VALIDATIE VAN HET DISK DIFFUSIE ANTIBIOGRAM VOOR DE BACTEROIDES FRAGILIS GROEP

Transcriptie

1 FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep klinische biologie, microbiologie en immunologie Klinisch laboratorium bacteriologie UZ Gent Academiejaar VALIDATIE VAN HET DISK DIFFUSIE ANTIBIOGRAM VOOR DE BACTEROIDES FRAGILIS GROEP Sara VAN DEN BOSSCHE Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling Promotor: Prof. Dr. Geert Claeys Commissarissen: Dr. Jerina Boelens, Prof. Dr. Cristophe Stove

2

3 FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep klinische biologie, microbiologie en immunologie Klinisch laboratorium bacteriologie UZ Gent Academiejaar VALIDATIE VAN HET DISK DIFFUSIE ANTIBIOGRAM VOOR DE BACTEROIDES FRAGILIS GROEP Sara VAN DEN BOSSCHE Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling Promotor: Prof. Dr. Geert Claeys Commissarissen: Dr. Jerina Boelens, Prof. Dr. Cristophe Stove

4 AUTEURSRECHT De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef. 24 mei 2016 Promotor Prof. Dr. Geert Claeys Auteur Sara Van den Bossche

5 SAMENVATTING De groeiende resistentie binnen de B. fragilis groep doet de vraag rijzen naar een gevoeligheidstest die routinematig kan gebruikt worden. De reeds gevalideerde E-test is duur en omslachtig. Daarom is er vraag naar een eenvoudige, flexibele en goedkopere techniek. De disk diffusie methode voldoet aan deze voorwaarden. De validatie in deze studie is gebaseerd op een preliminaire studie van EUCAST. De disk diffusie methode werd gevalideerd op Brucella bloed agar en op Mueller Hinton agar met bloed. De E-test werd hiervoor als referentiemethode gebruikt. De breekpunten voorgesteld in de studie van EUCAST werden getoetst aan de bekomen data. Als deze breekpunten ontbraken of niet aanvaard konden worden, werden zelf breekpunten voorgesteld. De gevoeligheid van 62 klinische isolaten werd met de disk diffusie methode op beide bodems en met de E-test nagegaan. Hiervoor werd gestart van een 1 McFarland suspensie in steriel, fysiologisch water. Volgende antibiotica werden getest: amoxicilline-clavulaanzuur (20/10 µg), clindamycine (2 µg), clindamycine (10 µg), meropenem (10 µg), metronidazole (5 µg), moxifloxacine (5 µg) en tigecycline (15 µg). De platen werden 24 h geïncubeerd (clindamycine 48 h) bij 35 C in anaerobe omstandigheden. De verwerking van de data gebeurde met behulp van een lineaire regressie analyse en een foutenanalyse. Er werd een goede overeenkomst teruggevonden tussen de MIC bepaald met de E-test en de diameter volgens de disk diffusie methode voor amoxicilline-clavulaanzuur, meropenem, metronidazole en tigecycline zowel op de Brucella bloed agar als op de Mueller Hinton agar met bloed. De breekpunten bepaald in de preliminaire studie van EUCAST kunnen aanvaard worden voor amoxicilline-clavulaanzuur en metronidazole voor de methode op Brucella bloed agar. Voor meropenem en tigecycline op Brucella bloed agar en voor alle antibiotica op Mueller Hinton agar met bloed moeten zelf breekpunten worden voorgesteld. Voor clindamycine en moxifloxacine is het onderscheid tussen de gevoeligheidscategorieën op basis van de diameters onduidelijk. Het opnemen van moxifloxacine en clindamycine in het antibiogram moet bijgevolg in vraag gesteld worden. Voor drie stammen (4,84 %) was groei op Mueller Hinton met bloed onmogelijk. De disk diffusie methode als gevoeligheidstest voor de B. fragilis groep is dus een optie voor amoxicilline-clavulaanzuur, meropenem, metronidazole en tigecycline op beide bodems.

6 DANKWOORD Deze masterproef is de neergeschreven versie van een zeer leuk en leerrijk semester. Daarom moet het indienen ervan gepaard gaan met het bedanken van het laboratorium bacteriologie in het UZ Gent. In het bijzonder gaat mijn dank uit naar professor Claeys; voor de goeie begeleiding en de nieuwe inzichten die hij me heeft bijgebracht. Daarnaast wil ik graag alle andere medewerkers bedanken. In de eerste plaats voor wat ze me bijgeleerd hebben, maar ook voor het warme welkom en de leuke tijd. Ook wil ik graag professor Stove bedanken om de mogelijkheid aan te bieden deze onderzoeksstage te volgen. Daarnaast is deze masterproef ook een belangrijk onderdeel van mijn studies. En in dat opzicht wil ik ook mijn mama, mijn broer en mijn vriend bedanken. Zij stellen immers op elk moment mijn studies op de eerste plaats en steunen mij als het even niet lukt. Tenslotte wil ik graag mijn vader bedanken omdat hij mij geleerd heeft dat mooie dingen voortkomen uit hard werk. Dat laatste heb ik bij het maken van deze masterproef zelf ervaren. Ik heb er veel tijd en energie ingestoken, maar ik ben ook trots op het resultaat. Bedankt aan jullie allen, Sara Van den Bossche

7 INHOUDSOPGAVE 1. INLEIDING ANAEROBE BACTERIËN EN ANAEROBE INFECTIES BACTEROIDES FRAGILIS GROEP Taxonomie Klinische betekenis Groei Identificatie Resistentie binnen de B. fragilis groep ANAEROBIE Historisch Obligate anaeroob Anaerobe condities in het labo NUTTIGE ANTIBIOTICA BIJ ANAEROBE INFECTIES Antibiotica en gevoeligheid β-lactam antibiotica Clindamycine Metronidazole Tetracyclines Fluoroquinolones Resistentiemechanismen Inactiverende enzymes Andere resistentiemechanismen GEVOELIGHEIDSBEPALINGEN Gevoelig, intermediair of resistent Belang MIC Klinisch breekpunt en epidemiologische cut-off waarde Methoden Dilutietechnieken Disk diffusie methode E-test Moleculaire methoden... 14

8 1.5.6 AST bij anaerobe bacteriën Validatie van een nieuwe methode Minor error Major error Very major error Belang intermediaire categorie DOEL VAN DEZE STUDIE MATERIAAL EN METHODEN KWEEK KIEMEN IDENTIFICATIE STAMMEN E-TEST DISK DIFFUSIE METHODE STATISTISCHE ANALYSE RESULTATEN IDENTIFICATIE E-TEST EN DISK DIFFUSIE METHODE: STATISTISCHE VERGELIJKING Amoxicilline-clavulaanzuur Verdeling MIC Brucella bloed agar Mueller Hinton agar met bloed Clindamycine (2 µg) Verdeling MIC Brucella bloed agar Mueller Hinton agar met bloed Clindamycine (10 µg) Brucella bloed agar Mueller Hinton agar met bloed Meropenem Verdeling MIC Brucella bloed agar Mueller Hinton agar met bloed Metronidazole Verdeling MIC Brucella bloed agar... 36

9 Mueller Hinton agar met bloed Moxifloxacine Verdeling MIC Brucella bloed agar Mueller Hinton agar met bloed Tigecycline Verdeling MIC Brucella bloed agar Mueller Hinton agar met bloed DISCUSSIE BESLUIT LITERATUURLIJST... 51

10 LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN AST: Antimicrobial susceptibility testing BB: Brucella bloed agar B. fragilis: Bacteroides fragilis CLSI: Clinical and laboratory standards institute DNA: desoxyribonucleïnzuur ECOFF: Epidemiologische cut-off E-test: Epsiolometer test EUCAST: European committee on antimicrobial susceptibility testing I: Intermediair MALDI-TOF: Matrix assisted laser desorption ionization time of flight MBC: Minimale bactericide concentratie me: Minor error ME: Major error MHC: Major histocompatibility complex MHF: Mueller Hinton agar met paardenbloed MIC: Minimale inhiberende concentratie m/z: massa/lading PCR: Polymerase chain reaction PBP: Penicillin binding protein QQ-plot: Quantile-quantile plot R: Resistent ROS: Reactive oxygen species S: Gevoelig TSB: Tryptic soy broth vme: Very major error

11 1. INLEIDING 1.1 ANAEROBE BACTERIËN EN ANAEROBE INFECTIES Anaerobe micro-organismen zijn als commensaal terug te vinden in de darmflora en op slijmvliezen. Klinisch worden ze voornamelijk geïsoleerd uit abcessen en necrotisch weefsel. Een anaerobe infectie begint dan ook vaak met het verbreken van een anatomische barrière. Dit biedt aan lokale flora de kans om binnen te dringen in weefsels die anders steriel zijn. Hoewel in de humane flora heel wat anaerobe bacteriën aanwezig zijn, worden in klinische isolaten vooral bepaalde species teruggevonden. De species behorend tot de B. fragilis groep vormen één vierde van alle anaerobe bacteriën die in klinische isolaten worden teruggevonden. Voor de meeste clinici wordt het B. fragilis species dan ook als het belangrijkste anaerobe pathogeen beschouwd. Alle andere anaerobe bacteriën worden vaak onder de gemeenschappelijke noemer andere anaeroben geplaatst. Dit schetst het belang van de B. fragilis groep onder de anaerobe pathogenen. 1,2 De behandeling van anaerobe infecties gebeurt op dit moment enerzijds door chirurgie, anderzijds door het toedienen van antibiotica. Deze antibioticatherapie gebeurt voornamelijk empirisch. Daarvoor zijn drie belangrijke redenen. De eerste is dat gedurende een lange tijd de gevoeligheid van anaerobe bacteriën vrij voorspelbaar was door de lage resistentie. Ten tweede zijn infecties met anaerobe bacteriën vaak polymicrobieel. Het gebrek aan een snelle, goedkope en bruikbare gevoeligheidstest voor anaerobe bacteriën vormt de derde reden. Gezien de groeiende resistentie binnen de B. fragilis groep, is deze empirische benadering niet langer automatisch optimaal. Het valideren en nadien mogelijk in gebruik nemen van een geschikte gevoeligheidstest is dan ook een interessante mogelijkheid. 2,3,4 1

