Erytrocytenautoantistoffen; soms moeilijk onderscheid tussen allo- of autoantistoffen. Serologie en transfusiebeleid in 3 bijzondere casussen Auteurs Trefwoorden P.C. Ligthart, C.C. Folman en M. de Haas erytrocytenautoantistoffen, irregulaire erytrocytenantistofidentificatie Samenvatting Erytrocytenautoantistoffen die reactief zijn met alle erytrocyten van het identificatiepanel en de eigen erytrocyten van de patiënt, worden meestal benoemd als aspecifiek reagerende antistoffen. Soms maakt het uit om de specificiteit van deze antistoffen verder te onderzoeken. Het betreft dan vaak erytrocytenautoantistoffen die gericht zijn tegen een antigeen met een hoge tot zeer hoge frequentie. Het kennen van de specificiteit van erytrocytenautoantistoffen kan in sommige gevallen namelijk helpen bij het serologisch onderzoek naar de aanwezigheid van erytrocytenalloantistoffen en bij het vaststellen van het transfusieadvies. In dit artikel worden 3 patiënten beschreven met vermeende aspecifiek reagerende erytrocytenautoantistoffen, waarbij toch een specificiteit kon worden vastgesteld. De serologische verschillen en de invloed op het transfusieadvies worden besproken. (Tijdschr Bloedtransfusie 2009;2:130-4) Inleiding De aanwezigheid van aspecifiek reagerende autoantistoffen in het serum van een patiënt wordt serologisch gekenmerkt door een panreactief erytrocytenpanel en door de positieve reactie van de eigen erytrocyten met de in het serum aanwezige antistoffen. Ook de directe antiglobulinetest is vaak positief met IgG en/of complement. Indien antistoffen reageren met alle testerytrocyten maar niet met de eigen erytrocyten van de patiënt, is het waarschijnlijker dat het geen aspecifieke erytrocytenautoantistoffen betreft maar alloantistoffen gericht tegen een hoogfrequent antigeen dat de patiënt zelf niet tot expressie brengt. In een aantal gevallen is de scheidslijn tussen auto en allo en specifiek versus aspecifiek echter niet zo helder. Bekend is dat aspecifiek reagerende autoantistoffen vaak wel degelijk specifiek binden aan een bepaald bloedgroepantigeendragend membraaneiwit. Zo kunnen erytrocytenautoantistoffen gericht zijn tegen de Rhesus-, Band 3- of Kellstructuren, zonder antigeenspecificiteit, of tegen antigenen die met een hoge frequentie voorkomen, zoals Kpb of I. In sommige gevallen kan de aanwezigheid van een autoantistof gepaard gaan met een verlaagde expressie van het betreffende antigeen waartegen de antistoffen gericht zijn, waardoor de eigen erytrocyten niet reactief zijn en de antistoffen alloantistoffen lijken te zijn. Door testerytrocyten te behandelen met enzymen (bromeline, papaïne, ficine, trypsine of chymotrypsine) of chemische middelen (dithiothreitol (DTT) of 2-aminoethyl-isothiuroniumbromide (AET)) kunnen bloedgroepdragende membraanstructuren verwijderd worden of juist beter aantoonbaar worden. Veel membraanstructuren zoals de Rhesuseiwitten, het Duffyglycoproteïne of het Kellglycoproteïne tonen een specifiek veranderd eigen expressiepatroon na enzym- of chemische behandeling. Deze behandelingen kunnen gebruikt worden om de specificiteit van erytrocytenallo- of -autoantistoffen vast te stellen. Daarnaast kunnen deze behandelingen gebruikt worden om testerytrocyten te maken die gebruikt kunnen worden voor het uitsluiten van de aanwezigheid van alloantistoffen. De hier beschreven 3 casussen illustreren de complexiteit van het serologisch onderzoek bij panreactieve erytrocytenpanels en het belang van het vaststellen van de antistofspecificiteit voor het te voeren transfusiebeleid. 130
