodynamische focusering Uitlijningspartikels Validatie van de instrumentinstellingen voor immuno- fenotypering Drempelwaarde- en lichtverstrooiinginstelling: patientenstaal Achtergrondfluorescentie Versterking Fluorescentiecompensaties / spectrale overspraak Kwaliteitscontrole handelingen ivm instrumentkalibratie Instrumentinstellingen zijn robuust Borging instrumentinstellingen Borging compensatieinstellingen
Settings are robust Running calibration beads gives a false sense of security
Instrumentinstellingen zijn robuust een gegeven instelling van een moderne flowcytometer is zeer stabiel en robuust, maar... volledig onverwachte en snel voorbijgaande anomalieën kunnen optreden (ten gevolge van verstoring van laminaire condities van de fluidiek zoals luchtbelletjes, verstoppingen, passage van kleine stolsels etc ) Geen enkel QC materiaal garandeert dat het toestel perfect is blijven functioneren tussen twee acceptabele passages van dit materiaal. Enkel informatief voor evaluatie van lange termijn verloop van de instellingen
Instrumentinstellingen zijn robuust een gegeven instelling van een moderne flowcytometer is zeer stabiel en robuust, maar... volledig onverwachte en snel voorbijgaande anomalieën kunnen optreden (ten gevolge van verstoring van laminaire condities van de fluidiek zoals luchtbelletjes, verstoppingen, passage van kleine stolsels etc ) Geen enkel QC materiaal garandeert dat het toestel perfect is blijven functioneren tussen twee acceptabele passages van dit materiaal. Enkel informatief voor evaluatie van lange termijn verloop van de instellingen Elke flowcytometrische acquisitie is een experiment op zich, waarvan de kwaliteit tijdens de acquisitie zelf moet geëvalueerd worden
Within run QC Leave the operator in front of the machine to continuously follow the acquisition(s)
Phywe AG, Göttingen, 1970 Impulsfluorometrie bei Einzelezellen in Suspensionen. Z-Naturforsch-B. 1969; 24: 360-1 1970: ICP-11, impuls cytophotometer
Esoterix FCM: 2010 72389 acquisitions, 423486 reportables in Europe 76064 acquisitions, 258579 reportables in USA > 100 bioassays for ca. 37 clients Global production: 4 CantoII s and 10 Facscaliburs daily up and running Carroussel driven acquisition Time and pulse shape as within-run QC
Within run QC Leave the operator in front of the machine to continuously follow the runs Tijd als in-run kwaliteitscontroleparameter
Empty tube problem Before you tell the clinician that a patient has an enormous eosinophilia, go check SSC versus time; it might be air bubbles
Tijd als in-run kwaliteitscontrole parameter controle op het mogelijk acuut malfunctioneren van het apparaat redding van het correct gedeelte van de run door plaatsen van tijdsvenster(s)
Within run QC Leave the operator in front of the machine to continuously follow the runs Tijd als in-run kwaliteitscontroleparameter Pulsvormanalyse als in-run kwaliteitscontroleparameter
Pulsvormanalyse als in-run kwaliteitscontroleparameter systematisch meten en stockeren van niet alleen FSCpiek maar eveneens FSC-integraal of FSC-breedte aggregaatartefacten kunnen onderscheiden worden van reële (abnormaal) grotere cellen (via analyse van de pulsvorm). aggregaten
aggregaten Pulsvormanalyse PCR: TcR-γ keten, genherschikking
Pitfalls & artefacts de meeste fouten die kunnen optreden zijn een gevolg van acute, plots optredende en transiënte within-run problemen elke flowcytometrische acquisitie is een experiment op zich, waarvan de kwaliteit tijdens de acquisitie zelf moet geëvalueerd worden. in-run QC technieken en QC technieken gebaseerd op de postrun datainterpretatie van alle individuele acquisities uitgevoerd op een gegeven patiëntmonster. Een raar onverwacht resultaat is meestal een gevolg van een artefact Aandacht voor alles wat fysiologisch / biologisch absurd of inconsistent overkomt. Aandacht voor het reëel voorkomen van pathologische populaties met aberrante eigenschappen qua lichtverstrooiing en/of antigenexpressies
Absolutes (c/µl) in Single Platform Beads: at know concentration (beads/µl) Blood: unknown concentration cells Acquire: #beads / # cells = conc beads / conc cells
Vanishing counting beads Brando, B., Göhde, W., Scarpati, B. and D'Avanzo, G. (2001), The vanishing counting bead phenomenon: Effect on absolute CD34+ cell counting in phosphate-buffered saline-diluted leukapheresis samples. Cytometry, 43: 154 160
hν Nme
hν Time delay Δ t Event acquisinon Nme frame Nme Red excited signal
hν Time delay Δ t Event acquisinon Nme frame blue excited signal Nme
hν Time delay Δ t Event acquisinon Nme frame Extremely bright red fluorescent parncle Red fluorescence internal reflecnons on wall of chamber blue excited signal Nme
hν prepuls Time delay Δ t Event acquisinon Nme frame Extremely bright red fluorescent parncle Red fluorescence internal reflecnons on wall of chamber blue excited signal Nme Red light gets into collecnon opncs for red excited signals
hν prepuls Time delay Δ t Event acquisinon Nme frame Nme Coincidence!! And abort
hν Time delay Δ t Event acquisinon Nme frame Nme Bead events are selecnvely aborted ArNficially decreased bead counts ArNficially increased cell concentranons!!