12 1.2 BACTEROIDES FRAGILIS GROEP Taxonomie Binnen het genus Bacteroides zijn de laatste decaden op het vlak van taxonomie heel wat herzieningen gebeurd. Veel soorten die men vroeger Bacteroides noemde, zijn nu overgebracht naar andere genera: Prevotella, Porphyromonas, Campylobacter, Tanerella Het genus Bacteroides maakt deel uit van de familie van Bacteroidaceae. Deze maakt dan weer deel uit van de orde Bacteroidales, die deel uitmaakt van de klasse Bacteroidetes. Binnen de B. fragilis groep maakt het species B. fragilis 40 % tot 54 % uit. Een ander belangrijk species binnen deze groep is B. thetaiotaomicron, dat 13 % tot 23 % van de groep uitmaakt. Maar ook species van het genus Parabacteroides behoren tot de B. fragilis groep. De verschillende species van de B. fragilis groep zijn weergegeven in tabel , 5 Het genus Bacteroides en het genus Parabacteroides onderscheiden zich tussen de anaerobe bacteriën als gram negatieve staaf. Vaak wordt dan ook de fout gemaakt elke gram negatieve, obligaat anaerobe staaf als Bacteroides te benoemen. Ook het bacteriën van de genera Fusobacterium, Leptotrichia, Desulfomonas, Prevotella zijn gram negatieve, obligaat anaerobe staven. Het onderscheid wordt gemaakt op basis van morfologische, fysiologische en genetische kenmerken. 3 Tabel 1.1 Species van de B. fragilis groep (Brook et al., 2013) B. acidifaciens B. helcogenes B. plebeius P. distasonis B. caccae B. intestinalis B. uniformis P. merdae B. coprocola B. massiliensis B. salyersai P. goldsteinii B. coprosuis B. nordii B. pyogenes P. chartae B. eggerthii B. ovatus B. dorei P. gordonii B. finegoldii B. thetaiotaomicron B. johnsonii P. johnsonii B. fragilis B. vulgatus Klinische betekenis De species binnen de B. fragilis groep maken deel uit van de commensale flora. Daarnaast zijn het echter ook belangrijke pathogenen bij anaerobe infecties. Volgende infecties worden vaak geassocieerd met leden van de B. fragilis groep: wondinfectie, bacteriemie, intraperitoneale abcessen en peritonitis. Bij intra-abdominale infecties zijn kiemen uit de B. fragilis groep en van het species E. coli vaak de belangrijkste verwekkers. 2

13 Inflammatie, na beschadiging van de mucosa, is voornamelijk te wijten aan het polysacharide kapsel dat de bacterie omgeeft. Dit kapsel zorgt voor de vorming van een abces. Een mogelijk mechanisme voor abcesvorming is dat groeven in het polysacharide kapsel fungeren als bindingsplaats voor α-helices van specifieke moleculen zoals de MHC-molecule (major histocompatibility complex). Dit complex kan herkend worden door T-cellen. Op die manier wordt het verworven immuunsysteem geactiveerd, met inflammatie tot gevolg. Dit is slechts één mogelijk mechanisme voor infectie. Daarnaast zijn ook bepaalde enzymes en enterotoxines betrokken bij abcesvorming. 1,6,7, Groei De voeding van kiemen binnen de B. fragilis groep is vrij minimaal. De belangrijkste voedingsstoffen zijn ammonium als stikstofbron en glucose als koolstof- en energiebron. Anaerobe micro-organismen worden echter over het algemeen gekweekt op complexe media waaraan gepaste antibiotica en inhibitoren zijn toegevoegd om zo selectieve groei te bekomen. Deze rijke media zijn noodzakelijk voor heel wat anaerobe bacteriën, maar niet voor de kiemen uit de B. fragilis groep. Haem is wel voor vele stammen een essentiële voedingsstof. Vitamine K 1 en vitamine B 12 zijn niet noodzakelijk voor de groei van species binnen de B. fragilis groep. 3, 9 Stammen uit de B. fragilis groep zijn, in tegenstelling tot andere anaerobe bacteriën, snelgroeiende bacteriën. Hierdoor is een gevoeligheidsbepaling met behulp van de disk diffusie methode mogelijk (zie ook paragraaf en ). 4, 5 Concreet worden anaerobe bacteriën op drie verschillende bodems gekweekt: een Schaedler bodem, een Brucella bloed agar of een ARIA bodem. De eerste is een rijke bodem waaraan geen antibiotica zijn toegevoegd. Een alternatief voor de Schaedler bodem is een Brucella bloed agar. In de ARIA bodem is neomycine aanwezig om zo selectiviteit voor obligaat anaerobe bacteriën te bekomen. Alle drie de bodems bevatten haem en vitamine K als belangrijke groeifactoren. 10,11,12,13 3

14 1.2.4 Identificatie Vooraleer technologie een eenduidige identificatie mogelijk maakte, werden anaerobe kiemen op basis van geur, kweek en morfologie geïdentificeerd. 3 Nu wordt uitsluitsel over de identiteit van een bacterie geboden via massaspectrometrische technieken. Het grote voordeel van deze techniek is de analysesnelheid. Voor de identificatie van bacteriën wordt meestal gebruik gemaakt van MALDI-TOF massaspectroscopie. Het bekomen massaspectrum wordt vergeleken met referentiespectra, tot voldoende overeenkomst wordt teruggevonden. Deze vergelijking gebeurt via een multivariate statistische analyse en de mate van overeenkomst wordt weergegeven in een kleurencode. De spectra geven de m/z-waarden weer van de aanwezige structurele eiwitten en het ribosomaal RNA van de bacterie. Het massaspectrum is bijgevolg representatief voor het fenotype van de bacterie. Op die manier is het massaspectrum afhankelijk van de incubatietijd en de gebruikte groeimedia. Dus controle van de groei en standaardisatie in de staalvoorbereiding zijn belangrijke aspecten in de variabiliteit van massaspectra. 14 MALDI staat voor Matrix Assisted Laser Desorption Ionization en verwijst naar de manier van ioniseren. Hierbij wordt het te onderzoeken staal in een matrix gebracht. Deze matrix heeft twee belangrijke functies. Enerzijds is deze belangrijk voor het absorberen van de energie afkomstig van de laser. Anderzijds speelt deze een rol in het isoleren van de verschillende biologische moleculen. Door interactie van een laserstraal met dit mengsel worden ionen weggeschoten. Deze ionen worden dan verder geleid naar de analysator, die de ionen scheidt volgens m/z-waarde. De analysator is in dit geval TOF of Time of flight. Hierbij worden ionen versneld en nadien in een vacuüm gebracht. Lichte partikels ondervinden het minste weerstand van de zwaartekracht en bereiken het snelst de detector. 15 4

15 1.2.5 Resistentie binnen de B. fragilis groep Studies uit de jaren 80 beschrijven reeds resistentie binnen de B. fragilis ten opzichte van antibiotica waar andere bacteriën gevoelig voor zijn. In deze studies wordt voornamelijk gesproken over resistentie voor β-lactam antibiotica door β-lactamase desactivatie zoals uitgebreid besproken in paragraaf In de daarop volgende jaren zijn heel wat studies gepubliceerd die de gevoeligheid binnen deze opvallend resistente groep beschrijven. In studies uit de jaren 90 wordt al een grotere resistentie voor o.a. clindamycine en moxifloxacine besproken. De resistentie binnen de B. fragilis groep blijft toenemen. De huidige stand van zaken wordt uitgebreid besproken onder paragraaf ANAEROBIE Historisch 16, 17, 18 Hoewel Van Leeuwenhoek als eerste organismen opmerkte die in afwezigheid van zuurstof kunnen overleven, beschreef Pasteur het anaerobe leven voor het eerst (1861). Lange tijd bleef er onduidelijkheid bestaan omtrent anaerobe micro-organismen. Tijdens WO I werd, door frequente infecties, de nood aan kennis over anaerobe bacteriën groter. De ontdekking van de anaerobe jar in 1916 was dan ook een grote stap voorwaarts. Deze liet namelijk toe anaerobe bacteriën te kweken en ze op die manier nader te onderzoeken. In de daarop volgende 60 jaar werd vooral verder onderzoek verricht naar bacteriën van het genus Clostridium. Pas in de jaren 70 werd het belang van infecties door andere anaerobe bacteriën dan Clostridium ingezien Obligate anaeroob De B. fragilis groep behoort tot de obligaat anaerobe bacteriën. Obligate anaerobie houdt in dat bacteriën in zuurstofrijke omgeving niet kunnen overleven. Dit is te wijten aan een deficiëntie in superoxide dismutase, catalase of alkylhydroperoxide reductase. Deze beschermende enzymen breken in aerotolerante en aerobe bacteriën de uit zuurstof gevormde reactive oxygen species (ROS) af. Tot deze ROS behoren superoxide anionen, waterstofperoxiden en hydroxylradicalen. Deze kunnen alle drie schade berokkenen aan de cel door desactivatie van proteïnen en DNA-schade. De reacties die door bovenstaande enzymen worden gekatalyseerd, worden weergegeven in reactievergelijking 1.1, 1.2 en

16 2O 2 + 2H + O 2 + H 2 O 2 (superoxide dismutase) (1.1) 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 (catalase) (1.2) H 2 O 2 + H 2 R 2H 2 O + R (alkylhydroperoxide reductase) (1.3) Het genus Bacteroides werd lang tot de strikt anaerobe bacteriën gerekend. Recente studies tonen echter aan dat nanomolaire concentraties opgeloste zuurstof (2 % - 8 %) de groei juist bevorderen. Toch kunnen bacteriën van het genus Bacteroides niet overleven wanneer de zuurstofconcentratie verder wordt opgedreven. Deze beperkte bescherming is te wijten aan de aanwezigheid van enzymen zoals superoxide dismutase en catalase. Fumaraatreductase daarentegen bevordert de vorming van ROS in Bacteroides en speelt dus een belangrijke rol in de strikte anaerobie. De mogelijkheid om te groeien in nanomolaire concentraties zuurstof heeft belangrijke klinische gevolgen. Hierdoor is groei namelijk al mogelijk vooraleer 1, 3, 19 het anaerobe abces is gevormd. Een tweede belangrijk aspect in de groei van anaerobe bacteriën is de reductiepotentiaal. Het belang hiervan is aangetoond in studies waarin bepaalde anaerobe bacteriën aan zuurstof worden blootgesteld en de reductiepotentiaal met elektrische stroom laag wordt gehouden. Op die manier konden anaerobe bacteriën toch overleven, onafhankelijk van de aanwezigheid van zuurstof. De mate waarin anaerobe bacteriën groeien, bleek in deze studies rechtstreeks in verband te staan met de reductiepotentiaal. Er zijn dan ook bovengrenzen voor de reductiepotentiaal gedefinieerd, boven de welke bepaalde anaerobe bacteriën niet kunnen groeien Anaerobe condities in het labo Om de groei van obligaat anaerobe bacteriën toe te laten, moeten anaerobe condities verzekerd zijn. In het labo waar de studie wordt uitgevoerd, wordt gewerkt met het Whitley jar gassing system. Een jar wordt aan het toestel aangesloten. Dit toestel voert zes keer dezelfde cyclus uit, die bestaat uit twee fasen. De eerste fase is het verwijderen van de helft van de lucht die in de jar aanwezig is, waarna hetzelfde volume van een anaeroob mengsel wordt ingebracht. Dit anaeroob mengsel bestaat uit 80 % N 2, 10 % H 2 en 10 % CO 2. Door het meervoudig herhalen van de cyclus, wordt de aanwezige hoeveelheid zuurstof miniem. 20 De nog aanwezige zuurstof reageert weg door het gebruiken van een katalysator. De gebruikte katalysator bestaat uit aluminium korrels gecoat met een dunne laag palladium. Palladium is in staat de omzetting van de achtergebleven zuurstof naar water te katalyseren. 21 6