Tabel 1. Overzicht van de serologische bevindingen bij de verschillende patiënten. Serumreacties Directe antiglobulinetest Eluaat 2-staps enzym casus 1 zw/1+ zw/1+ +/2+ zw 1+ hemolyse polyspecifiek anti-igg anti-c3 PEG panel PEG Diamed LISS IAT serum panel autocontrolcontrole panel auto- met BSA autocontrole zw zw zw zw/1+ neg casus 1, neg zw nv nv nv nv zw zw neg neg zw 6 maanden later casus 1, neg neg nv nv nv nv neg neg neg neg neg 24 maanden later casus 2 3+ neg 2+/3+ neg 2+ 2+ zw zw neg zw neg casus 3 3+ 3+ 3+ 3+ neg nv 2+ 2+ neg 3+ 3+ PEG=polyethyleenglycol, IAT=indirecte antiglobulinetest, BSA=bovien serumalbumine, neg=negatief, zw=zwak positief, 1+ tot 3+=positief tot sterk positief, nv=niet verricht. Tabel 2. Reacties van de sera van de verschillende patiënten met testerytrocyten na enzymof chemische behandeling. Voorbehandeling testerytrocyten serum onbehandeld ficine DTT/AET trypsine chymotrypsine casus 1 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ casus 2 2+ 2+ neg 2+ 2+ casus 3 1+ neg 2+ 2+ 3+ DTT=dithiothreitol, AET=2-aminoethyl-isothiuroniumbromide, neg=negatief. Casus 1 Bij een 53-jarige man, gediagnosticeerd met een anemie (Hb 4,4 mmol/l) bij het syndroom van Guillain- Barré en nierinsufficiëntie, werd de antistofscreening voor het eerst positief bevonden. De anemie werd geduid als veroorzaakt door het nierlijden, en therapie met erytropoëtine was al ingezet. Hemolyseparameters waren niet bekend. In de voorgaande 3 maanden had geen transfusie plaatsgevonden. Het serum gaf zwakke reacties met alle gebruikte testerytrocyten in het screenings- en identificatiepanel in de indirecte antiglobulinetest met toevoeging van polyethyleenglycol (PEG) en in de Diamed low ionic strength solution (LISS)-kolomtechniek, en was duidelijk zwakker of niet reactief met de erytrocyten van de patiënt zelf (zie Tabel 1). De directe antiglobulinetest was zwak positief met anti-igg en met anti-c3d. In het serum bleken aspecifiek reagerende warmte hemolysinen aanwezig te zijn, die mogelijk een verklaring vormden voor de aanwezigheid van complement op de erytrocyten van de patiënt. Een zuur eluaat dat gemaakt was van de erytrocyten van de patiënt was reactief met alle gebruikte testerytrocyten, maar niet met de erytrocyten van de patiënt zelf. Op basis van het reactiepatroon van het eluaat kon niet met zekerheid worden vastgesteld dat het hier uitsluitend autoantistoffen betrof. Na uitgebreid serologisch onderzoek naar de specificiteit van de antistoffen, onder andere met enzym behandelde en chemisch gemodificeerde testerytrocyten, bleek dat de antistoffen gericht waren tegen het AnWj-antigeen (zie Tabel 2). 1 Voor het bepalen van de mate van expressie van het AnWj-antigeen waren voor deze patiënt geen geschikte testsera beschikbaar. De antistoffen in het serum en in het eluaat waren niet reactief met AnWjnegatieve testerytrocyten en ook niet met testerytrocyten met een verzwakte expressie van het AnWj-antigeen. We concludeerden dat het hier autoantistoffen betrof met de specificiteit anti-anwj. AnWj is een hoogfrequent antigeen waarvan niet duidelijk is tot welk bloedgroepsysteem het behoort, maar 131
