Het referentielaboratorium voor S. pyogenes bevindt zich in het U.Z.A. - U.I.A. - Antwerpen. Materialen & Methoden Stammen In totaal stuurden 3 Belgische diagnostische laboratoria vermoedelijke gevallen van group A streptococcus (GAS) door in de periode van 999 tot :.7% kwam van laboratoria en werd geïsoleerd uit keeluitstrijkjes, het aantal gestuurde gevallen van GAS per laboratorium varieerde van tot 9 geïsoleerde kiemen en het gemiddeld aantal bedroeg. De geïsoleerde kiemen bevatten S. pyogenes uit steriele zones en 7 organismen uit niet steriele zones (inclusief keeluitstrijkjes) (tabel ). Tabel : S. pyogenes : Bron van de isolatie van GAS Invasieve zones Niet-invasieve zones Nee ja Bloed Diepe wonde Synoviaal vocht weefsel cerebrospinaal vocht pleuraal vocht peritoneaal vocht andere steriele zones 3 Keel Oor Abces Huid Niet-steriele wonde Vagina Andere niet-steriele zone onbekend Totaal Totaal 7 Het aantal geïsoleerde gevallen ontvangen per jaar en per zone van isolatie is weergegeven in tabel. Tabel : S. pyogenes : ontvangen gevallen van S. pyogenes per jaar en zone van isolatie Jaar Zone van isolatie Invasief Niet-invasief Totaal Bloed Andere Keel Andere 999 3 37 9 3 7 7 Totaal 3 7 Meer dan % van de stammen werd verzameld bij patiënten jonger dan jaar (figuren, en 3). Figuur : S. pyogenes : leeftijdsdistributie van 7 GAS 3 3 7 7 age (y ears)
Referentielaboratorium Figuur : S. pyogenes : leeftijdsdistributie van 3 invasieve GAS 7 3 9 3 3 7 7 7 a g e (years) Figuur 3 : S. pyogenes : leeftijdsdistributie van 79 niet-invasieve GAS 3 3 7 7 9 age (years) Het merendeel van de isolaten werd verzameld tijdens de perioden Mei-Juli en Okotber-November (figuur ). Figuur : S. pyogenes : datum van isolatie van GAS //99 //99 /7/99 //99 // // /7/ // // // /7/ // date of isolation
Phenotypische opsporing van resistentiemechanismen Volgens de methode van de dubbele-schijf test werden Erythromycine (verspreidbare inhoud 7 µg) en Clindamycine (verspreidbare inhoud µg) Neo-Sensitab schijven (Rosco, Taastrup, Denmark) afzonderlijk aangebracht op tot mm op een bloed agar plaat (Mueller-Hinton agar aangevuld met % gedefibrineerd paardebloed) waarop voordien een bacteriële suspensie evenwaardig met een. McFarland standaard was geïnoculeerd. Na een etmaal incubatie bij 37 C in aerobe omstandigheden, werd het induceerbare, constitutieve of M resistentie phenotype van de stam bepaald door de inhibitiezone rond de twee schijven. Antimicrobiële gevoeligheidstest MIC-waarden werden bepaald door de agar verdunningsmethoden, gebruikmakende van de criteria aanbevolen door het Nationaal Committee voor Klinische laboratoria Standaarden. De volgende antibiotica werden getest: erythromycine, clindamycine, miokamycine, azithromycine, clarithromycine en tetracycline. Op Polymerase chain reaction (PCR)-gebaseerde opsporing van resistentiegenen Specifieke primers werden gebruikt om de genen mefa, ermb () en ermtr () op te sporen. M genotypering Het M genotype werd bepaald door hybridisatie van het gedenatureerd M-gen amplicion met M-type specifieke probes in een reversed line blotting systeem volgens de genotyperingsmethode beschreven door Kaufhold et al. (3) Pulsed-field gel elektroforese PFGE werd uitgevoerd zoals reeds beschreven (). Resultaten Phenotypische opsporing van resistentiemechanismen Gegevens worden enkel weergegeven voor GAS geïsoleerd in Belgische arrondissementen vermits ze een voldoende aantal van de isolaten vertegenwoordigen. Onder de uit de keel geïsoleerde en geteste GAS stammen waren er 99 (3,%) resistent voor erythromycine. Volgens de dubbele schijf test, vertoonden 93 (,%) van de erythromycine-resistente isolaten constitutieve resistentie (c MLS B) en (7.%) het patroon van nieuwe resistentie (M phenotype). De prevalentie van erythromycine resistentie varieerde tussen de laboratoria van,% tot,% (tabel 3). De verspreiding van erythromycine-resistentie in 999, en wordt weergegeven in tabel. Tabel 3: S. pyogenes : resistentie voor erythromycine Arrondissement % erythromycine-r % c MLS B % M phenotype Antwerpen..9. Leuven.. 7. Charleroi. 3. 9. Luik.7..9 Hasselt...9 Neufchâteau... Tabel : S. pyogenes : resistentie voor erythromycine per jaar Arrondissement Aantal erythromycine resistente gevallen/ totaal aantal gevallen van S. pyogenes (%) per jaar 999 Antwerpen 3/9 (.3) / (7.3) /(.) Leuven /9 (.) / (.) 9/ (.) Charleroi 3/ (7.) /7 (.) 3/7 (.7) Luik / (.) /3 (7.7) /9 (3.) Hasselt /9 (.) 7/ (.) 3/9 (.3) Neufchâteau / (3.) / (3.9) 3/ (.) Gemiddelde 73/3 (3.) /379 (.) 9/ (.) Op PCR-gebaseerde opsporing van resistentie genen In 9.% werd het constitutieve resistentie phenotype genotypisch geconfirmeerd door de aanwezigheid van het ermb gen, terwijl in 9.9% het mefa gen aanwezig was in stammen met een M resistentie-phenotype. Twee stammen, die wel resistent waren voor erytromycine maar negatief voor ermb en mefa, droegen het ermtr gen. 3