17 Controle op de anaerobe condities gebeurt door het gebruik van anaerobe indicator strips. Deze strips bevatten methyleenblauw en een witte kleur is indicatief voor anaerobe condities. Het wit verkleuren van de strips is echter geen garantie voor voldoende anaerobe condities. Hiervoor is deze indicator namelijk te ongevoelig. Een bijkomende controle kan gebeuren door de gevoeligheid van een strikt anaerobe bacterie voor metronidazole te beoordelen. Metronidazole is enkel werkzaam in anaerobe condities en heel weinig kiemen binnen de B. fragilis groep zijn resistent aan metronidazole (zie paragraaf ). Wanneer resistentie voor metronidazole wordt waargenomen, moeten de anaerobe condities bijgevolg in vraag worden gesteld. Indien er twijfel over de anaerobe condities bestaat, kan deze worden nagegaan door het bepalen van de MIC voor een controle stam waarvan de gevoeligheid voor metronidazole gekend is NUTTIGE ANTIBIOTICA BIJ ANAEROBE INFECTIES Antibiotica en gevoeligheid De hieronder besproken antibiotica zijn interessant in het geval van anaerobe infecties. Verschillende studies tonen echter een groeiende resistentie aan binnen de B. fragilis groep voor deze antibiotica (zie ook paragraaf 1.2.5). Daarom is het belangrijk de gevoeligheid na te gaan in een gevoeligheidstest. 16,17, β-lactam antibiotica Voor penicilline, ampicilline en amoxicilline is er resistentie waargenomen binnen de B. fragilis groep. De combinatie van een β-lactam antibioticum met een β-lactamase inhibitor heeft wel een goede activiteit voor de B. fragilis groep. Hieruit kan besloten worden dat het belangrijkste resistentiemechanisme de productie van β-lactamase is (zie paragraaf 1.4.2). Volgens een Belgische multicenter studie uit 2013 is 92 % van de stammen binnen het species B. fragilis gevoelig aan de combinatie van amoxicilline en clavulaanzuur en 91% gevoelig aan de combinatie van piperacilline en tazobactam. 4 Het gebruik van cephalosporines voor de behandeling van anaerobe infecties is niet zinvol, gezien de grote resistentie binnen de B. fragilis groep. Dit is te wijten aan de cephalosporinase activiteit van het aanwezige β-lactamase. 7

18 Carbapenems (bijvoorbeeld meropenem en imipenem) hebben een zeer goede activiteit ten opzichte van anaerobe bacteriën, zelfs ten opzichte van β-lactamase producerende stammen van het genus Bacteroides. Meropenem behoort dan ook tot de meest potente antibiotica voor de behandeling van anaerobe infecties. 2, Clindamycine Clindamycine kent een breed spectrum ten opzichte van anaerobe bacteriën. Toch zien we een wereldwijde toename van de resistentie binnen de B. fragilis groep. In de Belgische multicenter studie bleek slechts 58 % van de stammen van het genus Bacteroides of Parabacteroides gevoelig. Daarnaast is een belangrijk nadeel dat clindamycine niet actief is ten opzichte van E. coli. Daarom is bij een abdominale infectie steeds een combinatie met een ander antibioticum nodig Metronidazole 2, 4, 8 Metronidazole heeft een uitstekende activiteit ten opzichte van stammen binnen de B. fragilis groep en andere obligaat anaerobe bacteriën. Klinisch wordt het gebruik van metronidazole niet altijd aangemoedigd omwille van het gebrek aan activiteit ten opzichte van aerobe bacteriën. Er zal dus een combinatie van antibiotica moeten toegediend worden in het geval van een polymicrobiële infectie. 2 Dit gebrek aan activiteit ten opzichte van aerobe bacteriën, kan verklaard worden aan de hand van het werkingsmechanisme. Eens opgenomen in de cel wordt metronidazole omgezet tot een nitroso radicaal door het overdragen van een elektron naar de nitrogroep van de molecule. Dit radicaal is in staat schade toe te brengen aan het DNA van de cel. Op die manier wordt de cel afgedood. In aerobe bacteriën zijn geen elektronentransport proteïnen met voldoende negatieve reductiepotentiaal aanwezig om metronidazole te reduceren. De actieve vorm kan dus niet gevormd worden Tetracyclines Slechts 45 % van alle kiemen uit de B. fragilis groep is gevoelig voor tetracycline. Tigecycline daarentegen, een nieuwer antibioticum binnen de tetracyclines, vertoont wel sterke activiteit. Slechts 3,3 % tot 7,2 % blijkt resistent in de Belgische multicenter studie. Het nadeel van tigecycline is dat dit een bacteriostatisch antibioticum is en daarom niet in een acute fase kan gebruikt worden. 2, 24 8

19 Fluoroquinolones De oudere fluoroquinolones, zoals ciprofloxacine en ofloxacine, vertonen weinig activiteit voor anaerobe bacteriën. Toch vertonen sommige breed-spectrum fluoroquinolones, zoals moxifloxacine, significante antimicrobiële activiteit tegenover anaerobe bacteriën. In heel wat studies wordt echter een toenemende resistentie ten opzichte van moxifloxacine waargenomen. Slechts 71 % van de anaerobe kiemen bleek gevoelig in de recente Belgische studie. 2, 4, 25, Resistentiemechanismen Over het algemeen kunnen voorgenoemde resistenties door drie resistentiemechanismen veroorzaakt worden Inactiverende enzymes Het eerste belangrijke resistentiemechanisme is het uitscheiden van inactiverende enzymes, zoals β-lactamasen. Dit is het meest voorkomende resistentiemechanisme in het geval van resistentie ten opzichte van β-lactam antibiotica binnen de B. fragilis groep. β-lactamasen zijn in staat de cyclische amidebinding in de β-lactam ring te hydrolyseren, met verlies van activiteit tot gevolg. Dit resistentiemechanisme kan omzeild worden door het toedienen van een β-lactam antibioticum in combinatie met een β-lactamase inhibitor. De laatste inhibeert de activiteit van de uitgescheiden β-lactamasen en verhindert zo inactivatie van het antibioticum. Voorbeelden zijn de combinatie van amoxicilline met clavulaanzuur en piperacilline met tazobactam. Resistentie door inactiverende enzymen wordt op dit moment opgespoord met behulp van PCR Andere resistentiemechanismen Andere resistentiemechanismen zijn moeilijker op te sporen. Een eerste mogelijk resistentiemechanisme is het wijzigen van het doelwit voor penicillines, de penicilline binding proteins (PBP s). Daarnaast kan ook de permeabiliteit voor een antibioticum veranderen door een wijziging in de porinestructuur. Dit zijn mogelijke resistentiemechanismen voor o.a. amoxicilline-clavulaanzuur. 27, 28, 29, 30, 31, 32 9

20 1.5 GEVOELIGHEIDSBEPALINGEN Gevoelig, intermediair of resistent Het doel van het uitvoeren van een antimicrobiële gevoeligheidstest (AST) is bepalen of een kiem tot de gevoelige, intermediaire of resistente categorie behoort. Deze verschillende categorieën geven weer wat de kans op therapeutisch succes is bij toedienen van het betreffende antibioticum. Ze worden van elkaar onderscheiden op basis van klinische breekpunten (uitgebreid besproken in paragraaf 1.5.4). Van alle kiemen die tot de gevoelige categorie (S) behoren wordt verwacht dat therapie met het betreffende antibioticum succesvol zal zijn bij gebruik van de standaarddosering. De intermediaire zone is een grijze zone en helpt om te strikte categorisatie ten gevolge van onvoldoende precisie of onnauwkeurig aflezen te voorkomen. EUCAST en CLSI zijn organisaties die gevoeligheidstesten standaardiseren, respectievelijk op Europees niveau en in de VS. Beide organisaties geven aan de intermediaire categorie echter een verschillende betekenis. Volgens EUCAST, die geen voorstander is van een grijze zone, is therapeutisch succes mogelijk wanneer een grotere dosis wordt toegediend. Volgens CLSI vertonen intermediaire kiemen een lagere respons ten opzichte van de therapie dan gevoelige kiemen. Wanneer een kiem tot de resistente categorie (R) behoort, is er een grote kans op therapeutisch falen wanneer een behandeling met het betreffende antibioticum wordt gestart Belang Gevoeligheidstesten voor anaerobe bacteriën hebben de laatste jaren heel wat aan belang gewonnen. Zoals eerder aangehaald wordt steeds meer resistentie waargenomen, ook multidrug resistentie. Bovendien treden er geografische resistentieverschillen op. Daarnaast is een belangrijk gevolg van suboptimale therapie dat selectie naar resistente kiemen mogelijk is en zelfs kan zorgen voor overdracht van resistentiemechanismen. Alle voorgaande factoren benadrukken de nood aan een snelle en betrouwbare gevoeligheidstest zowel in het routine onderzoek als om geografische en temporele verschillen te bestuderen. 2,4 Een belangrijke stap voorwaarts in de geschiedenis van gevoeligheidstesten was het uitvoeren van een standaardisatie door EUCAST. Voor deze standaardisatie waren er verschillen in het gebruikte medium, het gebruikte inoculum, de incubatietijd en de temperatuur van incubatie. Deze verschillen leidden mogelijk tot verschillende conclusies. 10

21 Daarnaast was ook de standaardisatie van de breekpunten een belangrijke verwezenlijking. Voordien werden in elk land andere breekpunten gehanteerd. Door het gebrek aan Belgische breekpunten, werden in België vroeger de breekpunten van CLSI gebruikt. CLSI stelde immers vroeger een gestandaardiseerde AST op punt. De breekpunten volgens CLSI zijn echter vaak minder streng dan de breekpunten gebruikt in andere landen. Op die manier kan een kiem onterecht als gevoelig beschouwd worden. Op dit moment worden in België en dus ook in het UZ Gent de breekpunten volgens EUCAST gehanteerd MIC 34, 35, 36 De minimale inhiberende concentratie (MIC) is de concentratie van het antibioticum waarbij geen groei meer wordt waargenomen. Daarnaast definieert men de minimale bactericide concentratie (MBC) als de concentratie van het antibioticum waarbij micro-organismen afsterven. Gezien deze waarden vaak gelijk zijn en MIC-waarden makkelijker te bepalen zijn, worden in de routine MIC-waarden gebruikt. Deze MIC-waarden worden gebruikt om de uitkomst van de geteste klinische therapie te voorspellen en om resistentiemechanismen te detecteren (zie paragraaf 1.5.4) Klinisch breekpunt en epidemiologische cut-off waarde Het breekpunt is enerzijds de MIC-waarde die als grens fungeert tussen S en I, I en R of S en R. In dat geval spreken we van het klinisch breekpunt. Dit wordt gebruikt om na te gaan of een bepaalde stam gevoelig is. Anderzijds kan het breekpunt ook gebruikt worden om verworven resistentiemechanismen op te sporen. In dat geval spreken we van de epidemiologische cut-off (ECOFF) waarde; de grens van de natuurlijke populatie. EUCAST heeft beide breekpunten bepaald en gedocumenteerd. Het klinisch breekpunt wordt, zoals eerder verklaard, bepaald op basis van de kans op succes van de therapie. Voor het bepalen van deze breekpunten worden farmacokinetische en farmacodynamische eigenschappen gehanteerd. Bepaalde studies tonen namelijk aan dat er een zeer goede relatie is tussen deze eigenschappen en de bacteriologische uitkomst. Daarnaast wordt er ook rekening gehouden met klinische data en de ECOFF. 37, 38, 39 11