In a /In b CD44 Kell Kell vermoedelijke locatie van het AnWj-antigeen Kp a /Kp b Js a /Js b K/k Kx- Figuur 1. Model van CD44 met de vermoedelijke locatie van het AnWj-antigeen. dat zeer waarschijnlijk gelegen is op CD44, de structuur waarop ook de antigenen van het Indian-systeem tot expressie komen (zie Figuur 1). Er zijn slechts 2 patiënten beschreven met alloantistoffen tegen AnWj. In de meeste gevallen waarbij AnWj-antistoffen worden aangetoond, betreft het autoantistoffen bij personen van wie de erytrocyten een tijdelijk verlies hebben van expressie van het AnWj-antigeen. Daarom reageren (zoals ook in deze casus) autoantistoffen met de specificiteit anti-anwj vaak wel met testerytrocyten maar niet of verminderd met de erytrocyten van de patiënt. Dit verlies van antigene expressie wordt gezien bij gezonde personen en bij patiënten met verschillende aandoeningen, waarbij lymfomen (Hodgkin en non- Hodgkin) een overrepresentatie hebben. Bij deze patient waren er geen aanwijzingen voor de aanwezigheid van een lymfoom. De AnWj-autoantistoffen bij deze personen kunnen wel voor ernstige transfusiereacties zorgen. 2 Er wordt dan ook geadviseerd om in geval van AnWj-autoantistoffen eenheden te selecteren met een verminderde expressie van het AnWj-antigeen. 3 Personen met het In(Lu)-fenotype hebben een zeer zwakke expressie van de antigenen van Lutheran-systeem, het Indian-systeem en het AnWj-antigeen. In de ingevroren voorraad van de Sanquin Bank of Frozen Blood (SBFB) is een zeer beperkt aantal eenheden met die typering beschikbaar. Bij transfusie is ervoor gekozen om eenheden te selecteren met het In(Lu)-fenotype. De patiënt heeft naast continuering van therapie met erytropoëtine, Figuur 2. Structuur van het Kellglycoproteïne dat in complex met het Kx-eiwit tot expressie wordt gebracht, en de mogelijke locaties van een aantal antigenen behorende tot het Kellsysteem. 4 eenheden met het In(Lu)-fenotype gehad in een periode van 3 maanden, met een goede opbrengst. Voor deze patiënt zijn ook buitenlandse bloedtransfusiediensten (binnen en buiten Europa) benaderd om eenheden met In(Lu)-fenotype te verzorgen. Een half jaar nadat de AnWj-antistoffen waren aangetoond, waren deze in het serum niet meer aantoonbaar; de directe antiglobulinetest was positief, maar een zuur eluaat was niet reactief met de testerytrocyten. Anderhalf jaar later was zowel de erytrocytenantistofscreening als de directe antiglobulinetest negatief. Op dat moment is het transfusieadvies gewijzigd; en is besloten geen erytrocyten met het In(Lu)-fenotype meer te selecteren. Wel is besloten, omdat het serologisch onderzoek bij deze patiënt in geval van terugkeer van de AnWjantistoffen complex is, eenheden te selecteren die compatibel zijn voor Rh-, K-, Duffy-, Kidd- en Ss-antigenen ter preventie van de vorming van alloantistoffen. Casus 2 Bij een 80-jarige patiënte, die een onderbeenamputatie moest ondergaan, werden bij de antistofscreening en identificatie antistoffen tegen erytrocyten aangetoond, die sterk reactief waren met alle gebruikte testerytrocyten in de indirecte antiglobulinetest met toevoeging van PEG en de Diamed LISS-kolomtechniek, en niet reactief waren met de erytrocyten van patiënte zelf. Het Hb 132
was 5,4 mmol/l, de anemie werd verondersteld te berusten op een ijzergebrekanemie. Hemolyseparameters waren niet afwijkend en het reticulocytenaantal was niet verhoogd. Preoperatief was transfusie wenselijk, gezien de algehele en met name de cardiale toestand van de patiënte. De directe antiglobulinetest was zwak positief met anti-igg. Er werd gedacht aan antistoffen gericht tegen een hoogfrequent antigeen. Ook deze patiënte had de afgelopen periode geen bloedtransfusie gehad en antistofscreeningen die verricht zijn in het verleden waren altijd negatief geweest. Uit het serologisch vervolgonderzoek