Versie 02 Datum van toepassing

Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-143 I-MET-FLVVT-143 BEPALING VAN VETOPLOSBARE VITAMINEN IN SPECIFIEKE Versie 02 Datum van toepassing 2012-10-29 Opgesteld door : Mieke Vanbrabant, Sectieverantwoordelijke Nazicht door : Sophie De Volder; QAM; 2012-10-23 Goedkeuring vrijgave door : Mandy Lekens; Labomanager; 2012-10-26 Beheer & locatie geldende versie : FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem Bestemmelingen : Medewerkers FLVVT Trefwoorden : Toevoegingsmiddelen

Overzicht wijzigingen Herziening door/datum* M. Vanbrabant 11/2010 M. Vanbrabant, 10/2012 Reden van herziening Opsteller initiële versie Actualisatie en update documentbeheer Omwille van de omvang van de wijzigingen, wordt de tekst door gebruik van markering van wijzigingen niet meer bruikbaar. Vandaar is besloten om de markering van wijzigingen weg te laten in versie 02. Tekstdeel / draagwijdte van de herziening Volledige tekst * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 25 MET-FLVVT-143 Bepaling van vetoplosbare vitaminen v.02-2/12

INHOUDSTABEL 1 DOEL... 4 2 TOEPASSINGSGEBIED... 4 3 WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN... 4 4 DEFINITIES EN AFKORTINGEN... 5 5 PRINCIPE... 5 6 PRESTATIEKENMERKEN... 5 7 VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN... 5 8 REAGENTIA, MATERIALEN EN STANDAARDEN... 6 8.1 REAGENTIA... 6 8.2 HULPSTOFFEN... 7 8.2.1 Standaarden... 7 9 TOESTELLEN... 9 9.1 ALGEMEEN... 9 9.2 SPECIFICATIES VOOR DEZE METHODE... 9 10 WERKWIJZE... 9 10.1 HYDROLYSE... 9 10.2 EXTRACTIE... 10 10.3 CHROMATOGRAFIE... 10 10.4 HPLC... 11 11 KWALITEITSCONTROLE... 11 12 BEREKENING EN RAPPORTERING... 12 13 VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN... 12 LAB 25 MET-FLVVT-143 Bepaling van vetoplosbare vitaminen v.02-3/12

1 Doel Kwantitatieve bepaling van vetoplosbare vitaminen (vitamine A, D2, D3 en E) in specifieke voedingsmiddelen door middel van vloeistofchromatografie. Tot deze specifieke voedingsmiddelen behoren o.a. voedingssupplementen, babyvoeding en zuigelingenmelk (kunstmelkpoeder). Onder vitamine A wordt verstaan all-trans-retinylalcohol en de cis-isomeren daarvan. Vitamine D2 verwijst naar ergocalciferol en vitamine D3 naar cholecalciferol. Vitamine E wordt gerapporteerd onder de vorm van tocoferol-equivalenten of TE (d-alfa-tocoferol). Het gehalte aan vitamine A en D wordt uitgedrukt in Internationale Eenheden per kg (IE/kg), het gehalte aan vitamine E in milligram per kg (mg/kg). 2 Toepassingsgebied De methode is enkel geschikt voor de bepaling van vetoplosbare vitaminen in voedingssupplementen en zuigelingenmelk (kunstmelkpoeder). De rapporteringsgrens voor vitamine A bedraagt 1.000 IE/kg 1 De rapporteringsgrens voor vitamine D2 en D3 bedraagt 2.000 IE/kg 2 De rapporteringsgrens voor vitamine E bedraagt 3 mg/kg 3 3 Wettelijke en normatieve documenten Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT. 1 1 IE vit A = 0,3 µg all-trans-retinylalcohol (retinol) 2 1 IE vit D3 = 0,025 µg cholecalciferol 1 IE vit D2 = 0,025 µg ergocalciferol 3 1 IE vit E = 1 mg dl-alfa-tocoferolacetaat = 0,671 mg d-alfa-tocoferol (TE) = 0,909 mg dlalfa-tocoferol LAB 25 MET-FLVVT-143 Bepaling van vetoplosbare vitaminen v.02-4/12