22 Voor het bepalen van de ECOFF definieert men de wild-type distributie als de populatie waarbij er geen fenotypische resistentie mechanismen zijn. Dit wil niet zeggen dat stammen uit de wild type populatie gevoelig zijn en stammen buiten deze populatie resistent. Dit hangt namelijk af van het klinisch breekpunt. Belangrijk is wel dat de ECOFF steeds lager moet zijn dan het klinisch breekpunt om een species als gevoelig te beschouwen. Wanneer dit niet het geval is, dient het klinisch breekpunt en bijgevolg de dosering verhoogd te worden. Omwille van toxische redenen is dit laatste niet altijd mogelijk. In dat geval moet het gehele species als resistent worden beschouwd. Op die manier bepaalt de ECOFF mee de waarde van het klinisch breekpunt. 40 Voor het weergeven van de wildtype populatie worden data verzameld en samengebracht per combinatie micro-organisme antibioticum. Voorbeelden van distributies voor de B. fragilis groep zijn terug te vinden in bijlage (figuur 7.1 t.em. 7.12). Gebruik makend van zo een verdeling kan de ECOFF eenduidig bepaald worden als de hoogste MIC in de wild type populatie. Stammen met een MIC boven de ECOFF worden beschouwd als stammen met verworven resistentiemechanismen Methoden Dilutietechnieken Dit zijn de klassieke methoden om de MIC te bepalen. Bij de agar dilutie methode worden voedingsbodems met een verschillende concentratie aan antibioticum bereid. Vervolgens wordt op die bodem een standaard aantal micro-organismen gebracht. Dan wordt visueel beoordeeld vanaf welke plaat geen groei meer waar te nemen is. De concentratie die in die plaat aanwezig is, is de MIC. Het principe van broth microdilutie is hetzelfde. Het verschil is dat hier gewerkt wordt met een vloeibaar groeimedium. De voorganger van broth microdilutie is broth macrodilutie, met als enige verschil het volume van het vloeibaar groeimedium. Het nadeel van deze methoden is dat ze omslachtig en nogal duur zijn. Op die manier worden deze in de routine zelden gebruikt, hoewel ze de standaard techniek zijn. 41, 42, 43 12

23 Disk diffusie methode Het principe van deze test is dat een met antibioticum geïmpregneerde disk op een voedingsbodem wordt geplaatst waarop reeds een kiem is uitgestreken. Deze disks nemen vocht op en het antibioticum diffundeert, waardoor een concentratiegradiënt van het antibioticum ontstaat. De diameter van de inhibitiezone is een maat voor gevoeligheid: hoe kleiner deze zone, hoe minder gevoelig de kiem is. De gemeten diameters kunnen vergeleken worden met breekpunten, zodat de kiemen als gevoelig, resistent of intermediair kunnen worden benoemd. Deze methode is voor verschillende species gevalideerd door een regressie analyse uit te voeren tussen de gemeten diameters en de MIC bepaald door een dilutietechniek (zie figuur 1.1). Op die manier kan uit de zonediameter, in het geval van sommige antibiotica, de MIC bepaald worden. In de meeste gevallen is de correlatie daarvoor echter niet goed genoeg, maar kan de gevoeligheid wel kwalitatief beoordeeld worden als gevoelig, resistent of intermediair. De disk diffusie methode is flexibel, eenvoudig, snel en goedkoop is. Een belangrijk nadeel is echter dat het concentratiegradiënt slechts kortstondig stabiel is. Daardoor kan deze methode enkel worden toegepast voor snel groeiende kiemen. Voor vele anaerobe bacteriën, die trage groeiers zijn, is deze methode dus geen optie. Stammen uit de B. fragilis groep groeien echter snel, waardoor deze methode voor die groep wel tot de mogelijkheden behoort. 2, 43, E-test De E-test, of voluit epsilometer-test, is een test die een directe kwantificatie van de MIC mogelijk maakt. De test bestaat uit een plastic strip die een goed gecontroleerd, continu en exponentieel concentratiegradiënt van een bepaald antibioticum bevat. De MIC kan worden afgelezen op de plaats waar de elliptische inhibitiezone de strip snijdt. De E-test kan dus beschouwd worden als een geavanceerde vorm van de disk diffusie test. Dit omdat hier de MIC eenduidig, als een concentratie kan worden afgelezen. Een ander voordeel is dat het concentratiegradiënt bij een E-test langer stabiel is dan bij een disk. Op die manier kan deze test ook gebruikt worden voor trager groeiende kiemen. Het nadeel is dat deze test vrij duur 2, 45 en omslachtig is, vooral wanneer meerdere antibiotica moeten getest worden. 13

24 Moleculaire methoden Op dit moment is de meest gebruikte moleculaire methode PCR voor het opsporen van nim genen die verantwoordelijk zijn voor metronidazole resistentie en van cfia-type genen, verantwoordelijk voor carbapenem resistentie. Het lijkt echter aannemelijk dat in de toekomst een snelle, moleculaire test mogelijk zal zijn. Een belangrijke uitdaging hierbij is dat deze PCR methode resistentie ten opzichte van meerdere antibiotica tegelijkertijd moet kunnen opsporen. Een multiplex PCR voor meerdere genen, gelinkt aan een gekende resistentie, vormt dan ook een mogelijkheid. Het is belangrijk dat deze testen kritisch benaderd worden. De aanwezigheid van efflux pompen kunnen de conclusie uit een moleculaire test namelijk beïnvloeden. Deze worden niet opgespoord en kunnen toch een grote bijdrage leveren aan het resistentie patroon. Bovendien betekent de aanwezigheid van een gen niet altijd dat dit gen ook tot expressie wordt gebracht. Tenslotte worden kiemen met nieuwe resistentie mechanismen op basis van deze technieken niet als resistent beschouwd AST bij anaerobe bacteriën Op dit moment worden gevoeligheidstesten voor anaerobe bacteriën op Europees niveau onderzocht door de organisatie EUCAST. De laatste rapporteringen onderzoeken de mogelijkheid om de disk diffusie methode toe te passen. 46,47 Dit is beperkt tot de B. fragilis groep omwille van hoger vermelde redenen (zie paragraaf ). In het UZ Gent wordt momenteel een niet-adequaat antibiogram gebruikt door gebrek aan een handige en gevalideerde techniek. Drie antibiotica, onder de vorm van ROSCO-tabletten worden getest: penicilline, clindamycine en metronidazole. Deze tabletten werken volgens hetzelfde principe als de papieren disks (zie paragraaf ). Het verschil is dat het antibioticum hier niet verdeeld is in een papieren disk, maar wel als fijn kristal verdeeld ligt tussen een beschermend granulaat. De E-test voor anaerobe bacteriën is voor heel wat antibiotica reeds gevalideerd ten opzichte van de klassieke dilutiemethode door EUCAST. 48 Hoewel deze test goed en betrouwbaar is, is er toch vraag naar een snelle, goedkope en vooral eenvoudige test. De disk diffusie methode kan het antwoord zijn op deze vraag. 37, 45, 46, 47 14

25 Diameter (mm) Validatie van een nieuwe methode Wanneer verschillende antimicrobiële gevoeligheidstesten met elkaar vergeleken worden, is het mogelijk dat er discrepanties optreden. Hiermee wordt bedoeld dat in de verschillende testen een verschillende eindconclusie wordt getrokken met betrekking tot categorische resistentie (gevoelig, resistent of intermediair). Om te kunnen stellen dat twee methoden vergelijkbare resultaten geven, mogen maximum percentages voor deze discrepanties niet overschreden worden. 33 In figuur 1.1 worden de mogelijke discrepanties weergegeven GEVOELIG Minor Major error Minor error INTERMEDIAIR Minor error Very major Minor error RESISTENT 0 0, MIC (µg/ml) Figuur 1.1 Correlatie MIC en disk diffusie diameter en weergave mogelijke discrepanties (eigen illustratie) Minor error Discrepanties die ertoe leiden dat er onregelmatigheden optreden in het toewijzen aan aangrenzende categorieën (S en I, R en I), worden minor errors genoemd. Deze hebben namelijk beperkte therapeutische gevolgen. Het percentage aan minor errors wordt bepaald zoals in vergelijking 1.1. Dit percentage mag niet meer dan 10 % bedragen. N me 100 N Met N me : het aantal tests resulterend in een minor error Met N: het totaal aantal kiemen dat getest is 33, 49 (1.1) 15

26 Major error Het categoriseren van een gevoelige kiem als resistent wordt beschouwd als een major error. In dit geval wordt een antibioticum uitgesloten, hoewel de kans op klinisch succes groot is. Het percentage aan major errors kan worden berekend zoals weergegeven in vergelijking 1.2. Dit percentage moet kleiner dan of gelijk aan 3,0 % zijn. N ME 100 N Sref Met N me : het aantal tests resulterend in een major error Met N Sref: : het aantal kiemen dat als gevoelig beschouwd wordt met de referentiemethode Very major error De meeste ernstige discrepantie is natuurlijk het rapporteren van een resistente kiem als een gevoelige kiem. Op die manier is er een grote kans op therapeutisch falen. Dit wordt een very major error genoemd. Het percentage aan very major errors kan worden berekend zoals weergegeven in vergelijking 1.3. Dit percentage moet kleiner dan of gelijk aan 1,5 % zijn. 33, 49 N vme 100 N Rref Met N vme : het aantal tests resulterend in een very major error Met N Rref: : het aantal kiemen dat als resistent beschouwd wordt met de referentiemethode Belang intermediaire categorie Het aantal major errors en very major errors is afhankelijk van de accuraatheid van de methode en van de breedte van de intermediaire zone. Bij afwezigheid van een intermediaire zone, zijn S en R aaneengrenzende categorieën. Bijgevolg zijn alle discrepanties sowieso een major of een very major error. Een minor error is namelijk niet langer mogelijk. 33, 49 (1.2) (1.3) 16

27 Dit is een belangrijk gevolg van het weglaten van de intermediaire categorie door EUCAST. Volgens EUCAST is de intermediaire categorie enkel relevant voor antibiotica die ook in een hogere dosis kunnen worden toegediend. Voor antibiotica waarvoor slechts één standaarddosering is goedgekeurd, is een intermediaire categorie niet zinvol. Dit is een logisch gevolg uit de definitie van de intermediaire categorie volgens EUCAST. Deze stelt namelijk dat bij infecties met kiemen van de intermediaire categorie therapeutisch succes mogelijk is wanneer een hogere dosis wordt toegediend. Bovenstaande criteria voor de foutenpercentages kunnen dan ook problemen opleveren. Door het vernauwen van de intermediaire zone en zelfs het verdwijnen van de intermediaire zone, worden meer fouten gemaakt. De maximum percentages voor fouten zijn echter bepaald op basis van bredere intermediaire zones. Op die manier worden nieuwe analyses volgens EUCAST vaak te streng beoordeeld