bleek dat de antistoffen verminderd reactief waren met testerytrocyten die behandeld waren met bromeline of AET. Dit kan wijzen op antistoffen die reageren tegen antigenen binnen het Kell-systeem. Op de erytrocyten van de patiënt waren de hoogfrequente Kellbloedgroepantigenen k en Kp b alleen aantoonbaar met een zeer gevoelige techniek (absorptie/elutie). Het serum van de patiënte was niet reactief met testerytrocyten waar alle antigenen van het Kellbloedgroepensysteem op ontbraken. In het eluaat gemaakt van de erytrocyten van de patiënt waren geen antistoffen aantoonbaar. De specificiteit van de antistoffen werd vastgesteld als anti-k-totaal, dus gericht tegen alle vormen van het Kellglycoproteïne (zie Figuur 2). Moleculair biologisch onderzoek, verricht door het International Blood Group Reference Laboratory (IBGRL) te Bristol, liet geen afwijkingen in het KEL-gen zien van deze patiënt, waardoor normale expressie van het Kellglycoproteïne verondersteld mag worden. Meest waarschijnlijk betrof het hier erytrocytenautoantistoffen die geen duidelijke hemolyse tot gevolg hadden. Antistoffen van het type anti-kell-totaal kunnen een ernstige transfusiereactie veroorzaken. Volledig compatibele erytrocyteneenheden (zonder expressie van het Kellsysteem) waren niet beschikbaar. Aangezien de klinische relevantie van de antistoffen niet duidelijk was, werden eenheden geselecteerd die naast Rh en K compatibel ook compatibel waren voor antigenen binnen het Duffy-, Kidd- en MNSs-systeem. De ingreep is verricht onder bloedleegte en transfusie bleek niet noodzakelijk. Casus 3 De derde casus betreft ook een 80-jarige patiënt, die vanwege anemie (Hb 2,8 mmol/l) bij bloedverlies vanuit de blaas als gevolg van een blaascarcinoom, transfusiebehoeftig was. Alleen het lactaatdehydrogenase (LDH)-gehalte was bekend en niet afwijkend. Een week daarvoor, het Hb was 4,7 mmol/l, waren er knipplaats trypsine knipplaats ficine GPA M/N En a Figuur 3. De structuur van glycoforine A (GPA), drager van de antigenen M, N en En a. Binnen het En a -antigeen kunnen door enzymatische digestie van GPA 3 verschillende antigenen onderscheiden worden. En a TS=trypsinegevoelig, En a FS=ficinegevoelig, En a FR=ficineresistent. geen serologische problemen bij het pretransfusieonderzoek en bedroeg het Hb na transfusie van 2 eenheden 5,7 mmol/l. Bij het antistoffenonderzoek waren antistoffen aantoonbaar die sterk reactief waren met alle gebruikte testerytrocyten in de indirecte antiglobulinetest, met toevoeging van PEG en de Diamed LISS-kolomtechniek, en met de erytrocyten van de patiënt. De directe antiglobulinetest was positief en in het eluaat waren ook sterk reactieve antistoffen aantoonbaar. Deze antistoffen reageerden niet met enzymbehandelde testerytrocyten (bromeline en papaïne). Na uitgebreid vervolgonderzoek kon de specificiteit van de antistoffen worden vastgesteld als anti-en a FS. Het En a -antigeen is gelegen op het membraangekoppelde glycoproteïne glycoforine A (GPA), dat de antigenen van het MN-bloedgroepsysteem draagt (zie Figuur 3). Het En a -antigeen bestaat uit 3 epitopen die zijn opgedeeld op grond van de enzymgevoeligheid: En a FR (ficineresistent), En a FS (ficinegevoelig) en En a TS (trypsinegevoelig). De aanwezigheid van de anti-genen M, N en En a FS op de erytrocyten van de patiënt kon worden bevestigd, waarmee kon worden vastgesteld dat de aangetoonde antistoffen autoantistoffen waren. Autoantistoffen tegen GPA komen vaker voor en behoeven, buiten de selectie T F F 133