4 Definities en afkortingen Term HPLC RP Definitie High performance liquid chromatography Reversed phase 5 Principe Een hoeveelheid fijngemalen monster wordt warm gehydrolyseerd onder stikstofatmosfeer met een ethanolische kaliumhydroxide-oplossing in aanwezigheid van een antioxidant. De vetoplosbare vitaminen worden vervolgens geëxtraheerd met n-hexaan. Een bepaald volume van het extract, afhankelijk van de gewenste concentratie, wordt ingedampt tot droog en opgelost in methanol. Het gehalte aan vitaminen wordt bepaald met behulp van RP-HPLC met UV-detectie. 6 Prestatiekenmerken De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25-L 22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT. De waarden voor de reproduceerbaarheid (RSD R %) zijn terug te vinden in M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx. 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel giftige en kankerverwekkende stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de nodige maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. Alle werkzaamheden dienen te worden verricht in diffuus daglicht, eventueel in bruin glaswerk of glaswerk dat is beschermd met aluminiumfolie. In het laboratorium wordt gebruik gemaakt van het dimmen van de verlichting. Deze wordt op minimale lichtsterkte gebracht van zodra een vitamineoplossing of suspensie in de werkruimte aanwezig is. Alle werkzaamheden dienen te worden verricht zonder de invloed van zuurstof, vervang zuurstof waar mogelijk door stikstof. Het malen van monsters gebeurt vlak voor het wegen en hydrolyseren om het verlies aan vitaminen zo klein mogelijk te houden. Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT. LAB 25 MET-FLVVT-143 Bepaling van vetoplosbare vitaminen v.02-5/12

8 Reagentia, materialen en standaarden 8.1 Reagentia Alle reagentia dienen van pro analyse -kwaliteit te zijn of van hogere kwaliteit indien vermeld. Reagentia Ethanol, 96% (v/v) (gedenatureerd met bvb. methylethylketon) n-hexaan, HPLC-kwaliteit Methanol, HPLC-kwaliteit Water, HPLC-kwaliteit Stikstof, zuiver L-ascorbinezuur Kaliumhydroxide, zuiver Natriumsulfide, zuiver Glycerine, zuiver Diëthylether, zuiver, vrij van peroxiden Natriumsulfide-oplossing 0,5 M in glycerine 70% (v/v) in water Kaliumhydroxide-oplossing 50% (g/v) p.a. Kaliumhydroxide-oplossing 1M Kaliumhydroxide-oplossing 0,5M Aluminiumoxide, gestandaardiseerd volgens Brockmann, geactiveerd Aluminiumoxide, gedeactiveerd: Meng 1 deel H 2 0 met 9 delen aluminiumoxide (R0027) in een gesloten erlenmeyer, verwarm 5 minuten in een kokend waterbad. Laat afkoelen terwijl af en toe geschud wordt. Broomthymolblauw Broomthymolblauw (R0091): 1% oplossing in ethanol (R0338) Butylhydroxytolueen zuiver Butylhydroxytolueen-oplossing in methanol (R0183): 1 mg/ml Mobiele fase/eluens : water (R1003) in methanol (R0183) (v/v). De verhoudingen van het eluens kunnen aangepast worden. Natriumsulfaat p.a.: watervrij Natriumchloride Labonr. R0338 R0134 R0183 R1003 G0001 R0778 R0921 R0930 R0020 R0316 W0005 W0002 W0003 W0004 R0027 R0091 W0006 R1064 W0039 W0014 R0121 R0200 LAB 25 MET-FLVVT-143 Bepaling van vetoplosbare vitaminen v.02-6/12