28 1.6 DOEL VAN DEZE STUDIE De behandeling van een anaerobe infectie gebeurt op twee manieren: chirurgisch en medicamenteus met antibiotica. Deze medicamenteuze behandeling verliep tot over een aantal jaar vooral empirisch. Door een toenemende resistentie binnen de B. fragilis groep is dit niet langer optimaal. Bijgevolg rijst de vraag naar een geschikte gevoeligheidstest. Op dit moment wordt in het UZ Gent met een verouderd antibiogram met ROSCO-tabletten gewerkt. Dit wordt bovendien enkel uitgevoerd voor het species B. fragilis. Daarnaast is er op grote schaal reeds een validatie gebeurt van de E-test ten opzichte van de klassieke dilutiemethode voor de B. fragilis groep. 48 Het gebruik van E-testen is dus gevalideerd maar ook duur en complex wanneer meerdere antibiotica moeten getest worden. Daarom is er vraag naar een goedkoop, snel en eenvoudig alternatief. De disk diffusie methode kan de oplossing zijn. 46 Een groot nadeel is dat deze enkel voor snelgroeiende kiemen kan worden gebruikt. Dit is voor de meeste anaerobe bacteriën een probleem. De species van de B. fragilis groep zijn echter snel groeiende soorten. Daarom is het valideren en naderhand in gebruik nemen van de disk diffusie methode voor de B. fragilis groep interessant. Natuurlijk zijn er voor de disk diffusie methode verschillende praktische aspecten die in rekening moeten gebracht worden, zoals de gebruikte voedingsbodem. Volgens de laatste rapporteringen van EUCAST moet er gewerkt worden met een Brucella bloed agar (BB). Deze bodem wordt in het UZ Gent echter niet gebruikt. De Mueller Hinton agar met paardenbloed (MHF) is de EUCAST standaard voor moeilijke groeiende kiemen en wordt in het UZ Gent al gebruikt voor het antibiogram van die kiemen. Praktisch gezien, is het dus interessant het gebruik van deze bodem te overwegen. In deze studie wordt de disk diffusie methode zowel op BB als op de MHF gevalideerd. Deze validatie kan enkel als er breekpunten zijn gedefinieerd voor de nieuwe methodes. EUCAST doet hiervoor voorstellen voor de methode op BB. 46 Die voorstellen worden getoetst aan de data in deze studie. Als deze op basis van de foutenanalyse niet aanvaard kunnen worden, moeten breekpunten vanuit deze studie worden bepaald. Hetzelfde geldt wanneer EUCAST geen disk diffusie breekpunten heeft voorgesteld. Voor de methode op MHF kunnen ook enkel breekpunten worden bepaald vanuit deze studie. Het bepalen van breekpunten gebeurt met behulp van een lineaire regressiecurve. Daarnaast gebeurt er een foutenanalyse om na te gaan of de maximum percentages aan minor, major en very major errors niet worden overschreden. 46, 47 18

29 2. MATERIAAL EN METHODEN 2.1 KWEEK KIEMEN In deze studie wordt gewerkt met 65 isolaten die bewaard werden door invriezen bij -80 C. Invriezen gebeurt door een voldoende hoeveelheid van de kiem in 1 ml TSB-glycerol-mengsel te brengen. Dit mengsel wordt bereid door 15 g TSB (tryptic soy broth, BD, Erembodegem, België) en 75 ml glycerol (Merck, Overijse, België) op te lossen in 500 ml water, gezuiverd door omgekeerde osmose. Glycerol wordt toegevoegd om het beschadigen van de cellen door kristalvorming tegen te gaan. TSB bevat verschillende peptiden en aminozuren als voedingsbron. Op deze manier kunnen de kiemen gedurende lange tijd overleven. 50, 51 Vooraleer met de ingevroren kiemen kan gewerkt worden, moeten deze ontdooid worden. Een hoeveelheid (± 1 µl) van het ingevroren mengsel wordt in een uitdunningsenting uitgestreken op een Schaedler bodem (BD, Erembodegem, België). De plaat wordt anaeroob geïncubeerd bij 35 C tot wanneer er voldoende groei is (24 h of 48 h). 2.2 IDENTIFICATIE STAMMEN De ontdooide stammen worden ter controle opnieuw geïdentificeerd met behulp van de MALDI-TOF massaspectrometer (Bruker, Eke, België). Hiervoor wordt een kleine hoeveelheid van de kiem op een drager (Bruker, Eke, België) gebracht en uitgestreken. Nadien wordt 1 µl matrix (Bruker, Eke, België) op de drager gebracht. Na drogen wordt de drager in het toestel geplaatst. Het massaspectrum wordt gegenereerd. De software (Bruker, Eke, België) bepaalt de identiteit van de bacterie door het bekomen spectrum te vergelijken met referentiespectra. Deze identificatie mag enkel aanvaard worden wanneer er voldoende overeenkomst is, weergegeven als een groene score. Bij elke run moet een negatieve controle (enkel matrix) worden meegenomen. Eén maal per dag wordt er ook een positieve controle gespot: de Bruker bacterial test standaard (Bruker, Eke, België). Deze bevat een extract van een standaard kiem van E. coli en twee proteïnen. Deze laatste geven twee extra pieken, zodat over een wijdere range van m/z-waarden kan gecontroleerd worden. 19

30 2.3 E-TEST Vertrekkend van de ontdooide en geïdentificeerde stammen wordt een 1 McFarland suspensie gemaakt in steriel fysiologisch water. Nadien wordt de suspensie homogeen, in drie richtingen, uitgestreken over een BB (BD, Erembodegem, België). Per bodem worden 1 of 2 strips geplaatst. De volgende antibiotica worden getest: amoxicilline-clavulaanzuur (Biomérieux, Schaarbeek, België), clindamycine (Biomérieux, Schaarbeek, België), meropenem (Biomérieux, Schaarbeek, België), metronidazole (Biomérieux, Schaarbeek, België), moxifloxacine (Biomérieux, Schaarbeek, België) en tigecycline (Biomérieux, Schaarbeek, België). Er was gepland om piperacilline-tazobactam (Liofilchem, Zottegem, België) te testen, maar dat lukte niet tijdig omwille van leveringsproblemen. De regel wordt toegepast. Dit houdt in dat de tijd tussen het maken van de suspensie, het uitstrijken van de suspensie, het plaatsen van de strip en het plaatsen van de plaat in de juiste atmosfeer, steeds maximum 15 min is. De platen worden anaeroob geïncubeerd bij 35 C en kunnen na 24 h worden afgelezen. De plaat waarop clindamycine is gelegd, is hierop een uitzondering. Uit voorafgaand onderzoek bleek namelijk dat niet alle resistenties met de E-test kunnen opgespoord worden na 24 h incubatie. 47 Daarom wordt de MIC-waarde van clindamycine maar afgelezen na 48 h, tenzij reeds na 24 h groei tot tegen de strip wordt waargenomen. De MIC wordt afgelezen op de plaats waar de inhibitiezone de strip snijdt. Indien het snijpunt tussen twee waarden ligt, wordt steeds geopteerd voor de hoogste waarde. De MIC wordt, indien mogelijk, door twee verschillende personen afgelezen. De afgelezen MIC wordt vergeleken met de breekpunten volgens EUCAST versie 5.0. Deze worden weergegeven in tabel 2.1. Voor tigecycline is geen breekpunt gedefinieerd door EUCAST. Daarom worden voor tigecycline breekpunten gebruikt die bepaald zijn door CLSI, op aangeven van het FDA. Voor amoxicilline-clavulaanzuur wordt voor aerobe bacteriën slechts 1 breekpunt gedefinieerd: S 8 µg/ml. Er wordt nagegaan wat het weglaten van de intermediaire groep betekent voor de B. fragilis groep en voor de validatie van het diffusie antibiogram. Voor meropenem worden volgend jaar de breekpunten gewijzigd: S 2 µg/ml en R > 4 µg/ml. Deze wijziging wordt ook al in rekening gebracht bij het verwerken van de resultaten. 20

31 Tabel 2.1 MIC-breekpunten per antibioticum volgens EUCAST versie 5.0 Antibioticum S (µg/ml) R > (µg/ml) Amoxicilline-clavulaanzuur 4 8 Clindamycine 4 4 Meropenem 2 8 Metronidazole 4 4 Moxifloxacine 2 4 Piperacilline-tazobactam 8 16 Tigecycline Breekpunt volgens FDA: R in plaats van R > 2.4 DISK DIFFUSIE METHODE De methodologie voor de disk diffusie methode is gesteund op deze teruggevonden in twee publicaties van een EUCAST werkgroep. 46,47 Er wordt gestart van een 1 McFarland suspensie in steriel, fysiologisch water. Deze wordt uitgestreken in drie richtingen over twee BB bodems (BD, Erembodegem, België) en twee MHF bodems (Oxoid N.V., Aalst, België). De disks worden met een pincet over de platen verdeeld. Volgende antibiotica worden gebruikt: amoxicilline-clavulaanzuur 20/10 µg (Biorad, Temse, België), clindamycine 2 µg (Biorad, Temse, België), clindamycine 10 µg (Oxoid N.V., Aalst, België), meropenem 10 µg (Biorad, Temse, België), metronidazole 5 µg (Oxoid N.V., Aalst, België), moxifloxacine 5 µg (Biorad, Temse, België) en tigecycline 15 µg (Biorad, Temse, België). Er was gepland piperacilline-tazobactam te testen, maar door leveringsproblemen was dit niet mogelijk. Ook hier wordt de regel toegepast, zoals beschreven in paragraaf 2.3. De platen worden gedurende 24 h anaeroob geïncubeerd bij 35 C. De diameter van de inhibitezone wordt afgelezen op 100 % inhibitie. Het aflezen gebeurt, indien mogelijk, door twee personen. De plaat met clindamycine is opnieuw de uitzondering. Er wordt namelijk onenigheid gevonden in de 2 publicaties. 46, 47 In het studie van EUCASt worden de clindamycine disks, net als de andere disks, 24 h geïncubeerd. 46 In het verslag van de conferentie van ECCMID worden de clindamycine disks, net als de E-testen, 48 h geïncubeerd. 47 In deze studie wordt zowel na 24 h als na 48 h incubatie afgelezen. Wanneer na 24 h incubatie al groei tot tegen de disk wordt waargenomen, wordt de plaat met clindamycine niet langer geïncubeerd. 21