Aanwijzingen voor de praktijk 1. Redenen voor vervolgonderzoek naar de specificiteit van de antistoffen bij patiënten met vermoedelijke aspecifieke autoantistoffen: - De antistoffen in het serum zijn minder sterk reactief met de erytrocyten van de patiënt (autocontrole) dan met testerytrocyten. - De antistoffen in het serum zijn minder sterk reactief met enzym- of chemisch behandelde testerytrocyten. 2. Voordelen van de identificatie van de specificiteit van autoantistoffen: - de mogelijkheid om een aanpassing te maken bij het selecteren van het meeste geschikte donorbloed. - de mogelijkheid om de aanwezigheid van andere klinisch belangrijke antistoffen in een betrouwbare techniek uit te sluiten. van Rh-compatibel en K-negatief bloed, geen apart transfusieadvies. Aangezien alleen na enzymbehandeling uitgesloten kon worden, moest bij de selectie van eenheden echter wel rekening gehouden worden met de Duffy (Fy)-typering; in dit geval Fy b -negatief. Uiteindelijk is er geen transfusie toegediend en is de patiënt overleden. Conclusie Bij de 3 beschreven patiënten was er primair sprake van autoantistoffen gericht tegen een algemene bloedgroependragende structuur. Door afwijkende reactiepatronen is vervolgonderzoek verricht en de specificiteit van de autoantistoffen vastgesteld. Bij casus 1 leidde dat tot een aangepast transfusieadvies vanwege de in de literatuur beschreven transfusiereacties. Voor casus 2 en 3 was dit respectievelijk niet mogelijk of niet nodig. Voor alle 3 de casussen gold dat het transfusieadvies uitgebreid werd door naast Rh en K ook antistofvorming tegen Duffy (Fy), Kidd (Jk) en Ss te voorkomen. Het vaststellen van de specificiteit van autoantistoffen kan ook helpen bij het uitsluiten van de aanwezigheid van klinisch belangrijke alloantistoffen en voor de selectie van erytrocyten die negatief zijn voor het antigeen waartegen de autoantistoffen gericht waren. Bij de aanwezigheid van autoantistoffen adviseren wij in ieder geval Rhesusfenoytope en K- compatibele eenheden te selecteren. Bij casus 2 was het mogelijk om de aanwezigheid van een groot aantal klinisch belangrijke antistoffen uit te sluiten met AET behandelde testerytrocyten, bij casus 3 was dat mogelijk met papaïne behandelde testerytrocyten. Dankwoord De auteurs danken dhr. dr. W. van Gelder (Albert Schweitzer Ziekenhuis), mw. drs. N.C.V. Péquériaux (Jeroen Bosch Ziekenhuis) en mw. dr. S. Kos (ten tijde van casus t Lange Land Ziekenhuis, nu St. Jans Gasthuis) voor de prettige samenwerking en het aanleveren van de klinische gegevens betreffende deze 3 patiënten. Referenties 1. Folman CC, Ligthart PC, Smid WM, De Vooght KM, Adriaansen HJ. Een zwangere vrouw met antistoffen anti-cram, gericht tegen een hoogfrequent antigeen: serologisch en klinisch beloop. Tijdschr Bloedtransfusie 2008;1,73-7. 2. De Man AJ, Van Dijk BA. An example of anti-anwj causing haemolytic transfusion reaction. Vox Sang 1992;63,238. 3. Daniels G, Poole J, De Silva M, Callaghan T, MacLennan S, Smith N. The clinical significance of blood group antibodies. Transfusion Medicine 2002;12,287-95. Ontvangen 28 september 2009, geaccepteerd 16 november 2009. Correspondentieadres Dhr. P.C. Ligthart, senior analist Mw. dr. C.C. Folman, hoofd laboratorium Mw. dr. M. de Haas, manager Immunohematologie Diagnostiek Sanquin Diagnostiek Referentielaboratorium Erytrocytenserologie Plesmanlaan 125 1066 CX Amsterdam Tel.: 020 512 33 73 E-mailadres: p.ligthart@sanquin.nl Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld. 134