8.2 Hulpstoffen 8.2.1 Standaarden Retinolacetaat (vitamine A) standaardstof van gegarandeerde zuiverheid, synthetisch (± 500.000 IE/g) (S0003) Cholecalciferol (vitamine D3) standaardstof van gegarandeerde zuiverheid, kristallijn (± 40.000.000 IE/g) (S0004) Ergocalciferol (vitamine D2) standaardstof van gegarandeerde zuiverheid, kristallijn (± 40.000.000 IE/g) (S0005) dl-all-rac-alfa-tocoferol (vitamine E) standaardstof van gegarandeerde zuiverheid, olie (S0130) 8.2.1.1 Retinol standaard stockoplossing (500 IE/ml) (W0015) Weeg 100 mg retinolacetaat (500.000 IE/g, S0003) tot op 0,1 mg nauwkeurig af in een getarreerde erlenmeyer met behulp van een analytische balans. Pas hierop hydrolyse en extractie toe volgens de werkwijze in paragraaf 10.1en 10.2. Zo bekomt men een stockoplossing van ongeveer 50.000 IE in 100 ml. Bewaard in een koelkast bij 4 ± 4 C is deze oplossing 4 maanden bruikbaar. 8.2.1.2 Retinol standaard werkoplossing (5 IE/ml) (W0054) Van de bekomen oplossing (8.2.1.1) wordt 1 ml ( 500 IE) drooggedampt onder vacuüm in een maatkolf van 100 ml. Vervolgens wordt het residu opgenomen in 100 ml methanol (R0183). De concentratie bedraagt dan ongeveer 5 IE/ml. Bewaard in een koelkast bij 4 ± 4 C is deze oplossing 4 weken bruikbaar. De juiste concentratie retinol wordt bepaald volgens de volgende procedure: Meet met behulp van een UV-spectrofotometer de absorptie van de oplossing bij 325 nm, 310 nm en 334 nm (in kwartscuvetten). Het gehalte van de oplossing wordt dan berekend als volgt: A corr x 18,3 = IE retinol/ml - Waarin A corr = 6,815 x A 325 2,555 x A 310 4,26 x A 334 - Indien A corr > (A 325 /1,03) gebruik dan A 325 Dit gehalte wordt vervolgens ingevoerd in de HPLC System Manager software van het HPLCtoestel. LAB 25 MET-FLVVT-143 Bepaling van vetoplosbare vitaminen v.02-7/12

8.2.1.3 Cholecalciferol standaard stockoplossing (8.000 IE/ml) (W0031) Weeg 20 mg cholecalciferol (kristallijn, 40.10 6 IE vitamine D3/g, S0004) af tot op 0,1 mg nauwkeurig en voeg 1 ml butylhydroxytoleen-oplossing (W0039) toe. Vul aan tot 100 ml met methanol (R0183), de concentratie bedraagt dan ongeveer 800.000 IE/100 ml of 8.000 IE/ml. Bewaard in een koelkast bij 4 ± 4 C is deze oplossing minstens een jaar bruikbaar. 8.2.1.4 Cholecalciferol standaard werkoplossing (80 IE/ml) (W0033) Pipetteer 1 ml cholecalciferol stockoplossing (8.000 IE, W0031) in een maatkolf van 100 ml en vul aan tot 100 ml met methanol (R0183). De concentratie bedraagt dan 80 IE/ml. Bewaard in een koelkast bij 4 ± 4 C is deze oplossing 3 maanden bruikbaar. 8.2.1.5 Ergocalciferol standaard stockoplossing (8.000 IE/ml) (W0032) Weeg 20 mg ergocalciferol (kristallijn, 40.10 6 IE vitamine D2/g, S0005) af tot op 0,1 g nauwkeurig en voeg 1 ml butylhydroxytoleen-oplossing (W0039) toe. Vul aan tot 100 ml met methanol (R0183), de concentratie bedraagt dan ongeveer 800.000 IE/100 ml of 8.000 IE/ml. Bewaard in een koelkast bij 4 ± 4 C is deze oplossing minstens een jaar bruikbaar. 8.2.1.6 Ergocalciferol standaard werkoplossing (80 IE/ml) (W0034) Pipetteer 1 ml ergocalciferol stockoplossing (8.000 IE, W0032) in een maatkolf van 100 ml en vul aan tot 100 ml met methanol (R0183). De concentratie bedraagt dan 80 IE/ml. Bewaard in een koelkast bij 4 ± 4 C is deze oplossing 3 maanden bruikbaar. 8.2.1.7 Alfa-tocoferol standaard stockoplossing (1 mg/ml) (W0020) Weeg een druppel alfa-tocoferol (olie) ( 97,0%, S0130) in een getarreerde erlenmeyer (= x mg) tot op 0,1 mg nauwkeurig. Voeg vervolgens een gelijk aantal ml butylhydroxytoleenoplossing (W0039) toe zodat de concentratie 1 mg/ml bedraagt. Zo bekomt men uiteindelijk ongeveer 50 ml standaard stockoplossing. Bewaard in een koelkast bij 4 ± 4 C is deze oplossing 4 maanden bruikbaar. 8.2.1.8 Alfa-tocoferol standaard werkoplossing (0,02 mg/ml) (W0055) Pipetteer 1 ml standaard stockoplossing in een maatkolfje van 50 ml en vul aan tot 50 ml met methanol (R0183). De concentratie bedraagt dan 0,02 mg/ml. Bewaard in een koelkast bij 4 ± 4 C is deze oplossing 4 weken houdbaar. LAB 25 MET-FLVVT-143 Bepaling van vetoplosbare vitaminen v.02-8/12