32 In deze studie wordt gebruik gemaakt van clindamycine (2 µg) en clindamycine (10 µg). Er worden namelijk ook tegenstrijdigheden omtrent de lading teruggevonden in dezelfde publicaties. 46, 47 Door beide ladingen op te nemen in de analyse, kan onderscheiden worden welke lading de meest juiste differentiatie tussen S en R kan geven. De disks worden op twee verschillende bodems getest. De BB is de bodem die in beide referentiewerken wordt gebruikt. 46, 47 Deze wordt in het UZ Gent echter niet routinematig gebruikt. De MHF wordt in het UZ Gent, op aangeven van EUCAST, wel gebruikt voor het antibiogram van kiemen die moeilijk groeien. Daarom wordt nagegaan of deze bodem in de toekomst kan gebruikt worden voor het diffusie antibiogram voor de B. fragilis groep. In deze studie wordt het inoculum bereid in fysiologisch water, niet in thioglycolaat broth. Een deel van het onderzoek uitgaande van EUCAST toont namelijk aan dat er geen significante verschillen zijn tussen beide. 46 Aangezien werken met fysiologisch water goedkoper en eenvoudiger is, wordt hiervoor geopteerd. Daarnaast moet ook de vraag gesteld worden de media al dan niet te prereduceren. Ook dit is behandeld in het onderzoek uitgaande van EUCAST. 46 Er werd geen significant verschil aangetoond. Daarom wordt hier niet geprereduceerd. 2.5 STATISTISCHE ANALYSE De statistische analyse omvat een eenvoudige lineaire regressie analyse, uitgevoerd met SPSS statistics 22 (IBM, Armonk, NY, VS). Hiervoor moet aan verschillende veronderstellingen voldaan worden. De eerste is dat de onafhankelijke en de afhankelijke variabele beiden continue variabelen zijn. De tweede veronderstelling is dat de relatie tussen beide variabelen lineair is. Deze lineaire relatie wordt visueel beoordeeld in een scatter plot. Ten derde worden geen significante outliers getolereerd. Outliers kunnen geïdentificeerd worden op de scatter plot en de residual plot. Als vierde moeten alle metingen onafhankelijk van elkaar gebeuren. Dit wordt nagegaan met behulp van de Durbin- Watson test. 53 De vijfde veronderstelling is dat de data homoscedasticiteit vertonen. Dit houdt in dat de variantie niet afhangt van de waarde van de onafhankelijke. Dit kan het best beoordeeld worden in een residual plot. De numerieke test die wordt uitgevoerd voor het nagaan van homoscedasticiteit is de Breusch-Pagan test

33 Als laatste dienen de residuals normaal verdeeld te zijn. Dit kan nagegaan worden door het beoordelen van een histogram van de residuals of een QQ-plot van de residuals. De normaliteit van de residuals wordt ook nagegaan op een numerieke wijze via de Shapiro-Wilk test. 55, 56 Het voorstellen van breekpunten is enkel noodzakelijk wanneer de disk diffusie breekpunten door EUCAST niet aanvaard kunnen worden of ontbreken. Uit de MIC-breekpunten (zie tabel 2.1) kunnen dan aan de hand van de regressiecurve breekpunten voor de disk diffusie methode voorspeld worden. 52 Deze breekpunten worden voorspeld als een 95 % betrouwbaarheidsinterval. De discrete waarden binnen dit betrouwbaarheidsinterval worden met elkaar vergeleken op basis van de foutenpercentages. Het breekpunt dat uiteindelijk wordt voorgesteld is dat waarbij de foutenpercentages het laagste zijn. Om een methode te kunnen aanvaarden, mag het percentage minor errors niet groter zijn dan 10 %, het percentage major errors niet groter dan 3 % en het percentage very major errors niet groter dan 1,5 %. Deze errors worden uitgebreid besproken in paragraaf

34 3. RESULTATEN 3.1 IDENTIFICATIE De identiteit van de verschillende stammen en het bijhorende staalnummer worden weergegeven in tabel 7.1 in bijlage. Van de 65 stammen waren 3 stammen niet levensvatbaar. Bijgevolg kunnen slechts 62 stammen geïdentificeerd en gebruikt worden in de studie. 3.2 E-TEST EN DISK DIFFUSIE METHODE: STATISTISCHE VERGELIJKING De resultaten van de E-test en de disk diffusie methode worden per antibioticum weergegeven in tabellen in bijlage (zie tabel 7.2 t.e.m. tabel 7.8). Enkel de resultaten van de aflezing door de eerste persoon worden geanalyseerd. De aflezing door de tweede persoon gebeurde namelijk slechts voor 49 stammen (70,03 %). Het is wel belangrijk te vermelden dat tussen de twee aflezingen geen discrepanties zijn waargenomen. Stam 17, 30 en 65 zijn onvoldoende gegroeid op MHF. Daardoor kunnen slechts 59 stammen worden opgenomen in de analyse voor deze bodem. Voor de BB kan met 62 stammen worden gewerkt. In paragraaf tot en met worden de data visueel weergegeven en besproken. Voor elk antibioticum wordt driemaal een histogram weergegeven: één voor de verdeling van de MIC-waarden, één voor de verdeling van de diameters op BB en één voor de verdeling van de diameters op MHF. De verdeling van de MIC-waarden kan vergeleken worden met de natuurlijke populaties volgens EUCAST weergegeven in bijlage (figuur 7.1 t.e.m. figuur 7.12). Bij de verdelingen van de diameters worden de MIC-waarden, bepaald met de E-test, gelinkt aan de diameters met behulp van een kleurencode. Deze manier van voorstellen wordt ook gehanteerd door EUCAST. Als samenvatting van de statistische analyse worden de regressiecurves, die het verband tussen de MIC-waarden en de diameters tonen, voor beide bodems in paragraaf tot en met weergegeven. Een samenvattende tabel die toont aan welke voorwaarden voor lineaire regressie voldaan is, wordt weergegeven in bijlage (zie tabel 7.9 t.e.m. tabel 7.12). Indien mogelijk worden de breekpunten voorgesteld in de studie van EUCAST besproken. Daarnaast worden breekpunten voorgesteld aan de hand van deze studie en de bijhorende foutenpercentages beschreven. De verschillende breekpunten worden ook weergegeven bij de regressiecurve. 24

35 3.2.1 Amoxicilline-clavulaanzuur Verdeling MIC Volgens de referentiemethode zijn 56 stammen gevoelig voor amoxicilline-clavulaanzuur (90,32 %). S 4 µg/ml R > 8 µg/ml Figuur 3.1: Verdeling MIC voor amoxicilline-clavulaanzuur met de MIC-breekpunten volgens EUCAST Brucella bloed agar Het breekpunt voor gevoeligheid, voorgesteld in de studie van EUCAST is S 15 mm. Bij dit breekpunt zijn er 4 me (6,45 %) terug te vinden en geen ME of vme. Dit breekpunt is dus in staat de gevoelige van de resistente stammen te scheiden. In beide categorieën worden wel nog stammen van de intermediaire categorie teruggevonden. Dit kan afgeleid worden uit het histogram (figuur 3.2). In de studie van EUCAST wordt maar één disk diffusie breekpunt voorgesteld van uit twee MIC-breekpunten. Om die reden wordt ervoor geopteerd op basis van deze studie twee disk diffusie breekpunten voor te stellen. Vanuit de regressiecurve (figuur 3.3) kunnen uit de breekpunten voor de MIC-waarden (S 4 µg/ml en R > 8 µg/ml), twee breekpunten voor de disk diffusie methode voorspeld worden. Deze voorspelling wordt uitgedrukt als een 95 % betrouwbaarheidsinterval: S (13 mm, 29 mm) en R < (9 mm, 24 mm). Het laagste aantal me wordt teruggevonden bij het breekpunt voor gevoeligheid S 18 mm en het breekpunt voor resistentie R < (11 mm, 14 mm) en bedraagt 3 (4,84 %). Er worden geen ME of vme errors waargenomen. De kans op ME is het laagst bij het breekpunt voor resistentie R < 11 mm. 25

36 Voor aerobe bacteriën wordt slechts één MIC-breekpunt gedefinieerd door EUCAST (S 8 µg/ml). Wanneer dit MIC-breekpunt en het disk diffusie breekpunt volgens EUCAST (S 15 mm) gehanteerd worden, bedraagt het aantal ME 2 (3,33 %). S 4 µg/ml en R > 8 µg/ml 1 S 18 mm en R < 11 mm 1 S 15 mm 1 diameter = 30,18 14,99 log(mic) r 2 = 0,857 Figuur 3.2 Histogram voor disk diffusie methode voor amoxicilline-clavulaanzuur op BB; groen: gevoelig met de referentiemethode, oranje: intermediair met de referentiemethode, rood: resistent met de referentiemethode Figuur 3.3 Regressiecurve voor amoxicilline-clavulaanzuur op BB; 1 de MIC-breekpunten volgens EUCAST (blauw), de disk diffusie breekpunten voorgesteld in deze studie (rood) en de disk diffusie breekpunt voorgesteld in de studie van EUCAST (groen) Mueller Hinton agar met bloed Vanuit de regressiecurve (figuur 3.5) kunnen uit de breekpunten voor de MIC-waarden (S 4 µg/ml en R > 8 µg/ml), breekpunten voor de disk diffusie methode voorspeld worden. Deze voorspelling wordt uitgedrukt als een 95 % betrouwbaarheidsinterval: S (12 mm, 33 mm) en R < (7 mm, 28 mm). Het laagste aantal me wordt teruggevonden voor S 18 mm en R < (7 mm, 14 mm) en bedraagt dan 4 (6,78 %). Met dat breekpunt worden geen ME of vme gemaakt. De kans op ME is wel het kleinst bij het breekpunt voor resistentie R < 7 mm. Wanneer hier, naar analogie met de breekpunten voor aerobe bacteriën, met één MICbreekpunt (S 8 µg/ml) wordt gewerkt, wordt 1 me (1,69 %) gemaakt met bovenstaande breekpunten voor disk diffusie. 26

37 S 4 µg/ml en R > 8 µg/ml 1 S 18 mm en R < 7 mm 1 Figuur 3.4 Histogram voor disk diffusie methode voor amoxicilline-clavulaanzuur op MHF; groen: gevoelig met de referentiemethode, oranje: intermediair met de referentiemethode, rood: resistent met de referentiemethode diameter = 30,74 14,28 log(mic) r 2 = 0,755 Figuur 3.5 Regressiecurve voor amoxilicline-clavulaanzuur op MHF; 1 de MIC-breekpunten volgens EUCAST (blauw) en de disk diffusie breekpunten voorgesteld in deze studie (rood) Clindamycine (2 µg) Verdeling MIC Met de referentiemethode worden 32 stammen (51,61 %) als gevoelig beschouwd voor clindamycine. Uit de verdeling van de MIC-waarden (figuur 3.6) blijkt dat er geen duidelijke scheiding is tussen de natuurlijke en de resistente populatie. De populatie komt vrij goed overeen met de natuurlijke verdeling (zie figuur 7.3 in bijlage), maar de resistente populatie is wel groter. S 4 µg/ml Figuur 3.6 Verdeling MIC voor clindamycine met het MIC-breekpunt volgens EUCAST 27