Referentielaboratorium Antimicrobiële gevoeligheidstest De MIC ranges en de MIC-waarden waarbij respectievelijk % en 9% van de 37 stalen van keeluitstrijkjes werden geïnhibeerd worden weergegeven in tabel en. Tablel : S. pyogenes : MIC range, MIC, MIC 9 (µg/ml) en % resistentie van de 37 isolaten Antibioticum Range MIC MIC 9 Aantal resistente gevallen (%) Erythromycine.3 - >. (.) Clarithromycine.3 - >.3 9 (.) Azithromycine.3 - >. 9 (.) Miokamycine.7 -.. (.) Clindamycine.3 -.3. 9 (.) Tetracycline.3 -. (.) Tabel : S. pyogenes : range, MIC, MIC 9 (µg/ml), % resistentie en resistentie breekpunt van 37stammen van voor antibiotica Erythromycine-gevoelige stammen (97) Erythromycine-resistente gevallen () Antibioticum Range MIC MIC 9 Aantal resistente gevallen (%) Resistentie breekpunt Range MIC MIC 9 Aantal resistente gevallen (%) Erythromycine.3 -..3. - > > () Clarithromycine.3 -.3. (.7).3 - > > 7 (9.) Azithromycine.3 -.. (.3). - > 3 > (9.) Miokamycine.7 -.. (.3) *. -. 3 9 (3.) Clindamycine.3 -..3..3 - >. 9 (3.) Tetracycline.3 -.. (.). (.) * geen NCCLS breekpunt vastgesteld (.%) van de isolaten van keeluitstrijkjes waren resistent voor erythromycine,.% van de isolaten was resistent voor clindamycine. The resistentie voor clarithromycine en azithromycine was.%, terwijl de resistentie voor miokamycine.% bedroeg. De erythromycine-resistente isolaten waren, onafhankelijk van het phenotype, resistent voor de - en - ledige macroliden, clarithromycine en azithromycine in respectievelijk 9.% en 9.% van de isolaten. Daarentegen behielden clindamycine en miokamycine enige werking, afhankelijk van het phenotype; alle stammen met nieuwe resistentie waren gevoelig voor deze middelen, maar geen enkele stam met constitutieve resistentie. M typering Het M genotype werd opgespoord voor alle erythromycine-resistente isolaten uit keeluitstrijkjes verzameld in 999. Het meest gevonden M type is M, dit type werd enkel in,7% van de c MLS B stammen gevonden. Onder de stammen met M phenotype werd M type gevonden bij 9,%, andere M types die werden opgespoord bij deze stammen zijn M, M en M. Pulsed-field gel elektroforese Alle erythromycine-resistente isolaten uit keelstrijkjes werden getypeerd door PFGE met het restrictie enzyme SmaI of SfiI afhankelijk van het phenotype. De stammen met constitutieve resistentie waren typeerbaar met SmaI, terwijl de meerderheid van de stammen met het M resistentie phenotype niet typeerbaar waren met SmaI, daarom werd de klonale vewantschap gebaseerd op SfiI profielen bestudeerd. De interpretatie hiervan werd uitgevoerd zoals beschreven door Tenover at al. () Visuele en gecomputeriseerde analyse van alle verkregen SmaI patronen leverde 7 verschillende patronen op. Het meest gevonden patroon bevat 9,% (n=) van de bestudeerde isolaten en was samengesteld uit stammen geïsoleerd in 999 (7,7%) (,9%) (,%). In 999 vonden we vijf verschillende patrone, terwijl in vijftien verschillende patronen werden gevonden. Visuele en gecomputeriseerde analyse van alle verkregen SfiI patronen leverde 3 verschillende patronen op. Het meest gevonden patroon bevat 39,3% (n=) van de bestudeerde isolaten en was samengesteld uit stammen geïsoleerd in 999 (9,%) (33,3%) (7,%). In 999 vonden we tien verschillende patronen, terwijl in twaalf verschillende patronen werden gevonden. Om te besluiten vonden we meer klonaliteit voor de constitutieve isolaten in 999 dan in, terwijl voor de M resistente stammen de klonaliteit hoger was in dan in 999. Referenties. Sutcliffe, J., A. Tait-Kamradt, and L. Wondrack. 99. Streptococcus pneumoniae and resistant to macrolides but sensitive to clindamycin: a common resistance pattern mediated by an efflux system. Antimicrob. Agents Chem. : 7-.. Seppälä, H., M. Skurnik, H. Soini, M. Roberts, and P. Huovinen. 99. A novel erythromycin resistance methylase gene (ermtr) in. Antimicrob. Agents Chem. : 7-.
3. Kaufhold, A., A. Podbielski, G. Baumgarten, M. Blokpoel, J. Top, L. Schouls. 99. Rapid typing of group A streptococci by use of DNA amplification and non-radioactive allele-specific oligonucleotide probes. FEMS microbiol. lett. 9:9-.. Descheemaeker, P., S. Chapelle, C. Lammens, M. Hauchecorne, M. Wijdooghe, P.Vandamme, M. Ieven, and H. Goossens.. Macrolide resistance and erythromycin resistance determinants among Belgian Streptococci pyogenes and Streptococci pneumoniae isolates. J. Antimicrob. Chemother. :7-73.. Tenover, F., R. Arbeit, R. Goering, P. Mickelsen, B. Murray, D. Persing, B. Swaminathan. 99. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J. Clin. Microbiol. 33:33-39.