De concentratie van de nieuwe standaard werkoplossing uit de (nieuwe) stockoplossing wordt met behulp van HPLC vergeleken met die van de vorige standaard werkoplossing uit de (oude) stockoplossing. Zie LAB 25-P 04 en Beheer standaarden vitaminen.xls. De standaard werkoplossing wordt bij gebruik telkens gecontroleerd ten opzichte van de vorige run. Deze controle wordt geregistreerd in de file LAB 25-F 62 REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART. 9 Toestellen 9.1 Algemeen Een overzicht van de gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSES FLVVT. 9.2 Specificaties voor deze methode Isocratisch; elutiesnelheid 1,0-1,2 ml/min Eluens: o 5% water in methanol (A en D) o 1% water in methanol (E) RP-C 18 -kolom, 100Å, 5µ, 125 mm x 4 mm of gelijkwaardig UV-detector met golflengte 325 (A), 290 (E) en 264 (D2 en D3) nm 10 Werkwijze Weeg, afhankelijk van het te verwachten gehalte aan vitamine A, E en/of D van het monster een hoeveelheid (g) af volgens LAB 25-I 27 VERDUNNINGEN VITAMINEN. Dit document dient enkel als leidraad, de concentraties aan vitaminen dienen te worden uitgedrukt als IE/kg (A en D) of mg/kg (E). Breng de afgewogen hoeveelheid direct over in een kolf met ingeslepen stop. 10.1 Hydrolyse Voeg achtereenvolgens toe: 1 g ascorbinezuur (R0778) 50 (of 100) ml ethanol (R0338) 10 (of 20) ml kaliumhydroxide-oplossing 50% (W0002) 4 ml natriumsulfide-oplossing (W0005) LAB 25 MET-FLVVT-143 Bepaling van vetoplosbare vitaminen v.02-9/12