38 Brucella bloed agar Voor de clindamycine disk met lading 2 µg zijn door EUCAST geen breekpunten voorgesteld. De diameter van de inhibitiezones van clindamycine is gemeten na 24 h incubatie en na 48 h incubatie. Door het bestuderen van beide histogrammen (figuur 3.7 en figuur 3.8) valt op dat er meer overeenkomst is na 48 h incubatie. Dit wordt tegengesproken door de determinatiecoëfficiënt (na 24 h: r 2 = 0,695; na 48 h: r 2 = 0,669). De standard error geeft wel aan dat een voorspelling op basis van de data na 48 h incubatie preciezer is (na 24 h: SE = 6,345; na 48 h: SE = 5,834). Op basis van de verdeling (figuur 3.6) en de standard error wordt de verdere analyse uitgevoerd met de data bepaald na 48 h incubatie. Er is aan twee van de voornaamste voorwaarden voor lineaire regressie (tabel 7.10 in bijlage) niet voldaan. Daarom moet een voorspelling vanuit het lineaire regressie model (figuur 3.9) kritisch bekeken worden. Deze voorspelling vertrekt vanuit het MIC-breekpunt (S 4 µg/ml) en resulteert in een 95 % betrouwbaarheidsinterval: S (4 mm, 25 mm). Het laagste aantal fouten wordt teruggevonden bij het breekpunt voor gevoeligheid S 11 mm: 6 ME (18,75 %). Bij dit breekpunt worden geen vme waargenomen. Bovendien is het maken van me onmogelijk door het gebrek aan een intermediaire categorie Figuur 3.7 Histogram voor disk diffusie methode voor clindamycine 2 µg na 24 h incubatie; groen: gevoelig met de referentiemethode, rood: resistent met de referentiemethode Figuur 3.8 Histogram voor disk diffusie methode voor clindamycine 2 µg op BB na 48 h incubatie; groen: gevoelig met de referentiemethode, rood: resistent met de referentiemethode 28

39 S 4 µg/ml 1 S 11 mm 1 diameter = 18,21 6,07 log(mic) r 2 = 0,669 Figuur 3.9 Regressiecurve voor clindamycine 2 µg op BB na 48 h incubatie; 1 de MIC-breekpunten volgens EUCAST (blauw) en de disk diffusie breekpunten voorgesteld op basis van deze studie (rood) Mueller Hinton agar met bloed Uit beide histogrammen (figuur 3.10 en 3.11) blijkt dat voor bepaalde stammen een kleine diameter (6 mm) gemeten wordt, hoewel ze volgens de referentiemethode gevoelig zijn. Dit resulteert sowieso in discrepanties: 3 stammen na 24 h incubatie en 8 stammen na 48 h incubatie zijn gevoelig volgens de referentiemethode en vertonen toch een zone diameter van 6 mm. Daardoor zullen er, onafhankelijk van het breekpunt, 3 ME (9,68 %) zijn na 24 h incubatie en 8 ME (25,81 %) na 48 h incubatie. Bijgevolg is het zinloos de data verder te analyseren met behulp van lineaire regressie. 29

40 Figuur 3.10 Histogram voor disk diffusie methode voor clindamycine 2 µg op MHF na 24 h incubatie; groen: gevoelig met de referentiemethode, rood: resistent met de referentiemethode Figuur 3.11 Histogram voor disk diffusie methode voor clindamycine 2 µg op MHF na 48 h incubatie; groen: gevoelig met de referentiemethode, rood: resistent met de referentiemethode Clindamycine (10 µg) Brucella bloed agar De diameter van de inhibitiezones van clindamycine is gemeten na 24 h en na 48 h incubatie. Door het bestuderen van beide histogrammen (figuur 3.12 en 3.13) valt op dat er meer overeenkomst is na 48 h incubatie. Dit blijkt ook uit de determinatiecoëfficiënt (na 24 h: r 2 = 0,858; na 48 h: r 2 = 0,881) en de standard error (na 24 h: SE = 5,504; na 48 h: SE = 4,735). Daarom wordt de verdere analyse uitgevoerd met de data bepaald na 48 h incubatie. EUCAST stelt in de preliminaire studie S 25 mm voor als breekpunt voor gevoeligheid. Bij dit breekpunt worden 10 ME (31,25 %) gemaakt. Er worden geen vme teruggevonden en het maken van me is hier niet mogelijk. Door dit onaanvaardbaar hoog aantal major errors is het noodzakelijk andere breekpunten te overwegen. Numeriek is aan twee van de voornaamste voorwaarden voor lineaire regressie niet voldaan (zie tabel 7.9 in bijlage). Daarom zal een voorspelling vanuit het regressiemodel (figuur 3.14) kritisch bekeken moeten worden. De voorspelling vertrekt vanuit het MIC-breekpunt (S 4 µg/ml) en resulteert in een 95 % betrouwbaarheidsinterval: S (12 mm, 30 mm). Er worden het minste fouten gemaakt bij het breekpunt S 17 mm: 5 ME (15,63 %). 30

41 Figuur 3.12 Histogram voor disk diffusie voor clindamycine 10 µg op BB na 24 h incubatie; groen: gevoelig met de referentiemethode, rood: resistent met de referentiemethode Figuur 3.13 Histogram voor disk diffusie clindamycine 10 µg op BB na 48 h incubatie; groen: gevoelig met de referentiemethode, rood: resistent met de referentiemethode S 4 µg/ml 1 S 17 mm 1 S 25 mm 1 diameter = 26,93 9,40 log(mic) r 2 = 0,881 Figuur 3.14 Regressiecurve clindamycine 10 µg op BB na 48 h incubatie 1 het MIC-breekpunt volgens EUCAST (blauw), het disk diffusie breekpunt voorgesteld in deze studie (rood) en het disk diffusie breekpunt voorgesteld in de studie van EUCAST (groen) 31

42 Mueller Hinton agar met bloed Uit de histogrammen (figuur 3.15 en 3.16) kan worden afgeleid dat de overeenkomst tussen de MIC en de gemeten diameters groter is na 48 h dan na 24 h incubatie. Dit wordt tegengesproken door de determinatiecoëfficiënt (na 24 h: r 2 = 0,691; na 48 h: r 2 = 0,663). De standard error bevestigt dat er een beter regressiemodel is met de data na 48 h incubatie (na 24 h: SE = 6,679; na 48 h: SE = 6,212). Er wordt verder gewerkt met resultaten na 48 h incubatie. Op basis van de regressiecurve (figuur 3.17) kan een breekpunt voorspeld worden uit het gekende breekpunt voor MIC-waarden (S 4 µg/ml). Aangezien aan twee belangrijke voorwaarden niet voldaan is (tabel 7.9 in bijlage), moet een voorspelling vanuit dit model steeds kritisch bekeken worden. Deze voorspelling wordt uitgedrukt als een 95 % betrouwbaarheidsinterval: (4 mm, 27 mm). Het laagste aantal fouten wordt teruggevonden bij het breekpunt voor gevoeligheid S 11 mm: 1 ME (3,23 %) en 1 vme (3,57 %). Figuur 3.15 Histogram voor clindamycine 10 µg op MHF na 24 h incubatie; groen: gevoelig met de referentiemethode, rood: resistent met de referentiemethode Figuur 3.16 Histogram voor clindamycine 10 µg op MHF na 48 h incubatie; groen: gevoelig met de referentiemethode, rood: resistent met de referentiemethode 32

43 S 4 µg/ml 1 S 11 mm 1 diameter = 19,33 6,34 log(mic) r 2 = 0,663 Figuur 3.17 Regressiecurve voor clindamycine 10 µg op MHF na 48 h incubatie; 1 het MIC-breekpunt volgens EUCAST (blauw) en het disk diffusie breekpunt voorgesteld in deze studie (rood) Meropenem Verdeling MIC Volgens de referentiemethode zijn 56 stammen (90,32 %) gevoelig voor meropenem. Uit de verdeling van de MIC-waarden (figuur 3.18) valt af te leiden dat er een duidelijke scheiding is tussen de natuurlijke en de resistente populatie. In tegenstelling tot de verdeling in deze studie, zijn in de natuurlijke verdeling (zie figuur 7.5 in bijlage) geen resistente of intermediaire stammen aanwezig. S 2 µg/ml R > 8 µg/ml Figuur 3.18 Verdeling MIC voor meropenem met de MIC-breekpunten volgens EUCAST 33

44 Brucella bloed agar In de studie van EUCAST wordt geen breekpunt voorgesteld voor meropenem. Wel wordt gesuggereerd dat de gevoelige stammen kunnen gescheiden worden van de resistente en intermediaire stammen bij S 28 mm. Dit komt niet overeen met de resultaten uit deze studie. Uit het histogram (figuur 3.19) blijkt namelijk dat bij een diameter < 28 mm nog twee gevoelige stammen aanwezig zijn. Door gebruik te maken van de regressiecurve (figuur 3.20) kunnen uit de breekpunten voor de MIC-waarden (S 2 µg/ml en R > 8 µg/ml), de breekpunten voor de disk diffusie methode voorspeld worden. Deze voorspelling wordt uitgedrukt als een 95 % betrouwbaarheidsinterval: S (16 mm, 32 mm) en R < (9 mm, 25 mm). Het laagste aantal me wordt teruggevonden voor: S (16 mm, 28 mm) en R < (9 mm, 19 mm) en bedraagt 2 (3,23 %). De kans op ME en vme is het kleinst bij de breekpunten S 28 mm en R < 9 mm. Het breekpunt voor resistentie is in staat de resistentie populatie te scheiden van de gevoelige en intermediair populatie. Bij een diameter < 28 mm en 9 mm kan namelijk niet onderscheiden worden of de stam tot de intermediaire categorie of de gevoelige categorie behoort. De aangekondigde verandering van de MIC-breekpunten volgens EUCAST van S 2 µg/ml naar S 4 µg/ml heeft op deze analyse geen invloed. S 2 µg/ml en R > 8 µg/ml 1 S 28 mm en R < 9 mm 1 Figuur 3.19 Histogram voor disk diffusie methode voor meropenem op BB; groen: gevoelig met de referentiemethode, oranje: intermediair met de referentiemethode, rood: resistent met de referentiemethode diameter = 27,83 11,98 log(mic) r 2 = 0,831 Figuur 3.20 Regressiecurve voor meropenem op BB; 1 MIC-breekpunten volgens EUCAST (blauw) en disk diffusie breekpunten volgens deze studie (rood) 34

45 Mueller Hinton agar met bloed Aan de hand van de regressiecurve (figuur 3.22) kunnen uit de breekpunten voor de MIC-waarden (S 2 µg/ml en R > 8 µg/ml), breekpunten voor de disk diffusie methode voorspeld worden. Deze voorspelling wordt uitgedrukt als een 95 % betrouwbaarheidsinterval: S (15 mm, 34 mm) en R < (8 mm, 27 mm). Er worden geen fouten teruggevonden voor: S (15 mm, 26 mm) en R < (8 mm, 13 mm). Om zo weinig mogelijk risico te hebben op ME of vme wordt er geopteerd voor de breekpunten S 26 mm en R < 8 mm. Met deze breekpunten worden de gevoelige, intermediaire en resistente categorie perfect van elkaar gescheiden. De aangekondigde verandering van de MIC-breekpunten volgens EUCAST van S 2 µg/ml naar S 4 µg/ml heeft op deze analyse geen invloed. S 2 µg/ml en R > 8 µg/ml 1 S 26 mm en R < 8 mm 1 Figuur 3.21 Histogram voor disk diffusie methode voor meropenem op MHF; groen: gevoelig met de referentiemethode, oranje: intermediair met de referentiemethode, rood: resistent met de referentiemethode diameter = 28,28 11,93 log(mic) r 2 = 0,787 Figuur 3.22 Regressiecurve voor meropenem op MHF; 1 MIC-breekpunten volgens EUCAST (blauw) en disk diffusie breekpunten voorgesteld in deze studie (rood) 35