Sluit een condensor aan op de erlenmeyer en verwarm gedurende 30 minuten in een warmwaterbad met magneetroerder bij 70 à 80 C, onder terugvloeikoeling en al roerend met toevoer van een trage stikstofstroom boven de vloeistof. Spoel de condensor vervolgens met 50 (of 100) ml ethanol en koel de inhoud van de erlenmeyer af in een waterbad. 10.2 Extractie Voeg 100 (of 200) ml n-hexaan (R0134) toe aan de erlenmeyer. Schud krachtig gedurende 10 seconden, laat bezinken en decanteer de bovenstaande vloeistof in een scheitrechter. Voeg 100 ml kaliumhydroxide-oplossing 1M (W0003) toe en schud krachtig gedurende 10 seconden. Laat na scheiding der lagen de hexaanfase (bovenste laag) in een scheitrechter af. Voeg 100 ml kaliumhydroxide-oplossing 0,5M (W0004) toe en schud krachtig gedurende 10 seconden. Wacht tot de vloeistoffasen zich gescheiden hebben. Eventuele emulsievorming kan gebroken worden door toevoeging van enkele grammen natriumchloride (R0200) of enkele ml ethanol (R0338). Laat de hexaanfase in een scheitrechter af. Was nu 4 tot 8 maal met steeds 100 ml water tot de fase alkalivrij is (kleuromslag van broomthymolblauw naar geel-oranje, W0006). Breng de hexaanfase over in een erlenmeyer en verwijder de laatste sporen water door te schudden na toevoeging van enkele gram natriumsulfaat (R0121). Damp een aantal ml van de hexaanoplossing in tot droog door middel van een rotatievacuümverdamper bij gereduceerde druk en een badtemperatuur van 40 C. Los het residu onmiddellijk op in een aantal (2 à 3) ml n-hexaan (R0134). LAB 25-I 27 VERDUNNINGEN VITAMINEN dient hierbij als leidraad. 10.3 Chromatografie Vul de chromatografiebuis met n-hexaan (R0134). Giet hier 7 g (± 0,5 g) aluminiumoxide (R0027, gedeactiveerd) in. Regel de uitloopsnelheid, d.m.v. stikstofoverdruk, tot 2 à 3 druppels per seconden. Breng de oplossing, verkregen in 10.2 kwantitatief over op de kolom. Schakel de trekkast aan en de labo- en trekkastverlichting uit. Elueer met ongeveer 30 ml n-hexaan (R0134), die in kleine hoeveelheden gebruikt wordt om de indampkolf te spoelen. De caroteen-fractie wordt zo geëlueerd. Elueer vervolgens met ongeveer 20 ml oplossing 9% diëthylether in n-hexaan (W0037). De tocoferolen worden geëlueerd, samen met eventueel aanwezig etoxyquin. Elueer vervolgens met ongeveer 25 ml oplossing 20% diëthylether in n-hexaan (W0038). Cholecalciferol, ergocalciferol en retinol worden geëlueerd. LAB 25 MET-FLVVT-143 Bepaling van vetoplosbare vitaminen v.02-10/12

Volg de elutie door kortstondige bestraling met de UV-lamp: De licht-blauw fluorescerende zone van etoxyquin, die vaak aanwezig is, gaat de retinol-zone vooraf. De groen-blauw fluorescerende zone van retinol gaat de xanthofyl-zone vooraf. Vang het eluaat op in een rondbodemkolf zodra de retinol-zone ± 5 centimeter van het uiteinde van de kolom verwijderd is, vang verder het eluaat op tot de retinol-zone volledig geëlueerd is (de retinol-zone bevat ook de Cholecalciferol/ergocalciferolfractie). De gele fluorescerende zone van xanthofyl is duidelijk gescheiden van de groenblauw fluorescerende zone van retinol die er aan voorafgaat Damp de verzamelde geëlueerde oplossing in tot droog met de rotatievacuümverdamper bij gereduceerde druk en een badtemperatuur van 40 C. Koel af door kortstondig dompelen in een waterbad op kampertemperatuur. Los het residu onmiddellijk op in methanol (R0183). Document LAB 25-I 27 VERDUNNINGEN VITAMINEN dient hier weer als leidraad. 10.4 HPLC Algemene richtlijnen m.b.t. het gebruik van het HPLC-systeem (opstart, injectieschema, ) worden weergegeven in LAB 25-P 04 RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN. Voor de HPLC injecties worden de volgende standaardoplossingen gebruikt: Vitamine A E D2 D3 Standaaroplossing W0054 W0055 W0034 W0033 11 Kwaliteitscontrole Zie Procedure LAB 25-P 04 RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN. LAB 25 MET-FLVVT-143 Bepaling van vetoplosbare vitaminen v.02-11/12

12 Berekening en rapportering Het gehalte aan vetoplosbare vitamine A, D2, D3 en E van het monster wordt berekend op basis van de hoeveelheid afgewogen materiaal en van de verdunningen die in de loop van de analyse zijn uitgevoerd. Document LAB 25-I 27 VERDUNNINGEN VITAMINEN dient hier weer als leidraad. De concentratie wordt berekend door de HPLC System Manager software. Het resultaat wordt gerapporteerd in IE of mg per kg. 13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 25-I 27 LAB 25-L 18 LAB 25-L 21 LAB 25-L 22 LAB 25-P 04 LAB 25-P 07 LAB 25-F 62 VERDUNNINGEN VITAMINEN OVERZICHT WETGEVING FLVVT APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSES FLVVT OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART LAB 25 MET-FLVVT-143 Bepaling van vetoplosbare vitaminen v.02-12/12