46 3.2.4 Metronidazole Verdeling MIC Met de referentiemethode wordt slechts één stam als resistent beschouwd (98,39% is gevoelig). Uit de verdeling van de MIC-waarden (figuur 3.23) valt af te leiden dat er een duidelijke scheiding is tussen de natuurlijke en de resistente populatie. In vergelijking met de natuurlijke verdeling (zie figuur 7.7 in bijlage), is dit een zeer gevoelige populatie. Dit uit zich in lage MIC-waarden. Hier is wel één resistente stam aanwezig, die er in de natuurlijke verdeling niet is. Er zijn frequent niet-scherpe inhibitiezones waargenomen voor metronidazole. S 4 µg/ml Figuur 3.23 Verdeling MIC voor metronidazole met het breekpunt volgens EUCAST Brucella bloed agar Slechts 61 resultaten worden opgenomen in de analyse, aangezien bij stam 21 de inhibitie zone onvoldoende duidelijk af te lezen was. In de studie van EUCAST wordt S 24 mm voorgesteld als breekpunt voor gevoeligheid. Dit breekpunt is perfect in staat om de gevoelige en de resistente stammen van elkaar te onderscheiden. Het is dus niet noodzakelijk zelf breekpunten te voorspellen. 36

47 S 4 µg/ml 1 S 24 mm 1 Figuur 3.24 Histogram voor disk diffusie methode voor metronidazole op BB; groen: gevoelig met de referentiemethode, rood: resistent met de referentiemethode diameter = 24,51 13,64 log(mic) r 2 = 0,925 Figuur 3.25 Regressiecurve voor metronidazole op BB; 1 de MIC-breekpunten volgens EUCAST (blauw) en de disk diffusie breekpunten voorgesteld in de studie van EUCAST (groen) Mueller Hinton agar met bloed Vermits de inhibitie zones onvoldoende duidelijk afgelijnd waren, worden stam 21 en 63 uitgesloten voor analyse. Bijgevolg worden slechts 57 stammen opgenomen in de analyse. Door gebruik te maken van de regressiecurve (figuur 3.27) kan uit het breekpunt voor de MIC (S 4 µg/ml), het breekpunt voor de disk diffusie methode voorspeld worden. Deze voorspelling wordt uitgedrukt als een 95 % betrouwbaarheidsinterval: S (10 mm, 22 mm). Zoals ook uit het histogram blijkt (figuur 3.26) kan een foutenanalyse geen onderscheid maken tussen de waarden in dit interval. 37

48 S 4 µg/ml 1 S (10 mm, 22 mm) 1 Figuur 3.26 Histogram voor metronidazole op MHF; groen: gevoelig met de referentiemethode, rood: resistent met de referentiemethode diameter = 24,47 13,89 log(mic) r 2 = 0,723 Figuur 3.27 Regressiecurve voor metronidazole op MHF; 1 het MIC-breekpunt volgens EUCAST (blauw) en de mogelijke diameter breekpunten voorgesteld in deze studie (rood) Moxifloxacine Verdeling MIC Volgens de referentiemethode zijn 23 stammen gevoelig (37,10 %). Uit de verdeling van de MIC-waarden (figuur 3.28) valt op dat er geen duidelijke scheiding mogelijk is tussen de natuurlijke populatie en de resistente populatie. De fractie aan resistente stammen is hier ook veel groter dan in de natuurlijke verdeling (zie figuur 7.9 in bijlage). De analyse van de data gebeurt afzonderlijk voor de verschillende bodems. S 2 µg/ml R > 4 µg/ml Figuur 3.28 Verdeling MIC voor moxifloxacine met de MIC-breekpunten volgens EUCAST 38

49 Brucella bloed agar In de studie volgens EUCAST wordt S 19 mm voorgesteld als breekpunt voor gevoeligheid. Wanneer dit breekpunt op de data uit deze studie wordt toegepast, levert dat 3 me (4,84 %), 1 ME (4,35 %) en 1 vme (2,56 %) op. Dit groot aantal fouten is onaanvaardbaar. Bijgevolg is het noodzakelijk andere breekpunten voor te stellen. Door gebruik te maken van de regressiecurve (figuur 3.30) kunnen uit de breekpunten voor de MIC-waarden (S 2 µg/ml en R > 4 µg/ml), de breekpunten voor de disk diffusie methode voorspeld worden. Deze voorspellingen worden uitgedrukt als een 95 % betrouwbaarheidsinterval: S (18 mm, 25 mm) en R < (14 mm, 22 mm). Het laagste aantal me worden teruggevonden voor de breekpunten S 21 mm en R < (15 mm, 18 mm) en bedraagt dan 6 (9,68 %). Met deze breekpunten worden geen ME of vme waargenomen. De kans op ME is het laagst bij het breekpunt voor resistentie R < 15 mm. Een scheiding tussen de gevoelige en resistente populatie is hier niet mogelijk. Bij een diameter < 21 mm en R 15 mm kan een stam namelijk tot de gevoelige, intermediaire of resistente categorie behoren. S 2 µg/ml en R > 4 µg/ml 1 S 21 mm en R < 15 mm 1 S 19 mm 1 Figuur 3.29 Histogram voor disk diffusie methode voor moxifloxacine op BB; groen: gevoelig met de referentiemethode, oranje: intermediair met de referentiemethode, rood: resistent met de referentiemethode diameter = 25,41 12,31 log(mic) r 2 = 0,977 Figuur 3.30 Regressiecurve voor moxifloxacine op BB 1 de MIC-breekpunten volgens EUCAST (blauw), de disk diffusie breekpunten voorgesteld in deze studie (rood) en de disk diffusie breekpunt voorgesteld in de studie van EUCAST (groen) 39

50 Mueller Hinton agar met bloed Er is aan twee van de belangrijkste voorwaarden voor lineaire regressie niet voldaan (tabel 7.12 in bijlage). De voorspellingen vanuit de lineaire regressiecurve (figuur 3.32) moeten dan ook kritisch bekeken worden. Deze voorspellingen vertrekken van uit de MIC-breekpunten (S 2 µg/ml en R > 4 µg/ml) en worden uitgedrukt als een 95 % betrouwbaarheidsinterval: S (15 mm, 23 mm) en R < (11 mm, 19 mm). Het laagste aantal minor errros wordt teruggevonden bij S 16 mm en R < (12 mm, 14 mm) en bedraagt 3 (4,84 %). Bij deze breekpunten worden geen ME of vme waargenomen. Het risico op ME is het kleinst bij het breekpunt voor resistentie R < 12 mm. Het breekpunt voor resistentie kan de resistente categorie van de gevoelige en intermediaire categorie onderscheiden. Bij een diameter 12 mm is het namelijk onduidelijk of een stam tot de gevoelige of de intermediaire categorie behoort. S 2 µg/ml en R > 4 µg/ml 1 S 16 mm en R < 12 mm 1 Figuur 3.31 Histogram voor disk diffusie methode voor moxifloxacine op MHF; groen: gevoelig met de referentiemethode, oranje: intermediair met de referentiemethode, rood: resistent met de referentiemethode diameter = 21,85 10,76 log(mic) r 2 = 0,929 Figuur 3.32 Regressiecurve voor moxifloxacine op MHF; 1 de MIC-breekpunten volgens EUCAST (blauw) en de diameter breekpunten voorgesteld in deze studie 40

51 3.2.6 Tigecycline Verdeling MIC Met de referentiemethode wordt geen enkele stam als resistent beschouwd en worden 61 stammen als gevoelig beschouwd (98,39 %). De verdeling van de MIC-waarden (figuur 3.33) komt zeer goed overeen met de natuurlijke verdeling (zie figuur 7.12 in bijlage). Door het gebrek aan een MIC-breekpunt volgens EUCAST, wordt gewerkt met breekpunten volgens CLSI, opgelegd door de FDA. S 4 µg/ml R 16 µg/ml Figuur 3.33 Verdeling MIC voor tigecycline met het MIC-breekpunt volgens FDA Brucella bloed agar In de studie van EUCAST wordt geen breekpunt voorgesteld voor tigecycline. Er wordt wel gesteld dat alle stammen met een MIC 4 µg/ml, onderscheiden kunnen worden bij een diameter 20 mm. Dit stemt niet overeen met wat in deze analyse is teruggevonden (zie figuur 3.34). Er zijn namelijk 3 stammen met een MIC 4 µg/ml en een diameter < 20 mm. Vanuit de breekpunten voor de MIC-waarden (S 4 µg/ml en R 16 µg/ml) kan een voorspelling gedaan worden aan de hand van de regressiecurve (figuur 3.35). Deze voorspelling wordt uitgedrukt als een 95 % betrouwbaarheidsinterval: S (14 mm, 26 mm) en R (8 mm, 20 mm). Er worden geen fouten waargenomen bij de breekpunten S (14 mm, 16 mm) en R (8 mm, 11 mm). Het risico op ME of vme is het kleinst bij de breekpunten S 16 mm en R < 8 mm. Met deze breekpunten wordt er een perfecte scheiding tussen stammen uit de gevoelige en de intermediaire categorie bekomen. Over de scheiding tussen gevoelige en resistente stammen of intermediaire en resistente stammen kan aan de hand van deze data geen uitspraak worden gedaan. 41

52 S 4 µg/ml en R 16 µg/ml 1 S 16 mm en R 8 mm 1 Figuur 3.34 Histogram voor tigecycline op BB groen: gevoelig met de referentiemethode, oranje: intermediair met de referentiemethode diameter = 26,45 10,25 log(mic) r 2 = 0,833 Figuur 3.35 Regressiecurve voor tigecycline op BB; 1 de MICbreekpunten volgens FDA (blauw) en de diameter breekpunten voorgesteld in deze studie (rood) Mueller Hinton agar met bloed Vertrekkend van de breekpunten voor de MIC-waarden (S 4 µg/ml en R 16 µg/ml) kan een voorspelling gedaan worden aan de hand van de regressiecurve (figuur 3.37). Deze voorspelling wordt uitgedrukt als een 95 % betrouwbaarheidsinterval: S (14 mm, 24 mm) en R < (7 mm, 17 mm). Er worden geen fouten waargenomen bij S 15 mm en R < (7 mm, 14 mm). Het risico op ME is het kleinst bij R < 7 mm. Met deze breekpunten wordt er een perfecte scheiding tussen stammen uit de gevoelige en de intermediaire categorie bekomen. Aan de hand van deze data kan er geen uitspraak gedaan worden over de scheiding tussen gevoelige en resistente stammen of tussen intermediaire en resistente stammen. 42

53 S 4 µg/ml en R 16 µg/ml 1 S 15 mm en R 7 mm 1 Figuur 3.36 Histogram voor tigecycline op MHF groen: gevoelig met de referentiemethode, oranje: intermediair met de referentiemethode diameter = 24,44 11,02 log(mic) r 2 = 0,820 Figuur 3.37 Regressiecurve voor tigecycline op MHF; 1 de MIC-breekpunten volgens FDA (blauw) en de diameter breekpunten voorgesteld in deze studie (rood) 43